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30 cm X 3,9 mm
FM: gua, com 5% HOAc
Deteco: UV 254nm
Tempo: 30 min.
OH
O
OH
HO
s s
--
22
00
O HO
O OH
O OH
OH
1. cido glico 2. c. protocatecuico
3. c. p-OH-benzico
8. c. o-coumrico 10. c. cinmico
OH
OMe
4. d-Catequina
00
11
22
OH O
OH O
O HO
OH
Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal
OH
OH
OH
OH
OH
OH
6. c. saliclico
5. c. cafeico
7. c. p-coumrico
Aplicao: antidepressivos tricclicos
FASE REVERSA (C18)
MM
Coluna: Zorbax ODS 5m, 150 x 0,46 mm
FM: ACN/Tampo 30:70 + 0,2% TEA e
0,2% TFA
( )
ii
nn
ii
O
Tampo Fosfato 25 mM pH 2,5
Fluxo: 1,0 mL/min Detector: UV
cc
uu
rr
O
N
rr
ss
oo
s s
N
C H
3
CH
3
NH
C H
3
CH
4
1 2
s s
--
22
00
N
CH
3
00
11
22
N
C H
3
CH
3
N
C H
3
CH
3
3 4
Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal
Aplicao: anlise de tocoferis
FASE REVERSA (C18)
MM
FASE REVERSA (C18)
ii
nn
ii
Coluna: Inertisil ODS 250 x 4,6 mm
FM: MeOH a 1,0 mL/min
Detector: UV (
e
: 295 nm)
O
CH
3
CH
3
CH
3
O H
CH
3
CH
3
CH
3
1 o tocoferol
cc
uu
rr
CH
3
O H
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
1. o-tocoferol
rr
ss
oo
s s
O H
CH
3
CH
3
CH
3
O
CH
3
3
CH
3
CH
3
2. |-tocoferol
s s
--
22
00
O
CH
3
CH
3
CH
3
3 3
CH
3
C H
3
3. o-tocoferol (vitamina E)
CH
3
00
11
22
O
CH
3
CH
3
CH
3
O
CH
3
CH
3
CH
3
C H
3
C H
3
O
4 Vitamina E - acetato
Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal
4. Vitamina E - acetato
Aplicaes das Principais Fases Estacionrias
MM
ii
nn
ii
cc
uu
rrrr
ss
oo
s s s s
--
22
0000
11
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Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal
FASEESTACIONRIA(NormaiseReversas)
MM
COLUNASCROMATOGRFICAS
ii
nn
ii
tubo:aoinoxidvel316tratado;contmFE
*colunascapilaresenano:tubosdeslicafundida
cc
uu
rr
Coluna guarda (pr-coluna): C18 (5 m)
rr
ss
oo
s s
Coluna analtica:
C-18 250 x 4,6mm x 5m
s s
--
22
00
Coluna semi-preparativa:
C-18 250 x 21,2mm x 10m
00
11
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Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal
MM
ii
nn
ii
cc
uu
rrrr
ss
oo
s s s s
--
22
0000
11
22
Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal
1/37
CAVALHEIRO, A.J. (IQ-UNESP)
MM
ii
nn
ii
cc
uu
rrrr
ss
oo
s s s s
--
22
0000
11
22
Cavalheiro,A.J.IQUNESP
Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal
MM
ii
nn
ii
cc
uu
rrrr
ss
oo
s s s s
--
22
0000
11
22
Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal
Cavalheiro,A.J.IQUNESP
Otimizao dos parmetros envolvidos na
separao cromatogrfica
MM
p g
ii
nn
ii
cc
uu
rrrr
ss
oo
s s s s
--
22
0000
11
22
Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal
MM
ii
nn
ii
cc
uu
rrrr
ss
oo
s s s s
--
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0000
11
22
Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal
MM
ii
nn
ii
cc
uu
rrrr
ss
oo
s s s s
--
22
0000
11
22
Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal
MM
ii
nn
ii
cc
uu
rrrr
ss
oo
s s s s
--
22
0000
11
22
Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal
MM
ii
nn
ii
cc
uu
rrrr
ss
oo
s s s s
--
22
0000
11
22
Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal
MM
ii
nn
ii
cc
uu
rrrr
ss
oo
s s s s
--
22
0000
11
22
Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal
MM
ii
nn
ii
cc
uu
rrrr
ss
oo
s s s s
--
22
0000
11
22
Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal
MM
ii
nn
ii
cc
uu
rrrr
ss
oo
s s s s
--
22
0000
11
22
Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal
CLCULO DO FATOR DE RETENO (k)
MM
( )
ii
nn
ii
cc
uu
rrrr
ss
oo
s s s s
--
22
0000
11
22
Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal
MM
ii
nn
ii
cc
uu
rrrr
ss
oo
s s s s
--
22
0000
11
22
Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal
MM
ii
nn
ii
cc
uu
rrrr
ss
oo
s s s s
--
22
0000
11
22
Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal
MM
ii
nn
ii
cc
uu
rrrr
ss
oo
s s s s
--
22
0000
11
22
Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal
Equao de Purnell:
A Equao Fundamental da Resoluo em HPLC
MM
Resoluo (Rs)
ii
nn
ii
'
.
) 1 (
.
2
=
k N
Rs
o
cc
uu
rr
) 1 ' ( 4
2
+ k o
rr
ss
oo
s s s s
--
22
00
EFICINCIA
Depende da
configurao
do sistema
00
11
22
SELETIVIDADE RETENO
Dependem das caractersticas da
FATORES FSICOS
Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal
1/37
Dependem das caractersticas da
FM e FE do sistema
FATORES QUMICOS
MM
ii
nn
ii
cc
uu
rrrr
ss
oo
s s s s
--
22
0000
11
22
Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal
MM
ii
nn
ii
cc
uu
rrrr
ss
oo
s s s s
--
22
0000
11
22
Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal
MM
ii
nn
ii
cc
uu
rrrr
ss
oo
s s s s
--
22
0000
11
22
Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal
MM
ii
nn
ii
cc
uu
rrrr
ss
oo
s s s s
--
22
0000
11
22
Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal
MM
ii
nn
ii
cc
uu
rrrr
ss
oo
s s s s
--
22
0000
11
22
Efeito da concentrao de metanol no tempo de reteno de
compostos analisados
Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal
compostos analisados
MM
ii
nn
ii
cc
uu
rrrr
ss
oo
s s s s
--
22
0000
11
22
Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal
EfeitodaSeletividade()sobreR
s
MM
2.MudanasnaFE
geralmenteacompanhadapormudanasnaFM
ii
nn
ii
Ex.FE
inicial
=Metil;FE
alternativas
=C8,C18
cc
uu
rrrr
ss
oo
s s s s
--
22
0000
11
22
Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal
3 Mudanas na temperatura
EfeitodaSeletividade()sobreR
s
MM
3. Mudanas na temperatura
1 C k de 1-2%
ii
nn
ii
cc
uu
rrrr
ss
oo
s s s s
--
22
0000
11
22
Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal
Journal of Chromatography A Volume 814, Issues 12, 24 July 1998, Pages 97104
MM
ii
nn
ii
cc
uu
rrrr
ss
oo
s s s s
--
22
0000
11
22
Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal
Volume de Injeo x Mxima Resoluo
MM
Para evitar a saturao dos stios de interao da coluna, o que pode
causar uma piora na resoluo cromatogrfica , no se deve injetar um
l i 1% d l d l i
ii
nn
ii
volume maior que 1% do volume da coluna vazia.
Clculo do volume mximo
cc
uu
rrrr
ss
oo
s s s s
--
22
0000
11
22
dxL, onde d=dimetro em mm e L=comprimento da
l
Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal
coluna em cm
Otimizao Cromatogrfica
MM
Modos de eluio em Cromatografia Lquida
ii
nn
ii
Isocrtico
Gradiente
%B %B
cc
uu
rr
tempo tempo Teq.
Teq.
rr
ss
oo
s s
k = (t
R
t
m
)/t
m
+ %B | k
| k | t
k* = (20.F)/(V
m
.%/min)
+ %/min | k*
| k* | t
s s
--
22
00
| k | t
R
| t
R
|W e + Int.
| k* | t
R
| t
R
|W e + Int.
00
11
22
Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal
Otimizao Cromatogrfica
M d I ti G di t ?
MM
Modo Isocrtico ou Gradiente?
Gradiente exploratrio utilizado para testes iniciais:
ii
nn
ii
Gradiente exploratrio utilizado para testes iniciais:
Coluna RP C18, 150 x 4,6 mm, 5 mm
Gradiente Linear: 5 a 100 % de ACN 60
cc
uu
rr
Gradiente Linear: 5 a 100 % de ACN, 60
Fluxo: 2,0 mL/min.
Amostra: < 50 uL; 50-100 mg
(0 5 - 1 mg/mL) rr
ss
oo
s s
Modo Isocrtico possvel
tr/tg < 0 25 1 < k < 10
Modo gradiente ser
i
(0,5 1 mg/mL)
s s
--
22
00
tr/tg < 0,25 1 < k < 10
tr/tg < 0,40 0,5 < k < 20
necessrio se:
tr/tg > 0,40
00
11
22
Onde tr = tr do ltimo pico - tr do primeiro pico
/tg = tempo total de gradiente exploratro
Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal
FASE REVERSA C-18 - AVALIAO DA AMOSTRA
GRADIENTE EXPLORATRIO
MM
Modo Isocrtico possvel
Atr/tg < 0,25 1 < k < 10
Atr/tg < 0,40 0,5 < k < 20
Amostra muito retina, muito apolar
Usar THF ou fase reversa no aquosa (NARP)
ii
nn
ii
Usar THF ou fase reversa no-aquosa (NARP).
Usar coluna menos lipoflica.
cc
uu
rr
Modo gradiente ser necessrio
Atr/tg > 0,40
rr
ss
oo
s s
Amostra muito polar.
cidos/Bases/Aucares
Controlar pH, fora inica.
on-par. Troca nica.
s s
--
22
00
Amostra complexa
Coluna RP C18, 150 x 4,6 mm, 5 m
00
11
22
Amostra complexa
Gradiente Linear: 5 a 100 % de ACN, 60
Fluxo: 2,0 mL/min.
Detetor: DAD ou 254 nm
Amostra: < 50 L; 50 100 g
Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal
CAVALHEIRO, A.J. (IQ-UNESP)
Amostra: < 50 L; 50-100 g
(0,5 - 1 mg/mL)
Amostra fcil modo isocrtico possvel
MM
At
R
/t
G
= (24 19)/60 = 0,083 < 0,25
t 19 i t 24 i
ii
nn
ii
t
Rp
= 19 min. t
Ru
= 24 min.
Gradiente Exploratrio
C18, 150 x 4,6 mm, 5 m
5 a 100 % de ACN, 60
2 0 mL/min
cc
uu
rr
Eluio isocrtica possvel
1 < k < 10
2,0 mL/min.
rr
ss
oo
s s
k = 7 %ACN = 1 7 t
R
= 1 7 24 = 40 8 % k = 20 %ACN = 1 7 t
R
- 10 = 30 8 %
s s
--
22
00
k
u
7 % ACN 1,7.t
Ru
1,7.24 40,8 %
ACN/gua 40:60
k
u
20 % ACN 1,7.t
Ru
10 30,8 %
ACN/gua 30:70
00
11
22
Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal
Resoluo satisfatria CAVALHEIRO, A.J. (IQ-UNESP)
Amostra mais difcil modo isocrtico possvel - I
MM
At
R
/t
G
= (24 9,5)/60 = 0,24 < 0,25
t = 9 5 min t = 24 min
ii
nn
ii
El i i ti l
t
Rp
= 9,5 min. t
Ru
= 24 min.
Gradiente Exploratrio
C18, 150 x 4,6 mm, 5 m
5 a 100 % de ACN, 60
2,0 mL/min.
cc
uu
rr
Eluio isocrtica possvel
1 < k < 10
rr
ss
oo
s s
k
u
= 7 % ACN = 1,7.t
Ru
= 1,7.24 = 40,8 % k
u
= 20 % ACN = 1,7.t
Ru
- 10 = 30,8 %
s s
--
22
00
ACN/gua 40:60 ACN/gua 30:70
00
11
22
Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal
Resoluo insatisfatria
CAVALHEIRO, A.J. (IQ-UNESP)
Amostra mais difcil modo isocrtico possvel - II
Otimizao da FM
MM
Otimizao da FM
Gradiente Exploratrio 1
1
ii
nn
ii
8
k
u
= 7 k
u
= 20
ACN/gua 40:60
2
ACN/gua 30:70
3
cc
uu
rr
2 3
8
ACN
ACN/MeOHgua 6 ACN/MeOHgua 7
rr
ss
oo
s s
6 7 9
ACN/MeOH
4
20:25:55
5
15:20:65
s s
--
22
00
4 5 10
MeOH
MeOHgua 50:50
4
MeOHgua 40:60
5
00
11
22
%MeOH = 1,22 + 1,37(%ACN) - 0,004(%ACN)
2
ACN/MeOHgua
23:30:47
Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal
J. Chromatogr. A, 721:15 1996.
CAVALHEIRO, A.J. (IQ-UNESP)
Amostra mais difcil modo gradiente - I
MM
At
R
/t
G
= (23 2)/60 = 0,35 < 0,40
ii
nn
ii
t
Rp
= 2 min. t
Ru
= 23 min.
Eluio isocrtica possvel
0,5 < k < 20
Gradiente Exploratrio
C18, 150 x 4,6 mm, 5 m
5 a 100 % de ACN, 60
cc
uu
rr
Modo gradiente
2,0 mL/min.
rr
ss
oo
s s
Modo gradiente
%I
ACN
= 1,65.t
Rp
9 = 1,65.2 9 = -5,7 0%
%F
ACN
= 1,65.t
Rp
+ 10,3 = 1,65.23 +10 = 48%
% / i 48/10 4 8 k* 20 F/(V % i ) 8 3 % / i 48/30 1 6 k* 20 F/(V % i ) 12 5 s s
--
22
00
%
ACN
/min = 48/10 = 4,8 k* ~ 20.F/(V
m
.%min) ~ 8,3 %
ACN
/min = 48/30 = 1,6 k* ~ 20.F/(V
m
.%min) ~ 12,5
0 a 47 % de ACN, 10
2,0 mL/min. - 30
o
C
0 a 47 % de ACN, 30
2,0 mL/min. - 60
o
C
00
11
22
Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal
Resoluo insatisfatria
CAVALHEIRO, A.J. (IQ-UNESP)
Amostra mais difcil modo gradiente - II
MM
Gradiente Exploratrio 1
ii
nn
ii
k* = 5 k*= 17
Gradiente Exploratrio 1
Ajustar % I e % F
cc
uu
rr
2 3
8
35
o
C
5 %/min 1,6 %/min
0 a 47 % de ACN, 10
2,0 mL/min. - 30
o
C
0 a 47 % de ACN, 30
2,0 mL/min. - 60
o
C
rr
ss
oo
s s
6 7 9
0 a 47 % de ACN, 10
2,0 mL/min. - 60
o
C
0 a 47 % de ACN, 36
2 0 mL/min - 60
o
C
s s
--
22
00
4 5 10
65
o
C
,
2,0 mL/min. - 60 C
00
11
22
0 a 47 % de ACN, 72
2,0 mL/min. - 60
o
C
Col. 30 cm - 3,5 m
Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal
CAVALHEIRO, A.J. (IQ-UNESP)
Gradiente - Otimizao
1 Aj % i i % i
MM
1. Ajustar % Inicial e % Final de B
2. Otimizar k* (considerar t
G
)
3. Verificar influncia do solvente B
ii
nn
ii
4. Avaliar influncia da temperatura
5. Ajustar configurao da coluna
6 O t i i
cc
uu
rr
6. Outras variveis
Ajustar % Inicial e % Final de B
Mistura de Herbicidas: 9 fenilurias e 6
s-triazinas (J. Chromat. , 261:329 1983)
rr
ss
oo
s s
0-100% MeOH
50 min. (2%/min.)
40-100% MeOH
30 min. (2%/min.)
60-100% MeOH
20 min. (2%/min.)
s s
--
22
00
50-100% MeOH
25 min. (2%/min.)
50-70% MeOH
10 min. (2%/min.)
50-80% MeOH
15 min. (2%/min.)
00
11
22
Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal
CAVALHEIRO, A.J. (IQ-UNESP)
Gradiente - Otimizao
MM
1. Ajustar % Inicial e % Final de B
2 Oti i k* ( id t )
ii
nn
ii
2. Otimizar k* (considerar t
G
)
3. Verificar influncia do solvente B
4. Avaliar influncia da temperatura
cc
uu
rr
5. Ajustar configurao da coluna
6. Outras variveis
rr
ss
oo
s s
Verificar influncia do solvente B
Col.: C18 - 10 m
30 x 0,42 cm
1 mL/min - t.a.
Mistura de fenis (J. Chromatogr., 214:35 1981)
s s
--
22
00
100
% ACN
100
% MeOH
10
% MeOH
20
% ACN
Mistura de fenis (J. Chromatogr., 214:35 1981)
00
11
22
0
60 min. tempo
0
60 min. tempo
0
60 min. tempo
Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal
Gradiente - Otimizao
MM
1. Ajustar % Inicial e % Final de B
2. Otimizar k* (considerar t
G
)
ii
nn
ii
3. Verificar influncia do solvente B
4. Avaliar influncia da temperatura
5. Ajustar configurao da coluna
cc
uu
rr
5. Ajustar configurao da coluna
Aj t fi d l
rr
ss
oo
s s
Ajustar configurao da coluna: comprimento, partcula, fluxo
25 cm - 10 m
2 mL/min - 1040 psi
25 cm - 10 m
1 mL/min - 520 psi Coluna C18 d.i. 0,46 cm
FM: 40 a 77% MeOH a 0,7%/min
Rs = 1,1 Rs = 1,3
s s
--
22
0000
11
22
Mistura de Herbicidas:
9 fenilurias e 6 s-triazinas
50 cm - 10 m
2 mL/min - 2080 psi
25 cm - 5 m
1 mL/min - 2080 psi
Rs = 1,5 Rs = 2
Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal
9 fenilurias e 6 s triazinas
(J. Chromat. , 261:329 1983)
BOMBASDEALTAPRESSO
MM
PermitemvenceraresistnciapassagemdaFMexercidapelaspartculasdaFE.
Funo:proporcionarfluxoconstanteereprodutveldeFMatodoosistema.
ii
nn
ii
u o p p p
CARACTERSTICASDESEJVEIS:
cc
uu
rr
composiodaFMefluxoprecisoseexatos
vazocontnuaelivredepulsaes
rr
ss
oo
s s
respostarpidaaalteraesnofluxoecomposiodaFM gradientedeeluio!!
pressomxima:700atm(10.000psi)
s s
--
22
00
maiorparteconstrudaemaoinox316;outrosmateriais:titnio,peek,teflon
inrciaqumicaasolventescomuns
00
11
22
manutenosimples
reservatriodesolventeilimitado
Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal
BOMBASDEALTAPRESSO
MM
BOMBASDEVOLUME(FLUXO)CONSTANTE
ii
nn
ii
BombasmaisutilizadasemCLAE
Vantagem:
cc
uu
rr
Capacidadederepetiodosvolumesoufluxose,consequentemente,das
reasdospicos,mesmocommudanasnaviscosidadedaFMoubloqueioda
colunaporpartculas.
rr
ss
oo
s s
p p
s s
--
22
0000
11
22
Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal
BOMBASDEALTAPRESSO
MM
BOMBASDEVOLUME(FLUXO)CONSTANTE
ii
nn
ii
BOMBADOTIPOSERINGA
cc
uu
rrrr
ss
oo
s s s s
--
22
0000
11
22
Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal Lanas,2009
Collins;Braga;Bonato,2006
BOMBASDEALTAPRESSO
MM
BOMBASDEVOLUME(FLUXO)CONSTANTE
BOMBA DO TIPO PISTO RECIPROCANTE OU ALTERNANTE
ii
nn
ii
BOMBADOTIPOPISTORECIPROCANTEOUALTERNANTE
cc
uu
rr
pistoconectadoaomotorpormeio
deengrenagense1EXCNTRICO
rr
ss
oo
s s
escoamvolumesconstantesdeformanocontnuaoupulsante
bomba mais empregada em CLAE at almente
s s
--
22
00
bombamaisempregadaemCLAEatualmente
adequadaparapresseselevadas
00
11
22
reservatriodeFM:ilimitado
movimentosdopistonacmarageramPULSOS
Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal
aplicaes:CLAEanalticaepreparativa
Lanas,2009
SISTEMASDEINTRODUODEAMOSTRAS(INJETORES)
INJETORES MANUAIS
MM
INJETORESMANUAIS
amostradeveseraplicadanacolunapressurizadanaformadeumabandaestreita
ii
nn
ii
vlvuladeintroduodeamostramaiscomum:vlvulade6prticos(orifcios)
aladeamostragemouloop:comprimentoedimetrointernodefinemseuvolume
loop para escala analtica
(L)
cc
uu
rr
( )
rr
ss
oo
s s
loop para escala preparativa
(mL)
s s
--
22
0000
11
22
Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal
http://www.restek.com/hplcsixport/6_Port_Injector_content.html
SISTEMASDEINTRODUODEAMOSTRAS(INJETORES)
MM
INJETORESMANUAIS
VISOESQUEMTICADOFUNCIONAMENTODAVLVULADE6PRTICOS
ii
nn
ii
sada da amostra
POSIODECARGA
LOAD
cc
uu
rr
entrada da amostra
sada da amostra
ala de amostragem (loop)
2
3
rr
ss
oo
s s
entrada do eluente
1
4
6
s s
--
22
00
coluna
5
1
2
3
4
6
00
11
22
4
5
6
Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal
1/37
POSIODEINJEO
INJECT
DETECTORES
MM
Funo do detector: identificar a presena de substncias de
interesse que estejam eluindo da coluna cromatogrfica
ii
nn
ii
interesse que estejam eluindo da coluna cromatogrfica.
Caracterstica desejveis:
cc
uu
rr
- alta sensibilidade e baixo limite de deteco
- ampla faixa de linearidade
rr
ss
oo
s s
- confivel e reprodutvel
-fcil de operar e manter
-informao qualitativa e quantitativa
s s
--
22
00
informao qualitativa e quantitativa
-no destruio do soluto
-insensibilidade a mudanas na FM e de T
t id li lt d t d l t
00
11
22
- resposta rpida e linear a alteraes das concentraes dos solutos
-baixo nvel de rudo
Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal
CLASSIFICAO
MM
De acordo com as propriedades medidas:
Detectores de propriedades do eluente: medem a variao de
ii
nn
ii
Detectores de propriedades do eluente: medem a variao de
propriedades do eluente (ex. constante dieltrica)
Detectores de propriedades do analito: medem propriedade fsica ou
qumica do analito (ex fluorescncia)
cc
uu
rr
qumica do analito (ex. fluorescncia)
De acordo com o tipo de resposta:
Detectores sensveis concentrao: resposta proporcional
rr
ss
oo
s s
etecto es se s e s co ce t ao esposta p opo c o a
concentrao de um componente no eluente (ex. UV, fluorescncia).
Detectores sensveis ao fluxo de massa: resposta proporcional
quantidade de massa do componente da amostra que chega ao detector
s s
--
22
00
quantidade de massa do componente da amostra que chega ao detector
por unidade de tempo (ex. eletroqumico, espalhamento de luz).
De acordo com a seletividade:
00
11
22
Detectores universais
Detectores seletivos
Detectores especficos
Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal
Detectores especficos
DETECTORES
MM
ii
nn
ii
cc
uu
rrrr
ss
oo
s s s s
--
22
0000
11
22
Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal
DETECTORES
MM
ii
nn
ii
cc
uu
rrrr
ss
oo
s s s s
--
22
0000
11
22
Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal
DETECTORESBASEADOSNAABSORODELUZ
MM
C O S S OS SO O U
UV/VIS
ii
nn
ii
Faixas de utilizadas:
Ultravioleta: 190 - 400 nm
cc
uu
rr
Visvel: 400 - 800 nm
Espectro eletromagntico
rr
ss
oo
s s s s
--
22
0000
11
22
Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal
1/37
DETECTORES
MM
ii
nn
ii
cc
uu
rrrr
ss
oo
s s s s
--
22
0000
11
22
Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal
1/37
DETECTORES
MM
ii
nn
ii
cc
uu
rrrr
ss
oo
s s s s
--
22
0000
11
22
Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal
DETECTORES
MM
LEI DE LAMBERT-BEER
ii
nn
ii
cc
uu
rrrr
ss
oo
s s
Leitura = Unidade de Absorbncia (UA)
1 UA = Depreciao da luz incidente em 90 %
s s
--
22
00
Comprimento de onda
S l t
mximo
00
11
22
Solvente
pH
mximo
Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal
Temperatura
> Sensibilidade
DETECTORNOUV/VISDECOMPRIMENTODEONDAFIXO
MM
ii
nn
ii
cc
uu
rr
rr
ss
oo
s s
s s
--
22
00
00
11
22
cc
uu
rr
rr
ss
oo
s s
s s
--
22
00
Lmpadas: deutrio UV
00
11
22
Lmpadas: deutrio UV
tungstnio - visvel
Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal
DETECTORNOUV/VISCOMARRANJODE
MM
/
FOTODIODOS(DAD)
ii
nn
ii
arranjo de diodos: srie de fotodiodos posicionados lado a lado num cristal de
silcio de modo que cada difratado pela grade atinja um diodo.
cc
uu
rr
a absorbncia de uma amostra pode ser determinada em todos os de modo
simultneo.
rr
ss
oo
s s s s
--
22
0000
11
22
Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal
MM
ii
nn
ii
cc
uu
rrrr
ss
oo
s s s s
--
22
0000
11
22
Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal
CAVALHEIRO, A.J. (IQ-UNESP)
DETECTOR DETECTOR - -UV/VIS UV/VIS
MM
Qual o comprimento de onda ideal para a
ii
nn
ii
anlise quantitativa ?
cc
uu
rr
223 252 280
OH OH
O O
500
mAU
rr
ss
oo
s s
215 nm
223 nm 252 nm 280 nm
300
s s
--
22
00
100
250 300 350
nm
00
11
22
== >> c = c = > sensibilidade > sensibilidade
Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal
max max
c c sensibilidade sensibilidade
MM
ii
nn
ii
cc
uu
rrrr
ss
oo
s s s s
--
22
0000
11
22
Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal
MM
ii
nn
ii
cc
uu
rrrr
ss
oo
s s s s
--
22
0000
11
22
Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal
MM
ii
nn
ii
cc
uu
rrrr
ss
oo
s s s s
--
22
0000
11
22
Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal
MM
ii
nn
ii
cc
uu
rrrr
ss
oo
s s s s
--
22
0000
11
22
Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal
MM
ii
nn
ii
cc
uu
rrrr
ss
oo
s s s s
--
22
0000
11
22
Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal
MM
ii
nn
ii
cc
uu
rrrr
ss
oo
s s s s
--
22
0000
11
22
Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal
DetectorEletroqumico
MM
ii
nn
ii
cc
uu
rrrr
ss
oo
s s s s
--
22
0000
11
22
Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal
DETECTORES
MM
Espectrmetrosdemassas(HPLCMS/MS)
ii
nn
ii
cc
uu
rrrr
ss
oo
s s s s
--
22
0000
11
22
Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal
DETECTORES
MM
Comparaodarespostadealgunsdetectores
ii
nn
ii
cc
uu
rrrr
ss
oo
s s s s
--
22
0000
11
22
Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal
Algumas Dicas
MM
ii
nn
ii
cc
uu
rrrr
ss
oo
s s s s
--
22
0000
11
22
Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal
Algumas Dicas
MM
Algumas Dicas
TAMPES EM CLAE
ii
nn
ii
< 3,1 2,1
H
3
PO
4
/KH
2
PO
4
ou K
2
HPO
4
210 nm (0,1%) 1,5-2,5 >> 2
cido Trifuoractico (TFA)
UV limite Faixa pK
a
Tampo
cc
uu
rr
230 nm (10 mM) 2,1-6,4
3,1
4,7
cido ctrico/K
3
citrato
< 200 nm (0,1 %) 6,2-8,2
11,3-13,3
7,2
12,3
rr
ss
oo
s s
< 200 nm (10 mM) 5 4 7 4 6 4
KHCO ou K CO /cido actico
210 nm (10 mM) 3,8-5,8 4,8
cido actico/Acetato de K
210 nm (10 mM) 2,8-4,8 3,8
cido frmico/Formiato de K
5,4
s s
--
22
00
215 nm (10 mM)
225 nm (10 mM)
5,8-7,8
8,0-10,0
6,8
9,0
Bis-tris propano.HCl/Bis-tris propano
< 200 nm (10 mM) 5,4-7,4
9,3-11,3
6,4
10,3
KHCO
3
ou K
2
CO
3
/cido actico
00
11
22
< 200 nm (10 mM) 10 0-12 0 11 0
Et N HCl/Et N
215 nm (10 mM) 9,1-11,1 10,1
1-Me-Piperidina.HCl/1-Me-Piperidina
200 nm (10 mM) 8,2-10,2 9,2
NH
4
Cl/NH
3
205 nm (10 mM) 7,3-9,3 8,3
Tris.HCl/Tris
Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal
< 200 nm (10 mM) 10,0-12,0 11,0
Et
3
N.HCl/Et
3
N
Algumas Dicas
MM
ii
nn
ii
cc
uu
rrrr
ss
oo
s s s s
--
22
0000
11
22
Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal
Algumas Dicas
MM
ii
nn
ii
cc
uu
rrrr
ss
oo
s s s s
--
22
0000
11
22
Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal
Algumas Dicas
MM
T ( i ) % H O % M OH
Gradiente otimizado
ii
nn
ii
Tempo (min) % H
2
O % MeOH
0 70 30
15 35 65
Tempo de equilbrio de 3 min
cc
uu
rr
17 0 100
20 70 30
25 70 30
rr
ss
oo
s s
Tempo de equilbrio de 8 min
Fique atento ao tempo
de equilbrio da sua coluna
s s
--
22
00
cido cetico 0,1 % foi usado como
supressor inico
00
11
22
Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal
O d f HPLC
MM
O que voc no deve fazer em HPLC
ii
nn
ii
cc
uu
rrrr
ss
oo
s s s s
--
22
0000
11
22
Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal
Agradecimentos
MM
Agradecimentos
Ao Conselho Regional de Qumica - CRQ-IV
ii
nn
ii
g
Aos Participantes do Curso
cc
uu
rr
Contato
Guilherme Julio Zocolo
rr
ss
oo
s s
E-mail: gjzocolo1@gmail.com
s s
--
22
00
Quaisquer dvidas estarei sempre a
disposio
00
11
22
Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal
Minicursos CRQIV Princpios da HPLC
Apoio Caixa Econmica Federal
Princpios da Cromatografia Lquida de Alta Eficincia (HPLC)
Dinmica 1
1. O entendimento do processo cromatogrfico e dos fatores de reteno (k), seletividade () e
eficincia (N) fundamental para o desenvolvimento racional de um mtodo cromatogrfico.
Assim sendo, explicar objetivamente:
a) O que fora de eluio e qual a sua influncia na distribuio de cada componente
de uma mistura de substncias orgnicas entre as fases estacionria (FE) e mvel
(FM);
b) O que seletividade cromatogrfica? Cite exemplos de solventes e adsorventes com
seletividades diferentes.
c) O que eficincia cromatogrfica?
2. Quais as vantagens e desvantagens do uso dos modos de eluio isocrtico e gradiente?
3. Para avaliar a qualidade de uma coluna de CLAE, quais parmetros (cite pelo menos trs)
devem ser freqentemente monitorados e o que eles podem indicar?
Minicursos CRQIV Princpios da HPLC
Apoio Caixa Econmica Federal
Princpios da Cromatografia Lquida de Alta Eficincia (HPLC)
Dinmica 2
1. a. Qual a caracterstica mais importante de um detetor em sistema de cromatografia
lquida? Por que? Quais detetores satisfazem essa caracterstica?
b. Considerando sensibilidade e seletividade, que detetores seriam mais indicados
para analise quantitativa em CLAE das misturas abaixo:
I. lcoois e aminas saturados industria de alimentos.
II. Antioxidantes polifenlicos presente em medicamentos fitoterpicos.
III. Hidrocarbonetos policclicos aromticos presentes na fuligem resultante
da queima da cana-de-acar amostra ambiental concentraes
na ordem de ng mL
-1
(ppb)