A UTILIZAO DA TECNOLOGIA DE

CRISPR-CAS9 COMO ALTERNATIVA

PARA O TRATAMENTO DA DMD

Ana Carolina Carvalho

Silva
Fernanda Chacon
Cavalcante
Filipe Fideles Duarte
Andrade

CRISPR
Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats

RepetiesPalidrnicas Curtas Agrupadas e Regularmente

Interespassadas
Ferramenta de edio de genoma;
Adaptado do sistema imunolgico bacteriano;

CRISPR- cas 9 em Bactrias

Fonte: Prashant et al 2013

CRISPR- cas 9 em Bactrias

Fonte: Prashant et al 2013

Mecanismo
de CRISPR Cas 9
Histrico
...

Fonte: Doudna and Chaepentier, 2014 (Adaptado)

Mecanismo de CRISPR Cas 9

O reconhecimento do alvo requer tanto o pareamento
com sgRNA quanto a presena de PAM;
PAM critica para a ligao inicial ao DNA;
Cada cas9 tem um requerimento diferente de PAM (NAG
e NGG).

CRISPR

Fases G1,
S, G2

Fases S e
G2
Dificuldade
de
edio
gnica
baseada em HDR
em tecidos psmitticos.
Fonte: Y. Mei et al, 2016
(Adaptado)

CRISPR
Comparao com Outras Tecnologias de Edio
de Genoma
Vantage
ns

Facilidade de customizao;
Padro de clivagem (3bp 5 de
PAM);
Possibilidade de experimentos
multiplex;
Eficincia pode atingir 80%.

Limita
es

Necessidade PAM 3 da
sequncia alvo;
Mutaes off-target.

Fonte: Hsu, Lander e Zhang,

2014.

CRISPR

Aplicaes

CRISPR
Aplicaes
Regular o nvel de transcrio;
Marcao multicolor de loci
cromossmicos.

Fonte: Doudna e Charpentier,

CRISPR
Aplicaes

Distrofia Muscular de Duchenne (DMD)

a forma mais comum e severa de distrofia
Causada por uma mutao no gene da distrofina
no cromossomo X;
1 em cada 3.500 nascimentos de meninos;
Caracterizada pela progressiva e irreversvel
degenerao
da
musculatura
esqueltica,
resultando
e
uma
fraqueza
muscular
generalizada e cardiopatias;
Primeiros sintomas 3 a 5 anos .

Fonrapiadoesporte.comtene

Fonte: Gentica Molecular Humana, 4

edio

Distrofia Muscular de Duchenne (DMD)

Distrofia Muscular de Duchenne (DMD)

A distrofina

Associado a
actina

Associados a matriz
extracelular

Distrofia Muscular de Duchenne (DMD)

Histrico

Histrico

Mioblastos
imortalizados

Histrico
Problemas no Uso do Adenovrus
como Vetor:
Grande para atravessar a matriz
extracelular;
Escassez de receptores para
adenovrus em clulas musculares;
Imunogenicidade.

Objetivo
Corrigir mutaes do gene da Dmd atravs
da tcnica CRISPR-cas9 mediado pelo
reparo de juno de pontas no homlogas
(NHEJ) em tecidos musculares ps-natais
utilizando o vetor AAV9.

Modelo mdx
Apresentam cdon de parada
prematuro no xon 23;
um dos modelos mais
utilizados para estudo da DMD;
Fonte: Joe W. McGreevy et al,2015

Vetor AAV
AAV um vrus no-patognico;
Capacidade de empacotamento: 5kb;
Imunogenicidade muito baixa;
AAV-9 apresenta alto tropismo por tecidos musculares.

Estratgia do Estudo

Validao

Fonte: thermofischer.com

Fonte: soquimica.pt

Validao

Fonte: icb.usp.br

Transfeco
(cas9) e sgRNA

Seleo e expanso
das clulas
transfectadas

Extrao de DNA
e
amplificao
por PCR

Anlise do produto
por digesto com
T7E1

Validao

Experimentos em Zigoto mdx

Experimentos em Zigoto mdx

PCR e
Sequenciamento

Experimentos em Zigoto mdx

Anlise
Histolgica

Experimentos em Zigoto mdx

Anlise Funcional

Fonte: bioseb.com

Experimentos em Zigoto mdx

Avaliao de alvos
inespecficos

Experimentos em Camundongo mdx

Vetor AAV para Expresso de Cas9, sgRNA e GFP

Experimentos em Camundongo mdx

Diferentes Modos de Entrega do
Vrus AAV

Experimentos em Camundongo mdx

Resgate da Expresso de Distrofina por Injeo IM

Imunocolorao
avaliou expresso da
distrofina;
Hematoxilina e eosina
(H&E)
carctersticas
histopatolgicas dos
tecidos da distrofina;
Miofibras
necrticas
foram diminudas.

Experimentos em Camundongo mdx

RT-PCR do RNA de Camundongos Injetados RO e
Sequenciamento

Experimento em Camundongo mdx

Resgate da Expresso de Distrofina por Injeo RO

Experimentos em Camundongo mdx

Resgate da Expresso de Distrofina por Injeo IP

Experimentos em Camundongo mdx

Medida da Fora do Camundongos Injetados por IP

Resultados
A expresso de distrofina foi restabelecida em clulas
do msculo liso por todas as vias, mais efetivamente
por RO;
Incapacidade de restabelecimento da expresso de
distrofina no hipocampo;
Ausncia de evidncias de mutaes inespecficas.

Discusso
Aumento progressivo do nmero de fibras distrofinaspositivas
expresso persistente da maquinaria de
edio;
Mesmo aumentos pequenos na expresso de distrofina
podem melhorar a cardiopatia;

Discusso
Qualquer INDEL que interfira com um stio
aceptor ou aceptor de splicing resultar em
exon skipping;
NAG a sequncia consenso de aceptor de
re
a
splicing e tambm a sequncia PAM para
r
Pa
spCas9.

m
e
l

.r ..
a
r
b

Fonte: Human genetics, 4th edition

Fonte: Gentica Molecular Humana, 4

Perguntas
1) Sobre o sistema de reparo HDR e NHEJ possvel
afirmar, exceto:
a) O mecanismo de reparo NHEJ expresso
principalmente nas fases G1, S e G2
b) O mecanismo de reparo NHEJ propenso a erros e
frequentemente levam mutaes de insero ou
deleo
c)O reparo por HDR ocorre prioritariamente no final da
fase s e durante a fase G2
d) Clulas altamente diferenciadas utilizam

Perguntas
2) Qual a funo das PAM? Assinale as alternativas
corretas:
a)So espaadores no DNA.
b)Responsveis pelo reconhecimento de self e no self.
c) Presente somente em bactrias
d)Sequncia de reconhecimento de cas9

Perguntas
3) A distrofia muscular de Duchenne est entre as doenas genticas mais
prevalentes, ocorrendo em 1 a cada 3500 indivduos do sexo masculino.
Esta forma de distrofia severa e resulta em degenerao muscular
progressiva e falecimento precoce. Em contraste, a distrofia de Becker
uma forma de distrofia com sintomas mais brandos e sobrevida maior.
Ambas as doenas so causadas por mutaes no gene que codifica a
distrofina (Nelson et al. 2016 adaptado). Sobre essas doenas incorreto
afirmar:
a) Aproximadamente 2/3 das mutaes em ambas as distrofias so
causadas por delees em um ou mais xons do gene que codifica a
distrofina
b) As delees presentes na distrofia muscular de Becker no produzem
alteraes na matriz de leitura
c) As delees na distrofia muscular de Duchenne resultam em uma
mudana na matriz de leitura

Perguntas
4) Um dos problemas associados utilizao da tcnica
de CRISPR a possvel ocorrncia de mutaes em stios
que no so o stio alvo primrio do desenho do
pesquisador. So ferramentas para verificao ou
predio da ocorrncia de mutao off-target, com
exceo de:
a) Sequenciamento
b) Ensaio com a enzima T7E1
c) Programas de predio in silico
d) PCR em tempo real

Perguntas
5) So vantagens do CRISPR, exceto:
A) Fcil customizao
B) Alta eficincia
C) Padro de clivagem reconhecido
D) Necessidade da presena de PAM

Fonte: An introdution to genetic analysis, 8th

Edition

NHEJ e HDR

NHEJ
HDR