Testes de sensibilidade:

difusão por disco e E-test

Daniel Archimedes da Matta

Laboratório Especial de Micologia-DIPA
UNIFESP – EPM
lemits@terra.com.br
Desenvolvimento de testes de susceptibilidade a antifúngicos
NCCLS – diluição em caldo
Variáveis relevantes na padronização do ensaio
Metodologia NCCLS: diluição em caldo
Correlação in vitro versus in vivo
A regra do “90-60”
Correlação in vitro versus in vivo candidíase orofaríngea tratada com Fluconazol
Correlação in vitro versus in vivo NCCLS: candidíase oral e fluconazol
Propostas de critérios para interpretação de testes de sensibilidade para Candida spp (NCCLS)
Diluição em caldo
Teste de susceptibilidade a antifúngicos
Métodos comerciais e alternativos ao Padrão Ouro
Princípio de Difusão em Disco: Etest e Disco Difusão
Resistência a anfotericina B em isolados de Candida lusitaniae por ETEST
ETEST
Correlação entre Etest e microdiluição para isolados de Candida spp.

continua

índice
Disco Difusão
Isolado sensível a fluconazol
Cuidado na distribuição do inóculo
Critérios para interpretação de diâmetros de inibição Disco-difusão de fluconazol para Candida spp
(NCCLS M 44-A)
Tipos de Erros
Correlação entre Disco difusão e microdiluição para isolados de Candida spp. frente ao fluconazol
Comparação dos resultados de disco difusão para Candida spp
Resultados

índice
Desenvolvimento de testes de
susceptibilidade a antifúngicos

• Aumento da necessidade de testes de susceptibilidade:

• inúmeros relatos de resistência a antifúngicos

• novas drogas disponíveis

• CLSI – Clinical and Laboratory Standards Institute

(antigo NCCLS): estudos multicêntricos para padronizar
testes de susceptibilidade a antifúngicos com leveduras
e fungos filamentosos (“guidelines” para diluição em
caldo)

Colombo et al, J. Antimicrob Chemother 36:93-100, 1995

Rex et al, Clin Infect Dis 24:235-47, 1997
Rex et al, Clin Micr Rev 14:643-58, 2001
 NCCLS – diluição em caldo

Espécies
Documentos

Candida spp. e • M27-P – 1992

Cryptococcus neoformans • M27-T – 1995
• M27-A – 1997
• M27-A2 – 2002

Aspergillus spp, Fusarium spp, • M38-P – 1998

Rhizopus spp, Pseudollescheria boydii e
Sporothrix schenckii • M38-A – 2002

Candida spp. • M44-P – 2003

• M44-A – 2004

NCCLS – disco difusão

 Variáveis relevantes na
padronização do ensaio

• Solubilização de drogas
• Tamanho do inóculo
• Meio de composição definida e tampão
• Temperatura do ensaio
• Tempo e critérios de leitura
• Avaliação da correlação clínica
• Estabelecimento de “breakpoints”

Sheehan et al, CID 17 (suppl 2):S494-500, 1993

Rex et al, Clin Micr Rev 14:643-58, 2001
Rodrigues-Tudela JCM 39:2513-17, 2001
 Metodologia NCCLS: diluição
em caldo

Meio:
• RPMI-1640 tamponado c/MOPS
• Inóculo: • 0,5 a 2,5 x 103 cels/mL
• Temperatura: • 35ºC
• Tempo de leitura: • 48 horas
Anfo: inibição total
• Critério de leitura: { Azóis: inibição significativa (trailing)

NCCLS, Documento M27A2, 2002

 Correlação in vitro versus in vivo

• CIM não é variável física ou quimicamente mensurável, sofrendo

influências biológicas diversas
• Fatores relacionados ao hospedeiro são geralmente mais importantes
que testes de susceptibilidade para definir resposta terapêutica
• Susceptibilidade in vitro pode não implicar em sucesso terapêutico
• Resistência in vitro geralmente associa-se a falha terapêutica

Rex J, Pfaller M. Clin. Infect. Dis., 2002;35:982-9

A regra do “90-60”

• Infecções por microrganismos susceptíveis repondem à

terapêutica apropriada 90% das vezes

• Infecções por microrganismos resistentes respondem à

terapêutica 60% das vezes

Rex J and Pfaller M. Clin. Infect. Dis., October-2002

 Correlação in vitro versus in vivo
candidíase orofaríngea tratada com
Fluconazol

Autor No isolados No pacientes Correlação

Dupont et al., 1992 45 45 Boa

Rodriguez-Thudela et al., 1992 29 26 Boa
Cameron et al., 1993 98 87 Boa
Troilet et al., 1993 65 25 Boa
Heinic et al., 1993 2 2 Boa
Boken et al., 1993 4 4 Boa
He et al., 1994 212 46 Boa
Pfaller et al., 1994 131 29 Boa
Barchiesi et al., 1995 62 28 Boa
Revankar et al., 1998 155 64 Boa
Correlação in vitro versus in vivo
NCCLS: candidíase oral e fluconazol

100
 Resposta clínica a Fluco 100 mg/dia
 Negativação de cultura
Porcentagem de sucesso terapeutico

80

60

40

20

0
1 2-4 8 16-32  64
(n=53) (n=43) (n=11) (n=18) (n=30)

MIC

Revankar et al. Clin Infec Dis 26:960-63, 1998

 Propostas de critérios para
interpretação de testes de sensibilidade
para Candida spp (NCCLS)

Variações dos valores de CIM (mg/ml) para a categoria

Susceptibilidade
Sensibilidade Dose Dependente Resistente
Antifúngicos (S) (SDD) (R)

Fluconazol 8 16 - 32  64

Itraconazol 0,125 0,25 - 0,50 1

Sensibilidade Intermediário (I) Resistente (R)

(S)
5FC 8-16 32
4
Rex et al., CID 14:235-247, 1997
Diluição em caldo

Macrodiluição em caldo Microdiluição em caldo

(Padrão ouro) (Equivalente)

JCM 1992:30;3138-45
JCM 1994 32(10):2494-
500
Teste de susceptibilidade a antifúngicos

Procura de métodos de sensibilidade:

• reprodutíveis e confiáveis
• com baixo custo
• fácil execução em laboratórios clínicos
• e com excelente correlação com a clínica

Morace et al JCM 40:2953-8 2002

Barry et al – AAC 2002 46(6):1781-4
 Métodos comerciais e alternativos
ao Padrão Ouro

 Colorimétricos • Mais antigos

- Sensititre YeastOne (EUA) • ATB Fungos (França)

- Asty (Japão) • Mycostandard (França)

• Mycototal (França)

• Difusão em Meios sólidos

 Concentr. Reduzidas
• Difusão em disco
- Fungitest (França)
• Etest
- Candifast (Itália)
- Integral System Yeasts (Itália) • Microdiluição
• - EUCAST (Europeu)
Princípio de Difusão em Disco:
Etest e Disco Difusão

Ilustração esquemática do gradiente de

concentração

Disc
o
 ETEST

• Facilidade operacional
• Possibilidade de testar poucos isolados
• Correlação entre 60-90% c/ resultados do NCCLS
• Leitura difícil c/ azólicos
• Resultados de resistência devem ser confirmados por
método referência
• Parece ser uma boa opção para discriminacão de cepas
menos sensíveis a Anfotericina B

Colombo et al, JAC 36:93-100, 1995

Colombo et al, JCM 33(3):535-40, 1995
Pfaller et al, DMID 32:223-7, 1998
 Descrição da Metodologia

• Placa de petri 90mm para testar um único antifúngico

• Placa 120mm para ate 3 antifúngicos
• Fita plástica contendo os antifúngicos
• RPMI 1640 + 1.5% de agar suplementado com 2% de glicose
• Microrganismo puro com subcultivo recente (18-24h)
• 0.5 de McFarland (espectrofotômetro)
• Swab
• Temperatura de incubação: 35°C
• Tempo de incubação: 24h (azólicos e 5FC) e 48h (anfotericina B)
• Critério de leitura: inibição parcial (azólicos e 5FC) e total (anfotericina B)

Colombo et al, JCM 33(3):535-40, 1995

Sensibilidade

Colombo et al, JCM 33(3):535-40, 1995

trailing trailing

Sensibilidade

Colombo et al, JCM 33(3):535-40, 1995

Resistência

Colombo et al, JCM 33(3):535-40, 1995

 Presença de
Resistência Macrocolônias
indicam
subpopulações
resistentes

Peyron et al, JCM 39:339-42, 2001

A
A B
B E
E

C
C D
D

Colombo et al, JCM 33:535-40, 1995

Peyron et al, JCM 39:339-42, 2001
 Resistência a anfotericina B em isolados
de Candida lusitaniae por ETEST

• Candida lusitaniae possui Resistência intrínsica a anfotericina B

• 47 isolados
• 9 isolados eram reconhecidamente resistentes
• Macrodiluição NCCLS em RPMI e AM3 (Antibiotic Medium 3)
• ETEST em RPMI e AM3 com leitura de 24h e 48h
• > 0.38 mg/ml Resistência (critério sugerido por Clancy e Nguyen,
1999)

Peyron et al, JCM 2001 39(1):339-42

Resistência a anfotericina B em isolados
de Candida lusitaniae por ETEST

isolados categoria ETEST NCCLS

com meio
AM3
Resistente 0,5 - 1
Resistente
Resistente
Resistente
Resistente
Resistente
Resistente
Resistente
Resistente
Resistente

Resistente

Sensível

Sensível

Peyron et al, JCM 2001 39(1):339-42

 Resistência a anfotericina B em isolados
de Candida lusitaniae por ETEST

• ETEST (RPMI ou AM3) foi superior a NCCLS

• Houve baixa correlação entre ETEST e NCCLS para isolados resistentes
devido aos baixos valores de CIM pela metodologia do NCCLS
• Exceto 1 isolado, todos aqueles reconhecidamente resistentes tiveram CIM >
0.38 mg/ml (como sugerido por Clancy e Nguyen, 1999)
• NCCLS com AM3 falhou na detecção de isolados reconhecidamente
resistentes e sensíveis

Peyron et al, JCM 2001 39(1):339-42

Correlação entre Etest e microdiluição
para isolados de Candida spp.

% Concordância
(n) Fluconazol Itraconazol Anfo-B

Colombo et al. (1995) 100 80 84 -

Martin-Mazuelos et al. (1999) 402 66-74 43-89 -

Chryssanthou (2001) 233 77-85 60-72 86-97

Barry et al. (2002) 467 95,7 - -

Morace et al. (2002)

800 82 - -

Matar et al. (2003)

400 96,5 - -
Pfaller et al. (2004)
4936 - - 92,9
 Disco difusão

Documento M44-A (aprovado) – NCCLS

2004
Disco Difusão

• Disco-difusão em ágar:
• Facilidade operacional
• Possibilidade de testar poucos isolados
• Falta de padronização nos ensaios: EXCETO FLUCONAZOL
• Progressos recentes com voriconazol

Meis et al Diag Microbiol Infect Dis 36:215-23, 2000

Hoffman & Pfaller, Pharmacotherapy, 21(8s): 111s-123s, 2001
 Disco Difusão

• Disco-difusão em ágar:
• Ótimos resultados com discos de fluconazol 25 g em
Mueller-Hinton agar e 2% glicose
• Alta reprodutibilidade
• Boa correlação com o NCCLS
• Ótima performance no reconhecimento de isolados
sensíveis
• Adicionar azul de metileno

Meis et al Diag Microbiol Infect Dis 36:215-23, 2000

Hoffman & Pfaller, Pharmacotherapy, 21(8s): 111s-123s, 2001
Isolado sensível a fluconazol
(presença de trailing)

(Halo de inibição  30 mm)

Traili
ng

Traili
ng
Cuidado na distribuição do inóculo

Inadequado Adequado
Leituras de Ensaio de Disco-
Difusão com fluconazol

Isolado Resistente, sem halo Isolado Sensível , com halo de

de inibição definido inibição bem definido
 Critérios para interpretação de diâmetros de
inibição Disco-difusão de fluconazol para Candida
spp (NCCLS M 44-A)
.

  Método  Sensível (SDD)  Resistente

M44-A (2004)
Disco Difusão ≥ 19mm 15-18mm ≤ 14mm

M27-A2 (2002)
Diluição em caldo ≤ 8 g/ml 16-32 g/ml ≥ 64 g/ml

NCCLS – M27A2 (2002)

Barry et al – Antimicrob Agents Chemoth 46(6):1781-4, 2002
 24h – Diâmetro do halo (mm) disco com 25ug de fluconazol

Barry et al – Antimicrob Agents

Chemoth 46(6):1781-4, 2002
S
SD

S SDD R

48h – CIM de fluconazol (ug/ml) – Microdiluição NCCLS

Concordância de resultados entre sistemas
comerciais de avaliação de susceptibilidade ao
fluconazol e o NCCLS c/ 48 horas de incubação

Nº (%) de resultados
discrepantes
Método e meio Tempo de Nº de % de
concordância
de cultivo incubação (h) testes

Leve Grave Gravíssimo

Microdiluição RPMI-1640

ETEST
RPMI-1640

Disco Difusão
RPMI-1640

Disco Difusão – agar

Mueller Hinton +
glicose + azul de
metileno

Barry et al – Antimicrob Agents Chemoth 2002 46(6):1781-4

 Tipos de Erros

NCCLS (Padrão Alternativo

Ouro

Minor Error (Leve) S I

I S
I R
R I

Major Error (Grave) S R

Very Major (Gravíssimo) R S

Correlação entre Disco difusão e
microdiluição para isolados de Candida spp.
frente ao fluconazol

% Discrepância
(n) % Concordância Leve Grave Gravíssimo
Barry et al. (2002) 495 96,9 2,9 0 0,2

Morace et al. (2002) 800 77,6 - - -

Matar et al. (2003) 400 88,8 7,5 0 3,8

Pfaller et al. (2004) 2949 90,4 5,8 3,4 0,4

Comparação dos resultados de disco difusão para
Candida spp. entre Laboratório Referência e
Participantes do grupo Artemis

Inoculado com swab com uma suspensão de células ajustado pelo turbidimetro em
escala 0,5 Mc Farland

Placas incubadas a 35oC e leitura de 18 a 24 h

Todos os isolados foram preservados em ágar , sendo enviados para o laboratório

central em Iowa para realização de identificação , teste de susceptibilidade e
posterior congelamento.

Foram selecionados isolados de Candida spp com significância clínica nos sítios
de infecção (sangue e sítios esterilizados) que causam doença invasiva através de
trabalhos em hospitais sentinela da América do Norte, América Latina, Europa,
África e Ásia .

Monitoramento do diâmetro do halo do disco para fluconazol reportado em 54

diferentes centros médicos entre 2001 e 2002.
Pfaller et al. JCM 2004 42(8):3607-12
Resultados do halo de inibição dos centros
participantes X NCCLS dos Laboratório Referência
Diâmetro do halo (mm) disco com 25ug de fluconazol

VM

ME

Microdiluição NCCLS – CIM de fluconazol (ug/ml)

Pfaller et al. JCM 2004 42(8):3607-12
Resultados do halo de inibição X NCCLS –
ambos realizados no laboratório referência
Diâmetro do halo (mm) disco com 25ug de fluconazol

VM

ME

48h Microdiluição NCCLS – CIM de fluconazol

(ug/ml) Pfaller et al. JCM 2004 42(8):3607-12
“É importante ter em mente que os
critérios para teste de susceptibilidade a
antimicrobianos são resultado da
colaboracão de várias ciências, fé e
trabalho…”
Baquero F – Eur J Clin Microbiol Infect Dis 1990;9:492-5 – p492