Espectrometria de Massas

O que é espectrometria de massas?

É uma técnica analítica potente usada para identificar produtos

desconhecidos, para determinação quantitativa de compostos e
esclarecer propriedades estruturais e químicas das moléculas
 Definição
A espectrometria de massas baseia-se na formação de
íons dos analitos, em fase gasosa, para posterior
separação dos mesmos em função da relação m/z;

 Pode ser empregada sozinha ou como um detector para

as técnicas de separação (cromatográficas ou
eletroforéticas);

 Suas principais características são: rapidez,

sensibilidade, abrangência, facilidade de uso, seletividade e
diversidade de instrumentação.
 Perspectiva Histórica

• Goldstein – 1886
– Existência de Partículas com Cargas Positivas

• Wein – 1898
– Íons com Cargas Positivas podem ser Defletidos em um campo
Elétrico ou Magnético

• J.J. Thomson – 1913

– Demonstração dos Isótopos de Neon
– “Pai da Espectrometria de Massas“

• Primeira Interface GC-MS - 1960’s

• Desenvolvimento da Primeira Interface LC-MS - 1969

– 1uL/min de vazão numa fonte de EI

• Aplicação para LC/MS - 1970’s

– Perda de compostos voláteis
– Perda de composto termicamente reativos
 Perspectiva Histórica

• Ganho de popularidade do Thermospray (TSI) - 1983

– 1.0 – 1.5 mL/min
– Fases móveis constituídas de tampão aquoso

• Atmospheric Pressure Interfaces (API)

– meados 1990’s (inicio comercialização)

• Electrospray (ESI)
– Trabalho iniciais com vazões baixas (1-5 uL/min)
– Capacidade de produzir moléculas multicarregadas

• Atmospheric Pressure Chemical Ionization (APCI)

– Similar ao Thermospray
– Ionização do solvente dopante
 Quando Usar Espectrometria de Massas?

• EM é um detector universal para Cromatografia e Eletroforese Capilar

•Alta sensibilidade (baixos limites de detecção) (~10–12 gramas)

•Confirmação da presença do analito (massa molar e informação

estrutural)

• Alta seletividade (possibilidade de analise de compostos com picos

sobrepostos, Co-eluições Cromatográficas)

• Identificação de Compostos

• Alto Grau de Especificidade

Massa do analito de interesse = Σ massas atômicas elementos.
 Instrumentação

Analisador

Direto EI Q Multiplicador de e–
GC CI IT
HPLC APCI LIT
CE APPI TOF
MALDI
 Resumo do processo MS-

ionização
m/z 29
Ion com massa 57
m/z 57
análise de massa de todos os íons
m/z 27

+
aquisição de dados
gráfico de barras

M M 29
57

amostra 15
43
m/z 15
m/z 58
e absorção de m/z 43
excesso de energia Decomposição m/z

-
unimolecular de M+ Espectro de massa

Ion com massa 59

M MS+

Na fonte de íons, os componentes de uma amostra são convertidos em íons, pela ação de
um agente ionizante, os íons positivos ou negativos são imediatamente acelerados em
direção ao analisador de massa.

A função do analisador de massas é separar tais íons de acordo com a sua relação massa-
carga (m/z).

Um detector recebe os íons que foram separados pelo analisador, transformando a

corrente de íons em sinais elétricos que são processados.
 Esquema de um espectrômetro de massas

Fonte de íons Analisador

Detector
de massas

Bomba de vácuo

Tratamento de dados Processador

de sinais
amostras

m/z

Espectro de massa
 Seleção da Interface

LC
muito polar Eletrospray

APCI/APPI

EI

pouco polar CG

CG
muito volátil pouco volátil

CG LC
IONIZAÇÃO

Transferência de energia para analito.

O requisito básico para uma análise por espectrometria de massa é a formação de íons
livres em fase gasosa.
O alcance e a utilidade do método de espectrometria de massas é definido pelo processo
de ionização. A aparência do espectro de massa de uma espécie molecular é altamente
dependente do método de ionização usado.
FORMAS DE IONIZAÇÃO Fase gasosa
Ionização por elétrons
Dessorção
 Interface CG/MS

vácuo Fonte de Alta Voltagem

e- Coluna CG
e-
e-
Analisador A+ e-
B+ A+ ABC
B+
de massa C+ C+
e-
e-

Anodo (+70 eV)

 vácuo Fonte de Alta Voltagem

Analisador
de massa
e- e- Coluna CG
e-
A+ A+ e-
B+ ABC
C+ B+ C+
e-
B+ e-

Campo magnético
A+
Anodo (+70 eV)

C+

A+

Detector
de massa
Interface CG/MS

A+
e-
e-
e-
Sistema multiplicador

e-
e-e-
e-
 Interface LC/MS CE/MS

Podem ser acopladas ao HPLC ou Eletroforese capilar

 Interfaces para LC/MS

1. Atmospheric Pressure Chemical Ionization (APCI)

Ionização Química à Pressão Atmosférica

2. Atmospheric Pressure Photoionization (APPI)

Fotoionização à Pressão Atmosférica

3. Electrospray Ionization (ESI)

Ionização por Electrospray
Aplicação relativa das técnicas de ionização a pressão atmosférica

100.000
ESI

Peso Molecular
APPI
APCI

10
não polar muito polar

Polaridade do Analito
Técnicas de Ionização
 IONIZAÇÃO POR ELECTROSPRAY (ESI) 1984

Uma solução de amostra é bombeada através de um capilar metálico, mantido em 3 a 5 Kvolts. A

nuvem resultante, carregada de finas gotículas, passa, então, por um capilar (cone de Taylor –
campo elétrico) onde ocorre a evaporação do solvente. À medida que as gotículas ficam menores,
suas densidades de carga tornam-se maiores e ocorre a separação da molécula da gota por
repulsão.
 Definição e aplicação da técnica de Eletrospray

• Eletrospray pode ser usado para moléculas ionizadas de alto e baixo peso
molecular.

• Compostos que são ions em solução

• Amostras que possuem múltiplas cargas em solução (ex., peptídeos,

proteínas)

• Amostras que contem heteroátomos

• Compostos que podem aceitar uma carga por indução

• Evitar amostras que tem compostos apolares onde a indução de carga é

ineficiente

• Os ions são formados na fase móvel pela nebulização de gotas

carregadas que encolhem. O solvente é secado encolhendo as gotas em
um forte campo elétrico aplicado nessa gota carregada.
 Processo ESI

Gotas carregadas Ions do analito

 
 

  Gotas de solvente
  Sal/Par iônico
Neutros
Evaporação


  Ion com solvente
  
Rayleigh   
Limite atingido    


   Ion do analito


Explosão de Coulomb
exemplo
Eletrospray
 Parâmetros cromatográficos para uso em Eletrospray

• Fase móvel pode fornecer a carga ao analito

• pH da fase móvel é crítico

• Conhecer os valores de pKa dos componentes

• Analise ácidos, bases – qualquer um com carga

• Opera com uma grande faixa de fluxo – 1 L/min até 1 mL/min

• Permite colunas desde nano/capilar (proteínas e peptídeos) até as

analiticas 4.6 mm ID onde diâmetros menores são ideais para a
melhor sensibilidadade

• Compatíveis com solventes de fase reversa

• A escolha de colunas de fase reversa para alguns compostos

carregados pode ser difícil devido a limitada retenção nessas
colunas.
 Fontes APCI e APPI para LC/MS

APCI APPI

Agulha corona em APCI vs. lâmpada UV em APPI

 Definição e aplicação da técnica APCI

• Em APCI, a descarga de elétrons de uma agulha corona, ioniza a fase

móvel vaporizada, que subsequentemente leva a uma reação
em fase gasosa em que a carga do solvente é transferida para
o analito que está também em fase gasosa.

• Os ions são formados no spray pela transferência de cargas do

solvente ( Não é necessário ions pré-formados para APCI)

• Bom para moléculas pequenas (< 1500), polar a apolar e semivoláteis.

• Não é bom para bio-moléculas pois são pouco voláteis

• Evitar amostras que são tipicamente carregadas em solução porque

ESI é geralmente mais sensível.

• Evitar amostras extremamente instáveis termicamente ou fotosensíveis

porque elas podem fragmentar completamente em APCI. Para as
fotosensíveis, tente com APPI.
 Processo de ionização química APCI

Aerosol com analito

Evaporação

Rayleigh
Limite atingido

 

   Ion do analito
Explosão de Coulomb  


 Transferência
  de carga para o analito

  
  
 
Formação de carga no solvente
 Processo de ionização química APCI

Coroa de
descarga
 Parâmetros cromatográficos para uso em APCI

• Opera em uma grande faixa de fluxo – até 1.5 mL/min

• Além disso, pode usar colunas de 2.1 – 4.6 mm id, sendo a de 3.0 mm
mais popular para APCI e ESI com o mesmo instrumento

• Pode usar com fase móvel tamponada até 100 mM

• Usada com alguns solventes de fase normal para analisar analitos

apolares.
 Definição e aplicação da APPI - Fotoionização

• APPI – atmospheric pressure photoionization é a nova fonte para LC/MS

• Boa para vários compostos apolares, ex., HPAs, Vitamina E

• Dois Modos – com dopante e sem dopante

• Dopante - um solvente (metanol) que ioniza facilmente num

comprimetno de onda da lâmpada de fotoionização e então
transfere carga ao analito

• Sem dopante – o analito é ionizado diretamente por um fóton

• APPI é complementar as técnicas API relativas a APCI e ESI

• Desenvolvimento de métodos simples – não otimiza a corrente de

descarga – lâmpada ligada ou não
 Processo de ionização APPI

Aerosol com analito

Evaporação

Rayleigh
Limite atingido Dopante é foto ionizado
e transfere carga para o analito

 

Explosão de Coulomb   
  
   
h 
 
 

  Ion do analito

h 
  
 
 
Formação de carga no solvente

Foto ioniza o analito

 Processo de Foto ionização química APPI

Lâmpada UV
 Técnicas de ionização a pressão atmosférica

•ESI APCI/APPI

• Volatilidade não é necessária • Alguma volatilidade é necessária

•Técnica preferida para compostos • Analito deve ser termicamente

sensíveis ao calor estável

• Ions formados em solução • Ions são formados em fase gasosa —

produz ions com carga
• Pode formar ions com múltiplas cargas
• Limite superior para peso molecular
•Limite superior para o peso molecular de de 1000 Da
100,000 Da
•Confirmação do peso molecular
•Altos LODs (ppm)
•Baixos LODs (ppb)
•Ionização ocorre no vácuo
•Bons para compostos fragéis
 Técnicas de ionização a pressão atmosférica

100.000
ESI

Peso Molecular
APPI
APCI

10
não polar muito polar

Polaridade do Analito

Filme
Analisadores de Massas
QUADRUPOLO

Barras paralelas arranjadas em pares opostos.

Um dos pares apresenta potencial elétrico aplicado
(DC – corrente contínua) e o outro par apresenta
potencial de corrente alternada (RF).

A aplicação das duas voltagens afeta a trajetória dos

íons. Variação de voltagens somente íons de razão
m/z determinada irão atravessar o quadrupolo.

O espectro de massas é obtido fazendo-se variar as

voltagens do quadrupolo, de maneira a se realizar
uma varredura.
Adequado para quantificação.
 Sistema de quadrupolo

Analito de interesse
Mistura de Analitos

quadrupolo
 Fragmentação

Gás nitrogênio

Fragmento
fragmentos selecionado

fragmentação
 Time-of-flight (TOF)
(TEMPO DE VÔO)

Tempo em que íons diferentes levam para cruzar o sistema de separação de

íons de diferentes m/z.

Um campo elétrico acelera todos os íons formados na ionização para uma

região livre de efeitos externos.

Íons mais leves viajarão mais rápido do que íons pesados e alcançarão o
detector.

Tempo de vôo depende massa

carga

energia cinética

Quanto mais leve o íon, mais rápido este "voa" através do espaço entre a amostra e o detector.
 TOF

• Alta resolução;
• Alta exatidão;
• Alta sensibilidade para espectros;
• Análise pulsada  perfeito
acoplamento com MALDI;
• Para ESI, APCI e EI é necessário
transformar o feixe contínuo em pulsado
 Extração ortogonal.
TOF com feixe contínuo
Ion Trap 3D (IT)
 Sequência de Eventos (MS)

• Aprisionamento
• Resfriamento
• Varredura
• Detecção (por instabilidade de órbita)

Sequências no Tempo !!!

1. Aprisionamento

• Lentes na entrada do Ion Trap permitem a

entrada de íons;
• Após um certo tempo, muda-se a
voltagem da lente, bloqueando a entrada;
• Cuidado tem de ser tomado para não
acumular muitos íons;
• Razão espaço/carga é critica (repulsão
dos íons)  chemical shift.
2. Gás de Resfriamento

• Íons tem uma distribuição de velocidade

inicial ao entrar no IT;
• O ion trap é preenchido com He (1 mTorr);
• Íons colidem com He a baixas energias de
colisão e são cineticamente resfriados;
• Íons são acumulados no centro do trap,
diminuindo a dispersão.
3. Varredura

• Após o resfriamento, faz-se uma rampa da

voltagem RF;
• Íons deixam de ter trajetórias estáveis e
são ejetados para fora do trap;
• Detector captura (parte) desses íons
ejetados.

4. Detecção
 Análise Total Análise Total
Por sistema ion trap (armadilha iônica) Por sistema triplo quadrupolo

Análise Total com qTOF

Por sistema triplo quadrupolo acoplado ao qTOF (tempo de vôo)

 Aplicações em Alimentos

Esteróis
Aromas
Pigmentos naturais
Corantes artificiais
Antibióticos
Polissacarídeos
Aminoácidos
Hidrocarbonetos (HPAs)
Proteínas
Terpenóides
Pesticidas
Metabólitos de animais e plantas
Compostos fenólicos
Vitaminas
outros
Vitamina D3
Fungicidas
 Negative-Ion ESI FT-ICR MS

Canola Oil

Olive Oil

Soybean Oil

250 350 450 550 650

m/z
 C18:1
Canola Oil Fatty Acids
C18:2
C18:0
C18:3

C18:1
Olive Oil

C18:2 C18:0

C18:2

Soybean Oil
C18:1
C18:0
C18:3
277 278 279 280 281 282 283 284 285
m/z
 Relative Abundance %
100
Fatty Acids
80

60

40

C18:2 20
C18:3

Pure 282
Olive 278

Pure 274
Soybean
 Triacylglycerols

Canola Oil

C54:5
Olive Oil

C54:7
Soybean Oil
C54:8

875 880 885 890

m/z
 Relative Abundance %
100

80
Triacylglycerols
60

40
C54:5
C54:6 20
C54:7 884

880
Pure
Olive Oil 876
Pure
Soybean Oil