Ttulo

Cromatografia

Introduo
Uma amostra a ser analisada freqentemente uma mistura de vrios componentes numa matriz complexa. Para amostras que contenham componentes desconhecidos, eles precisam ser separados dos demais, de modo que cada componente individual possa ser identificado por um determinado mtodo analtico.

Separao de misturas
Uma mistura pode ser separada utilizando as diferenas nas propriedades fsicas e qumicas dos componentes individuais. Estas separaes so baseadas nos estados fsicos da matria dos dois componentes. As propriedades fsicas que permitem separar compostos so: solubilidade, ponto de ebulio, presso de vapor, etc. Outras duas propriedades que tambm so teis para separaes so a densidade e o tamanho das partculas.

Separao de misturas

As propriedades que permitem separar os componentes de uma mistura, so constantes sob condies constantes, e portanto, uma vez determinadas, podem ser utilizadas para identifica-los e quantifica-los. Tais procedimentos so tpicos dos mtodos cromatogrficos de separao.

Procedimentos simples de separao Procedimentos Simples de

Separao. Mtodos Cristalizao Instrumentais de Separao Destilao

Extrao Filtrao

Centrifugao

Mtodos Instrumentais de Separao:

Cromatografia Eletroforese

Cromatografia
um processo de separao, identificao e quantificao no qual os componentes da amostra so arrastados por uma fase mvel atravs de um leito de fase estacionria, no qual as espcies so separadas por interaes com a fase mvel e estacionria

Classificao dos mtodos Cromatogrficos

Cromatografia

Planar

Coluna

F.M. Lquida

F.M. Gasosa

F.M. Lquida

C.Papel

C.Camada C. Gasosa CCC CLAE Delgada CCC-Cromatografia em Coluna Clssica. CLAE-Cromatografia Lquida de Alta Eficincia.

Mtodos cromatogrficos
Cromatografia em camada delgada (CCD) utilizada para separar analitos em soluo, incluindo ons metlicos e compostos orgnicos. A fase mvel um solvente A fase estacionria um lquido sobre um suporte slido ou um slido, etc.

Mtodos cromatogrficos Cromatografia Lquida em Coluna Clssica Cromatografia Lquida em coluna clssica (CCC)
utilizada para separar analitos em soluo, incluindo ons metlicos e compostos orgnicos.
A fase mvel um solvente A fase estacionria um lquido sobre um suporte slido, um slido ou uma resina de troca inica, etc.

Mtodos cromatogrficos
Cromatografia Gasosa (CG): aplicada a compostos orgnicos volteis. A fase mvel um gs A fase estacionria frequentemente um lquido de alto p.e. sobre um suporte slido ou um adsorvente slido

Mtodos cromatogrficos Cromatografia Lquida de Alta Eficincia

Cromatografia Lquida de Alta Eficincia (CLAE)

uma variao da cromatografia lquida que utiliza bombas de alta presso para aumentar a eficincia das separaes

Mecanismo de Separao
Adsoro: Fase Estacionria Slida. - Competio entre as molculas da amostra e da Fase Mvel pelos stios ativos da Fase Estacionria.

* * *

Partio: Fase Estacionria Lquida. - Solubilidade relativa dos componentes da amostra na Fase Estacionria e na Fase Mvel.

 Troca Inica - diferentes graus de afinidade eletrosttica entre o trocador e os ons da fase mvel.

Especificidade Biolgica

Cromatografia em Camada Delgada

Definio: Consiste na utilizao de uma placa de vidro ou outro material rgido inerte recoberta com uma camada de adsorvente que pode ser a Fase Estacionria (slida) ou um suporte para Fase Estacionria (lquida).

Utilizao da CCD (Cromatografia

em Camada Delgada):

monitorar o andamento de uma reao qumica; determinar a pureza de substncias orgnicas; utilizada como mtodo de identificao.

Procedimento para preparao das placas cromatogrficas

1) Preparao das Placas:

Tipos de Adsorvente Utilizados em Cromatografia Planar

Papel: Acetilado. Carregado. Tratado: Substncias anfteras. Substncias de mdia polaridade. (leo de silicone). Camada Delgada: Alumina. Slica. Celulose. Fases Estacionrias Quimicamente Ligadas.

Celulose

Celulose

Aplicao: Utilizada para separao de compostos hidroflicos (acares, aminocidos, ons inorgnicos, cidos nuclicos). Preparao: 20g de celulose microcristalina + 60 mL de H2O. Rendimento: 5 placas 20 x 20 cm, 300 um. Ativao: 105C, 10 min.

Alumina

Aplicao: A atividade depende dos tomos O e Al: cida- (pH = 4) Pigmentos sintticos e naturais, aminocidos, cidos carboxlicos. Neutra- (pH = 6,9-7,1)- Aldeidos, cetonas, substncias instveis em meio alcalino. Alcalina- (pH = 9,5-10,5)- Hidrocarbonetos aromticos e insaturados, corantes sintticos, alcalides. Preparao: 30g + 60 mL de H2O. Ativao: 105C, 10 min.

Slica Gel

Tipos: Slica Gel G- 13 % CaSO4. Slica Gel H- Sem aglutinante. Slica Gel P- Uso Preparativo. Slica Gel F254- Com indicador de fluorescncia. Slica Gel R- Extra pura. Aplicao: Utilizada para separao de compostos hidroflicos
(acares, aminocidos, ons inorgnicos, cidos nuclicos).

Preparao: 20g de slica + 60-70 mL de H2O. Rendimento: 5 placas 20 x 20 cm, 300 um. Ativao: 105C- 110C, 30 min.

2) Ativao da Placa:

Ativao da Placa e aplicao da 105-110C durante 30-60 min. Amostra

3)Aplicao da amostra:

Tcnica de aplicao Ponto anlise qualitativa Faixa anlise quantitativa e preparativa

4) Desenvolvimento:

Fase mvel
O Solvente utilizado possui papel fundamental na separao dos componentes. Existe uma competio entre as molculas da amostra e da fase mvel, pela superfcie adsorvente, portanto considera-se a natureza qumica da amostra e a polaridade da fase mvel.

Srie de eluentes em ordem crescente de polaridade

Solventes Hexano ter de petrleo Cicloexano Tetracloreto de carbono Benzeno Tolueno Diclorometano Clorofrmio ter etlico Acetato de etila Piridina Acetona Etanol Metanol cido actico

5) Revelao:
Procedimentos qumicos, fsicos, ou biolgicos aplicados ao cromatograma para tornar visvel as manchas das substncias separadas por cromatografia.

Revelao do Cromatograma

A- Procedimentos Fsicos: Muitos compostos se tornam fluorescentes quando excitados por luz UV, ou utiliza-se o adsorvente contendo uma substncia fluorescente (aromticos ou dupla ligao conjugada).

B - Procedimentos Biolgicos e Enzimticos: Utiliza-se reaes enzimticas ou bacterianas para tornar a mancha visvel.
Placa de slica, eluda com diclorometano:metanol (97:3). A placa foi borrifada com soluo esporos de fungos e, onde apareceram manchas brancas porque houve inibio dos fungos pelas substncias contidas nos extratos de uma planta.

C - Procedimentos Qumicos: Aplicao de um reativo qumico para formar um derivado colorido ou fluorescente.

Revelao do Cromatograma por mtodo qumico

Documentao dos Cromatogramas

Os resultados obtidos aps a revelao das cromatoplacas, podem ser documentados: -Desenhando as cromatoplacas -Delineando as cromatoplacas sobre papel de seda -Fotografando as cromatoplacas -Xerocando as cromatoplaca - Retirando a camada adsorvente pela formao de uma pelcula flexvel (propionato de polivinila) sobre a superfcie.

Anlise Qualitativa
Leva em considerao cor e Rf
Parmetros Utilizados na Cromatografia Planar

Linha de chegada da F.Mvel

Fator de reteno (Rf):

Rf = d r / d m
Ws1

Resoluo (Rs):
Rs = 2(dr1dr2) / (Ws1+Ws2)

dm

Ws2

Eficincia:
n = 16 (dr Ws)2

dr2

dr1

Ponto de partida da amostra

Profundidade da FM

Fatores que Afetam a Reprodutibilidade em Caractersticas da Mancha: Cromatografia Planar A mancha deve ser: Compacta, redonda ou oval. (1)
As causas das manchas assimtricas (caudas) so: Insolubilidade na Fase Mvel.

Fatores que Afetam a Reprodutibilidade em Cromatografia Planar

Adsoro forte na Fase Estacionria.

Aplicao de quantidade muito grande da amostra. Dissociao.

Fatores que Afetam a Reprodutibilidade em Falta de reprodutibilidade : As anlises devem ser reprodutivas. Cromatografia Planar (2) Caso contrrio verificar :

Fatores que Afetam a Reprodutibilidade em Cromatografia Planar

Envelhecimento e composio da Fase Mvel. Viscosidade, Miscibilidade, Polaridade da F. Mvel Natureza, marca humidade e tratamento da Fase Estacionria. Quantidade da Fase Mvel. Quantidade da amostra. Vedao da cuba. Dimenses da cuba. Impurezas da amostra. Temperatura (No deve variar mais que 5C). Soluto, Fase Mvel, Fase estacionria, Suporte. Tcnica de aplicao. Ponto - anlise qualitativa. Faixa - Anlise quantitativa e preparativa.

Procedimentos para aumentar a Procedimentos para Aumentar reprodutibilidade :

Reprodutibilidade
Saturao da cuba cromatogrfica.
Qualidade e quantidade da Fase Mvel. Atividade da Fase Estacionria. Qualidade da Fase Estacionria. Espessura da camada delgada. Tcnica e condio da Fase mvel (desenvolvimento, temperatura, distncia percorrida pela Fase Mvel, quantidade da amostra)

Cromatografia em Coluna Comum (CCC)

A Fase Estacionria colocada em um tubo cilndrico (Coluna Cromatogrfica)

Eluio de uma amostra

Comatografia por troca inica

B+ C++ X+ X+ Z+ B+ B+ X+ W+ Z+ Z+ X+

X+ C++

-- --

X+

-- - - ++ C
B
+

C++

-- - - ++ C
Z+

Z+ Z
+

-- -Z
+

W+ W+

X+ - - - X+
X+

X+

X+

X X
+

X X
+

B+

+ Z+ W

C++

C++

Z+ W

Z+

Esquema de mecanismo de troca inica. B+ e C2+ so materiais a serem separados. X+, Z+ e W+ so ons contidos nos eluentes 1, 2 e 3 respectivamente.

Matriz: Material poroso, natural ou sinttico, inerte e insolvel em gua e solventes orgnicos, apresentando ligaes covalentes a grupos trocadores inicos.

--+---+
a

+++ + +

- -

Esquema de trocadores inicos. a) trocador catinico; b) trocador aninico.

Grupos trocadores grupos ligados a matriz

Grupos fortes: se encontram ionizados em grande faixa de pH. Grupos fracos e mdios: o grau de dissociao influenciado pelo pH.

Trocadores baseados em polmeros sintticos

Tipo cido forte Constituio Grupos de cidos sulfnico ligados a copolmeros de estireno-divinilbenzeno Grupos de cidos carboxlico ligados a copolmeros de cido metacrlico e divinilbenzeno Frmula do trocador -SO3H+

cido fraco

-CH-COO-Na+

Base forte

Grupos de amnio quaternrio ligados a copolmeros de estireno-divinilbenzeno

Grupos de polialquilamina ligados a copolmeros de estireno-divinilbenzeno

-CH2N+(CH3)Cl-

Base fraca

-N+HR2Cl-