Lipdios em superfcies

Monografia da Disciplina QBQ 5716 Biomolculas e Superfcies

Erika Temperly Rabak Tathyana Cristina M. C. Tumolo Vincius Curcino C. Vieira

2005

Resumo..............................................................................................................................3 Introduo..........................................................................................................................4 Tcnicas para a formao de filmes lipdicos ...................................................................7 Filmes de Langmuir-Blodgett (LB)...............................................................................7 Adsoro de filmes lipdicos em suportes slidos a partir de vesculas......................10 Black lipid membranes (BLM)...............................................................................17 Filmes na interface ar-lquido (filmes de Langmuir)...................................................19 Tcnicas utilizadas na caracterizao de filmes lipdicos e em suas interaes com outras molculas..............................................................................................................21 Microscopia de Fora Atmica (AFM).......................................................................21 Ressonncia Plasmnica de Superfcie (SPR).............................................................25 Elipsometria.................................................................................................................28 QCM-D (Microbalana de Cristal de Quartzo com dissipao).................................30 Microscopia de Fluorescncia.....................................................................................34 Gerao de segunda harmnica em superfcie (SHG).................................................36 Concluso........................................................................................................................40 Bibliografia......................................................................................................................41

Resumo O uso de filmes lipdicos formados em interfaces ar-lquido, lquidolquido e slido-lquido tem sido utilizado com grande freqncia e com grandes resultados em estudos de interao, como a associao entre protenas e membranas. Esses filmes so interessantes de serem estudados pois podem mimetizar superfcies celulares. Alm dos estudos envolvendo filmes lipdicos adsorvidos em suportes slidos ou nas interfaces ar-lquido (como os filmes de Langmuir) e lquido-lquido (black lipid membranes), h na literatura tambm estudos envolvendo lipossomas e vesculas gigantes em soluo. Aps a formao do filme, o mesmo pode ser caracterizado por uma srie de tcnicas, tais como microbalana de cristal de quartzo com dissipao (QCM-D) e microscopia de fora atmica (AFM). Pode-se obter informaes sobre a formao da camada lipdica (mono ou bicamada ou ainda se um filme vesicular), a cintica de adsoro em determinada superfcie e a espessura e a massa do filme adsorvido. Uma vez obtido o filme pela tcnica desejada e caracterizado por determinados mtodos, diversos estudos podem ser feitos. Entre eles a interao protena-membrana, devido importncia biolgica dessas interaes e que podem ser mimetizados com um filme lipdico. Como exemplo, os estudos de interao citocromo c com membranas constitudas de fosfolipdios carregados negativamente, como a cardiolipina, feitos com o auxlio de tcnicas como a AFM e o SPR, podem conduzir s respostas sobre o exato mecanismo de dissociao dessa protena da membrana mitocondrial interna, evento que est relacionado ao desencadeamento da apoptose (morte celular).

Introduo Os lipdios so compostos muito abundantes na natureza e encontrados em todas as clulas. So geralmente insolveis na gua e solveis em solventes orgnicos polares como clorofrmio e metanol. Basicamente podem ser classificados como cidos graxos, triacilgliceris, glicerofosfolipdios, esfingolipdios, e esterides. (1-2) Glicerofosfolipdios (tambm chamados de fosfolipdios) so importantes compostos de membranas biolgicas. Possuem longas caudas hidrofbicas e grupos cabea altamente hidroflicos, portanto so molculas anfiflicas. Os grupos cabea podem ser carregados positivamente ou negativamente, serem zwiterinicos ou ainda possurem grupos poliidroxilados no-carregados podem ocorrer.
Frmula de -X O H2 C O R2 C O CH O H2 C O P O
-

(3)

. A

Figura 1 exemplifica a estrutura de um fosfolipdio e alguns grupos cabea que

Nome do fosfolipdio NH3

+

H2 C R1 H2C

CH2

Fosfatidiletanolamina

CH2 N

CH3 CH3 CH3

Fosfatidilcolina (lecitina)

H2 C

CH OH

CH2 OH

Fosfatidilglicerol

Figura 1 Estrutura de um Fosfolipdio e exemplos de grupos cabea representados por X que podem ocorrer nessa molcula. As caudas hidrofbicas so representadas por R1 e R2.

A maioria dessas molculas fosfolipdicas normalmente se associa em bicamadas, devido interaes entre as cadeias e entre as cabeas polares. O modelo de bicamada lipdica (muitos estudos utilizam modelos de monocamadas lipdicas formadas em interfaces) tem sido muito utilizado para mimetizar as membranas celulares. Os fosfolipdios mais utilizados em estudos envolvendo mimticos de membrana so aqueles que apresentam o grupo cabea fosfatidilcolina, como DMPC, DPPC e DOPC (fosfolipdios com esse grupo cabea esto presentes em maior quantidade nas membranas celulares
(4,5)

. As estruturas para os dois ltimos so mostradas na Figura 2.

1,2-Dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC)

1,2-Dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DPPC)

Figura 2 Estruturas de dois fosfolipdios com o mesmo grupo cabea, mas com comprimentos da cauda hidrofbica distintos, alm da presena de insaturao na estrutura de DOPC. Esses fosfolipdios so muito utilizados em estudos de formao de filmes lipdicos.

A utilizao de fosfolipdios como mimticos de membrana pode ser feita com os seguintes sistemas: lipossomas, vesculas, vesculas unilamelares grandes (LUV), black lipid membrane, monocamadas e bicamadas lipdicas (6). O sistema de monocamadas ou bicamadas lipdicas formadas a partir do contato entre as solues de vesculas (ou lipossomas) e um suporte slido abriu caminho para o estudo da cintica de adsoro desses filmes, alm dos mecanismos envolvidos na associao entre a membrana e o suporte slido. Esse sistema mostrou-se eficiente como um modelo mimtico de membranas celulares devido sua simplicidade e reprodutibilidade, alm de possuir aplicaes em biotecnologia e no desenvolvimento de biosensores. A formao de filmes lipdicos nas diferentes interfaces pode ser caracterizada por tcnicas como a microscopia de fora atmica (AFM) microbalana de cristal de quartzo com dissipao (QCM-D) segunda harmnica em superfcie (SHG) Fourier (FTIR)
(12) (10) (8,9) (7,8)

, gerao de

, elipsometria

(11)

, reflectncia total e ressonncia

atenuada (ATR) e espectroscopia no infravermelho com transformada de , microscopia de fluorescncia

(16,17,18) (13,14,15)

plasmnica de superfcie (SPR) condutncia e capacitncia (19).

, alm de medidas eletroqumicas como

Embora toda a complexidade de constituintes presentes em uma membrana celular no seja possvel de se reproduzir experimentalmente com esses modelos mimticos, muitos eventos podem ser estudados: adeso celular em estudos envolvendo interao entre gangliosdeos e fosfolipdeos presentes em membranas celulares protena
(24,25) (20,21,22)

; ao do antimictico anfotericina B
(23)

em mimticos contendo esteris de membrana

; associao membrana-

; e membrana-quitosana (utilizada em pesquisas de entregas de

drogas e genes) biolgicas.

(26,27)

, imunoensaios

(28)

dentre outras aplicaes em pesquisas

Muitos estudos tm sido feitos tambm para serem avaliados os modos de interao entre lipossomas de composio variada em diferentes superfcies, como ltex (29), aerogis e xerogis (13), slica, mica, ouro oxidado ou modificado com alcanotiol superfcie slida quimicamente
(33) (32,32) (30)

e em sistemas polimricos auto-montados em ao desenvolvimento e aprimoramento de

, muitas vezes com os fosfolipdios modificados

levando

biosensores para deteco de interaes biomoleculares.

Tcnicas para a formao de filmes lipdicos Os estudos envolvendo a interao entre biomolculas e membrana podem ser feitos com modelos mimticos a partir de filmes lipdicos formados em interfaces. Esses modelos podem ser formados na interface lquido-ar (filmes de Langmuir), em interface lquido-lquido com um suporte slido (black lipid films), e tambm em superfcies slidas, as quais podem estar modificadas ou no. Os mtodos utilizados na formao desses filmes so mostrados a seguir. Filmes de Langmuir-Blodgett (LB)

Para a formao de filmes pela tcnica de Langmuir-Blodgett, deve-se primeiramente considerar a formao de uma monocamada do composto anfiflico em uma interface lquido-ar, a partir de uma soluo do anfiflico preparada em solvente orgnico. A monocamada formada na interface com a evaporao do solvente. Estudos cinticos mostram duas etapas para a formao dessa monocamada, esquematizadas simplificadamente na Figura 3.

Figura 3 Reorganizao interfacial das vesculas, durante a formao de uma monocamada na interface ar-gua (34).

A essa monocamada aplicada uma presso levando a autoorganizao das molculas, enquanto um substrato slido movimentado na interface ar-monocamada, em sentido vertical ascendente, ou ainda descendente. Isso permite a deposio da monocamada sobre o substrato, e se a movimentao do substrato for feita vrias vezes pode-se obter um filme orientado com mais de uma camada e de espessura definida para a deposio desses filmes mostrado na Figura 4.
(35)

. Um esquema

Com a realizao de repetidos movimentos no substrato slido (para cima e para baixo) na interface lquido-ar, pode-se obter filmes como os ilustrados na Figura 5.

Figura 4 Aparato utilizado para a deposio de filmes LB em substrato slido. So indicados: a) uma cuba, feita usualmente de Teflon; b) uma barra mvel, que permite o controle da presso aplicada monocamada; c) motor que movimenta a barra; d) dispositivo para controle da presso exercida sobre o filme; e) dispositivo para medir a presso na superfcie; f) motor para movimentar o substrato slido; g) substrato slido(32)

Primeira camada

Segunda camada

Terceira camada

Figura 5 Formao de filmes com multicamadas pela tcnica de Langmuir-Blodgett.

Na formao de filmes por essa tcnica, algumas consideraes devem ser feitas. O ambiente deve estar livre de contaminantes, com vibrao minimizada e ter controle de temperatura, atmosfera e umidade. A fase lquida geralmente gua, com pH e fora inica controlados, pois muitos anfiflicos so susceptveis a essas variaes. Alm disso, os anfiflicos utilizados devem estar livres de contaminantes, pois qualquer impureza poder ser incorporada durante a formao do filme. A natureza do substrato utilizado para deposio do filme ser modificada aps a formao da primeira camada. Se o processo de deposio for iniciado em um substrato hidroflico, ele torna-se hidrofbico aps a primeira transferncia de monocamada. Considerando molculas de fosfolipdios adsorvidas em uma superfcie hidroflica, aps a deposio da primeira camada as caudas hidrofbicas das molculas estaro voltadas para a soluo e na prxima deposio as caudas hidrofbicas dos fosfolipdios iro interagir, de modo que as cabeas polares estaro voltadas para o lquido, e haver uma bicamada adsorvida no filme. Este tipo de deposio tambm chamado de tipo Y. Para muitos grupos cabea polares este o modo de deposio mais estvel, pois entre as monocamadas adjacentes as interaes so hidrofbicahidrofbica ou hidroflica-hidroflica (36). Outro tipo de deposio tambm j observado para multicamadas de fosfolipdios o do tipo Z, onde as interaes entre as monocamadas adjacentes so do tipo hidroflica-hidrofbica. A Figura 6 ilustra a diferena entre os tipos Y e Z, encontrados em multicamadas de fosfolipdios.
Figura 6 Tipos distintos de deposio para filmes lipdicos em multicamadas.

Embora a deposio de filmes lipdicos pelo tipo Y j fosse conhecida

(37,38)

, a formao de filmes multicamadas pelo tipo Z foi mostrada 9

primeiramente em artigo de 1988 utilizando DPPC, onde os autores utilizaram a tcnica de ATR FTIR a fim de estudar a estrutura desses filmes
(39)

. Foi

sugerido que os trs grupos metila ligados ao nitrognio no grupo cabea poderiam exercer um importante papel na reduo do carter hidroflico do grupo cabea na monocamada formada na interface. Isso resultaria em uma energia livre melhor para a interao com a superfcie hidrofbica, levando formao de filmes tipo Z estveis. A deposio de uma monocamada de fosfolipdios pela tcnica de Langmuir-Blodgett pode ser feita tambm em um substrato j modificado quimicamente. Foi estudada recentemente a deposio de uma monocamada de DPPC em uma superfcie oxidada de slica previamente modificada por domnios de uma monocamada automontada de octadeciltriclorosilano
(40)

devido ao grande potencial desses domnios para ancorar molculas, inclusive molculas de fosfolipdios, levando ao aumento da estabilidade do filme lipdico adsorvido. Para a formao da monocamada de DPPC, uma soluo de DPPC preparada em clorofrmio foi colocada gota a gota na gua contida em uma cuba de Langmuir, e aps a evaporao do solvente, a monocamada de DPPC formada na interface ar-gua foi transferida para o substrato slido aplicandose um presso de 35 mN/m e com velocidade de movimentao vertical do substrato 5 mm/min, no sentido ascendente. Filmes LB lipdicos podem tambm ser formados por misturas de fosfolipdios. A fim de serem utilizados como modelos de membrana celular, filmes LB formados por DPPC / DOPC / gangliosdeo G M1 foram depositados em superfcie de mica, variando-se a porcentagem de cada um dos compostos para a obteno de filmes com a composio variada. A mistura de DPPC / DMPC / gangliosdeo foi preparada em clorofrmio/metanol (9:1), colocada com o auxlio de uma microseringa na soluo aquosa da cuba e aps a evaporao do solvente, uma monocamada constituda pela mistura de lipdios foi formada no substrato, com velocidade de compresso da monocamada 20mm/min, presso na superfcie 30 mN/m, e velocidade de deposio na mica 5 mm/min. As monocamadas obtidas com as diferentes composies foram analisadas por AFM (22). Adsoro de filmes lipdicos em suportes slidos a partir de vesculas

10

Um mtodo muito utilizado no estudo das propriedades de membranas e suas interaes com biomolculas a formao de monocamadas ou bicamadas lipdicas sobre suportes slidos, como slica e mica. Este modelo muito utilizado como um mimtico de superfcie celular, e pode ser tambm formado sobre suportes polimricos finos. Avanos nessa rea tem possibilitado uma variedade de estudos envolvendo membranas, protenas de membrana, imunoensaios e aprimoramento de biosensores
(41)

. A formao

dessas camadas lipdicas comumente feita com o uso de vesculas ou lipossomas adsorvidos em um suporte slido, que pode ser modificado ou no. O preparo de lipossomas iniciado pela dissoluo dos fosfolipdios de interesse em um solvente orgnico, como clorofrmio, seguindo com a evaporao desse solvente para que um fino filme lipdico seja formado no tubo onde a soluo estava contida. Com uma soluo tampo esse filme pode ser resuspendido, levando a formao de lipossomas com muitas bicamadas. Entre essas bicamadas h um espao aquoso que pode ser utilizado em estudos de transporte e permeabilidade de membranas. Por ser um sistema com propriedades reprodutveis, pode ser utilizado tambm em vrios estudos biofsicos. Entretanto, possui entre as desvantagens a heterogeneidade em tamanho de nmero de bicamadas e a inabilidade de se acessar os dois lados da bicamada quando utilizadas em estudos eletroqumicos. Os problemas na heterogeneidade no tamanho e no nmero de camadas em solues de lipossomas podem ser resolvidos com a utilizao de vesculas, formadas por mtodos que permitam a homogeneidade dos agregados presentes na soluo (os mtodos mais utilizados so extruso e sonicao). Agregados conhecidos como vesculas pequenas unilamelares (SUV) so formadas por esses mtodos, e pode-se diferenciar esses agregados das lipossomas atravs de medidas por espalhamento de luz (SUV possuem dimetro menor que as lipossomas, sendo formados por apenas uma bicamada lipdica). Entretanto, o pequeno tamanho desses agregados resulta em um pequeno raio de curvatura comparado ao de muitas membranas celulares. Desse modo, o empacotamento observado na bicamada no mimetiza o empacotamento de membranas biolgicas, alm do pequeno espao aquoso disponvel internamente, fazendo com que essas vesculas no sejam teis em estudos de transporte. A formao de vesculas unilamelares 11

com dimetro de cerca de 1 m (LUV, large unilamellar vesicles) pode ser feita utilizando o mtodo de extruso, e tais agregados podem ser utilizados em estudos de transportes de drogas, por exemplo, por apresentarem um espao aquoso maior do que aquele observado para as lipossomas e as vesculas unilamelares pequenas (3,6). A formao de uma bicamada lipdica em slica j foi estudada pela adio de SUV formadas por PC, DPPC, DODAB (brometo de dioctadecildimetilamnio) e DHP (dihexadecilfosfato) s partculas hidroflicas de slica (Aerosil OX-50) colocadas em eppendorf e levadas ao vrtex. Aps o perodo de sedimentao das partculas no eppendorf e centrifugao, a poro sobrenadante foi utilizada para determinar as concentraes dos compostos utilizados. A construo das curvas de isotermas de adsoro forneceu as informaes sobre as diferentes afinidades desses compostos pelas partculas de slica hidroflica
(42)

. Dando continuidade a essa pesquisa

(excluindo o composto DHP), os autores publicaram um estudo em que dados experimentais adicionais foram obtidos utilizando o corante merocianina 540 incorporado nas vesculas para detectar a ocorrncia de defeitos hidrofbicos na bicamada formada na superfcie de slica, conforme esquematizado na figura 7 (43).

Figura 7 Esquema da incorporao da molcula de corante na poro externa da vescula (a poro hidrofbica da molcula do corante situa-se na poro hidrofbica da vescula), e posterior adsoro na superfcie de slica. Informaes sobre a bicamada lipdica foram obtidos por dados de absorbncia (43).

Em anlises por QCM-D (microbalana de cristal de quartzo com dissipao), camadas de slica e mica so evaporadas na superfcie do cristal, seguindo os procedimentos descritos na literatura
(9,30,44)

. Se uma soluo de

vesculas for colocada em contato com essas camadas, j na cela do equipamento, o processo de adsoro com formao da camada lipdica 12

iniciado e pode ser monitorado em funo do tempo pela tcnica de QCM-D

(8,9,30,44,45)

Superfcies de ouro do sensor utilizados em equipamentos de Ressonncia Plasmnica de Superfcie (SPR) so modificados com uma monocamada auto-montada de alcanotiol (SAM), deixando a superfcie hidrofbica e permitindo que o processo de formao de uma monocamada lipdica ocorra sobre essa superfcie quando uma soluo contendo vesculas a cela de fluxo do equipamento, onde est localizado o sensor. Esses filmes so denominados de membranas de bicamada hbrida (HBM), por serem formados por uma monocamada de alcanotiol e por uma monocamada lipdica
(46,48,49)

.A

formao de bicamadas lipdicas sobre uma monocamada auto-montada de tiol tambm j foi descrito na literatura, com a utilizao de uma molcula de colesterol modificada com um grupo SH inserida entre molculas de tiol com terminao hidroxila esse suporte.
(49,50)

. A Figura 8 ilustra a bicamada lipdica formada sobre

Figura 8 Modelo de uma bicamada lipdica formada por um nico fosfolipdio adsorvida sobre uma camada mista auto-montada de tiol (49).

Bicamadas lipdicas podem ser formadas tambm sobre suportes polimricos, inclusive polieletrlitos. Para estudar a formao de bicamada contendo os fosfolipdios 1-estearoil-2-oleoil-fosfatidilserina (SOPS) e 1palmitoil-2-oleoil-fosfatidilcolina (POPC) em um suporte polimrico, uma camada do polieletrlito cloreto de polidialildimetilamnio (PDDA) foi montada sobre uma superfcie de ouro modificada com cido 11-mercaptoundecanico (MUA)
(51)

. Tal sistema foi utilizado para impedir o contato entre a bicamada

13

lipdica e o substrato. Aps a adsoro da camada de MUA (carregada negativamente), uma soluo contendo PDDA foi deixada em contato com essa superfcie modificada, a fim de que uma camada do polieletrlito fosse formada, via interaes eletrostticas. Solues de vesculas formadas apenas por SOPS ou pela mistura SOPS / POPC foram colocada em contato com esse sistema, e a adsoro monitorada por SPR e tambm por voltametria cclica. A insero do peptdio protegrina-1 que forma canal inico em membranas, possui atividade antimicrobiana e tem preferncia por membranas de clulas de bactrias carregadas negativamente foi monitorado, concluindo-se que o sistema utilizado como suporte para a bicamada poderia ser utilizado em estudos envolvendo protenas de membrana. Entretanto, protenas transmembrana maiores que a protegrina-1, se estudadas nesse sistema, poderiam entrar em contato com a superfcie metlica, prejudicando sua mobilidade na membrana
(41)

. Tal observao levou

ao desenvolvimento de um sistema multicamada formado pelos polieletrlitos cloreto de polidialildimetilamnio (PDDA) e poliestirenosulfonato (PSS), montados sobre a camada de MUA
(31)

, o qual devido a sua espessura ser

maior do que para o sistema MUA / PDDA poderia ser utilizado em estudos de protenas transmembranas grandes. No estudo, aps a adsoro da camada de MUA, solues de PDDA (positivo), PSS (negativo) e novamente PDDA foram colocadas consecutivamente, de modo que o sistema formado camada por camada, via interaes eletrostticas entre os polieletrlitos. Solues de vesculas formadas apenas por SOPS ou pela mistura SOPS / POPC foram colocada em contato com esse sistema, e a adsoro monitorada por SPR e fluorescncia. Novamente, a insero de protegrina-1 foi monitorada, obtendo resultados satisfatrios nessa associao membrana-peptdio observados tambm por AFM. Assim, demonstrou-se a aplicabilidade desse sistema para estudos que envolvem protenas transmembranas, o qual previne que as protenas adsorvidas na bicamada entrem em contato com a superfcie metlica alm de permitir a mobilidade lateral dos componentes de membrana estudados, reproduzindo as caractersticas de uma clula. So apresentados na Figura 9 dois esquemas que ilustram os sistemas utilizados nesses estudos.

14

Figura 9 Ilustrao dos sistemas de polieletrlitos utilizados na formao de bicamada lipdica para o estudo da interao membrana-peptdio (31,51).

Ainda focalizando o estudo de protenas de membrana, um novo mtodo para a formao de bicamada lipdica em suporte slido foi proposto visando a formao de bicamadas lipdicas livres de defeitos em sua estrutura. Inicialmente uma superfcie de xido de alumnio silanizada com soluo de aminopropildimetiletoxisilano (ADMS), criando grupos amino nessa superfcie. Uma soluo de NHS-LC-biotina deixada sobre essa superfcie por um determinado tempo e, aps um fluxo de tampo, uma soluo de estreptavidina colocada em contato as molculas de NHS-biotina adsorvidas na superfcie. Vesculas preparadas com DPPE biotinilado (alm de egg-PC e DOPE, estes em maior porcentagem e tambm NBD-DPPE) entram em contato com a camada de estreptavidina. Dessa maneira as interaes so estabelecidas especificamente (estreptavidina associa-se de modo especfico com molculas de biotina, tanto na superfce quanto com as molculas de lipdio biotinilado). As vesculas no adsorvidas especificamente so removidas com sucessivas trocas de tampo. A formao de bicamada lipdica finalizada com a troca da soluo tampo por uma soluo 30% de PEG (polietilenoglicol). Nesse sistema o polmero PEG torna-se um agente de fuso das vesculas, disparando rapidamente o processo de formao da bicamada lipdica. Experimentos como esse foram tambm realizados em uma superfcie de vidro, e os resultados obtidos mostram que a formao e as propriedades das bicamadas ancoradas so idnticas qualquer que seja o substrato, abrindo possibilidades para novos estudos. Entretanto a presena de PE nas vesculas

15

mostrou-se essencial na etapa de fuso promovida por PEG. A Figura 10 ilustra as etapas necessrias at a formao de bicamada lipdica induzida por PEG.

Figura 10 Esquema da formao de bicamada lipdica em suporte de estreptavidina em duas etapas. No primeira passo as vesculas so acumuladas na superfcie modificada por estreptavidina, com especificidade de ligao com os lipdios biotinilados. O segundo passo induz a formao da bicamada com a introduo de PEG no sistema, o qual induz a fuso entre as vesculas imobilizadas (33).

16

Black lipid membranes (BLM) Embora no pertena categoria de filmes lipdicos formados em suportes slidos, o modelo de membranas BLM tem tido uma grande participao em estudos envolvendo mimticos de membranas biolgicas, e por esse motivo ser descrito nesse trabalho. Tendo sido apresentado h mais de 40 anos, esse modelo especialmente til devido sua sensibilidade modificao de propriedades eltricas da membrana, como condutncia e constante dieltrica. o nico sistema a permitir que medidas de condutividade eltrica sejam feitas, colocando-se eletrodos em ambos lados da bicamada fosfolipdica (6,52). O comportamento ptico observado durante a formao dessas bicamadas resultou na denominao black lipid membranes, ou bicamada lipdica escura. Dois mtodos para a formao dessas membranas so descritos. O primeiro utiliza os lipdios dissolvidos em solvente orgnico, como decano e hexano, colocados atravs de uma abertura localizada na parede de um recipiente de Teflon imerso em soluo aquosa. O filme atravessa essa abertura at a formao de uma bicamada simples. Uma desvantagem a permanncia do solvente no meio em que se forma a bicamada. O segundo mtodo faz uso do espalhamento dos lipdios sobre a superfcie de um tampo com o auxlio de um solvente (forma-se desse modo uma monocamada lipdica na superfcie do tampo). Abaixando-se o nvel do tampo at a abertura localizada no substrato slido, a primeira monocamada formada. Elevando-se novamente o nvel do meio aquoso h a formao da segunda monocamada, gerando dessa maneira a bicamada lipdica. Neste caso, a presena de solvente no meio menor do que no primeiro mtodo apresentado. Entretanto, em ambos observa-se que na formao da bicamada a membrana torna-se opaca devido interferncia destrutiva da luz refletida dos dois lados da bicamada (sendo percebidos pontos cinza-escuros espalhando-se pelo filme)
(6,52)

. A formao de BLMs ilustrada na Figura 11.

17

Figura 11 Esquema da formao de black lipid membranes.

Medidas eletroqumicas so ento possveis porque podem ser colocados eletrodos nas duas faces da membrana, sendo possvel tambm modificao do tampo em qualquer dos lados em que a membrana est exposta (6,52,53). Esse modelo mimtico de membrana pode ser aplicado em estudos de interao membrana-membrana, fuso de membrana, transporte molecular transmembrana e lateral, transporte de prtons, incorporao de porinas mitocondriais, entre outras aplicaes
(52,19,53,54,55)

. Colocando-se duas BLMs

separadas por distncias muito curtas pode-se investigar a interao entre as bicamadas, com aplicao no estudo de fuso de membranas. Utilizando-se essa fuso, pode-se estudar a assimetria gerada na membrana pela diferena de composio lipdica entre as bicamadas utilizadas (53). Em um interessante estudo mostrado na literatura, a interao de compostos odorantes com uma BLM foi utilizada como base no
(56)

desenvolvimento de um sensor potenciomtrico para molculas neutras

Bicamadas de lecitina modificadas com a introduo de -caroteno foram formadas em um orficio de uma divisria de Teflon, separando dois meios contendo NaCl. Mudanas de potencial foram observadas na adio de solues etanlicas de alguns compostos odorantes, como citral, mentol e geraniol, um dos compartimentos. Foi possvel observar o grau de despolarizao da membrana modificada com o -caroteno causado pelos odorantes, em comparao uma membrana composta apenas de fosfolipdio,

18

alm do aumento da sensibilidade para deteco de molculas neutras por potenciometria. Filmes na interface ar-lquido (filmes de Langmuir) Filmes lipdicos de Langmuir, formados na interface ar-gua, tambm no constituem exemplos de camadas lipdicas em suportes slidos. Mas devido sua relevncia e a grande quantidade de artigos cientficos que utilizam essa tcnica em estudos de formao de filmes lipdicos, um breve comentrio sobre a tcnica e algumas aplicaes desses filmes so mostrados a seguir. A formao de um filme de Langmuir constitudo por fosfolipdios segue basicamente o mesmo estgio inicial de formao dos filmes LB: uma determinada quantidade de uma soluo de fosfolipdio ou uma mistura de lipdios preparada em um solvente orgnico (geralmente clorofrmio) colocada na interface ar-gua, de modo que uma monocamada contendo os anfiflicos seja formada aps a evaporao do solvente. Controlando-se a presso aplicada essa monocamada, controla-se tambm o grau de organizao das molculas na interface. Entretanto, os estudos com filmes lipdicos de Langmuir utilizam a monocamada formada na prpria interface, sem a formao de filmes em suportes slidos, como os filmes LB. Utilizando filmes na interface ar-gua, a interao entre DPPC e etilpalmitato (EP) foi estudada, obtendo-se isotermas de adsoro que fornecem informaes relevantes sobre o empacotamento dessa monocamada devido s interaes entre os lipdios
(57)

. Os dados experimentais desse

trabalho mostraram que a interao entre DPPC e EP leva reduo da rea superficial por molcula, o que pode ser relevante para sistemas biolgicos, j que a reduo na rea de membranas pode estar relacionado diminuio do tamanho de clulas e com o aumento de sua esfericidade, com importncia na etapa de diferenciao celular. Filmes de Langmuir constitudos de dipalmitoilfosfatidiletanolamina (DPPE) foram utilizados no estudo da interao dessa monocamada com uma protena que desempenha papel fundamental na diviso celular de bactrias (denominada FtsZ). A monocamada formada apenas com DPPE foi escolhida

19

pelo fato desse fosfolipdio ser o componente principal da membrana interna da bactria E. coli (58). A interao entre o antimictico anfotericina B e monocamadas de DOPC contendo esteris de membranas celulares foi estudada a partir da formao de filmes constitudos de DOPC-ergosterol e DOPC colesterol na interface ar-gua. Informaes sobre o modo de associao entre o antimictico e as membranas puderam ser obtidas, levantando hipteses sobre o mecanismo de ao desse composto que leva morte da clula microbiana
(23)

20

Tcnicas utilizadas na caracterizao de filmes lipdicos e em suas interaes com outras molculas A formao de um filme lipdico sobre uma superfcie pode ser caracterizada mediante a utilizao de diversos mtodos, os quais podem fornecer informaes sobre a cintica de formao do filme, sua topografia, espessura, massa do material adsorvido, mudana conformacional das vesculas na superfcie, alm da homogeneidade e fluidez da camada lipdica. Os mtodos mais utilizados e descritos na literatura para a obteno dessas informaes so mostrados a seguir, juntamente com uma breve explicao dos princpios operacionais do mtodo, Microscopia de Fora Atmica (AFM) A tcnica de AFM foi desenvolvida por Bining et al. por volta de 1986 e desde ento tem se destacado por permitir a aquisio de imagens da topografia de superfcies tanto condutoras como no-condutoras, e em algumas situaes essas imagens possuem resoluo atmica
(36,59)

. Os

principais componentes de um microscpio de fora atmica so: uma ponta de prova montada em uma alavanca (cantilever), um sensor de deflexo da alavanca, um microposicionador piezoeltrico e um mecanismo eltrico para esse microposicionador. Um sistema ptico e um fotodiodo quadrante sensvel deflexo da alavanca so utilizados para a deteco nesses equipamentos. Desajustes da alavanca podem ser corrigidos com esse sistema. Um esquema ilustrando os componentes bsicos utilizados nessa tcnica mostrado na Figura 12.

21

Figura 12 Ilustrao dos componentes bsicos da tcnica de AFM e modo de deteco da topologia da superfcie da amostra.

As imagens topogrficas so obtidas atravs do movimento da ponta de prova do microscpio na superfcie da amostra causando a deflexo da alavanca, a qual proporcional a fora de interao que ocorre entre a ponto da prova e as molculas na superfcie (essa fora est na faixa de 10 -9 10-10 N)
(60)

. Os modos de imagem podem ser divididos em contato e no contato. A

operao do microscpio na regio atrativa define o modo no contato, e nesse caso a alavanca puxada por foras atrativas, como van der Waals, e encontra-se curvada em direo amostra. Imagens obtidas por contato formam-se com operaes na regio repulsiva, e a alavanca est distanciada da amostra devido s foras repulsivas. Caractersticas da ponta de prova como a sua forma e sua geometria so pontos crticos na obteno das imagens. Quanto alavanca, so importantes a constante de elasticidade (pois determina a fora entre a ponta de prova e a amostra) e a oscilao na freqncia de ressonncia quando a alavanca movida da sua posio de equilbrio ( determinada por propriedades mecnicas da alavanca) (59). Utilizando-se essa tcnica, muitos estudos envolvendo camadas lipdicas tm sido feitos, como propriedades de membrana e aspectos da fuso de vesculas, em diferentes substratos, com diferentes composies de fosfolipdios e tambm variao na fora inica. Foi demonstrado, por exemplo, que a presena de clcio induz a fuso das vesculas em uma superfcie de mica, enquanto que na sua ausncia as vesculas adsorviam, mas no ocorria

22

fuso

(8,61)

. Alm disso, a tcnica de AFM pode ser empregada tambm nos

estudos de interao membrana com protenas. A formao de bicamada lipdica em suporte de estreptavidina foi monitorada etapa por etapa pela tcnica de AFM. As seqncias de tratamento da superfcie at a formao do filme lipdico so mostrados na Figura 13 (33).

Figura 13 As imagens da seqncia I mostram as etapas de formao da camada de estreptoavidina: a) superfcie de xido de alumnio sem funcionalizao; b) aps silanizao e tratamento com NHS-biotina; c) aps 45 minutos com soluo de estreptoavidina e lavagem com tampo. A seqncia II mostra as etapas de formao da bicamada lipdica: a) subcamada de streptoavidina, com uniformizao da superfcie, b) vesculas imobilizadas na subcamada de estreptoavidina; c) aps tratamento com PEG; d) controle, a camada lipdica foi removida com detergente (octadecil glicopiranosideo OG).

Pode ser facilmente observado na imagem c da seqncia II que aps o tratamento uma bicamada lipdica contnua sobre a subcamada de estreptoavidina formada. As imagens por AFM podem ser tambm obtidas com uma escala de cores que indica a espessura dos filmes formados. Desse modo, monocamadas compostas de gangliosideo GM1 / DPPC / DOPC foram 23

investigadas em uma superfcie de mica, juntamente com os efeitos da variao da composio desses lipdios na monocamada. A Figura 14 mostra diferentes imagens obtidas com a variao na composio dessas camadas (22).

Figura 14 Imagens por AFM para monocamadas formadas por GM1 / DPPC / DOPC, nas respectivas propores indicadas.

Nota-se que a topologia da superfcie altamente modificada com a variao da composio da camada. Estes resultados levaram sugesto de que os diferentes estados da monocamada dependentes da composio podem estar relacionados um papel especfico (como transduo de sinal ou especfico reconhecimento celular) desempenhado pelo gangliosdeo G M1 em cada rgo, pois as concentraes de GM1, DPPC e fosfolipdios insaturados nas membranas celulares dos rgos so diferentes.

24

Ressonncia Plasmnica de Superfcie (SPR) Informaes cinticas de interaes biomoleculares podem ser obtidas em tempo real atravs da tcnica de SPR, um mtodo muito utilizado na determinao das constantes de associao e dissociao de molculas que ocorrem em uma interface slido-lquido. O fenmeno ressonante ocorre como resultado da reflexo interna total de um feixe de luz em uma interface slido (metal) lquido. Essa reflexo observada em situaes onde a luz se propaga em um meio de alto ndice de refrao (como vidro) e aps atingir uma interface em um meio com ndice de refrao menor, com um ngulo de incidncia acima do ngulo crtico, a luz refletida totalmente na interface propagando-se novamente no meio de alto ndice de refrao. Embora a luz seja totalmente refletida, um componente do momento de luz incidente, denominado onda evanescente, penetra a uma certa distncia no meio de ndice de refrao menor. Se a luz incidente monocromtica e plano polarizada e um filme fino de metal, como o ouro, formado na interface entre os meios, a onda evanescente ir interagir com eltrons livres oscilantes na superfcie do filme de metal, gerando plasmons de superfcie. Desse modo, quando ocorre o fenmeno de ressonncia plasmnica de superfcie, a energia da luz incidente perdida no filme de metal, resultando em um decrscimo na intensidade da luz refletida, para um determinado comprimento de onda. Esse fenmeno ocorre em um determinado ngulo da luz incidente, o qual dependente do ndice de refrao do meio prximo superfcie de metal, e tambm do metal (o vetor da onda plasmnica depende do ndice de refrao do metal e da amostra sobre a superfcie desse metal), sendo percebida at uma distncia de cerca de 300 nm da superfcie de metal. A troca de uma soluo tampo presente na superfcie do metal por uma soluo contendo biomolculas, por exemplo, altera o ndice de refrao do meio onde ocorre a penetrao da onda evanescente. Com isso, altera-se tambm a ngulo de incidncia necessrio para criar o fenmeno de SPR (ngulo de SPR), o qual detectado pelo instrumento. Essa mudana igualmente observada durante um processo de adsoro no filme de metal, e com o monitoramento contnuo das variaes no ndice de refrao, detectadas como uma variao no ngulo de ressonncia, os valores obtidos podem ser 25

colocados em funo do tempo, obtendo-se um sensorgrama. Amostras de aspecto opaco tambm podem ser analisadas por SPR, pois a onda evanescente que penetra no meio e no a luz incidente. O tratamento dos dados fornece valores de espessura do filme formado sobre o metal e quantidade do composto adsorvido, alm da obteno dos parmetros cinticos. Para determinao desses valores em experimentos de adsoro a quantidade de material ligado na superfcie obtida pela diferena de valores obtidos nas leituras da soluo tampo e da soluo de interesse um equipamento de SPR.
(62)

. A figura

15 esquematiza como uma associao entre molculas pode ser medida em

Figura 15 Ilustrao dos componentes de um sensor de Ressonncia Plasmnica de Superfcie, onde o analito levado at a superfcie do sensor atravs de uma cela de fluxo. No detector, 1 indica o ngulo de SPR medido com a presena do ligante na superfcie do sensor, e 2 o ngulo observado na ligao entre o analito e o ligante.

A cintica de formao de uma monocamada fosfolipdica a partir de vesculas em soluo em uma monocamada de alcanotiol hidrofbica foi descrita por um modelo que considera a concentrao de lipdios, difuso e reorganizao das molculas na superfcie
(46)

. Os dados cinticos que

possibilitaram o tratamento foram obtidos pela tcnica de SPR. A Figura 16 mostra o grfico obtido utilizando-se vesculas com diferentes concentraes de DMPC adsorvidas em uma monocamada de dodecanotiol auto-montada sobre ouro.

26

Figura 16 Cintica de formao de camada lipdica obtida por SPR. As vesculas foram colocadas na cela de fluxo no tempo t=0. Os pontos representam dados experimentais, ajustados com equao apropriada (linha slida). As concentraes das vesculas em soluo so indicadas.

Os dados obtidos neste estudo mostraram que a cintica de formao do filme lipdico sobre monocamada de alcanotiol ocorre pelo rearranjo das vesculas na superfcie hidrofbica e dependente da concentrao de lipdio. Em altas concentraes h dependncia da constante de difuso das vesculas
(46)

. Estudos cinticos de formao de filme lipdico em monocamadas auto-

montadas de tiol foram tambm realizadas variando-se a composio do filme de tiol com terminao hidroflica e hidrofbica, tambm monitorados por SPR
(49,50,63)

. Desses estudos, foram propostos possveis mecanismos para a

adsoro de vesculas nessas superfcies, mostrados na Figura 17.

27

Figura 17 Possveis mecanismos para ruptura e fuso de vesculas em superfcie de tiol hidrofbico (a) e hidroflico (b).

A velocidade inicial de formao de camada lipdica em SAM de tiol com terminao hidroflica ou mista mais rpida do que aquela observada para SAM de tiol hidrofbico. Isso deve-se provavelmente necessidade das vesculas romperem sua camada externa para permitirem que as caudas hidrofbicas entrem em contato com as cadeias alqulicas dos tiis hidrofbicos. Posteriormente deve ocorrer a abertura da vescula e difuso na camada de tiol. Esses processos so termodinamicamente mais desfavorveis do que aqueles necessrios para a formao de uma bicamada sobre SAM de tiol hidroflico. A tcnica de SPR, alm de possibilitar a caracterizao cintica da formao de filmes lipdicos em diferentes superfcies, tambm muito utilizada nos estudos de cintica de associao protenas e membranas
27,31,51, 64,65) (9,

Elipsometria A adsoro de filmes em um substrato pode ser monitorada pela tcnica de elipsometria, que fornece tambm valores de espessura para o filme adsorvido. Em um aparelho de elipsometria, uma luz monocromtica plano polarizada (p = ngulo de polarizao) atinge uma superfcie. Um compensador muda o feixe de luz refletido que elipticamente polarizado para plano

28

polarizada (a = ngulo de polarizao). Um analisador determina ento o ngulo a, pelo qual o compensador polarizou o feixe. A figura 18 ilustra os componentes de um elipsmetro tpico.

Figura 18 Descrio esquematizada dos componentes de um elipsmetro.

Esses dois ngulos (a e p) fornecem a diferena de fase entre os componentes paralelo e perpendicular (), e a mudana na proporo das amplitudes dos dois componentes (tg ), onde = 2p + /2 e = a. Para uma superfcie limpa, e esto diretamente relacionados ao ndice de refrao complexo da superfcie e so denominados ngulos elipsomtricos. Se um filme com ndice de refrao nf adsorver na superfcie, esses ngulos estaro relacionados aos ndices de refrao complexos tanto do filme quanto do substrato, e tambm espessura do filme. Desse modo, a tcnica permite monitorar fenmenos de adsoro (36,44). Muitos estudos focam o uso da elipsometria na determinao de espessura de camadas lipdicas formadas em suporte slidos, em relao ao tempo de exposio dos fosfolipdios ao suporte
(66,67)

. Desse modo, variando-

se a composio e a porcentagem dos fosfolipdios estudados, alm do substrato utilizado, pode-se obter a espessura e cintica de formao dos filmes, alm de caracterizar dentre os filmes estudados o que possui melhor estabilidade para aplicao em estudos com protenas ou como biosensores. Os grficos mostrados na Figura 19 foram obtidos em um estudo de formao de filme lipdico em wafers de silcio variando-se a porcentagem dos lipdios utilizados.

29

Figura 19 Formao de filmes constitudos de 50 mol% DPPC, 20 mol% DPPG and 30 mol% DPPE+Colesterol, nas propores DPPE/Col 0,3; 2 e 14 respectivamente nos grficos 1,2 e 3. O monitoramento foi feito por elipsometria. O seta em a indica adio de lipossomas, b indica adio de cloreto de clcio e c indica tampo.

Alm dessa superfcie, o estudo tambm mostrou dados cinticos obtidos por elipsometria em uma superfcie de platina. A adio de clcio foi feita para determinar sua influencia na formao do filme lipdico e na sua estabilidade. O mesmo trabalho mostrou tambm como a presena de protenas (extradas de crebro bovino) na preparao de lipossomas pode influenciar a formao dos filmes (66).

QCM-D (Microbalana de Cristal de Quartzo com dissipao) Esta uma tcnica custo-efetiva simples e que permite a anlise de massa de amostra adsorvida em determinada superfcie baseada no efeito piezoeltrico. Tambm analisa a amostra termodinmicamente, parmetros cinticos e viscoelasticidade do sistema (68).

30

O princpio est na proporcionalidade entre a variao da freqncia de ressonncia do cristal de quartzo e a massa depositada sobre o mesmo. A freqncia de vibrao diminui com pequena quantidade de material depositado sobre a superfcie do cristal piezoeltrico. A relao dada pela equao que diz que a variao da freqncia f (Hz) resulta da mudana da massa M (g) (sendo proporcionais) e inversamente proporcional rea piezoeltrica do cristal (em cm2) (69). A Figura 20 esquematiza a tcnica.

Figura 20 Ilustrao esquemtica de equipamento de QCM utilizado em anlises com clulas.

A tcnica se popularizou quando permitiu a anlise de mudana de massas em sistemas lquidos-slidos e sobre eletrodos de metal. Dentre as principais vantagens da QCM esto a permisso de captao de sinais mesmo em mudanas abruptas no sistema; eliminao da necessidade de marcao da amostra para transduo de sinal e a anlise de propriedade de biofilmes durante sua formao e depois com perturbaes na sua natureza. Um instrumento de QCM-D, utilizado em muitos estudos, monitora simultaneamente um segundo parmetro importante, denominado fator de dissipao do oscilador (D). As medidas de dissipao fornecem informaes qualitativas e tambm quantitativas sobre as propriedades viscoelsticas do filme adsorvido e permite o modelamento terico para a resposta obtida por QCM-D. A dissipao geralmente elevada se o filme adsorvido tem um componente viscoso tambm elevado. Tal filme deforma com maior facilidade e dissipa a energia guardada no oscilador devido frico interna durante a 31

deformao cclica na escala atmica. importante frisar tambm que a tcnica de QCM-D sensvel tanto massa do filme adsorvido quanto massa de gua presente no sistema, como o tampo no interior de vesculas intactas na superfcie e gua ao redor de protenas adsorvidas em determinada superfcie. Alm disso, a tcnica tambm sensvel mudanas de viscosidade no lquido em contato com o cristal (9,45). Em um estudo de adsoro em slica
(8)

, trs preparaes de vesculas

constitudas por DOPC / DOPS (1:1), DOPC / DOPS (4:1) e DOTAP foram utilizadas, de modo a investigar as mudanas conformacionais que ocorriam com as vesculas quando em contato com o suporte de slica. O monitoramento foi feito por QCM-D, e os dados obtidos so mostrados na Figura 21.

Figura 21 Respostas obtidas por QCM-D para a deposio de misturas diferentes de fosfolipdios em slica. Em (A) DOTAP, (B) DOPC / DOPS (1:1), (C) DOPC / DOPS (4:1). As ilustraes indicam as camadas lipdicas formadas em cada situao (47).

Para vesculas de DOPC / DOPS na proporo 1:1 observa-se que a frequancia diminui monotonicamente at o equilbrio em torno de 54 Hz, e a dissipao aumenta, havendo equilbrio por volta de 2,9 x 10 -6. Esses valores indicam a formao de uma camada flexvel de vesculas (supported vesicular layer - SVL), adsorvida de maneira estvel aps a lavagem com tampo. Para vesculas de DOPC / DOPS com proporo 4:1, observa-se inicialmente o mesmo caso descrito acima (diminuio na freqncia, aumento na dissipao), entretanto um segundo estgio observado, com aumento na

32

freqncia e diminuio na dissipao. Isso indica a adsoro inicial de uma camada vesicular, seguido pela formao de uma bicamada lipdica contnua aps a ruptura das vesculas. Para os dados obtidos com as vesculas de DOTAP, h formao de uma bicamada lipdica, com possvel rompimento espontneo das vesculas. A adsoro em superfcies diferentes tambm pode ser verificada com QCM-D. Vesculas de egg-PC foram estudadas em superfcie de ouro modificada por alcanotiol, slica e ouro oxidado. A Figura 22 mostra os grficos obtidos nesse estudo (30).

Figura 22 Variaes nas freqncias de ressonncia e dissipao, para as trs superfcies estudadas. As ilustraes indicam as provveis camadas que so formadas em cada um dos casos.

A freqncia de 13 Hz obtida no experimento com alcanotiol a metade do valor observado para a superfcie de slica (-26 Hz), o que indica a formao de uma monocamada lipdica sobre a camada de alcanotiol. A formao de bicamada em slica novamente precedida da adsoro de vesculas intactas na superfcie (freqncia diminui, dissipao aumenta), ocorrendo aps determinado tempo a ruptura dessas vesculas e formao de bicamada. Em ouro oxidado h formao de uma camada vesicular, com saturao alcanada rapidamente. A elevada dissipao indica que a estrutura do filme adsorvido diferente de uma monocamada ou bicamada.

33

Microscopia de Fluorescncia Pode-se dizer que nos estudos feitos com microscopia de fluorescncia, a amostra a prpria fonte luminosa. Esta tcnica baseia-se no fenmeno de que certos materiais emitem uma energia detectvel como luz visvel quando irradiados com uma fonte luminosa de comprimento de onda especfico. A amostra pode ser tanto fluorescente em seu estado natural (como clorofila e alguns minerais), como devido um tratamento com compostos qumicos fluorescentes. Uma fonte de luz com determinado comprimento de onda, aps passar por um filtro que a seleciona para o material a ser analisado, alcana os tomos da amostra fazendo com que os eltrons sejam excitados para um nvel de energia mais alto. Quando o eltron no orbital de maior energia possui spin com orientao oposta ao do segundo eltron no orbital inferior a multiplicidade de spin a mesma. Isso ocorre no estado excitado singlete. Ao retornar ao estado fundamental, o eltron no precisa mudar sua orientao de spin. Nesse retorno ocorre a emisso de luz, e o material fluoresce, o que pode ser detectado com um microscpio. Para tornar-se visvel, a luz emitida separada da luz de excitao mais brilhante com um segundo filtro. A luz emitida de menor energia e tem comprimento de onda maior. Os esquemas da Figura 23 mostram o modo de deteco simplificado em um microscpio de fluorescncia e o princpio dessa tcnica.

34

Figura 23 esquerda ilustra-se a deteco da fluorescncia de uma amostra. No esquema direita, mostrado de que maneira a espcie fluoresce: a energia absorvida pelo tomo (1), excitando o eltron a um nvel mais alto de energia (2). Ao retornar para o estado fundamental, h emisso de ftons, sendo observada a fluorescncia (3).

Essa tcnica revela a presena de material fluorescente com grande sensibilidade cerca de 50 molculas fluorescentes por mL so suficientes para serem detectadas. Aliado a isso pode-se estudar tambm os processos dinmicos de macromolculas, como difuso, constantes de ligao, alm de monitorar importantes funes celulares, como endo e exocitose, transduo de sinal e gerao de potencial transmembrana (70,71). Sistemas sintticos, como vesculas polimricas, podem tambm ser estudados com a microscopia de fluorescncia
(60)

. Nesses casos, um corante

fluorescente solvel em gua encapsulado durante a formao das vesculas, seguido pela excluso de molculas de corantes do espao extra-vesicular (por cromatografia de excluso de tamanho, dilise, ultrafiltrao ou centrifugao). A formao de bicamada contnua sobre um suporte de estreptavidina auxiliado por PEG foi monitorado por fluorescncia, entre outras tcnicas
(33)

As vesculas continham em sua composio o fosfolipdio fluorforo 1,2dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfo-etanolamina-N-(7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-il), NBD-DPPE, em concentrao 1 2 % em mol. A fluorescncia foi utilizada principalmente para obter dados quanto eficincia do polmero PEG no processo de fuso das vesculas, avaliando-se as propriedades de dinmica lateral dos lipdios antes e aps o tratamento com PEG. As imagens obtidas so mostradas na Figura 24.

35

Figura 24 As imagens da seqncia A foram obtidas antes do tratamento com PEG. A seqncia B mostra imagens obtidas aps o tratamento com PEG. Como superfcie para a camada de streptavidina foi utilizado xido de alumnio.

Na seqncia A observou-se que as vesculas esto corretamente imobilizadas no suporte de streptavidina e que a taxa de fuso pode ser desprezada (coeficiente de difuso 10-11 cm2 s-1). Aps o tratamento com PEG (seqncia B), observa-se um comportamento completamente diferente. O coeficiente de difuso dos lipdios NBD-DPPE foi estimado em 2 x 10-8 cm2 s-1. Verificou-se dessa maneira que a presena de PEG provoca a formao de uma bicamada lipdica contnua no suporte de streptavidina.

Gerao de segunda harmnica em superfcie (SHG) A gerao de segunda harmnica em superfcie um processo que surge da radiao de dipolos oscilantes em 2 em um meio induzido no36

linearmente por um laser na freqncia , e permitido apenas em sistemas sem inverso de simetria sob a aproximao do dipolo eltrico. Este geralmente o caso para modos de superfcie devido falta de simetria na interface de sistemas gua-ar, slido-ar, etc. Portanto o mtodo de SHG mostra-se verstil para o estudo da orientao molecular em superfcies e pode ser sensvel o bastante para detectar at mesmo a cobertura de uma submonocamada
(36)

. Os componentes bsicos em uma determinao por SHG

so ilustrados na Figura 25.

Figura 25 Esquema do aparato utilizado na tcnica de gerao de segunda harmnica de superfcie.

Um dos pontos principais da tcnica requerer a falta de simetria em uma interface a ser estudada, permitindo com isso a visualizao de certas regies de uma bicamada suspendida. Uma bicamada altamente simtrica pode no gerar um sinal significante de SHG, a menos que exista alguns domnios na estrutura que apresentem assimetria atravs da bicamada. atravs de um poro em um substrato de silcio. A figura 26 mostra uma imagem obtida por SHG de uma bicamada suspendida

37

Figura 26 Imagem por SHG de uma black lipid membrane. A imagem foi obtida utilizando microscopia SHG resolvida por polarizao. Uma ilustrao da bicamada mostrada direita da imagem

A imagem da Figura 26 revela duas regies, uma rea central (em vermelho) que no produz sinal de SHG e uma rea que aparentemente apresenta alguma estrutura. O aspecto dessa bicamada, ilustrado direita da imagem, mostra que a regio central representa uma bicamada simtrica e de espessura fina, na qual as caudas hidrofbicas dos fosfolipdios esto longe de qualquer solvente orgnico. A regio em forma de anel, detectvel por SHG, no possui a simetria da regio central e pode produzir sinal (10). Essa tcnica permite tambm que a dinmica de formao de bicamada possa ser acompanhada em relao ao tempo em diferentes substratos, sem a necessidade de se utilizar um corante no monitoramento. Imagens obtidas da formao de bicamada de 1-estearoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (SOPE) em dois substratos distintos, delrin (uma resina de acetal) e slicio, so mostradas na Figura 27.

38

Figura 27 Imagens da formao de bicamada de SOPE em Delrin e silcio, mapeadas em intervalos de 22 minutos.

A primeira imagem obtida no substrato de Delrin (seqncia a) uma bicamada recm obtida, e as imagens em seqncia mostram sua evoluo. A bicamada sofre um afinamento inicial, seguido por um perodo de espessura constante, at que ocorre novamente um afinamento e a bicamada se rompe. Esse afinamento pode estar relacionado expulso do solvente do interior da bicamada para a regio anular. Estas etapas de evoluo de bicamada so geralmente observadas quando se aplica voltagem, mudando o potencial qumico da regio anular, forando a bicamada a ajustar a quantidade de solvente incorporado para manter o mnimo de energia livre. Se esse ajuste no ocorre a bicamada rompe. Para a bicamada formada no substrato de silcio (b), as imagens revelam um aumento na poro vermelha (central), caracterstica de afinamento da bicamada, com expanso radial dessa regio. As regies azuis e verdes so mais espessas. O afinamento da poro central comea a ser observado entre a segunda e a terceira imagem. Na ltima imagem, a regio em vermelho ocupa cerca de 35 % da poro da bicamada. Tais medidas por SHG com imagem mostram que a tcnica extremamente sensvel pequenas variaes na espessura da bicamada, a qual um parmetro dinmico.

39

Concluso A utilizao de filmes lipdicos, seja em superfcies slidas, em interface ar-gua ou como black lipid membranes, leva mimetizao de membranas biolgicas, tornando possvel o estudo de interao de protenas, de imunoensaios, interao membrana-mebrana, desenvolvimento

biosensores, entre outros. O suporte utilizado na formao das camadas lipdicas, desde alcanotiis sobre uma superfcie de ouro at a utilizao de estreptoavadina e multicamadas polimricas, pode gerar tambm diferentes linhas de pesquisa, na busca pela superfcie mais estvel para a formao das camadas lipdicas. Esses estudos incluem tambm a utilizao de superfcies diferentes para a formao desses suportes. Devido grande quantidade de fosfolpidos sintticos e de origem biolgica disponveis para estudo, pode-se aliar os estudos de superfcie com a formao de camadas lipdicas com diferentes composies de fosfolipdios, nas mais diferentes propores. Alm de proporcionar os estudos das propriedades fsicas da membrana formada em um suporte slido. Pela variedade de pesquisa nas quais os fosfolipdios podem ser estudados em interfaces, as respostas para os diferentes questionamentos de mecanismos celulares podero ser elucidados com a utilizao de camadas lipdicas como sistemas mimticos de membrana.

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Bibliografia

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