TOXICOLOGIA

QUANTIFICAÇÃO DE ANALITOS
E INTERPRETAÇÃO DO
RESULTADO TOXICOLÓGICO
 Como é cobrado em provas:
o Parte de quantificação: conceitos de validação, construção de curva de
calibração
o A relação entre o quantitativo e a interpretação do resultado é cobrada em
questões de interpretação de casos clínicos – bom assunto para uma
discursiva
 Quais parâmetros fisiológicos e farmacocinéticos devem ser
considerados na hora de avaliar os resultados
 Técnicas quantitativas mais empregadas
 Pontos de atenção:
o Esse tópico concentra conhecimentos de vários assuntos, pois se trata da
parte final do toxicologista forense. Deixe para estudar ao final e tenha
atenção ao enunciado da questão para não confundir o comando da mesma
(especialmente na discursiva).
 Como estudar:
o Estudar de forma resumida o que é importante para uma validação de técnica
quantitativa
 Diferenciação de métodos quali para quantitativos
 Diferenciação de métodos clássicos e instrumentais
o Principais aplicações da análise quantitativa e o que ela pode influenciar no
caso forense
 Fontes úteis:
o https://www.fcav.unesp.br/Home/departamentos/tecnologia/
LUCIANAMARIASARAN/quimicaanalitica/introducao-a-analise-quimica.pdf
o Tabela do artigo “Therapeutic and toxic blood concentrations of nearly 1,000
drugs and other xenobiotics” que resumo os valores de referência e doses
tóxicas de muitos fármacos em soro:
https://www.researchgate.net/publication/230572075_Therapeutic_and_toxi
c_blood_concentrations_of_nearly_1000_drugs_and_other_xenobiotics#read

Quantificação de analitos
A quantificação de um analito se dá após a identificação (análise qualitativa) do mesmo na
amostra biológica.

Para que a quantificação seja possível, o toxicologista necessita ter conhecimento de alguns
parâmetros que são importantes para se empregar uma técnica corretamente validada, o que
vai ser relevante para o resultado do laudo pericial.

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REQUISITOS DA METODOLOGIA A SER EMPREGADA NA ANÁLISE

QUANTITATIVA FORENSE
Validação
Prática responsável pela qualidade analítica. A validação representa a comprovação de que os
métodos estão apropriados para os seus devidos usos.

Especificidade/seletividade
Parâmetro que corresponde à capacidade do método em detectar o analito de interesse na
presença de outros componentes da matriz.

Intervalo de trabalho
O intervalo do método analítico corresponde à faixa do maior ao menor nível que possa ser
determinado com precisão e exatidão.

Linearidade
A linearidade refere-se à capacidade do método de gerar resultados linearmente proporcionais
à concentração do analito, enquadrados em faixa analítica especificada.

Sensibilidade
A sensibilidade é a capacidade do método em distinguir, com determinado nível de confiança,
duas concentrações próximas.

Exatidão
A exatidão representa a concordância entre o valor real do analito na amostra e o estimado
pelo processo analítico.

Precisão
Representa o parâmetro responsável pela avaliação da proximidade entre várias medidas
efetuadas na mesma amostra

Limite de detecção
O limite de detecção representa a menor concentração do analito que pode ser detectada,
mas não necessariamente quantificada, sob condições experimentais estabelecidas.

Limite de quantificação
O limite de quantificação é definido como a menor concentração do analito, que pode ser
quantificada na amostra, com exatidão e precisão aceitáveis, sob as condições experimentais
adotadas.

Robustez
A robustez é a medida da capacidade do método de permanecer inalterado sob pequenas, mas
estudadas, variações nos seus parâmetros e prover indicação da sua dependência durante o
uso normal.

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ETAPAS DA ANÁLISE QUANTITATIVA

CLASSIFICAÇÃO DOS MÉTODOS PARA ANÁLISE

QUÍMICA QUANTITATIVA
MÉTODOS TRADICIONAIS OU “CLÁSSICOS”
Baseiam-se no acompanhamento quantitativo de reações químicas.

Quando o número de amostras é pequeno como, por exemplo, no caso de uma análise
eventual, são comumente preferíveis.

Ao contrário do que ocorre com os métodos instrumentais, o equipamento não requer

recalibração constante.

São relativamente baratos, com baixo custo unitário por determinação.

São menos sensíveis dos que os métodos instrumentais

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São frequentemente menos seletivos do que os métodos instrumentais.

Quando muitAs determinações semelhantes devem ser feitas, a análise com métodos
instrumentais é normalmente mais rápida do que com métodos clássicos, que exigem grande
volume de trabalho.

Métodos Gravimétricos (ou Gravimetria): determinam a massa do analito ou de algum

composto a ele relacionado.

Métodos Titrimétricos (também denominados métodos volumétricos): são baseados na

medida do volume de solução contendo reagente em quantidade suficiente para reagir com
todo analito.

MÉTODOS INSTRUMENTAIS
Requerem o uso de um instrumento apropriado para serem aplicados.

Mais rápidos e aplicáveis em concentrações muito pequenas para serem determinadas por
métodos clássicos.

Os equipamentos de medida podem ser acoplados a microcomputadores e com o auxílio de

mecanismos apropriados o processo analítico pode ser completamente automatizado.

Muitos instrumentos têm custo elevado.

Os equipamentos requerem calibração usando uma amostra de material de composição

definida como referência.

A obtenção de resultados acurados requer reagentes cuidadosamente pesados e o preparo de

soluções padrões.

Ideais para a determinação rotineira de muitas amostras.

Exemplos:

1. Espectroscopia molecular UV-visível;

2. Espectrometria de absorção atômica com chama;

3. Potenciometria;

4. Cromatografia líquida de alta resolução, entre outros.

FATORES DE ESCOLHA DO MÉTODO ANALÍTICO

Tipo de análise requerido: elementar ou molecular, de rotina ou eventual;

Interferência de outros constituintes do material;

Faixa de concentração a ser analisada;

A acurácia (ou exatidão) necessária;

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Facilidades disponíveis, particularmente em termos de instrumentos;

O tempo necessário para completar a análise;

O número de análises do mesmo tipo que deve ser efetuado.

Interpretação dos exames toxicológicos

Em se tratando de provas periciais, a correta identificação da substância detectada e a
avaliação quantitativa são, em muitos casos, essenciais para a detecção de contaminantes que
possam contribuir para a obtenção de falsos resultados positivos ou negativos.

A interpretação dos resultados é vista como outro passo importante; onde devem ser
considerados fatores como a dose e via de administração, efeitos aditivos devido a associação
com outras substâncias, patologias existentes e idiossincrasias.

A resposta do organismo a um determinado tóxico depende da sua concentração no

órgão alvo - afinidade da substância a determinado sítio - e do seu mecanismo de ação. Há,
portanto que correlacionar exposição, dose e resposta. Para isso, é importante conhecer a
toxicocinética das substâncias no organismo: absorção, distribuição,
metabolização e eliminação.

A cinética do toxicante influencia na extensão da resposta farmacológica, sendo

importante na apreciação dos dados analíticos obtidos.

Em toxicologia, o processo de biotransformação assume especial interesse, dado que os

tóxicos são geralmente agentes xenobióticos, e, portanto, susceptíveis a sofrer alterações
metabólicas no organismo, o que pode resultar na produção de metabólitos, que muitas vezes
são responsáveis pelo efeito letal ao organismo.

Outros fatores como genética da vítima, idade, sexo, e outros tais como dieta são
também fundamentais, pois podem afetar a exposição e a dose, através de alterações na
absorção, distribuição ou metabolismo.

Não basta, portanto, identificar uma substância com relevância toxicológica, mas é
essencial interpretar adequadamente os dados obtidos face às variáveis envolvidas. Até
porque, descobrir seu significado (interpretar o resultado analítico) pode estar além do
encontrado no laboratório.

Ademais, a interpretação dos resultados obtidos freqüentemente depende das

informações coletadas na perinecroscopia e necroscopia. Portanto, fica caracterizada a
necessidade de trabalho em conjunto de todos os profissionais da Polícia Civil.

ASPECTOS FISIOLÓGICOS DE RELEVÂNCIA TOXICOLÓGICA

 CINÉTICA DAS SUBSTÂNCIAS NO ORGANISMO
o Concentração na amostra vai depender da fase cinética em que a substância
se encontrava no momento da amostragem
 VALORES DE REFERÊNCIA

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o Embora seja bastante comum que se questione sobre isso em quesitos oficiais,
não existem valores estabelecidos de doses ou concentrações letais em seres
humanos. O que existe na literatura são relatos de casos nos quais se
descrevem as concentrações das substâncias encontradas em periciados cuja
morte foi atribuída à intoxicação..
 TOLERÂNCIA
o Indivíduos que desenvolveram tolerância farmacodinâmica a uma substância
podem apresentar níveis altíssimos da mesma no sangue sem que isso
ocasione a ocorrência de efeitos tóxicos pronunciados.
 NÍVEIS SANGUÍNEOS, SÉRICOS E PLASMÁTICOS
o A diferença entre essas matrizes ocorre porque a distribuição das substâncias
dentro do sangue pode não ser homogênea entre suas frações líquidas e
plasmáticas.
 ACUMULAÇÃO NOS TECIDOS

ASPECTOS POST-MORTEM DE RELEVÂNCIA TOXICOLÓGICA

 Degradação de substâncias de interesse
o Metabolismo de microrganismos e fatores ambientais, como temperatura e
umidade
 Formação de interferentes
o Mais comuns: etanol e anfetamínicos
 Procedimentos usados nos processos para conservação de cadáveres, como
embalsamento e tanatopraxia podem diluir ou extrair os compostos de interesse,
impedindo a detecção ou alterando suas concentrações.
o Formol é altamente reativo
 Muita putrefação  humor vítreo é recomendado
 Etanol: aumento da permeabilidade gástrica após a morte e consequente difusão a
partir do estômago para o sangue cardíaco e outros tecidos adjacentes.
 Alteração da ligação de drogas às proteínas plasmáticas
 Sangue das veias femorais e humor vítreo são os locais menos suscetíveis à
redistribuição post mortem.

RESULTADOS QUALITATIVOS VS QUANTITATIVOS

 Não detectar não significa necessariamente a ausência das substâncias pesquisadas,
uma vez que as metodologias empregadas podem não ser capazes de detectar
algumas substâncias específicas ou, se o fazem, apresentam um limite de detecção
que as impede de detectar níveis inferiores.
 Resultados falso negativos também podem ocorrer devido à degradação da substância
eventualmente presente na amostra analisada, o que pode se dar por conservação
inadequada da amostra ou por fenômenos putrefativos.

CONSIDERAÇÕES POR TIPO DE AMOSTRA

 SANGUE
o Maior parte dos valores de referência disponíveis foram obtidos neste fluido

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o Principalmente coleta de sangue da veia femoral – contorna os problemas de

redistribuição post mordem e de drenagem de sangue de outras regiões que
não a de interesse
 Principal desvantagem: limitação da quantidade de material
o Cuidado na preservação de amostras – principalmente com relação a
metabólitos instáveis
 Cocaína – pode ser convertida em seus metabólitos benzoilecgonina e
éster metilecgonina
 Essa conversão pode ser minimizada pela coleta da amostra de
sangue com fluoreto de sódio, que inibe a conversão da
cocaína a éster metilecgonina pela enzima sanguínea
butirilcolinesterase.
 O congelamento da amostra também é crucial, uma vez que
inibe a atividade da butirilcolinesterase, a conversão não
enzimática e ainda a atividade de metil-esterases, enzimas
presentes no sangue que convertem a cocaína em
benzoilecgonina.
 LSD e anti-hipertensivos bloqueadores de canais de cálcio – são
sensíveis à luz e exigem a coleta em frascos não transparentes.
 Benzodiazepínicos – podem ser degradados caso a temperatura seja
maior que -20ºC.
o FÍGADO
 Quando a coleta de sangue não foi possível
 Antidepressivos tricíclicos e fenotiazinas
 Substâncias que apresentam alto grau de ligação às suas proteínas e
de solubilidade em lípides – tendem a se concentrar no tecido
hepático.
 Propenso à sofrer difusão post mortem devido à sua proximidade com
o estômago
 Coleta do lobo direito – localiza-se distalmente ao estômago
o URINA
 Concentrações variam enormemente em função de fatores como
desidratação, ingestão de água, pH da urina e taxa de metabolismo,
não sendo possível (com raras exceções) fazer correlação com a
concentração sanguínea
 Outra limitação é que os metabólitos detectados muitas vezes não são
exclusivos de uma única substância, podendo ser produtos de
biotransformação comuns a outros compostos do mesmo grupo
 Isoladamente, é pouco útil para fazer inferências relativas à
recenticidade da administração da substância, correlacionar os níveis
urinários com os níveis sanguíneos ou estimar a intensidade do efeito
por ela gerado no organismo.
 Resultados podem orientar as análises nas demais matrizes, e podem
ser significativos quando interpretados em conjunto com os resultados
obtidos nos outros tipos de amostra.
o ESTÔMAGO E CONTEÚDO GÁSTRICO

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 A administração de várias unidades de comprimidos ou outra

formulação sólida propicia a formação de grumos no estômago que
não são facilmente dispersos e dissolvidos.
 Deve-se considerar ainda que a ocorrência de vômitos é muito comum
em intoxicações, o que também pode levar a um esvaziamento
gástrico.
o HUMOR VÍTREO
 Muito pouco propensa a sofrer difusão post mortem
 Análise ainda restrita devido à carência de estudos
o CABELO
 Coleta simples, não invasiva, de difícil adulteração
 Não são necessárias condições especiais de transporte e
armazenamento, pois as amostras de cabelo são estáveis por um
longo período de tempo
 Grande janela de detecção dos analitos
 A concentração de melanina é determinante no acúmulo de fármacos
no cabelo – cabelos negros e grossos acumulam mais que os finos e
loiros
 Tratamentos capilares causam danos no cabelo e podem influenciar a
estabilidade dos analitos, modificando a concentração da droga
incorporada

QUANDO QUANTIFICAR
o A quantificação dos agentes tóxicos é importante em casos de intoxicações ou
envenenamentos acidentais ou em casos de tentativa ou “sucesso” de suicídio
ou homicídio para se verificar se os valores encontrados na vítima estavam
acima dos valores de referência preconizados ou se ultrapassavam muito esses
valores, se aproximando de uma dose letal.

Álcool
o Dosagem (quantificação) de álcool no sangue também é importante para os
casos de enquadramento nas leis de trânsito (acima de 6 dg/L tem implicações
penais) ou pessoas envolvidas em acidentes de trânsito (tanto vítimas quanto
causadores do acidente) para.
o Álcool em urina também pode ser avaliado, mas de forma qualitativa

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Monóxido de carbono
o Quantificação dos níveis de carboxiemoglobina no sangue também são úteis
para ajudar na elucidação da causa da morte (se pode ser sido por asfixia ou
algum outro motivo).

Nitrito/nitrato
É importante quantificar no para diferenciar valores basais (pois ingerimos em alimentos
embutidos) de valores tóxicos. No sangue, quantifica-se o nitrato, pois o nitrito é convertido a
nitrato após absorvido.

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Em amostras de conteúdo gástrico, avalia-se qualitativamente o nitrito.

Cocaína
Se a concentração encontrada no sangue for muito alta, pode-se fazer a quantificação
para se avaliar a possibilidade de morte por overdose de cocaína.

Outras substâncias
Quantificação pode ser feita pedido do médico legista, dos quesitos formulados no
pedido de perícia ou a critério do perito.

Principais metabólitos

COMBUSTÃO DO CRACK  ANIDROECGONINA METIL ESTÉR

COCAÍNA  BENZOILECGONINA – extração em fase sólida com coluna mista (tem

propriedades anfóteras)

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9THC – hidrólise para remover o ácido glicurônico, acidificação do meio para neutralização do
grupo carboxilato, extração com solventes orgânicos apolares (como o hexano).

HIDRÓLISE do ácido glicurônico!

Laudo
Elaborar laudo que contenha, além dos resultados qualitativos e quantitativos,
informações referentes aos métodos de análise utilizados, no que diz respeito à critério de
qualidade laboratorial, sensibilidade, especificidade e reprodutibilidade do ensaio.

Interpretar os achados laboratoriais, levando em consideração o tipo de substância

envolvida na intoxicação, sua concentração no material biológico analisado e qual seria a
relação desta concentração com alterações de comportamento ou do estado de saúde do
indivíduo; 8. Fornecer informações com relação a possível dose administrada, a via de
introdução utilizada, a freqüência de uso ou outros fatores relacionados à exposição (estas
informações devem ser embasadas principalmente na toxicocinética e toxicodinâmica da
substância encontrada).

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