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BQF Protocolos 2010
BQF Protocolos 2010
Trabalhos Práticos
Bioquímica Fisiológica
Licenciaturas em:
Fisioterapia
Enfermagem (Ponte de Lima)
Medicina Dentária (Nocturno)
2009/10
Índice
Introdução
Material
. Espectrofotómetro UV/Vis
. Células (acrílico, volume reduzido)
. Pipetador
. Micropipeta automática de 1000 l
. Micropipeta automática de 200 l
. Suporte para tubos eppendorf
. Tubos eppendorf
Reagentes
. Água desionizada
. Reagente de Benedict
Procedimento experimental
< 100 mg/dl < 160 mg/dl < 120 mg/dl valores normais
100-130 mg/dl 160-220 mg/dl 120-150 mg/dl suspeito
> 130 mg/dl > 220 mg/dl > 150 mg/dl diabético
Princípio
Material
. Espectrofotómetro UV/Vis
. Células (acrílico, volume reduzido)
. Pipetador
. Micropipeta automática de 1000 l
. Micropipeta automática de 20 l
. Suporte para tubos eppendorf
. Tubos eppendorf
. Cronómetro
Reagentes
Resultados
Introdução
Procedimento Experimental
Nota: Normalmente, um eppendorf de cada uma destas soluções é suficiente para cada
grupo.
15. Retirar 5mL da solução de mitocôndrias e 5 mL da solução de citoplasma e
misturar num novo tubo - esta solução será chamada EXTRATO DE
CORAÇÃO DE VACA.
Protocolo experimental:
Parte III – Identificação das fracções celulares activas que promovem as reacções
de oxidação
Protocolo experimental:
Introdução
R1.CHNH3+.COO- R1.CO.COO-
+ +
R2.CO.COO- R2.CHNH3+.COO-
Reagentes
Piruvato de sódio 0,1M
L-glutamato 0,1M
Leucina 0,1M
α-cetoglutarato 0.1 M
Tampão fosfato pH 7,4
Etanol
Padrões: L-alanina , L-leucina e L-glutamato
Placas de T.L.C. (sílica gel)
Solução de naftoquinona
Solvente: propanol:NH4OH a 33% (70:30)
Material
Banho
Material de vidro: tubos de centrífuga e pipetas
Pipeta automática
Método
- Incubação do extracto com vários substratos
1 - Preparar 8 tubos de centrífuga: A, B, C, D, E, F, G e H.
2 - Pipetar os seguintes reagentes:
A B D E F G H
Piruvato Na (mL) 0,5 0,5 0,5
L-Glutamato (mL) 0,5
L-Leucina (mL) 0,5 0,5
L-Alanina (mL) 0,5
-Cetoglutarato 0,5 0,5 0,5
(mL)
Fosfato 0,05M (mL) 1,0 0,5 0,5
º º º º º º º º º º º
Ala A B Leu C D Glu E F Ala G
Resultados
2 – Em que tubos detectou a presença de aminoácidos novos (i.e., não introduzidos por
si)? Esses aminoácidos poderão ter sido produzidos a partir dos cetoácidos adicionados
através de reacções de transaminação?
A maior parte dos alimentos é ingerida sob formas que o organismo não pode
utilizar directamente, por serem sólidos ou não serem absorvidos no tubo digestivo.
Desta forma, os alimentos precisam de sofrer a mastigação para se produzir a
ruptura de parte das suas estruturas e, posteriormente, serem decompostos em
moléculas suficientemente pequenas para passarem a mucosa da parede intestinal e
atingirem a corrente sanguínea.
A desintegração dos alimentos ingeridos em formas assimiláveis é facilitada pelas
operações prévias de cozedura, e constitui o processo inicial de digestão.
Na boca, os alimentos vão libertando os seus hidratos de carbono simples e
complexos, que começam a ser desintegrados pelos processos de trituração e da
digestão enzimática, em resultado dos movimentos de mastigação, pela acção
múltipla da saliva, que actua pela sua qualidade de líquido humidificante e
lubrificante e veículo da enzima amilase e de elementos minerais.
A saliva é produzida por três pares de glândulas salivares e é formada por cerca de
99,5% de água, pelo que favorece a dissolução de moléculas que a mastigação vai
libertando dos alimentos sólidos, e inicia o ataque, pela amilase, dos
polissacarídeos que são sensíveis à sua acção.
A amilase actua sobre o amido e o glicogénio, em presença de cloro, que é
indispensável, desdobrando-os em dextrinas e maltose, de que é corrente
apercebermos o sabor adocicado. Mas este efeito não tem significado relevante em
digestão porque é de curta duração, e cessa quando o bolo entra em contacto com o
suco gástrico estomacal. Este é praticamente inactivo no desdobramento dos
polissacarídeos.
No intestino, o conteúdo do estômago (quimo) chegado intermitentemente, de
consistência cremácea, vai sofrer desde o duodeno, e após se tornar alcalino, a
acção de enzimas pancreáticas (amilase pancreática de efeito semelhante ao da
amilase salivar) e intestinais segregadas pelas glândulas de Brunner do duodeno e
de Lieberkuhn (dissacaridases: sacarase, lactase, maltase e isomaltase).
Sabe-se que existem várias dissacaridases, dentro das designações genéricas
indicadas, sendo quatro particularmente importantes:
- maltase Ia: hidrolisa 50% da maltose e toda a isomaltose.
- maltase Ib (invertase ou sacarase): hidrolisa a totalidade da sacarose e
25% da maltose. Possui uma rápida actividade.
- Maltases II e III: dissociam os restantes 25% de maltose.
No intestino grosso há acção variável da flora intestinal, actuando pelas enzimas
hidrolases sobre alguns polissacarídeos não decompostos na parte superior do
intestino, como a hemicelulose e, em menor extensão, a celulose, que além de
fermentações gasosas, podem produzir alguma glicose.
Princípio
Esta reacção ocorre com todas as moléculas de aldoses e cetoses que têm, senão um
grupo aldeídico ou cetónico livre, pelo menos pseudoaldeídico ou pseudocetónico
susceptível de fornecer um grupo livre à medida que o estado de equilíbrio da
solução se desloca em função da própria reacção.
A maltose, um di-holósido redutor (a função hemiacetálica de uma das oses está
envolvida numa ligação osídica com um hidroxilo alcoólico da segunda ose), é um
produto intermediário da hidrolise - ácida ou enzimática - de poli-holósidos, tais
como o amido e o glicogénio. É formada pela união de duas moléculas de D-
glucose através de uma ligação -1,4-glicosídica.
Material
3 mL de H2O
1 gota de lugol
-----------------------------------------------
Observar a cor
-----------------------------------------------
Incubar a 100ºC até mudança de cor
-----------------------------------------------
Observar a cor
-----------------------------------------------
Arrefecer em H2O fria
Observar a cor
Experiência 2
T1
3 mL de Benedict
agitar e ferver 5’
Observar a cor
T1 T2 T3
Agitar e ferver 5’
Observar a cor
Questões várias:
proteína
colesterol
Objectivo
Material
. Espectrofotómetro UV/Vis
. Células (acrílico, volume reduzido)
. Estufa ou incubadora com temperatura constante a 37 ºC
. Vórtex
. Pipetador
. Pipeta volumétrica (1 mL)
. Micropipeta automática (20 l)
. Suporte para tubos eppendorf
. Tubos eppendorf
. Cronómetro
Resultados
Introdução
Objectivo
Material
. Placas para TLC (de sílica gel com indicador de fluorescência F-254)
. Câmara cromatográfica
. Lâmpada de luz UV ( = 254 nm)
. Capilares
. Óculos de protecção com filtro UV
. Provetas de vidro
. Régua, lápis
1. Sem danificar a placa de TLC, e sem lhe tocar com as mãos, marcar com
um lápis a linha de origem a 1,5 cm de uma das extremidades
2. Aplicar 5 µL de amostra na placa sem ferir o adsorvente: encostar a ponta à
placa mantendo-a quase na vertical e deixar sair o conteúdo.
3. Repetir este procedimento para as restantes soluções padrão e também para
as amostras, respeitando os locais previamente marcados. Devido à sua
difícil detecção, o padrão de estradiol deve ser aplicado novamente (mais 5
µL) exactamente no mesmo local da aplicação anterior, após a evaporação
da primeira gota de solvente.
4. Deixe secar e coloque a placa, cuidadosamente, na câmara cromatográfica
5. Esperar pelo menos 30 min para desenvolver o cromatograma pelo solvente
ascendente
6. Remover a placa e marcar a frente do solvente. Deixe secar na “”hotte”
durante aproximadamente 10 min.
7. Colocar a placa já seca sob a lâmpada de luz UV para observar os pontos de
aplicação.
8. Delimitar com um lápis as manchas observadas. Analisar o cromatograma e
com uma régua medir as distâncias de cada mancha à origem.
Resultados
Calcular os valores dos factores de retenção, Rf, para os padrões e para cada
amostra usando a seguinte expressão:
onde,
Dmancha - distância desde a origem até à mancha em cm
Dsolvente - distância desde a origem até à frente do solvente em cm
Com base nos valores calculados indique qual é a solubilidade relativa dos
esteróides analisados.