CIDOS NUCLEICOS E TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE

Prof: Otacilio Moreira

NUCLEOTDEOS E CIDOS NUCLEICOS

Os nucleotdeos so compostos ricos em energia que direcionam os processos metablicos (principalmente as biossnteses) em todas as clulas. Eles tambm funcionam como sinais qumicos, elos importantes nos sistemas celulares que respondem a hormnios e outros estmulos extracelulares, e so componentes estruturais de vrios cofatores enzimticos e de intermedirios metablicos. Os cidos nuclicos, cido desoxirribonuclico (DNA) e cido ribonuclico (RNA), so os reservatrios moleculares de informao gentica. A estrutura de todas as protenas e, em ltima anlise, de toda a clula um produto da informao programada numa seqncia nucleotdica dos cidos nuclicos da clula.

OS GENES
Os genes so formados por longas cadeias de DNA no ncleo da clula. Eles especificam os tipos de protenas que so feitas pelas clulas, mas o DNA no o molde direto para a sntese de protenas. Os moldes para a sntese de protenas so molculas de RNA. Em particular uma classe de molculas chamada RNA mensageiro (mRNA) serve de intermedirio na sntese de protenas. Outras molculas de RNA, tais como RNA transportador (tRNA) e o RNA ribossomal (rRNA), so parte da maquinaria de sntese de protenas. Todas as formas de RNA so sintetizadas por enzimas chamadas de RNA polimerases que obtm intrues a partir dos moldes de DNA. Este processo de Transcrio seguido da traduo, a sntese de protenas de acordo com as instrues dadas pelos moldes de mRNA. Assim o fluxo da informao gentica, ou expresso gnica, das clulas normais : DNA RNA Protena
Transcrio Traduo

TRANSCRIO

TRADUO

NUCLEOTDEOS

(a) Estrutura geral dos nucleotdeos. A estrutura mostrada a de um ribonucleotdeo (RNA, porque possui uma ribose). Nos desoxirribonucleotdeos (DNA) o grupo OH no carbono 2 (em vermelho) substitudo por um H. (b) Os compostos ancestrais das bases pricas e pirimdicas dos nucleotdeos. Os nucleotdeos possuem trs componentes caractersticos: 1. uma base nitrogenada; 2. uma pentose e 3. um fosfato. As bases nitrogenadas so derivadas de dois compostos ancestrais, as pirimidinas e as purinas. A base est ligada covalentemente (pelo N-1 das pirimidinas e pelo N-9 das purinas), atravs de uma ligao N-glicosdica ao carbono 1da pentose, e o fosfato est esterificado ao carbono 5. Sem o grupo fosfato, a molcula chamada de nucleosdeo.

BASES PURNICAS E PIRIMIDNICAS

Tanto o DNA quanto o RNA contm duas bases de purina principais, a adenina (A) e a guanina (N). O DNA e o RNA possuem tambm duas pirimidinas principais: em ambos os tipos de cidos nuclicos, uma delas a citosina (C). A nica diferena importante entre as bases do DNA e as do RNA a natureza da segunda pirimidina: timina (T) no DNA e uracila (U) no RNA.

NOMENCLATURA DOS NUCLEOTDEOS

RIBONUCLEOTDEOS X DESOXIRIBONUCLEOTDEOS

(a) As unidades desoxirribonucleotdicas do DNA em pH 7,0. (b) As unidades ribonucleotdicas do RNA em pH 7,0.

A FORMAO DOS CIDOS NUCLICOS

Os nucleotdeos sucessivos so ligados covalentemente atravs de pontes de grupos fosfato. Especificamente, o grupo hidroxila 5 de uma unidade nucleotdica ligado ao grupo hidroxila 3 do nucleotdeo seguinte por uma ligao fosfodister. Desta forma, o esqueleto covalente dos cidos nuclicos consiste de resduos fosfato e pentose alternantes e as bases caractersticas podem ser consideradas como grupos laterais unidos ao esqueleto a intervalos regulares. Observe tambm que os esqueletos tanto do DNA quanto do RNA so hidroflicos. O H ou OH dos resduos de acar formam pontes de hidrognio com a gua.

LIGAES ENTRE OS NUCLEOTDEOS

Os grupos funcionais mais importantes das pirimidinas e das purinas so os nitrognios do anel, os grupos carbonila e os grupos amino exocclicos. Pontes de hidrognio envolvendo os grupos amino e carbonila so o segundo modo de interao mais importante entre as bases. As pontes de hidrognio entre as bases permitem uma associao complementar de duas e ocasionalmente trs fitas de cido nuclico. Os padres de pontes de hidrognio mais comuns so: A liga-se especificamente a T (ou U) e G liga-se especificamente a C. Estes dois tipos de pareamento predominam nas duplas fitas de DNA e RNA. Este pareamento especfico de bases permite a duplicao da informao gentica pela sntese de fitas de cidos nuclicos que sejam complementares s fitas existentes.

A ESTRUTURA DO DNA

A descoberta da estrutura do DNA por Watson e Crick, em 1953, foi um evento momentoso na cincia, um evento que originou disciplinas inteiramente novas e influenciou o curso de muitas outras. Estes cientistas postularam um modelo tridimensional para a estrutura do DNA que considerava todos os dados disponveis na poca. Este modelo consiste de duas cadeias helicoidais de DNA que se enrolam ao redor do mesmo eixo formando uma dupla hlice que gira no sentido da mo direita. O esqueleto hidroflico de grupos alternantes desoxirribose e fosfatos carregados negativamente esto na parte externa da dupla hlice, olhando a gua circundante. As bases pricas e pirimdicas de ambas as fitas esto empilhadas dentro da dupla hlice, com suas estruturas hidrofbicas de anel quase planar muito prximas e perpendiculares ao longo eixo da hlice. A relao espacial entre essas fitas cria um sulco principal e um sulco secundrio entre as duas fitas. Cada base da fita est pareada no mesmo plano com uma base de outra fita. As duas fitas que formam o DNA esto dispostas de forma antiparalela: suas ligaes fosfodister 5, 3 ocorrem em direes opostas. valido lembrar que a dupla hlice do DNA ento mantida apenas por dois conjuntos de foras: as pontes de hidrognio entre os pares de bases complementares e as interaes de empilhamento das bases.

A ESTRUTURA DO DNA

(a)

(b)

O modelo Watson-Crick para a estrutura do DNA. (a) Modelo linear mostrando o esqueleto e o empilhamento das bases. (b) Modelo espacial.

A ESTRUTURA DO DNA

OUTRAS ESTRUTURAS DO DNA

Comparao entre formas A, B e Z do DNA. Cada estrutura mostrada possui 36 pares de base. As bases esto mostradas em cinza, O fosfato est mostrado em amarelo e as riboses e os oxignios dos fosfatos em azul.

REPLICAO SEMICONSERVATIVA DO DNA

As caractersticas importantes do modelo da estrutura da dupla hlice do DNA so apoiadas por muitas evidncias qumicas e biolgicas. Alm disto, o modelo imediatamente sugere um mecanismo para a transmisso da informao gentica. A caracterstica essencial do modelo a complementariedade das duas fitas do DNA. Fazer uma cpia desta estrutura poderia logicamente comear pela: 1. separao das duas fitas e 2. sntese de uma fita complementar para cada uma, unindo os nucleotdeos numa seqncia especificada pelas regras de pareamento de bases. Cada fita preexistente poderia funcionar como um molde para guiar a sntese da fita complementar. Em conseqncia, medida que o DNA se replica, uma das cadeias de cada molcula filha de DNA seria recmsintetizada, enquanto a outra seria transmitida inalterada a partir da molcula me de DNA. Este mecanismo de replicao de DNA conhecido como Replicao semiconservativa do DNA. Estas expectativas foram confirmadas experimentalmente e esta descoberta foi uma revoluo no conhecimento do metabolismo do DNA.

REPLICAO SEMICONSERVATIVA DO DNA

O RNA

(b)

(a)

(c)

(a) Padro tpico de empilhamento segundo o enrolamento no sentido da mo direita, encontrado em uma fita nica de RNA (as bases esto em branco, as riboses em verde e os fosfatos em amarelo), (b) Tipos de estrutura secundria encontrada em alguns RNAs. As regies pareadas geralmente possuem uma forma de hlice, enrolada no sentido da mo direita , como mostrado para um grampo (c).

ESTRUTURAS TRIDIMENSIONAIS NO RNA

tRNA

Ribozima

ntron

O RNA, segunda forma principal de cidos nuclicos na clula, desempenha o papel de intermedirio na converso da informao numa protena funcional. Nos eucariontes, o DNA principalmente confinado no ncleo, enquanto a sntese de protenas ocorre nos ribossomos do citoplasma. Portanto, alguma molcula diferente do DNA deve transportar a mensagem gentica para a sntese de protenas do ncleo at o citoplasma. Este o papel do RNA mensageiro. O RNA mensageiro apenas um das vrias classes de RNA celular. O RNA transportador funciona como uma molcula adaptadora na sntese de protenas; covalentemente unido a um aminocido numa extremidade, o tRNA pareia com o mRNA de tal forma que os aminocidos so ligados na seqncia correta. O RNA ribossmico um componente estrutural dos ribossomos que possibilita a ligao dos demais RNAs. Independente da classe de RNA sintetizado, o produto da transcrio sempre uma fita simples de RNA. A natureza de fita nica dessas molculas no significa que sua estrutura seja ao acaso. As fitas simples tendem a assumir uma conformao helicoidal com o sentido da mo direita, que denominada por interaes do tipo empilhamento de bases. O RNA pode parear suas bases com fitas complementares tanto de RNA quanto de DNA. As regras de pareamento das bases padres so idnticas quelas para o DNA. As fitas pareadas no RNA ou no RNA-DNA so antiparalelas, como no DNA. Ao contrrio da dupla hlice do DNA, no h uma estrutura secundria regular e simples que forme um ponto de referncia para a estrutura do RNA. As estruturas tridimensionais de muitos RNAs, como aquelas das protenas, so complexas e nicas.

TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE

TCNICAS PARA MANIPULAO E ANLISE DE DNA

A tecnologia do DNA recombinante revolucionou a bioqumica desde que surgiu na dcada de 1970. A constituio gentica dos organismos pode agora ser mudada com exatido de modos programados. O rpido progresso na biotecnologia, de fato sua prpria existncia, um resultado de relativamente poucas tcnicas. 1 - Anlise com enzimas de restrio: as enzimas de restrio so bisturis moleculares precisos que permitem ao pesquisador manipular segmentos de DNA. 2 - Tcnicas de transferncia (em ingls, blotting). As transferncias de Southern e Northern so usadas para separar e caracterizar, respectivamente, DNA e RNA. 3 - Seqenciamento de DNA. A seqncia exata de nucleotdeos de uma molcula de DNA pode ser determinada. O seqenciamento gerou muitas informaes quanto arquitetura do gene, ao controle da expresso gnica e estrutura das protenas. 4 - Sntese de cidos nuclicos em fase slida. Seqncias exatas de cidos nuclicos podem ser sintetizadas e usadas para identificar ou amplificar outros cidos nuclicos. 5 - Reao em cadeia com polimerase (PCR: do ingls, polymerase chain reaction). A reao em cadeia com polimerase leva a uma amplificao de um bilho de vezes um segmento de DNA. Uma molcula do DNA pode ser amplificada a quantidades que permitem a caracterizao e manipulao. Esta tcnica poderosa est sendo usada para detectar patgenos e doenas genticas, para determinar a fonte de um cabelo deixado na cena de um crime e recuperar genes de fsseis. A todas estas tcnicas deve se adicionar um instrumento importantssimo, que permite a optimizao da anlise dos resultados: o computador. Sem ele, certamente os avanos obtidos at hoje no teriam sido possveis (Bioinformtica).

Clonagem gnica de um fragmento eucaritico em clulas bacterianas.

de

DNA

(b)

(a) A Reao em Cadeia com Polimerase (PCR). Com esta tcnica, possvel amplificar (multiplicar) um fragmento de DNA em 1 bilho de vezes. (b) Identificao de um clone com o segmento de DNA desejado; um diagrama do mtodo de hibridizao. A sonda do DNA radioativo hibridiza apenas com o DNA homlogo. A sonda radioativa anelada revelada por autoradiografia. Quando as colnias marcadas forem reveladas, as colnias correspondentes na placa de agar original podem ser usadas como fonte do DNA clonado para outros estudos.

REAO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR)