Anlise de Risco Ambiental do Milho GM: Manejo da Resistncia de Insetos (MRI)

Jos Magid Waquil jmwaquil@gmail.com INOVADEFESA/RIT DA/CNPq Sete Lagoas, MG.

Protocolo de Cartagena
Biossegurana de OGMs vivos; Pases desenvolvidos e em desenvolvimento;

Mtodos cientficos para avaliar:

biossegurana pr-liberao; monitoramento ps-liberao;

Uso seguro e sustentvel da tecnologia e Consenso da necessidade da avaliao de Risco

Principais Aspectos
1) Hibridizao dos OGM com seus parentes selvagens; 2) Desenvolvimento de resistncia de pragas ao OGM;

3) Mudana de status de pragas secundrias;

4) Alteraes na composio dos OGMs

Principais Aspectos (cont.)

5) Reduo de biodiversidade;

6) Efeito sobre polinizadores; 7) Efeito sobre inimigos naturais; e

8) Efeitos sobre organismos do solo - incluindo os decompositores

Anlise de Risco de OGMs

uma iniciativa internacional para desenvolver uma abordagem cientfica rigorosa visando avaliar os riscos potenciais das culturas OGMs resistentes a artrpodes sobre as espcies alvo e no-alvo . Adaptao de testes abordando a anlise de risco que seja aplicada internacionalmente dentro dos conceitos da toxicologia e da ecologia (meio ambiente).

Objetivos:
Formulao e avaliao de hipteses de risco, claras, usando o mximo de dados disponveis para a tomada de decises consistentes em cada etapa da avaliao. Espera-se com a ARP-OGM dar subsdios para as agncias de regulamentao que esto desenvolvendo suas prprias anlises e para harmonizar as exigncias regulatrias entre os diferentes pases e regies do mundo.

Determinao do Risco
Dose de Eficcia
Sistema de produo cultura, fenologia, Manejo, etc.

Risco = f (perigo, exposio)

Histria de Resistncia da espcie Dinmica populacional da espcie-alvo, Mobilidade da espcie Sub-estrutura

Risco Ambiental mais Eminente

Quebra da Funcionalidade Resistncia
Praga Resistente: Praga com capacidade de sobreviver em resposta a uma presso de seleo por ex. um inseto resistente a um inseticida. Bitipo indivduo ou populao de inseto distinguvel da sua espcie por critrios outros que no o morfolgico por ex. capacidade parastica.

Omoto&Maia

Omoto&Maia

Omoto&Maia

Omoto&Maia

Bases para a Anlise:

Curva de Mortalidade
linha Probit-Log

Dose Letal Mdia

suficiente para matar 50% populao

Concentrao Letal Mdia

na qual se observa 50% mortalidade.

Omoto&Maia

Bioensaio: distribuio de frequncia

Mort. (%)
3,0 9,0 15,0

Freqncia
20 40 70

700 600 500 400 300 200 100 0 0 20 40 60 80 100

20,0
30,0 40,0 50,0 60,0 70,0 85,0 93,0

100
300 550 600 550 300 150 100

96,0
98,0 99,0 100,0

90
85 80 78

Bioensaio: mortalidade acumulada

Dose (mg) 0,0 Mortal. (%) 0,0
Curva de Dose-Mortalidade (%)
100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0 5000 10000 15000 20000 25000

1.690,0 2.856,1 3.712,9 4.826,8 5.550,8 6.274,9 8.157,3 10.604,5 13.785,8 17.921,6 23.298,1

3,0 9,0 15,0 30,0 50,0 70,0 85,0 93,0 96,0 98,0 99,0

Porcentagem (%)

Dose (mg)

Bioensaio: log da dose/mortalidade

Log dose 3,22789 3,33000 3,45577 3,56972 3,68366 3,74436 3,79760 3,91155 Mortalidade (%) 3,0 5,0 10,0 15,0 25,0 40,0 60,0 88,0

Dose - Mortalidade (%)

100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 3,00

Mortalidade (%)

3,98000
4,02549 4,09000
3,50 Log Dose 4,00 4,50

93,0
95,0 97,0 98,0 99,0 99,5 99,9

4,13943 4,20000 4,25338 4,36732

Bioensaio: curva de mortalidade

Log Dose 3,2279 Probit 3 3,4 3,9 4,2 4,6 4,8 5.0 5,6 5,8

LC50=5626,18 mg
Log-Probit
8
7 6

3,3300 3,4558 3,5697 3,6837 3,7444 3,7976 3,9115 3,9800

Probit

4 3

4,0255
4,0900
y = 4,0764x - 10,3 R = 0,99
3,50 Log Dose 4,00 4,50

6,1
6,5

2
1 0 3,00

4,1394
4,2000 4,2534 4,3673

6,7
6,9 7,2 7,5

Gentica da Resistncia

Omoto&Maia

Gentica da Resistncia: dominncia

Omoto&Maia

Gentica de populaes
Equilbrio de Hardy-Weinberg
(p+q)2= p 2 (SS)+ 2pq(Ss)+ q 2(ss)= 1 onde: q= freqncia do Susceptvel p= freqncia do Resistente

Condies do equilbrio
Populao infinita e cruzamentos aleatrios No h seleo, migrao, mutao de alelos Meiose normal - gametognese ao acaso

Interaes gnicas

Omoto&Maia

Evoluo da Resistncia: frequncia

Premissas : monognica, dialtica (S e R) e autossmica

SS

RS

RR

SS

RS

RR

SS

RS

RR

__________________ Fonte: Georghiou (1983)

Evoluo da Resistncia: dominncia

Omoto&Maia

Omoto&Maia

Frequncia Crtica

Omoto&Maia

Tamanho da Amostra
Necessrio para detectar pelo menos um indivduo resistente
P(x1) = 1 P(x=0) P(x=0) = (1 f)n
Sample Size (n)

10000

0.1% R na pop.

Onde: n = tamanho da amostra f = freqncia de Resistente 1 - P(x1) = (1 f)n n log (1 f) = log [1 - P(x1)]

1000

1% R na pop.
100

10% R na pop.
10

n=

log [1 - P(x1)] log (1 f)

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

Probability of detection (%)

Roush & Miller (1986)

Omoto&Maia

Alta Dose Operacional

Depois que se conhece o alelo R, a alta ideal seria aquela concentrao que mata 100% dos indivduos heterozigotos (RS). Antes de se conhecer o alelo R, o EPA-US: alta dose a concentrao da toxina equivalente a 25 vezes a concentrao LC99 para a praga-alvo.

Bioensaio: CL de Toxinas Bt/LCM

Probabili -dade (%) 01 05 10 50 90 95 99

CL
(g / cm2 ) 1,05 7,04 19,37 689,81 24561,0 67622,0 452007,0

Cry 1 A(b) Intervalo confiana (95%) (g / cm2) Inferior Superior 0,20 2,97 2,48 2,37 13,98 5,45 8,81 32,39 8,30 36,46 459,55 1241,0 8823 129291,0 160,21 20041 491001,0 243,75 92947 6027744,0 535,58

CL

Cry 1F Intervalo confiana (95%) Inferior Superior 1,47 3,69 3,66 7,40 5,94 10,75 31,09 42,33 129,54 209,24 188,94 338,21 380,15 839,82

ndice de Inibio no Ganho Peso

LC50=689,81ng/cm2 =91,61% inibio peso
ndice de inibio da LCM/Cry 1A(b)
90 80
Arcsin % Inibio

LC50=36,46 ng/cm2 =89,81 % inibio peso

ndice de I nibio da LCM /Cry 1F
100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 y = 15,8x + 46,606 R2 = 0,7435

70
Arcsen % Inibio

60 50 40 30 20 10 0 0 1 2 Log dose 3 4 y = 16,08x + 27,562 R2 = 0,7594

1 Log Dose

LCM - 7 dias aps ecloso

Milho No-Bt

Milho- Bt

No-Preferncia LCM para milho Bt

No-Bt
DKB 330

Bt
DKB 330 YG

86,00 4,27%

11,00 4,47%

LCM neonatas, 24 h aps infestao

Recuperao de Larvas Pequenas

No. vivas=66 No. total= 105
800 700 600 500

Sobrevivncia = 62,86% Aps 10 dias de exposio

Peso Inicial 2a pesagem Peso de pupa

Peso (mg)

400 300 200

100 0
1 6 11 16 21 26 31 36 41 46 51 56 61 66 71 76 81 86 91 96 101

Populao

Evoluo da Resistncia Depende

Fatores que Afetam a Evoluo da Resistncia

Eventos de Bt disponveis rea cultivada com a cultura transgnica Espcies-alvo Impacto sobre os sobreviventes inverno Definio: pragas primrias e secundrias Impacto da expresso e dose

Manejo da Resistncia

Manejo da Resistncia/Insetos (MRI)

Manejo da Resistncia(Inseto): Esforo para
adiar ou prevenir a adaptao de espcies-praga pesticida pela preservao de genes de susceptibilidade na populao;

MR padro: combinao da estratgia de alta dose da toxina (25X DL99) com rea de refgio (rea cultivada com no Bt);

Pirmide de genes: combinao de mais de uma toxina de diferentes receptores.

rea de Refgio - AR
Objetivo da AR permitir desenvolvimento de insetos susceptveis em quantidade suficiente para reduzir a chance de cruzamento entre insetos resistentes e Reduzir a presso de seleo

Distncia da AR deve estar no mximo 800 metros de qualquer planta de milho Bt. Tamanho da rea de refgio
Frmulas empricas Atravs de Modelo (computador)

Manejo da Resistncia Milho Bt

Tamanho da rea de refgio:
10% da rea de milho para uma toxina 5% da rea de milho para duas toxinas 800 m disperso da mariposa no campo

Distncia da rea de Refgio:

Cultivar da rea de Refgio:

Deve ter mesmo ciclo Caractersticas semelhantes cultivar Bt. Preferencialmente o hbrido isognico

Funcionamento do Refgio
Disperso suficiente para garantir cruzamentos entre RR ou RS X SS rea de refgio para produzir SS

90% rea
Sobrevivncia RR ou RS

10% rea: produo SS

Perda potencial: 34% X 10%= 3,4%

Bt
800 m
Milho-Bt
___________________ Adaptado de Omoto&Maia

Refgio

Refgio: milho no-Bt com mesmo ciclo e porte

Refgio Estruturado I
800 m

Campo separado qual tamanho? qual distncia?

Refgio externo

rea definida com plantas no-Bt, dentro Refgio dentro do campo com OGM da lavoura Bt (faixas de plantas)

800 m

800 m

800 m

Refgio Estruturado II/piv-central

Milho no-Bt no centro do Piv
Refgio central 10%
800 m

Campo separado

Refgio externo

10%

800 m

800 m

rea definida com plantas Bt e no-Bt,

Refgio em Piv independente

Milho-Bt 800 m

Milho no-Bt

Milho-Bt

Refgio no Saco/mistura de semente

Mistura de sementes milho Bt e no-Bt no mesmo saco e foi aprovado nos EUA para 2012 Dificuldades operacionais/Empresa Facilidade para o semeio/produtor Efetividade do uso do refgio Distribuio uniforme do refgio Inviabilidade controle qumico Reduo da rea de refgio Melhor distribuio IN na rea Movimento de lagartas (+/-)

Pirmide/Sequncia de Genes

a 75% mortalidade RS para cada toxina b 50% mortalidade RS para cada toxina c 50% + 75% mortalidade RS das toxinas

Fonte: Roush (1998)

Monitoramento Ps-Liberao
Exemplo: Ostrinia nubilalis ECB/EUA
Biomassa Moralidade

________________________ Fonte: Siegfried et al 2008

Mortalidade da LCM em Cry 1F

Inibio da LCM em Cry 1F

Determinao do Perigo da Resistncia

Caracterizao da populao em risco
Histria de resistncia da espcie-alvo Variabilidade natural toxina do Bt Frequncia inicial do gene R ao Bt

Efetividade potencial da toxina transgnica

Qual a Dose?

Fluxo Gnico: o milho em referncia

Fontes de misturas adventcias

1. Transferncia de plen entre plantas fluxo gnico
2. Misturas de sementes (contaminaes) 3. Misturas de gros nas operaes de colheita,transporte e armazenamento 4. Plantas voluntrias
Fonte: Commission of the European Communities, Recomendations of 23 July 2003

Fluxo Gnico
Vertical: entre indivduos da mesma espcie
1. Algamas menos de 5% de autofecundao 2. Autgamas mais de 95% de autofecundao 3. Intermedirias entre 5% e 95% de autofecuandao

Horizontal: entre indivduos diferentes, distantes

geneticamente

Coexistncia
Estratgia para que os produtores agrcolas continuem a fazendo suas escolhas prtica utilizando variedades convencionais, cultivares transgnicos e cultivos orgnicos, de acordo com as obrigaes legais para rotulao e padres de pureza.
_________________________________________________________ Fonte: Commission of the European Communities, Recomendations of 23 July 2003

Caractersticas do Milho
Planta monica: inflorescncia masculina (pendo) e
feminina (boneca) na mesma planta

Liberao do plen: dura em mdia 13 dias Pendo: produz em mdia de 25 milhes de gros de plen Alta competio para fertilizao: 645 gros de
plen competem para fertilizar um nico estilo-estigma (cabelo)

Viabilidade no campo: aproximadamente 2 horas Polinizao: predominantemente pelo vento

__________________________________ Fontes: Bignotto 2002 e Luna et al 2001

Polinizao cruzada/milho
Distncia entre a lavouras Barreiras fsicas Condies climticas Velocidade do vento Topografia Sincronia das cultivares Arranjo espacial

__________________________________ Fonte: Eastham & Sweet. IN: European Environmental Agency, Environmental Issue Report 28, Capitulo 5.

Exemplos de Coexistncia
1. Manuteno da pureza gentica de linhagens elites em programas de melhoramento

2. Manuteno da pureza gentica de cultivares crioulas 3. Em cultivos de milhos especiais no transgnicos para consumo humano (speciality maize)
4. Em cultivos de milhos coloridos importantes na alimentao de povos latino-americanos 5. Cultivo de milho waxy para a industria de amido

Isolamento Espacial no Milho

Resultados de 16 ensaios no Canad e de 40 ensaios nos Estados Unidos

Gustafson et al. Crop Science 46:2133-2140, 2006.

Taxa de Cruzamento/Distncia
Milho
Soja

Indicador: resistncia herbicida

________________________________________ Fonte consultada: Siqueira et al.Cadernos de Cincia & Tecnologia, 21(1): 11-81, 2004

Regras de Coexistncia: Milho-Bt

CTNBio Decreto 5.991 22/11/2005 Liberao planejada 20/07/2006

Isolamento

de 400 m ou 40 dias

Liberao comercial 16/08/2007

Isolamento

de 100 m 20 m + 10 fileira milho no-Bt Hbrido de igual ciclo e igual porte

Obrigado!