UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA JLIO DE

MESQUITA FILHO
Instituto de Biocincias de Botucatu
Departamento de Fsica e Biofsica
Laboratrio de Biologia Molecular Estrutural

Estudos Estruturais de
protenas
Me. Lino Fernando Gomes de Lima
Agosto - 2014

Tpicos a serem abordados

Cristalografia
Dicrosmo

de protenas

Circular (CD)

Espalhamento

Dinmico da luz (DLS)

Espalhamento

de Raios-X a baixo ngulo

(SAXS)

Cristalografia de protenas
Clonagem, expresso e purificao da
protena alvo recombinante ou
purificao da protena alvo nativa
Obteno de cristais convenientes para
difrao de raios-X
Coleta de dados de difrao de raios-X
Processamento dos dados de difrao de
raios-X e caracterizao inicial dos
cristais
Resoluo do problema das fases
Mtodos :MR ,MAD, MIR
Refinamento/Modelagem
Anlise da qualidade do modelo
Modelo final

Por que estudar cristalografia de

protenas??
Principais

componentes
catalisadores dos seres vivos;

Funo

estruturais

relacionada a estrutura;

Conhecer

o mecanismo de ao;

Identificar

stios de inibio;

Desenvolvimento

de frmacos (Drug Design).

 Principal

tcnica utilizada para a

resoluo de estrutura de protenas
(90 % das estruturas de protenas
depositadas no Protein Data Bank
[PDB]);

www.pdb.org;
Fazer

figuras bonitas pro Lehninger!

Obteno de material a ser

cristalizado
Alto grau de pureza (>95%)

Diretamente da sua
origem

Expresso de protenas
recombinantes

Obteno de cristais
(Cristalizao de protenas)

Metodos de cristalografia
Como

uma protena cristaliza?

Cristal: Fase slida de uma protena e

formada quando sua solubilidade em uma
dada soluo excedida.

Solues supersaturadas (10-12 mg/mL)

O sistema caminha ao equilbrio e a protena fica entre uma fase

slida e uma fase solvel. Estas condies favorecem novas
ligaes qumicas e estveis.

 Etapas

para o crescimento de cristais:

Nucleao,
Crescimento
e
Cessao
do
crescimento.

Protenas

cristalizam porque sua energia livre

diminui com o aumento de interaes
favorveis.

Cristais

apresentam ordem em sua estrutura

interna e possuem arranjo peridico (retculo e
empacotamento cristalino).

Mtodo de difuso de vapor

Parmetros que influenciam

processo de cristalizao:
1)

Amostra protica:

- Pureza
- Concentrao
- Presena de ligantes
2)Soluo

cristalizao:
- Tipo de precipitante;
Concentrao
precipitante;
- Fora inica;
- pH;
- Aditivos e outros.

3)

Parmetros
ambiente:

o
do

- Temperatura;
- Presso;
- Gravidade.

de

do

4)

Mtodo
cristalizao:

de

- Razo do equilbrio;
- Volumes da gota e do
reservatrio.

Avaliao dos experimentos de

cristalizao

Coleta de dados

LNLS

Coleta de dados de difrao de

Raios-X

Processamento dos dados de difrao:

Resoluo do problema da fase

1
( xyz ) F (hkl ) exp(i ) exp 2i (hx ky lz )
V h k l

Rede de Bravais ndice de Miller

Eixos e ngulos interaxiais

ngulo entre b e c
ngulo entre a e c
ngulo entre a e b

Escolher melhor modelo para substituio

molecular
Substiuio Molecular
Refinar a estrutura

- encaixar resduos na densidade eletrnica

Analisar Modelo Final
- estereoqumica

Substituio
(MIR)

isomrfica

mltipla

Fator

R (work
e free)

Arquivo PDB (Protein Data Bank)

REMARK
CRYST1
ORIGX1
ORIGX2
ORIGX3
SCALE1
SCALE2
SCALE3
ATOM
ATOM
ATOM
ATOM
ATOM
ATOM
ATOM
ATOM
ATOM
ATOM
ATOM
ATOM
ATOM
ATOM
ATOM
ATOM
ATOM
ATOM
ATOM
ATOM
ATOM
.....
......
ATOM
ATOM
ATOM
ATOM

Sun Feb 25 14:05:51 1996

72.307
73.069
54.284 90.00 90.00
1.000000 0.000000 0.000000
0.000000 1.000000 0.000000
0.000000 0.000000 1.000000
0.013830 0.000000 0.000000
0.000000 0.013686 0.000000
0.000000 0.000000 0.018422
1 CB MET
1
103.933 112.272
2 CG MET
1
104.548 112.540
3 SD MET
1
106.336 112.671
4 CE MET
1
106.542 114.250
5 C
MET
1
103.199 114.420
6 O
MET
1
102.995 114.577
7 HT1 MET
1
102.092 112.026
8 HT2 MET
1
100.857 112.905
9 N
MET
1
101.710 112.330
10 HT3 MET
1
101.467 111.494
11 CA MET
1
102.732 113.140
12 N
GLU
2
103.906 115.275
13 H
GLU
2
104.333 114.933
14 CA GLU
2
104.085 116.695
15 CB GLU
2
104.531 117.459
16 CG GLU
2
103.464 117.597
17 CD GLU
2
103.286 116.347
18 OE1 GLU
2
102.216 115.703
19 OE2 GLU
2
104.183 116.042
20 C
GLU
2
105.065 117.015
21 O
GLU
2
104.918 118.030

90.00
0.00000
0.00000
0.00000
0.00000
0.00000
0.00000
94.785
96.126
95.934
95.159
93.762
92.561
92.841
93.606
93.759
94.328
94.479
94.503
95.316
94.178
95.428
96.515
97.374
97.266
98.197
93.046
92.386

1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00

50.37
55.72
62.79
54.71
47.20
51.55
0.00
0.00
48.54
0.00
47.79
44.44
0.00
40.49
43.49
52.62
53.08
57.29
54.12
35.47
35.53

6
6
16
6
6
8
1
1
7
1
6
7
1
6
6
6
6
8
8
6
8

2807
2808
2809
2810

68.955
69.904
67.984
67.550

1.00
1.00
1.00
1.00

61.06
59.28
66.73
67.00

6
6
6
8

CD1
CD2
C
O

LEU
LEU
LEU
LEU

298
298
298
298

103.557
101.503
99.298
99.829

107.255
106.167
109.657
110.678

Unidades =10 m

-10

Refinamento cristalogrfico
N

F (hkl ) f j exp 2i (hx j ky j lz j )

j 1

REMARK Written by O version 5.10.2

REMARK Sun Feb 25 14:05:51 1996
REMARK Walter F. de Azevedo Jr.
CRYST1
72.307
73.069
54.284 90.00 90.00
ORIGX1
1.000000 0.000000 0.000000
ORIGX2
0.000000 1.000000 0.000000
ORIGX3
0.000000 0.000000 1.000000
SCALE1
0.013830 0.000000 0.000000
SCALE2
0.000000 0.013686 0.000000
SCALE3
0.000000 0.000000 0.018422
ATOM
1 CB MET
1
103.933 112.272
ATOM
2 CG MET
1
104.548 112.540
ATOM
3 SD MET
1
106.336 112.671
ATOM
4 CE MET
1
106.542 114.250
ATOM
5 C
MET
1
103.199 114.420
ATOM
6 O
MET
1
102.995 114.577
ATOM
7 HT1 MET
1
102.092 112.026
ATOM
8 HT2 MET
1
100.857 112.905
ATOM
9 N
MET
1
101.710 112.330
ATOM
10 HT3 MET
1
101.467 111.494
ATOM
11 CA MET
1
102.732 113.140
ATOM
12 N
GLU
2
103.906 115.275
ATOM
13 H
GLU
2
104.333 114.933
ATOM
14 CA GLU
2
104.085 116.695
ATOM
15 CB GLU
2
104.531 117.459
ATOM
16 CG GLU
2
103.464 117.597

90.00
0.00000
0.00000
0.00000
0.00000
0.00000
0.00000
94.785
96.126
95.934
95.159
93.762
92.561
92.841
93.606
93.759
94.328
94.479
94.503
95.316
94.178
95.428
96.515

1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00

50.37
55.72
62.79
54.71
47.20
51.55
0.00
0.00
48.54
0.00
47.79
44.44
0.00
40.49
43.49
52.62

6
6
16
6
6
8
1
1
7
1
6
7
1
6
6
6

Mtodos Diretos
MAD
2 a 3 comprimentos de onda
Metionina mutada para selnio-metionina

MIR
Uso de 2 tomos pesados
nico comprimento de onda

E se os
crescer...

cristais

no

querem

Tpicos a serem abordados

Cristalografia
Dicrosmo

de protenas

Circular (CD)

Espalhamento

Dinmico da luz (DLS)

Espalhamento

de Raios-X a baixo ngulo

(SAXS)

Dicrosmo Circular (CD)

Diferena de absoro da luz circularmente polarizada

esquerda e direita: CD = AE AD

til para o estudo de molculas quirais Unidades opticamente

ativas Alterao na luz circularmente polarizada incidente.

A tcnica de CD detecta exatamente a alterao atravs da

medida da diferena da absoro da luz circularmente
polarizada esquerda e direita, aps a luz passar pela
amostra.

Composio de estrutura secundria de protenas (-hlice e

conformaes )

Preparao
da
amostra
Problema dos tampes

Preparao
da
amostra
Problema dos tampes

Preparao
da
amostra
Concentrao de protena

Aplicaes

Enovelamento de Protenas

Comparao de estruturas
- Protenas obtidas de diferentes fontes
- Mutantes de uma mesma protena
- Controle de qualidade de protenas Estrutura secundria

Estabilidade Trmica e Qumica

- pH
-T
- Desnaturantes

Mudanas conformacionais e ensaios de interao

- Interaes protena-protena
- Interaes protenas-ligantes

Tpicos a serem abordados

Cristalografia
Dicrosmo

de protenas

Circular (CD)

Espalhamento

Dinmico da luz (DLS)

Espalhamento

de Raios-X a baixo ngulo

(SAXS)

Espalhamento
(DLS)
Movimento

Dinmico

da

luz

Browniano:

- Movimento aleatrio de partculas em soluo

- A Energia cintica envolvida nos encontros Brownianos
entre as partculas dirige a diluio das solues.
Difuso

translacional

- Movimento da partcula na soluo

Difuso

rotacional

- Movimento da partcula entorno de seu eixo

O DLS investiga a correlao de ftons: Metodologia para determinao

do D de partculas homogneas

Molculas em movimento browniano causam flutuaes

espalhada devido a interferncias construtivas e destrutivas.

Essas flutuaes ocorrem em escalas de tempo relacionadas com a

velocidade de movimento das molculas, e portanto, dependem de seu
tamanho e forma.

A coleta dos ftons em janelas de tempo, ou canais e subseqente

anlise (auto-correlao) destes dados nos fornece o D.

A partir do D, pode-se calcular o RH usando a equao de StokesEinstein:

na

luz

Como funciona o DLS

Um
laser
minsculo
(muito colimado) de
estado slido emite
uma
luz
monocromtica que
atravessa um porta
amostra de quartzo.
A luz espalhada em
todas
as
direes
pelas partculas em
soluo.
Os ftons espalhados a
90 so coletados por
uma pequena lente
que a transmite a um
fotodiodo por meio
de uma fibra tica.

As flutuaes da luz espalhada (espalhamento Raylegh)

constante

Observando um pequeno elemento de volume

O nmero de macromolculas neste V flutua com o tempo devido

Difuso

 Num

experimento DLS, os ftons detectados so

transformados num sinal eletrnico, basicamente
1 ou 0 dependendo se o fton foi ou no
detectado num certo intervalo de tempo gera
um grfico de Intensidade [g(t)] versus tempo
[t].

sinal analisado por uma funo de autocorrelao, que a convoluo do sinal da

intensidade em funo do tempo com ela mesma.

Aplicaes
Coeficiente
Raio

de difuso, D

hidrodinmico, RH

Tamanho

e dimenses/forma da partcula

Poli-dispersividade
Concentrao
Presena

(Biomassa)

de contaminantes

Mudanas
M

e distribuio de tamanho (sem soluo nica)

conformacionais, mobilidade

para uma partcula de mesmo RH

Oligomerizao MjTX-I
R (nm)

MW R (kDa)

% Pd

% Mass

Water

2,1

19

16,5

99,6

0,5 mM

2,1

19

19,3

99,4

0,5 mMa

2,7

33

37,6

99,8

2,0 mM

1,9

15

17,6

99,8

2,0 mMa

2,8

37

32,3

99,3

10 mM

1,9

15

15,8

99,8

10 mMa

2,8

37

28,6

99,8

20 mM

3,7

71

25,3

97,6

After two hours of Tris HCl addition

Tpicos a serem abordados

Cristalografia
Dicrosmo

de protenas

Circular (CD)

Espalhamento

Dinmico da luz (DLS)

Espalhamento

de Raios-X a baixo ngulo

(SAXS)

Espalhamento de Raios-X a baixo

ngulo (SAXS)

O espalhamento de raios X a baixo ngulo um processo

de espalhamento elstico que ocorre quando o feixe de
raios X atravessa a amostra e interage com os eltrons do
material.

A radiao reemitida pelos eltrons de cada tomo

espalhada isotropicamente e as ondas espalhadas
interferem umas com as outras se cancelando totalmente
em algumas direes.

A curva de espalhamento em funo do ngulo decresce

suavemente medida que o ngulo aumenta

Supondo que os centros espalhadores (amostra) esto no

vcuo, a amplitude de espalhamento proporcional ao
nmero de mols de eltrons por unidade de volume, ou
seja, densidade eletrnica.

Se os centros espalhadores esto imersos em outro meio,

apenas a diferena de densidade eletrnica ser relevante
no espalhamento de raios X. Neste caso, os centros
espalhadores so vistos como inomogeneidades, ou seja,
flutuaes na densidade eletrnica da amostra.

A tcnica de espalhamento de raios X a baixo ngulo

fornece informaes estruturais sobre inomogeneidades de
densidade eletrnica com dimenses caractersticas de dez
a algumas centenas de ngstrm.

Obrigado!!