Universidade Estadual do Rio Grande do Sul

Unidade de Bento Gonçalves

Engenharia de Bioprocessos e Biotecnologia
Recuperação e Purificação de Bioprodutos

w
  

ë PEPTÍDEOS E PROTEÍNAS
- Formados por ligações
peptídicas.
ë AE, RP-HP 
ë oluna: „
 
 

=   ë =   

ë ½ntrodução de cadeias alquílicas contendo

um número definido de átomos de carbono.
Ex.: n-butil (
, n-octil (, n-octadenil
(, fenil, cicloexil, outros.
ë aracterísticas a serem consideradas:

- Tamanho dos grãos da sílica derivatizada

DEF½NEM O VA OR DE ´Nµ
(EF½½ N½A DE SEPARAÇÃO

- Poros do grão de sílica: devem ter dimensão x

maior que o diâmetro do soluto.

- Separações analíticas:
coluna com 5-25 cm de comprimento
-
,6 mm diâmetro
recheadas com partículas de 3-5um.
ë aráter hidrofóbico da coluna:


2
|SiO2|-(H2-H3

ë ,  para peptídeos

ë , 
para proteínas
ë Preparado com água bidestilada ou deionizada.

ë 

água acidulada + TFA
+Ác. Fosfórico
+Ác. Perclórico
+Ác. Hepta-fluorobutírico
ph 2-5

ë 

solvente A + solvente orgânico
(metanol, acetonitrila ou 2-propanol

- Uso de bombas programáveis.

- Mistura desconhecida: variações
de ,2 a 5%/min. do solvente B
em relação a A.
ëF UXO:
- oluna analítica: -2 m /min.
- Semipreparativa: 3-5 m /min.
- Preparativa:  m /min.

ë Uso de tampão na eluição

ë Uso de temperaturas elevadas

ë Detecção:
- omprimentos de onda:
2-225 nm (ligação peptídica
25-2 nm (grupos aromáticos.
ë ½EX-HP 

ë Peptídeos
e proteínas polares, biomoléculas
com estrutura suscetível à desnaturação

ë Mais
seletiva e específica que a RP-HP ,
podendo ser utilizada como técnica
complementar

ë Temperatura ambiente ou mais elevadas

ë Fase estacionária:
estacionária
â Sílica derivatizada com poli-2-sulfoetil, poliestireno-
divinilbenzeno ou polímeros hidrofílicos derivatizados
(N+(H33, SO3-.

ë Eluição:
Eluição
(A Tampão
pH: 2,5-3,5

(B Tampão + acetonitrila/ metanol

com o aumento da concentração de B, minimiza-
se o efeito eletrostático de interação moléculas²
suporte.

ë Detecção: 2-22 nm; 25-2 nm.

ë Fase estacionária:
ë Sílica ou polímero funcionalizado.

ë igação da molécula-alvo baseada na

hidrofobicidade, cargas e outras propriedades
conferidas pelo grupo funcional.

ë ½nteração ligante-biomolécula se dá através dos

grupos NH2, OH e SH da proteína na presença do
tampão.
ë Passagem de uma solução que desestabiliza as interações
ligante-peptídeo/proteína.

- Redução do pH
- Adição de sais caotrópicos Œ 
   Técnicas
- Agentes dessorventes específicos (para para Eluição
proteínas sensíveis a desnaturação

ë Pode ocorrer quebra das ligações dissulfeto e de

hidrogênio.

ëEscolha do fluxo adequado para uma boa resolução dos

picos (condições analíticas: ,5- m /min.
ë Separação de compostos ionizáveis em campo
elétrico.
ë Aplicável para moléculas orgânicas e inorgânicas,
aminoácidos, nucleotídeos, peptídeos e
proteínas.
ë Rápido, necessita de pouca quantidade de
amostra e de solventes, elevada
reprodutibilidade e possibilidade de automação.
ë E com capilar em solução livre:
- apilar preenchido com tampão.
- A amostra injetada é submetida a uma
diferença de potencial que gera um corrente
elétrica e um campo elétrico, impulsionando
a migração dos íons da amostra.
- A separação ocorre devido a diferença de
velocidade dos íons decorrente do seu
tamanho, forma e carga.
- Fluxo da solução tampão.
ë E micelar
micelar::
ë Separação de misturas de componentes
neutros.
ë ½nteração das moléculas com a micela que
reveste o capilar.
ë E em gel:
ë Separação, quantificação e determinação da massa
molar de proteínas.
ë Géis: são estruturas porosas, em que um componente
fluido é imobilizado numa rede polimérica. A
distância média entre as ligações, distribuição dos
pontos de ligação e conteúdo líquido governam o
tamanho e a distribuição dos poros no gel.
ë Os solutos migram através de uma estrutura
polimérica, sendo mais ou menos impedidos em seu
percurso, de acordo com o seu tamanho, processo
este conhecido como Peneiramento.
ë ½dentificação e caracterização química de
peptídeos e proteínas.
ë A separação e detecção se dá pela ionização e
vaporização das moléculas com diferentes
valores de m/z.
ë O conjunto de valores m/z
possibilita a determinação da
massa molar e estrutura
primária dos peptídeos ou
proteínas
ë ontém uma fonte geradora de íons, um
analisador de massas que os separa de acordo
com a relação m/z e um detector.

 ½NSER½R A AMOSTRA NO APARE HO EM OND½ÇÕES

½ON½
ÁVE½S
2 VO AT½ ½
AR A AMOSTRA
3 PROPU S½ONAR E ETROSTAT½AMENTE OS ÍONS
GASOSOS

 SEPARAR OS ÍONS
5 DETETAR
 Fonte de íons

  

!  MA½S UT½ ½
ADOS,

FAB-MS: bombardeamento MÉTODOS SUAVES DE
rápido de elétrons. ½ON½
AÇÃO

ES½-MS: spray de elétrons

MA D½-MS: dessorção por

laser.
ë Amostra + solvente + matriz líquida não-
volátil
ë Matriz: absorve a maior parte da energia
ë Bombardeamento por átomos de xenônio ou
por íons s+.
ë As moléculas gasosas carregadas são
propulsionadas eletrostaticamente para o
analisador de massas e detectadas.
ë Feixe ionizante de luz laser e matriz sólida.
ë Matriz: absorve energia do feixe, o que causa
sua volatização junto com a volatização da
amostra.
ë As moléculas da matriz ionizada transferem
prótons para a amostra.
ë Os íons formados são dirigidos por lentes
eletrostáticas para um 
„„„„
 
ë Produz moléculas gasosas ionizadas a partir de uma
solução líquida acidificada.
ë Favorece a formação de moléculas com múltiplas cargas,
possibilitando a análise de peptídeos e proteínas de massa
molar alta (fluxo de gás perpendicular.
ë ½dentificação e caracterização química
ë Determinação da composição real de
aminoácidos
ë ompreensão das propriedades químicas,
físicas e biológicas
ë Secar e pesar o polipeptídeo isolado
ë olocar em um tubo de vidro pirex
ë Adição de Hl 6N contendo % de fenol a
   por 2
h, sob atmosfera de N2 em
completa ausência de íons metálicos, para
hidrólise das ligações peptídicas.
ë Hidrólise em estado vapor
ë Podem ocorrer reações secundárias
(Degradação, quebra parcial, oxidação
 DER½VAT½
AÇÃO DER½VAT½
AÇÃO
PÓS-O UNA PRÉ-O UNA
Separação dos AA por Baseada na propriedade
cromatografia de troca-iônica fluorescentes ou de absorção
de alta eficiência. de luz UV.
Após separados os AA entram Uso de RP-HP .
em contato com solução de Reagentes: OPA, P½T, PT.
ninidrina em reator tubular a A TA SENS½B½ ½DADE
3  .
Detecção: 5nm ou

nm
(prolina
uanto ½ntensidade da cor 
[AA]
  $ $ %&'($
( )

" ( acoplamento "  %&$ (
* 'w
+,)

(  -,( '=# $
'.$"Œ/'(,' ) 
01
(2 hidrólise com ácido # =$2).$ $ (
* 3,- $ 
trifluoroacético 'w
4  5

$ 
* 
Œw
=$ '.$")

$ 
(
* 
 $ '.$#
# acoplamento )*$,
' Œ/'(
,' )  1
(   .)'
-.5 $w
=
'.$$ %&'

' $ (
* 
hidrólise ácida

vai para novo ciclo

Seqüenciadores automatizados fazem

todas as etapas. imitado para
proteínas que apresentam N terminal
bloqueado.