Enzimas Parte 2

JANAINA DUARTE BAUMER SIANNAH MARIA MAS DIEGO

Estgio em Docncia Prof. Agenor Furigo Jr. Setembro/2008

Enzimas

Atividade enzimtica Produo industrial de enzimas O processo fermentativo; Separao de enzimas intra e extracelulares; Purificao; Controle de pureza; Produto final.

Atividade Enzimtica

As medidas de [ ] em m/V, no tem aplicao para solues enzimticas O que importa no a massa, mas a atividade Conserva a massa protica Sem atividade cataltica

Protenas desnaturadas

Atividade Enzimtica

Dosagem: atravs da medida de sua atividade Avaliada pela velocidade da reao que a enzima cataliza ([S] ou [P]) uma amostra da soluo contendo a enzima incubada com [ ] de substratos (Vmx.)

Produto mol/mL

velocidade constante

Tempo (min.)

Atividade Enzimtica

Dosagem: atravs da medida de sua atividade Avaliada pela velocidade da reao que a enzima cataliza uma amostra da soluo contendo a enzima incubada com [ ] de substratos (Vmx.)

Produto mol/mL

velocidade decresce
[ ] de substrato: -inativao parcial da enz.,
Tempo (min.)

-inibio por produto.

Atividade Enzimtica

Dosagem: atravs da medida de sua atividade Avaliada pela velocidade da reao que a enzima cataliza uma amostra da soluo contendo a enzima incubada com [ ] de substratos (Vmx.)

Produto mol/mL

velocidade constante Para evitar a influncia destes fatores associar- se: velocidade decresce atividade medida da velocidade
Tempo (min.)

[ ] de substrato: inativao parcial da enz., de produto reaoeem inibio por deslocamento do condio inicial equilbrio (reao reversvel).

Atividade Enzimtica

A velocidade da reao medida e expressa em Unidades Internacionais (UI).

1 UI a quantidade de enzima capaz de formar 1mol de produto por minuto em condies timas

Atividade Enzimtica

Mtodos para a determinao da atividade de enzimas: Conhecimento prvio da faixa de [ ] enzimtica que permite obter uma variao linear da [P] (ou [S]) com o tempo.

Mtodos para avaliar as [ ] das espcies:

Muito

diretos: - Espectrofotometria, - Titulometria... Menos diretos: - Medida da Viscosidade.

Atividade Enzimtica

A medida da atividade enzimtica imprescindvel para monitorar a purificao de uma enzima. A atividade especfica: nmero de Unidades de enzima miligramas de protena Portanto se a etapa de purificao for bem sucedida a atividade especfica deve

Significa que o procedimento adotado eliminou protenas indesejveis.

Atividade Enzimtica

Exemplo: Determinar a atividade de glicoamilase (hidrolisa o amido) em um caldo.

2 mL 8 mL: Soluo de Amido (4%) a pH 4,2 e 60C

Caldo contendo a enzima

Aps 10 min dosa-se glicose: 20 mg 20 mg em 10 min 2 mg/min ou 120 mg/h A = 120/2 = 60 U/ml

Atividade Enzimtica

Exemplo: Determinar a atividade de glicoamilase (hidrolisa o amido) em um caldo.

2 mL 8 mL: Soluo de Amido (4%) a pH 4,2 e 60C

Caldo contendo a enzima

Aps 10 min dosa-se glicose: 20 mg 20 mg em 10 min 2 mg/min ou 120 mg/h A = 120/2 = 60 U/ml 1 mL - 60mg amido 1 h

Produo Industrial de Enzimas

Fonte Animais Lpase Pancretica, Pepsina Bromelina, Papana Lactase: S.fragilis, Lipase: A.niger

Vegetais

Microrganismos

Produo Industrial de Enzimas

A produo se faz majoritariamente por fermentao submersa Nos pases orientais h uma tradio estabelecida de utilizao da fermentao semi-slida. Interessante para pases que dispem de resduos agroindustriais - baixo custo

Produo Industrial de Enzimas

Processo importantes prvios fermentao preparo do inculo. Pode-se partir de um cultivo em frasco agitado, inoculado com a cultura estoque liofilizada.

Decorrido o tempo suficiente, essa cultura inoculada no fermentador principal. Quantidade de inoculo: 1 a 10% (p/v) A produo da enzima pode ser afetada por esse parmetro.

Produo Industrial de Enzimas

Linhagem microbiana Composio dos meios de cultivo Sigilosamente protegida

Quimicamente conhecidos (sintticos) Matrias-primas naturais Fontes de carbono e energia, nitrognio, substncias minerais e fatores de crescimento

Produo Industrial de Enzimas

Fermentadores Mecanicamente agitados; 10.000 a 100.000 litros; Operados de modo descontnuo (batelada); Munidos de camisas ou serpentinas internas para as necessidades de aquecimento e refrigerao; Sistemas de medidas (sensores de pH, temperatura, oxignio dissolvido e espuma); As fermentaes em batelada para produo de enzimas tem durao da ordem de 30 a a150 h.

Produo Industrial de Enzimas

Processo a jusante (downstream) da fermentao

As operaes que se seguem ao processo fermentativo Dependem da localizao da enzima de interesse Intracelular Extracelular

Extrao Enzimas Extracelulares

O caldo resfriado a cerca de 5C, o Estabilidade do produto e o Evitar o crescimento de microrganismos contaminantes. O pH geralmente ajustado para o valor timo de atuao da enzima. A separao das clulas Centrifugao Filtrao

Extrao Enzimas Extracelulares

Soluo clarificada contendo a enzima (livre de clulas)

Concentrao Ultrafiltrao (utiliza a tecnologia de processos com menbranas)

Evaporao a vcuo (conduzida a T > 35C)

Extrao Enzimas Extracelulares

Soluo clarificada contendo a enzima (livre de clulas)

Concentrao Ultrafiltrao Esta soluo diluda (utiliza a nveis convenientes e Evaporao a vcuo a tecnologia acondiciona de processos com estabilizantes da atividade (conduzida a T > 35C) enzimtica com menbranas) pode ser embalada para comercializao.

Extrao Enzimas Intracelulares

Caldo de Cultivo Centrifugao

Romper as Clulas

Biomassa

Extrao Enzimas Intracelulares

Moagem com Esferas de Vidro Romper as Clulas Sonificao Tratamentos Qumicos

Homogeneizao em Alta Presso

Tratamentos Enzimticos

Extrao Enzimas Intracelulares

A ruptura das clulas libera substncias para o meio aquoso Precipitao

inmeras

cidos Nuclicos

Mn II

Sobrenadante

Filtrao Ultrafiltrao Concentrado Concentrao vcuo

Purificao
Forma de apresentao e pureza Concentrado Enzimtico Processo Iguais

Purificao
Forma de apresentao e pureza Concentrado Enzimtico Processo Iguais Forma slida: seco a vcuo ou por atomizao (spray drying) diluda pode ser um produto comercializvel

Purificao
Forma de apresentao e pureza Concentrado Enzimtico Processo Iguais Forma slida: seco a vcuo ou por atomizao (spray drying) diluda pode ser um produto comercializvel Peletizacao ou aglomerao Padronizao da atividade com material slido inerte

Purificao

Quando pretende-se obter uma preparao enzimtica com > grau de pureza deve submeter-se a uma srie de tcnicas de fracionamento e purificao.
(NH4)2SO4

Concentrado Enzimtico

Precipitao

Molculas Proteicas

Centrifugao

Purificao
Quando pretende-se obter uma preparao enzimtica com > grau de pureza deve submeter-se a uma srie de tcnicas de fracionamento e purificao. solventes (NH4)2SO4 (etanol, metanol) Concentrado Precipitao Enzimtico

Molculas Proteicas

Centrifugao

Purificao
Quando pretende-se obter uma preparao enzimtica com > grau de pureza deve submeter-se a uma srie de tcnicas de fracionamento e purificao. solventes (NH4)2SO4 (etanol, metanol) Concentrado Precipitao Enzimtico

Molculas Proteicas

Centrifugao

ultrafiltrao, microfiltrao e osmose inversa

Purificao

Quando busca-se um alto grau de pureza do produto, tcnicas cromatogrficas so empregadas Carga das Molculas Tamanho da Molculas Ligao bio-especfica da enzima com os ligantes (substratos ou inibidores)

Cromatografia de Troca Inica Cromatografia de partio ou de filtrao em gel Cromatografia de Afinidade

Purificao

A concentrao pode ser obtida das seguintes formas: Purificao por Cromatografia Concentrao Adio de um polmero tipo Sephadex G-25 Ultrafiltrao Remoo de gua sob vcuo

Poros pequenos. Remove cerca de 70% da H2O Remoo do solvente por membrana semi-permevel Liofilizao

Purificao

Controle de Pureza:

Eletroforese. o Tcnica de separao de molculas que envolve a migrao de partculas com a aplicao de uma diferena de potencial o As molculas so separadas de acordo com o seu tamanho, forma ou carga. Das muitas tcnicas de anlise de protenas, a eletroforese em gel a + verstil e facilmente aplicvel, o to sensvel que se podem detectar protenas que s diferem em um aa.

Purificao

O grau de purificao almejado esta relacionado aplicao do produto. No mercado esto disponveis:

Preparaes pouco purificadas, para uso tcnico ou industrial; Preparados de alto grau de pureza para uso analtico ou farmacutico.

Purificao

Produo Industrial de Enzimas

Caldo Fermentado Enzima Extracelular Enzima Intracelular Separao slido/lquido Separao slido/lquido Concentrao Rompimento Celular Precipitao c. Nuclicos Concentrao Purificao

Produo Industrial de Enzimas

Benefcios ambientais de trabalhar com enzimas: - So produzidas de fontes renovveis. - So completamente degradveis. - Propiciam economia de energia, gua, (condies brandas de temperatura, pH e presso minimizando a degradao trmica dos produtos finais).