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Contedo
1- Planejamento de validao 2- Como proceder para determinar as caractersticas de desempenho de mtodos 2.1- Aplicabilidade 2.2- Faixa de trabalho 2.3- Linearidade 2.4- Faixa linear de trabalho 2.5- Sensibilidade 2.6- Homocedasticidade/heterocedasticidade 2.7- Limite de deteco 2.8- Limite de determinao/quantificao 2.9- Exatido/recuperao 2.10- Preciso 2.10.1- Repetitividade 2.10.2- Preciso intermediria 2.10.3- Reprodutibilidade 2.11- Seletividade 2.12- Robustez
Validao
Um processo atravs do qual estudos de laboratrio so utilizados para garantir que o mtodo em questo atenda s exigncias desejadas
Tipo de mtodo
FDA. International Conference on Validation of Analytical Procedures: Definitions and Terminology; Availability. Federal Register. V. 60 (40) p. 11260-11262, March, 1995.
Procedimento analtico
Exatido Preciso Repetitividade Preciso Intermediria Especificidade LD LQ Linearidade Faixa
Identificao No
Teste de Quantitativo
Sim
Impureza Ensaio-limite
No
Doseamento Sim
No
No Sim No No No No
Sim
Sim Sim No Sim Sim Sim
No
No Sim Sim No No No
Sim
Sim Sim No No Sim Sim
Aplicabilidade Faixa de trabalho Linearidade Homocedasticidade/heterocedasticidade Faixa linear de trabalho Sensibilidade Limite de deteco Limite de determinao/quantificao Preciso (repetitividade, preciso intermediria e reprodutibilidade) Exatido/Taxa de recuperao Seletividade Robustez
Aplicabilidade
Determinar qual ou quais matrizes e analito ou analitos para que o mtodo analtico serviria, Identidade do analito, incluindo especificao onde apropriado (p. ex: arsnio total), Faixa de concentrao coberta pela validao (p. ex: 0 50 mg/kg), Uma especificao da faixa de matrizes do material teste coberta pela validao (p. ex: frutos do mar), Descrever o equipamento, reagentes, procedimento (incluir variao permissvel p. ex: aquecer 1005C por 305min), procedimento de calibrao e qualidade e, precauo de segurana especial necessria, A aplicao pretendida e sua incerteza crtica (p. ex: anlise de alimento para monitoramento). A incerteza padro u(c) do resultado c deveria ser < 0,1 x c.
THOMPSON, M., ELLION, S. R. , WOOD, R. Pure and Applied Chemistry. V. 74, p. 835-855, 2002.
Faixa de trabalho
A faixa de trabalho (FT) pode ser definida entre um dcimo a dobro do limite de restrio (LR) 0,1 . LR FT 2 . LR
FRAUNHOFER INSTITUT FR LEBENSMITTELTECHNOLOGIE UND VERPACKUNG Guide for testing of analytical method for the determination of monomers in foods simulants and polymers. Mnchen. 3p. M&T Project Development of methods of analysis. Printed papers.
Linearidade
a habilidade das respostas analticas serem diretamente proporcionais s concentraes das substncias em estudo. Ser verificada analisando em triplicata solues padro com 6 ou mais concentraes diferentes, dispostas em um intervalo estabelecido pela faixa de trabalho. Os valores encontrados para confeco da curva analtica tm que estar livres de valores aberrantes e os mesmos devem apresentar homocedasticidade.
Pode-se verificar se algum ponto de concentrao desvia da linearidade da curva por meio do clculo dos resduos entre os valores medidos e os valores calculados a partir da equao da curva. Calcular um ponto duvidoso de uma curva analtica pelo valor de t. tcalculado= resduo sr/n
Onde:
resduo = |xmedido - xcalculado| sr =desvio padro dos resduos n = nmero de pontos da curva
Preparo da soluo me
Pesou-se 0,1066g de estireno com 99% de pureza. Diluiu-se esta massa em balo volumtrico de 100mL com n-heptano. Considerando a pureza do estireno 99%, o procedimento resultou em soluo com concentrao de 1,055mg/mL
Solues de trabalho
Com pipetas volumtricas, tomou-se alquotas da soluo me para preparo das solues de trabalho. Todas as alquotas foram avolumadas a 100mL com n-heptano
10
Concentrao (mg/L)
0,00 10,55
21,10
52,75
105,5
De semana em semana retiramos uma alquota de 5mL da soluo me de estireno em heptano e avolumamos com heptano para 100mL em balo volumtrico. Tomamos uma alquota desta soluo e injetamos em cromatgrafo a gs. Observamos se o resultado da concentrao obtida semelhante ao obtido inicialmente na confeco da curva analtica
Homocedasticidade/heterocedasticidade
Determinao da homocedasticidade
Analisou-se em triplicata todos os pontos da curva analtica (10,55 105,5 mg/L), calculando em seguida as varincias das respostas de cada ponto de concentrao. Dividiu-se a maior varincia (S2) pelo somatrio das varincias ( S2). O valor obtido comparado com o valor tabelado
Varincia S2 = 1/n-1 [xi X(mdio)]2
Homocedasticidade
Se o valor calculado for menor que o tabelado de Cochran, o mtodo homocedstico. Portanto, a curva analtica pode ser construda pelo mtodo dos mnimos quadrados normais
C cal = S2 maior/ S2
A faixa de trabalho(conc. na alquota de anlise 10,55105,5 mg/L) possibilitou detectar o estireno dentro dos limites de interesse e a resposta do detector do cromatgrafo conservou-se linear, que foi de 0,035 a 0,35 % m/m concentrao na amostra
Sensibilidade
Descreve quanto a resposta varia com a variao da concentrao do analito. Pode ser expressa como a inclinao da curva analtica (coeficiente angular), expresso pala equao S=dx/dc, onde: dx=variao da resposta, dc=variao da concentrao medida ao mesmo tempo que testa a linearidade Depende da natureza do analito e da tcnica de deteco
BRUCE, P. , MINKKINEN, P. , RIEKKOLA, M. L. Practical Method Validation: Validation sufficient for an Analysis Method. Mikrochimica ACTA. V. 128, p. 93-106, 1998.
Limite de deteco LD
a mais baixa concentrao da substncia em exame que pode ser detectada com um certo limite de confiabilidade utilizando um determinado procedimento experimental
Limite de determinao/quantificao LQ
a mais baixa concentrao da substncia em exame que pode ser quantificada com certo limite de confiabilidade utilizando um determinado procedimento experimental
Limite de quantificao LQ
Geralmente o mais baixo ponto da curva analtica no deve ser determinado por extrapolao
UKAS PUBLICATION ref: LAB 27, United Kingdom Accreditation Service. www.ukas.com
Preciso
Repetitividade Preciso intermediria
Reprodutibilidade
Repetitividade
o grau de concordncia entre resultados de anlises individuais quando o procedimento aplicado repetidamente mltiplas anlises de uma mesma amostra homognea, em idnticas condies de teste.
Determinao da repetividade
Um mnimo de 9 determinaes cobrindo a faixa especfica para o procedimento (p. ex: 3 concentraes/3 replicatas cada, menor, intermediria e maior); ou Um mnimo de 6 determinaes a 100 % de concentrao teste
Calcular o desvio padro, o desvio padro relativo ou coeficiente de variao ou a varincia.
GUIDANCE FOR INDUSTRY Q2B. Validation of Analytical Procedures: Methodology U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration, Center for Drug Evaluation and Research, Center for Biologics evaluation and Research, November 1996 ICH.
Preciso intermediria
Expressa as variaes dentro de um laboratrio, como: dias diferentes, analistas diferentes, mtodos diferentes, ou equipamentos diferentes, sobre uma mesma amostra ou padro, definindo exatamente quais as condies a variar (uma ou mais)
Reprodutibilidade
o grau de concordncia entre os resultados das medies de um mesmo mesurando, efetuadas sob condies variadas de medio(VIM). A reprodutibilidade no um componente de validao de mtodo executado por um nico laboratrio, obtido em relao aos dados de validao obtidos atravs de comparao interlaboratorial (INMETRO, 2002).
INMETRO. Orientaes sobre validao de mtodos de ensaio qumicos. DOQ-CGCRE-008, reviso:00-outubro 2002.
VIM Vocabulrio Internacional de termos Fundamentais e Gerais de Metrologia, 1995.
Exatido
Taxa de Recuperao
a relao entre o resultado experimental obtido depois da anlise de uma amostra, fortificada com uma quantidade conhecida do analito, e o valor terico desta quantidade fortificada
A taxa de recuperao ser calculada pela diviso entre o resultado da concentrao mdia experimental e a concentrao terica multiplicada por 100.
Taxa recuperao=[conc. Exp./conc. Teor] x 100.
Seletividade
a interferncia por outra substncia, que no seja o analito de interesse, na medio pelo detector
Determinao da seletividade
Analisa-se trs vezes a soluo de estireno em heptano na concentrao de (10,55mg/L) e depois analisa-se trs vezes uma amostra que apresente na alquota de anlise uma concentrao prxima a concentrao de (10,55mg/L) e depois calcula-se o teste de igualdade de duas mdias de amostras independentes (t)
Determinao da seletividade
O clculo do valor de t quando se comparam mdias de duas amostras diferentes dado pela expresso
t=
x1 - x 2 Sa 1 / n1 + 1 / n2
Determinao da seletividade
Sa a estimativa do desvio padro agregado, calculado a partir das estimativas dos desviospadres das duas amostras
Sa
2 2
Robustez
a capacidade de um mtodo de no ser afetado por uma pequena e deliberada modificao em seus parmetros
Determinao da robustez
Resultados das amostras a 48 e 120 h
DEHA % m/m 48 120 h DEHP % m/m 48 120 h
Plastificantes Desvio padro das diferenas (%m/m) Teste de igualdade de duas mdias (%m/m) T tabelado