UNIVERSIDADE DO ALGARVE Faculdade de Cincias e Tecnologia

2011/2012 Bioqumica III aula P4

MEDIO DA ACTIVIDADE DE LIPASES E ESTERASES

Sumrio Medio da actividade de lipases e esterases num extracto enzimtico de pncreas porcino.

Introduo As lipases e esterases tm funes variadas como digesto, formao de membranas, armazenamento e mobilizao de lpidos de reserva, sinalizao e destoxicao, e apresentam distribuio generalizada em todos os grupos de seres vivos. Estes enzimas possuem especificidade alargada para substratos, podendo hidrolisar ligaes ster ou amida. As esterases com capacidade de hidrolisar ligaes ster envolvendo cidos gordos de cadeia longa tm a designao de lipases (EC 3.1.1.3). A utilizao destes enzimas cada vez mais intensa nas indstrias qumica, farmacutica e alimentar. A medio da actividade de lipases no soro importante na avaliao de patologias como dislipidmias ou pancreatite.

A monitorizao da actividade de lipases pode fazer-se de acordo com vrios princpios. possvel tirar partido da capacidade que as lipases tm de catalisar reaces em interfaces lpido-gua e seguir alteraes das propriedades fsicas da interface. A actividade de lipases pode tambm ser monitorizada quantificando a libertao de glicerol ou de cidos gordos. Um mtodo tradicional de medir a actividade de lipases quantificar o aumento de acidez do meio resultante da libertao de cidos gordos, por titulao com hidrxido de sdio. A quantificao dos cidos gordos libertados pode tambm ser feita por cromatografia ou turbidimetria (alterao do grau de turbidez da soluo). Os ensaios turbidimtricos so cerca de 40 vezes mais sensveis que os ensaios 1

titulimtricos e 4 vezes mais sensveis que ensaios espectrofotomtricos com substratos cromognicos, descritos abaixo. Geralmente os ensaios com lipases requerem a utilizao de molculas anfiflicas, como detergentes, outros lpidos, protenas ou cidos biliares, para permitir a emulsionao de substratos e cidos gordos libertados.

Em ensaios espectrofotomtricos so usados substratos sintticos cromognicos, como steres de p-nitrofenil com cadeias alifticas acil de comprimento varivel. A libertao de p-nitrofenol resultante da hidrlise do substrato por aco da lipase/esterase pode ser seguida a 400-410 nm. steres de cadeia curta, como acetato ou butirato, so usados para medir a actividade de esterases, enquanto steres de cadeia longa, como laurato, palmitato ou oleato, so usados para investigar a actividade de lipases. Os sters de cadeia longa so insolveis em meio aquoso e requerem a utilizao de agentes emusionantes, como j foi mencionado atrs.

Neste trabalho vamos medir a actividade de lipases e de esterases/proteases num extracto enzimtico de pncreas porcino, atravs de um ensaio espectrofotomtrico, usando os substratos cromognicos laurato de p-nitrofenil e acetato de p-nitrofenil. Ser seguido o aparecimento de pnitrofenol no meio de ensaio, continuamente, a 410 nm.

Realizao experimental

Procedimento A. Preparao dos meios de ensaio com steres de p-nitrofenil 1. Adicione 20 l da soluo me de laurato de p-nitrofenil 200 mM em CH2Cl2, a 10 ml de soluo tampo. Misture bem no vortex. Proceda de modo idntico para a soluo me de acetato de p-nitrofenil. 2. Pipete directamente para cuvettes de plstico de 1,5 ml:

Cuvette Lipases Esterases Controlo 1 Controlo 2

Soluo Soluo tampo com tampo com laurato de acetato de pp-nitofenil nitofenil 950 l 950 l 950 l 950 l

Extracto enzimtico 50 l 50 l

Soluo tampo

50 l 50 l

ATENO: ADICIONAR O EXTRACTO ENZIMTICO APENAS ANTES DO INCIO DE CADA ENSAIO.

B. Ensaio cintico 1. Escolha um programa de cintica apropriado no espectrofotmetro ( = 410 nm). 2. A cada cuvette, separadamente, adicione o extracto enzimtico (ou gua) imediatamente antes do incio de cada ensaio. Misture bem com um pedao de parafilm e coloque a cuvette no espectrofotmetro. Registe a absorvncia, continuamente, durante 2 minutos.

Materiais e reagentes

Reagentes: Diclorometano (CH2Cl2) Base Tris HCL NaCl Triton X-100 Acetato de p-nitrofenil Laurato de p-nitrofenil p-nitrofenol Extracto enzimtico (Kontron)

Solues: Tris-HCl 20 mM com NaCl 150 mM e Triton X-100 0,01%; pH 8,0 Acetato de p-nitrofenil 100 mM em CH2Cl2 Laurato de p-nitrofenil 100 mM em CH2Cl2

Material: Eppendorfs Tubos de ensaio Pipetas automticas Cuvettes de plstico de 1,5 ml Espectrofotmetro Microcentrfuga

Clculos 1. Expresse a actividade das lipases ou esterases em Abs410nm /min.

2. Determine a actividade de lipases e estereases, em termos de U/ml de extracto enzimtico, sabendo que 1 U de actividade enzimtica corresponde quantidade de enzima necessrio para a libertao de 1 mole de p-nitrofenol por minuto e que o coeficiente de extino molar do p-nitrofenol, , nas condies do ensaio, 18000 M-1 cm-1:

Abs410nm/min . 109 . volume ensaio (ml) U/ml = . 103 . volume de amostra (ml) 109 converso de moles para nmoles 103 converso de litros para mililitros

Bibliografia

Gilham, D. and Lehner, R.: Techniques to measure lipase and esterase activity, Molecular and Cell Biology of Lipids 36 (2005), pp. 139-147.