VIII Seminrio de Iniciao Cientfica e Tecnolgica

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SELEO E ISOLAMENTO DE MICRORGANISMOS PRODUTORES DE ACARES NO CONVENCIONAIS: FRUTOOLIGOSSACARDEOS

Diogo Henrique Hendges, Severino Matias de Alencar, Sideney Becker Onofre & Cludio Lima Aguiar
Laboratrio de Qualidade Agroindustrial Unidade de Pato Branco Centro Federal de Educao Tecnolgica do Paran CEFET - PR Via do Conhecimento Km 01 - Pato Branco/PR, Brasil, Caixa Postal 571 - CEP: 85501-970 d_hendges@hotmail.com, smalencar@pb.cefetpr.br, becker@pb.cefetpr.br, claguiar@yahoo.com.br

Resumo - Frutooligossacardeos (FOS) so oligossacardeos de ocorrncia natural principalmente em produtos de origem vegetal. So chamados acares no convencionais e tm tido impacto na indstria do acar devido s suas excelentes caractersticas funcionais em alimentos, alm de seus aspectos fisiolgicos e fsicos. Neste trabalho foi isolada uma estirpe de levedura osmoflica de flores de mangueira, produtora da enzima -D-frutofuranosidase com atividade de frutosilao. A produo FOS foi feita a partir da fermentao da sacarose e acompanhada pela tcnica de CLAE. A porcentagem correspondente dos acares produzidos, e determinados por CLAE, foi de 0,2% de Glicerol, 4,8% de Eritritol, 5,2% de Frutose, 2,78% de Glicose, 33,2% de GF2 e 16,1% de GF3. Palavras-chave: Frutooligossacardeos, leveduras osmoflicas, enzima, cromatografia. Abstract - Fructooligossaccharides (FOS) are oligossaccharides of natural occurrence mainly in products of vegetal origin. Not conventional sugars are so-called and have had impact in the industry of the sugar due to its excellent functional characteristics in foods, besides its physiological and physical aspects. In this paper a strain of osmophilic yeast of mango tree flowers was isolated, producing of the enzyme -Dfructofuranosidase with frutosilation activity. Production FOS was made from the fermentation of sucrose and folloied by the technique of HPLC. The corresponding percentage of the sugars produced, and determined by HPLC, was of 0,2% of Glycerol, 4,8% of Erythritol, 5,2% of Fructose, 2,78% of Glucose, 33,2% of GF2 and 16,1% of GF3. Key-words: Fructooligossaccharides, osmophilics yeasts, enzyme, chromatography.

INTRODUO Em resposta a uma demanda cada vez mais crescente dos consumidores por alimentos saudveis e de baixas calorias, o uso de adoantes alternativos como a palatinose [1,2] e vrios oligossacardeos como isomaltooligossacardeos [3,4,5] oligossacardeos de soja [6] e frutooligossacardeos [7,8] tm crescido significativamente. De todos estes produtos, os frutooligossacardeos (FOS) produzidos pela transformao microbiana a partir de sacarose, tem atrado uma ateno especial. Primeiramente, a produo em grande escala no complicada. Em segundo, o gosto muito similar ao da sacarose. Atualmente FOS o nome comum dado apenas a oligmeros de frutose que so compostos de 1-kestose (GF2), nistose (GF3) e frutofuranosil nistose (GF4) (Figura 1), em que as unidades de frutosil (F) so ligadas na posio beta-2,1 da sacarose, o que os distingue de outros oligmeros [9].

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(A)

(B)

(C)

Figura 1. Estrutura qumica dos principais frutooligossacardeos: (A) 1-kestose (GF2), (B) nistose (GF3) e (C) frutofuranosil nistose (GF4). Apesar do acentuado crescimento mundial do mercado de FOS e o baixo custo da sacarose, o Brasil importa todos os FOS que necessita para aplicao na indstria alimentcia e farmacutica. Isto se deve, em parte, a falta de um processo biotecnlogico adequado e economicamente vivel para aplicao industrial. Este trabalho teve como objetivo principal o isolamento e seleo de leveduras osmoflicas produtoras da enzima -D-frutofuranosidase, com atividade transfutosilao, para a produo de frutooligossacardeos a partir da sacarose. METODOLOGIA Coleta de amostras. A coleta de flores foi feita das mais diversas plantas existentes na regio Sudoeste do Paran, principalmente de espcies vegetais com flores freqentemente visitadas por abelhas. Em seguida todo material vegetal foi identificado quanto taxonomia botnica [10]. Isolamento e seleo de leveduras osmoflicas produtoras de FOS. Amostras de flores previamente coletadas, foram inoculadas em frascos Erlenmeyer de 125 mL contendo 10 mL de meio de cultura composto por 10% de sacarose e 1% de extrato de levedura, e incubados a 150 rpm a 30C, por 5 dias. Posteriormente, as culturas foram inoculadas em placas, contendo 20% de sacarose, 1% de extrato de levedura e 2% de gar-gar, para purificao. Aps a incubao, a 30C, colnias individuais foram pinadas e transferidas para tubos de armazenamento (meio de cultura contendo 20% de sacarose, 1% de extrato de levedura, 0,1% de uria e 2% de gar-gar). As culturas isoladas foram novamente inoculadas em frascos Erlenmeyer, contendo 10 mL do meio descrito acima, na concentrao de 10%, e incubadas a 30C sob agitao de 150 rpm, por 4 dias [11]. Cromatografia lquida de alta eficincia (CLAE). A quantificao dos FOS foi feita por cromatografia lquida de alta eficincia. Foi utilizada uma coluna YMC-Pack Poliamine, a 30 C, acoplada a um detector de ndice de refrao, tendo como fase mvel acetonitrila:gua (75:25, v/v) e o fluxo de 1 mL/min [12]. Foram utilizados padres de glicose, frutose, sacarose, 1-kestose, nistose e frutofuranosil nistose. Os

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acares foram identificados de acordo com os respectivos tempos de reteno, e quantificados de acordo com as curvas de calibrao dos padres. RESULTADOS E DISCUSSO Foram isoladas 17 estirpes de leveduras osmoflicas, sendo que apenas 1 foi selecionada como produtora de FOS por meio de anlise em CLAE (Figura 2).
30

33,2%

Concentrao de aucar (mg/mL)*

25

20

15

16,1%

16,1%

10

4,8% 0,2%

5,2% 2,8%

0 Glic erol E ritritol Frutose Glic os e S ac aros e GF2 GF3

* Os nmeros acima das barras referem-se a porcentagem de converso da sacarose aps o trmino da fermentao.

Figura 2. Concentrao dos acares produzidos e determinados por CLAE, aps 4 dias de fermentao pela estirpe de levedura isolada de flor de mangueira (Mandifera indiga) em meio contendo 10% de sacarose. A porcentagem correspondente dos acares produzidos, e determinados por CLAE, foi de 0,2% de Glicerol, 4,8% de Eritritol, 5,2% de Frutose, 2,7% de Glicose, 33,2% de GF2 e 16,1% de GF3. Estas concentraes de FOS so relativamente elevadas, evidenciando assim uma grande taxa de transfrutosilao pela enzima produzida pela levedura selecionada. Aps o processo de otimizao, a partir de clulas de Penicillium citrinum, a taxa de converso de sacarose de 55%, sendo 22% de 1-kestose, 14% de nistose e 11% neokestose [13]. Em um outro trabalhofoi utilizada a linhagem Aspergillus oryzae CFR 202 e obtido uma converso de 58% da sacarose em relao concentrao inicial, que era de 25%, correspondendo assim a uma produo de 33% de FOS [14]. Nesse trabalho foram otimizadas dezesseis variveis, como por exemplo, pH, tempo de fermentao, etc. Em estudos recentes [15] foi encontrad uma nova -D-frutofuranosidase, com atividade de frutosilao, produzida por um isolado de Bacillus macerans EG-6. Nesse trabalho os autores obtiveram aps a fermentao 42% de produo de GF4, sem formao de qualquer outro frutooligossacardeo. Essa reao ocorreu em pH e temperatura timos de 6,0 e 37oC, respectivamente. Esse estudo demonstrou um resultado totalmente diferente dos encontrados na literatura, inclusive com os dados deste trabalho, por exemplo, onde a produo de GF2 (33,2%) encontra-se como a maior dentre os frutooligossacardeos produzidos. CONCLUSES A fermentao em meios com alta concentrao de sacarose (10%), mostrou ser um meio seletivo para o isolamento e seleo de microrganismos, bem como para a produo de FOS.

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O GF2 (33,2%) foi o FOS mais produzido no processo de fermentao da sacarose pela estirpe de levedura selecionada. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS [1] CHEETHAM, P. S. J.; GARRETT, C. E CLARK, J. Isomaltulose production using immobilized cells. Biotechnology Bioengeneering, v. 27, p. 471-481, 1985. [2] YUN, J. W.; JUNG, K. W.; JEON, Y. J. E LEE, J. H. Continuous production of fructo-oligosaccharides from sucrose by immobilized cells of Aureobasidium pullulans. Journal of Microbiology and Biotechnology, v.2, p. 98 101, 1992. [3] KURIKI, T.; TSUDA, M. e IMANAKA, T. Highly branched oligosaccharides production by the transglucosylation reaction of neopullulanase. Journal Fermentation Bioengeneering, v. 73, p. 198-202, 1992. [4] KOHMOTO, T.; TSUJI, K. E KANEKO, T. Metabolism of 13Cisomaltooligosaccharides in healthy men. Bioscience Biotechnology Biochemical, v.56, p. 937-940, 1992. [5] PARK, Y. K.; UEKANE, R.T. E PUPIN, A. M. Conversion of sucrose to isomaltulose by microbial glucosyltransferase. Biotechnology Letters, v.14, n. 7, p. 547-551, 1992. [6] WADA, K.; WATANABE, J. E MIZUTANI, J. Effect of soybean oligosaccharides in a beverage on human fecal flora and metabolites. Nippon Nogeikagaku Kaishi, v. 66, p. 127-135, 1992. [7] JUNG, K. H.: LIM, J. Y.; E YOO, S. J. Production of fructosyltransferase from Aureobasidium pullulans. Biotechnology Letters, v. 9, p. 703-708, 1987. [8] YUN, J. W.; JUNG, K. H.; OH, J. W. E LEE, J. H. Semibatch production of fructooligosaccharides from sucrose by immobilized cells of Aureobasidium pullulans. Applied Biochemical Biotechnology, v.24/25, p. 299-308, 1990. [9] YUN, J. W. Fructooligosaccharides Occurrence, preparation and applications. Enzymes and Microbial Technology, v.19, p. 107-117, 1996. [10] HERMES, H. L.; SOUZA, M. Plantas ornamentais do Brasil: arbustivas, herbceas e trepadeiras. Editora Pantarum Ltda, Brasil, 1995. [11] AOKI, M.A.Y.; PASTORE, G.M. e PARK, Y.K. Microbial transformation of sucrose and glucose to erythritol. Biotechnological Letters, v.15, n. 4, p. 383-388, 1993. [12] PARK, Y. K. e ALMEIDA, M. M. Production of fructooligosaccharides from sucrose by a transfructosylase from Aspergillus niger. World Journal of Microbiology and Biotechnology, v. 7, n. 3, p. 331-334, 1991. [13] HAYASHI, S.; YOSHIYAMA, T.; FUJII, N. e SHINOHARA, S. Production of a novel syrup containing neofructo-oligosaccharides by the cells of Penicillium citrinum. Biotechnology Letters, v. 22, n. 18, p. 1465-1469, 2000. [14] SANGEETHA, P.T.; RAMESH, M. N. e PRAPULLA, S. G. Influence of media components and reaction parameters on the production of fructosyl transferase and fructooligosaccharides. Sciences des Aliments, v.22, n. 3, p. 277-287, 2002. [15] KIM, B. W.; KWON, H. J.; PARK, H. Y.; NAM, S. W.; PARK, J. P. e YUN, J. W. Production of a novel transfructosylating enzyme from Bacillus macerans EG-6. Bioprocess Engineering, v. 23, n. 1, p. 11-16, 2000.

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