4 9 .

LIVER AMYLASE AND HYPERGLYCAEMIA

BY MARGARET LEE AND DEREK RICHTER
From t h e Ce n t ra l Pa t h ol og i c a l La b ora t ory , W e 8 t Pa rk Ho8 p i t a l , Ep s om
( Re c e i v e d 2 6 J a n u a ry 1 9 4 0 )
THE b re a k d ow n of l i v e r g l y c og e n w h i c h oc c u rs a s on e of t h e c h i e f me c h a n i s ms
c on t rol l i n g t h e b l ood s u g a r l e v e l h a s g e n e ra l l y b e e n a s c ri b e d t o t h e l i v e r a my l a s e ,
b u t i t h a s re c e n t l y b e e n s u g g e s t e d t h a t t h e ma i n p a t h of g l y c og e n b re a k d ow n
ma y b e t h rou g h a p h os p h ory l a t i n g s y s t e m i n v ol v i n g a p h os p h ory l a s e w h i c h
f orms h e x os e p h os p h a t e a n d a p h os p h a t a s e w h i c h h y d rol y s e s t h e h e x os e p h os p h a t e
t o g l u c os e [ Cori & Cori , 1 9 3 8 ] .
Re c e n t w ork h a s a d d e d g re a t l y t o ou r k n ow l e d g e of t h e p h os p h ory l a t i n g
me c h a n i s m i n t h e l i v e r [ Cori e t a t . 1 9 3 9 ; O s t e rn e t a l . 1 9 3 9 ] , b u t i f t h e g l y c og e n
b re a k d ow n i n v i v o i s t o b e a s c ri b e d t o t h i s s y s t e m i t w ou l d l e a v e t h e s i g n i f i c a n c e
of t h e l i v e r a my l a s e i n d ou b t a n d t h e re i s a s y e t l i t t l e re a s on f or a t t ri b u t i n g
t h i s f u n c t i on t o t h e on e s y s t e m ra t h e r t h a n t o t h e ot h e r.
Cori & Cori [ 1 9 3 8 ] h a v e s u g g e s t e d t h a t t h e a my l a s e f ou n d i n t h e l i v e r ma y
b e d u e t o t h e b l ood c on t a i n e d i n t h e org a n a n d q u ot e i n t h i s c on n e x i on a n ol d e r
ob s e rv a t i on of Da v e n p ort [ 1 9 2 6 ] t h a t l i t t l e a my l a s e i s f ou n d i n t h e l i v e r a f t e r
t h orou g h p e rf u s i on : b u t ot h e r i n v e s t i g a t ors h a v e c on c l u d e d t h a t p e rf u s i on w a s h e s
t h e a my l a s e ou t of t h e t i s s u e s [ Le s s e r, 1 9 2 0 ; W i l l s t i Lt t e r & Roh d e w a l d , 1 9 3 6 ] .
Th e re i s t h e re f ore s ome d ou b t a s t o w h e t h e r t h e a my l a s e i s re a l l y p re s e n t i n t h e
l i v e r t i s s u e s or n ot . Th e q u e s t i on of t h e e x a c t l oc a l i z a t i on of t h e a my l a s e i s of
s p e c i a l i n t e re s t s i n c e Le s s e r [ 1 9 2 1 ] c on c l u d e d t h a t t h e g l y c og e n a n d a my l a s e
a re s p a t i a l l y s e p a ra t e d i n t h e l i v e r a n d t h a t a d re n a l i n e a c t s i n p rod u c i n g
h y p e rg l y c a e mi a b y e n a b l i n g t h e g l y c og e n a n d a my l a s e t o c ome t og e t h e r.
Th e p h os p h ory l a t i n g s y s t e m h a s b e e n s h ow n t o b e re v e rs i b l e , c a t a l y s i n g
e i t h e r t h e b re a k d ow n or t h e s y n t h e s i s of g l y c og e n . It i s u n l i k e l y t h a t t h e re
w ou l d b e more t h a n on e s y s t e m t h a t i s a b l e t o s y n t h e s i z e g l y c og e n a n d i t i s
t h e re f ore p rob a b l e t h a t t h i s s y s t e m i s c on c e rn e d i n t h e s y n t h e s i s of g l y c og e n
i n v i v o; b u t i t i s n ot k n ow n t h a t t h e p a t h of g l y c og e n b re a k d ow n i n v i v o i s t h e
s a me a s t h a t b y w h i c h i t i s s y n t h e s i z e d . It i s a l s o n ot k n ow n t h a t t h e me c h a n i s m
c on c e rn e d i n t h e n orma l re g u l a t i on of t h e b l ood s u g a r i s t h e s a me a s t h a t w h i c h
c ome s i n t o a c t i on i n c a u s i n g t h e ra p i d g l y c og e n b re a k d ow n w h i c h oc c u rs i n
t h e v a ri ou s f orms of e n d og e n ou s h y p e rg l y c a e mi a .
In c on s i d e ri n g t h e p os s i b l e s i g n i f i c a n c e of t h e l i v e r a my l a s e a n d p h os p h ory l a s e
i n re l a t i on t o h y p e rg l y c a e mi a i t i s c l e a r t h a t mu c h f u rt h e r i n f orma t i on i s re q u i re d
b e f ore i t i s p os s i b l e t o re a c h a n y f i n a l c on c l u s i on s . In t h e p re s e n t i n v e s t i g a t i on
p a rt i c u l a r a t t e n t i on w a s p a i d t o t h e s i g n i f i c a n c e of t h e l i v e r a my l a s e a n d a n
a t t e mp t w a s ma d e t o ob t a i n f u rt h e r e v i d e n c e on t h e
f ol l ow i n g q u e s t i on s . ( 1 ) Is
t h e a my l a s e p re s e n t i n s i g n i f i c a n t a mou n t i n t h e l i v e r t i s s u e ? ( 2 ) How a re t h e
a my l a s e a n d p h os p h ory l a s e d i s t ri b u t e d b e t w e e n t h e c e l l s , l y mp h a n d b l ood
s p a c e s i n t h e l i v e r? ( 3 ) How d oe s t h e a c t i v i t y of t h e l i v e r a my l a s e c omp a re w i t h
t h e ra t e of g l y c og e n ol y s i s w h i c h oc c u rs d u ri n g h y p e rg l y c a e mi a i n v i v o?
Me t h od s
Th e a my l a s e a n d p h os p h ory l a s e a c t i v i t i e s w e re d e t e rmi n e d b y i n c u b a t i n g
t i s s u e b re i w i t h g l y c og e n a n d f ol l ow i n g t h e ra t e s of g l y c og e n ol y s i s a n d p h os -
p h ory l y s i s b y g l y c og e n a n d p h os p h a t e e s t i ma t i on s u n d e r s u i t a b l e c on d i t i on s .
( 3 5 3 )
M. LEE AND D. RICHTER
In ord e r t o d i f f e re n t i a t e b e t w e e n t h e t w o e n z y me s u s e w a s ma d e of s e l e c t i v e
i n h i b i t ors a n d a p re l i mi n a ry s t u d y of t h e a c t i on of i n h i b i t ors on t h e e n z y me s
w a s ma d e f or t h i s p u rp os e .
Gl y c og e n . In p re l i mi n a ry e x p e ri me n t s i t w a s f ou n d t h a t c omme rc i a l s a mp l e s
of g l y c og e n w e re n ot h y d rol y s e d a s f a s t a s a s p e c i me n p re p a re d i n t h e l a b ora t ory .
It w a s t h ou g h t t h a t t h i s mi g h t b e d u e t o a mod i f i c a t i on of t h e g l y c og e n b y t h e
s t ron g a l k a l i u s e d i n t h e ma n u f a c t u re a n d f or t h e p re s e n t w ork t h e g l y c og e n
w a s t h e re f ore p re p a re d b y a me t h od t h a t a v oi d e d t h e u s e of p ot a s s i u m h y d rox i d e
or ot h e r d ra s t i c re a g e n t s . Th e l i v e rs of ra b b i t s t h a t h a d re c e n t l y b e e n f e d w i t h
s u g a r w e re q u i c k l y s l i c e d , d rop p e d i n t o b oi l i n g w a t e r a n d b oi l e d f or 2 mi n . Th e
l i q u i d w a s d e c a n t e d a n d t h e b oi l e d l i v e r mi n c e d , g rou n d w i t h s a n d , re t u rn e d t o
t h e l i q u i d a n d b oi l e d f or 1 0 mi n . a f t e r a d j u s t i n g t o p H 5 - 3 w i t h a c e t i c a c i d . Th e
mi x t u re w a s s t ra i n e d t h rou g h mu s l i n a n d t h e g l y c og e n p re c i p i t a t e d w i t h 1 . 5 v ol .
of a l c oh ol . Af t e r 3 0 mm. i n t h e c l e a r s ol u t i on w a s d e c a n t e d a n d t h e re s i d u e
c e n t ri f u g e d . Th e s ol i d w a s re d i s s ol v e d i n a s ma l l v ol u me of 1 % a c e t i c a c i d , t h e
p re c i p i t a t e re mov e d b y c e n t ri f u g i n g a n d t h e g l y c og e n re p re c i p i t a t e d w i t h a l c oh ol ,
w a s h e d w e l l w i t h a c e t on e a n d d ri e d .
Gl y c og e n e Bt i ma t i on . Gl y c og e n w a s e s t i ma t e d b y t h e mi c ro- me t h od of
He a t l e y [ 1 9 3 5 ] w h i c h w a s mod i f i e d on l y i n t h a t l a rg e r a mou n t s w e re t a k e n
a n d t h e s u g a r e s t i ma t i on s w e re d on e b y t h e Ha g e d orn & J e n s e n [ 1 9 2 3 ] me t h od .
For c e rt a i n p u rp os e s i t w a s f ou n d s u f f i c i e n t l y a c c u ra t e a n d mu c h more ra p i d t o
e s t i ma t e t h e g l y c og e n b y t h e re d c ol ou r w i t h i od i n e . Th e s a mp l e of b re i ( 0 . 5 ml . )
c on t a i n i n g g l y c og e n w a s mi x e d w e l l w i t h 0 5 ml . 2 0
%
t ri c h l oroa c e t i c a c i d i n
a c e n t ri f u g e t u b e . Af t e r c e n t ri f u g i n g , 0 - 5 ml . of t h e s ol u t i on w a s a d d e d t o
1 0 ml . N/ 2 0 i od i n e i n 2 - 5
%
KI a n d t h e c ol ou r c omp a re d w i t h s t a n d a rd s c on -
t a i n i n g 0 2 5 - 1 F0 mg . g l y c og e n . Sa mp l e s g i v i n g more c ol ou r t h a n t h e s t a n d a rd
ra n g e c ou l d b e d i l u t e d a n d e s t i ma t e d a f t e r a d d i n g more i od i n e t o b ri n g t h e
i od i n e c on c e n t ra t i on t o t h e s a me a s b e f ore . Th e s t a n d a rd s ol u t i on s k e p t f or
a b ou t a d a y .
Ph o8 p h a t e e 8 t i ma t i on . Th e p re s e n c e of g l y c og e n re d u c e s t h e a c c u ra c y of
p h os p h a t e e s t i ma t i on b y t h e u s u a l mol y b d a t e me t h od ow i n g t o t h e t u rb i d i t y
of t h e f i n a l s ol u t i on u s e d f or c ol ori me t ri c c omp a ri s on . Th i s w a s ov e rc ome b y
mi x i n g t h e s p e c i me n ( 0 5 ml . ) i n a c e n t ri f u g e t u b e w i t h 1 - 5 ml . a l c oh ol , a d d i n g
1 ml . 2 0 %
t ri c h l oroa c e t i c a c i d a n d k e e p i n g ov e rn i g h t b e f ore c e n t ri f u g i n g a n d
e s t i ma t i n g i n t h e u s u a l w a y a s d e s c ri b e d b y De n i g e s [ 1 9 2 1 ] a n d At k i n s & W i l s on
[ 1 9 2 6 ] .
De t e rmi n a t i on of a my l a s e a n d p h os p h ory k l e a c t i v i t i e s . Amy l a s e a c t i v i t i e s
w e re g e n e ra l l y me a s u re d b y i n c u b a t i n g t h e t i s s u e b re i w i t h a n e x c e s s of g l y c og e n
i n t h e p re s e n c e of a p h os p h ory l a s e i n h i b i t or a n d f ol l ow i n g t h e ra t e of g l y c og e n
d i s a p p e a ra n c e b y g l y c og e n e s t i ma t i on s a t s u i t a b l e i n t e rv a l s . In mos t e x p e ri me n t s
a t ot a l v ol u me of 5 ml . c on t a i n e d 2 ml . l i v e r b re i , 0 5 ml . M/ 9 S0 re n s e n p h os p h a t e
b u f f e r p H 7 a n d s u f f i c i e n t g l y c og e n s ol u t i on t o b ri n g t h e f i n a l c on c e n t ra t i on w i t h
t h e g l y c og e n a l re a d y p re s e n t i n t h e t i s s u e t o 1 - 2
%.
As p h os p h ory l a s e i n h i b i t ors
6
% g l u c os e , 0 4 1 mg . / ml . c op p e r a d d e d a s c op p e r s u l p h a t e , or 1
%
p h l ori d z i n
w e re f ou n d t o b e t h e mos t e f f e c t i v e . In p re p a ri n g t h e l i v e r b re i t h e l i v e r w a s
c ool e d on i c e i mme d i a t e l y a f t e r p e rf u s i on , g rou n d t h orou g h l y w i t h s a n d i n
a c ool e d mort a r a n d mi x e d w i t h a n e q u a l v ol u me of w a t e r a t 0 0 . Th e l i v e r b re i
w a s k e p t on i c e a n d u s e d w i t h i n 3 h r. of p re p a ra t i on .
In d e t e rmi n i n g p h os p h ory l a s e a c t i v i t i e s a d e n y l i c a c i d , h y d rog e n c y a n i d e
[ c f . Gi l l & Le h ma n n , 1 9 3 9 ] a n d ma g n e s i u j m c h l ori d e w e re a d d e d t o e n s u re t h e
a c t i v i t y of t h e p h os p h ory l a t i n g s y s t e m a n d s od i u m f l u ori d e w a s a d d e d t o i n h i b i t
t h e d e c omp os i t i on of p h os p h a t e e s t e rs s o t h a t t h e d i s a p p e a ra n c e of i n org a n i c
3 5 4
LIVER AMYLASE
p h os p h a t e c ou l d b e t a k e n a s a me a s u re of t h e p h os p h ory l a s e a c t i v i t y . In mos t
e x p e ri me n t s a t ot a l v ol u me of 5 ml . c on t a i n e d 2 ml . l i v e r b re i , 0 . 1 ml . a d e n y l i c
a c i d ( 0 - 1
%) ,
0 4 1 ml . Mg Cl 2 s ol u t i on ( 1 mg . Mg / ml . ) , 0 5 ml . M/ 2 HCN p re p a re d b y
n e u t ra l i z i n g KCN w i t h HCI, 0 5 ml . M/ 9 p h os p h a t e b u f f e r p H 7 , 0 5 ml . M/ 2 Na F
a n d s u f f i c i e n t g l y c og e n s ol u t i on t o b ri n g t h e c on c e n t ra t i on t o 1 - 2
%. Tu b e s
c on t a i n i n g t h e mi x t u re w e re i n c u b a t e d i n a w a t e r b a t h a t 3 7 . Th e ra t e w a s n ot
i n c re a s e d b y s h a k i n g . Sa mp l e s of 0 5 ml . w e re t a k e n a t t h e b e g i n n i n g a n d a t
v a ri ou s t i me i n t e rv a l s f or p h os p h a t e e s t i ma t i on . Th e i n i t i a l i n org a n i c p h os p h a t e
i n t h e t u b e s , w i t h t h a t c omi n g f rom t h e l i v e r b re i , w a s u s u a l l y e q u i v a l e n t t o
a b ou t 1 * 5 mg . P. Th e p h os p h a t e u p t a k e d u e t o p h os p h ory l a t i on w a s g e n e ra l l y
e q u i v a l e n t t o 0 * 3 - 0 - 8 mg . P. Th e p h os p h a t e c on c e n t ra t i on u s e d i n t h e s e e x p e ri -
me n t s w a s c h os e n a s b e i n g n ot t oo f a r re mov e d f rom t h e p h y s i ol og i c a l c on c e n t ra -
t i on . Th i s me t h od of e s t i ma t i n g t h e ra t e of p h os p h ory l y s i s of g l y c og e n w a s
s u b j e c t t o e rror i n t h a t e v e n i n t h e p re s e n c e of M/ 2 0 Na F t h e l i v e r b re i s of t e n
s h ow e d a s l ow s p on t a n e ou s l i b e ra t i on of i n org a n i c p h os p h a t e c omi n g p os s i b l y
f rom t h e p h os p h ol i p i n s or d u e t o t h e f a c t t h a t t h e p h os p h a t a s e w a s n ot c om-
p l e t e l y i n h i b i t e d , b u t t h e e rrors i n c u rre d i n t h i s w a y w e re g e n e ra l l y s ma l l .
Th e s od i u m f l u ori d e a n d ot h e r a d d i t i on s u s e d d i d n ot a p p re c i a b l y a f f e c t t h e
a my l a s e a c t i v i t y ; t h e g l y c og e n b re a k d ow n d u e t o t h e a my l a s e a n d t h a t d u e t o
t h e p h os p h ory l a s e w e re f re q u e n t l y me a s u re d s i mu l t a n e ou s l y . Gl y c og e n e s t i ma -
t i on s g a v e t h e t ot a l ra t e of g l y c og e n ol y s i s d u e t o b ot h e n z y me s , w h i l e p h os p h a t e
e s t i ma t i on s g a v e t h e ra t e of p h os p h ory l y s i s . Th e d i f f e re n c e b e t w e e n t h e t ot a l
g l y c og e n b re a k d ow n a n d t h e p h os p h ory l y s i s t h e n g a v e t h e ra t e of " a my l ol y s i s " ,
or h y d rol y s i s b y a my l a s e . In c a l c u l a t i n g t h e g l y c og e n b rok e n d ow n b y p h os -
p h ory l y s i s i t w a s a s s u me d t h a t e a c h mol e c u l e of p h os p h a t e l e d t o t h e p h os p h ory -
l y s i s of on e C6 H1 0 0 5 u n i t of g l y c og e n a n d t h e f orma t i on of on e mol e c u l e of
h e x os e mon op h os p h a t e : t h e p h os p h oru s u p t a k e f i g u re s w e re t h e re f ore mu l t i p l i e d
b y t h e f a c t or 5 - 2 t o ob t a i n t h e p h os p h ory l y s i s f i g u re s .
Pre l i mi n a ry e x p e ri me n t s w i t h ra b b i t l i v e r b re i i n w h i c h 2 % g l u c os e w a s
s u b s t i t u t e d f or g l y c og e n u n d e r t h e c on d i t i on s d e s c ri b e d s h ow e d n o me a s u ra b l e
u p t a k e of i n org a n i c p h os p h a t e : i t w a s c on c l u d e d t h a t , i n a g re e me n t w i t h O s t e rn
e t a l . [ 1 9 3 9 ] , n o p h os p h ory l a t i on of g l u c os e oc c u rs u n d e r t h e s e c on d i t i on s a n d
t h a t t h e p h os p h a t e u p t a k e w a s e n t i re l y d u e t o t h e p h os p h ory l a t i on of g l y c og e n .
Di s t ri b u t i on of a my l a s e i n t h e l i v e r
Pe rf u s i on . Th e p os s i b i l i t y of d e c i d i n g w h e t h e r t h e l i v e r a my l a s e i s p re s e n t
i n t h e t i s s u e s or i s ma i n l y c on f i n e d t o t h e b l ood s p a c e s i n t h e l i v e r d e p e n d s on
t h e s u c c e s s w i t h w h i c h t h e b l ood c a n b e re mov e d b y p e rf u s i on w i t h ou t c a u s i n g
a n y l os s of a my l a s e f rom t h e t i s s u e s ; c on s i d e ra b l e a t t e n t i on w a s t h e re f ore p a i d
t o t h e p e rf u s i on t e c h n i q u e .
Pe rf u s i on w i t h d i s t i l l e d w a t e r, w h i c h w a s u s e d b y Da v e n p ort [ 1 9 2 6 ] , i s l i a b l e
t o c a u s e c on s i d e ra b l e d a ma g e t o t h e t i s s u e s ow i n g t o t h e oe d e ma w h i c h ra p i d l y
oc c u rs a n d t h i s mu s t h a s t e n t h e l os s of a my l a s e f rom t h e t i s s u e s . An ot h e r s ou rc e
of e rror i s t h e c l ot t i n g of t h e b l ood i n t h e c a p i l l a ri e s t h rou g h s l i g h t d a ma g e or
c h i l l i n g of t h e s u rf a c e w h i l e t h e l i v e r i s b e i n g e x c i s e d . Af t e r s e v e ra l d i f f e re n t
me t h od s h a d b e e n t ri e d t h e f ol l ow i n g w a s a d op t e d a s b e i n g t h e mos t s u c c e s s f u l
i n re mov i n g a ma x i mu m a mou n t of b l ood i n a mi n i mu m of t i me a n d w i t h a
mi n i mu m of d a ma g e t o t h e t i s s u e s .
Ra b b i t s w e re a n a e s t h e t i z e d w i t h n e mb u t a l ( a b ou t 2 5 mg . / k g . i n t ra v e n ou s l y ) .
Th e a b d omi n a l c a v i t y w a s op e n e d a n d a l oos e l i g a t u re ra p i d l y p u t i n p os i t i on
rou n d t h e p ort a l v e i n . A h y p od e rmi c n e e d l e d e l i v e ri n g n orma l s a l i n e a t 3 7 0
3 5 5
3 5 6 M. LEE AND D. RICHTER
a n d f rom a h e i g h t of 4 0 c m. w a s t h e n i n s e rt e d i n t o t h e p ort a l v e i n , t h e l i g a t u re
t i e d rou n d t h e n e e d l e a n d t h e v e n a c a v a a n d a ort a c u t t o a l l ow t h e b l ood t o
e s c a p e f re e l y . Th e re mov a l of b l ood f rom t h e l i v e r w a s h a s t e n e d b y g e n t l e
ma s s a g e . Af t e r a b ou t 7 mi n . of ra p i d p e rf u s i on , w h e n t h e p e rf u s a t e a p p e a re d
f re e f rom b l ood , t h e l i v e r w a s t a k e n ou t a n d i mme d i a t e l y c ool e d on i c e .
Th e e f f i c i e n c y of t h e p e rf u s i on w a s f re q u e n t l y c h e c k e d b y c e n t ri f u g i n g a s u s -
p e n s i on ma d e b y s h a k i n g t h e mi n c e d l i v e r i n s a l i n e : a n y re d b l ood c orp u s c l e s
w h i c h mi g h t b e p re s e n t t h e n f orme d a f i n e l a y e r on t h e s u rf a c e w h i c h e n a b l e d
t h e p re s e n c e of a v e ry s ma l l a mou n t of b l ood t o b e d e t e c t e d . It w a s e s t i ma t e d
t h a t i n n on e of t h e e x p e ri me n t s w a s t h e re s i d u a l b l ood a s mu c h a s 1 % of t h a t
ori g i n a l l y p re s e n t or 0 - 3
%
of t h e w e i g h t of t h e l i v e r; i t c ou l d t h e re f ore b e t a k e n
t h a t a t l e a s t 9 9
%
of t h e b l ood a my l a s e w a s re mov e d i n t h i s w a y .
Gl y c og e n ol y t i c a c t i v i t y of p e rf u 8 e d l i v e r
Th e a c t i v i t y of t h e b re i p re p a re d f rom t h e p e rf u s e d ra b b i t l i v e rs i n b re a k i n g
d ow n g l y c og e n w a s t e s t e d u n d e r t h e c on d i t i on s d e s c ri b e d . Th e a c t i v i t y v a ri e d
g re a t l y f rom on e a n i ma l t o a n ot h e r: f re q u e n t l y t h e a c t i v i t y w a s v e ry h i g h a n d
c orre s p on d e d t o t h e g l y c og e n ol y s i s of 2 0 - 5 0 mg . g l y c og e n p e r g . f re s h l i v e r
p e r h r. , b u t i n ma n y e x p e ri me n t s t h e g l y c og e n ol y s i s d i d n ot e x c e e d 1 mg .
g l y c og e n p e r g . l i v e r p e r h r. Th e ra t e of g l y c og e n ol y s i s u n d e r t h e s e c on d i t i on s
re ma i n e d c on s t a n t f or s e v e ra l h ou rs or u n t i l n e a rl y a l l t h e g l y c og e n h a d
d i s a p p e a re d .
1 3 O
Ti me ( h r. )
Fi g . 1 . Gl y c og e n b re a k d ow n b y l i v e r b re i . Gu i n e a - p i g I a n d ra b b i t 2 l i v e rs p e rf u s e d ; g u i n e a - p i g 2 ,
ra b b i t 1 a n d 3 a n d l a mb l i v e rs n ot p e rf u s e d . In i t i a l g l y c og e n c on c e n t ra t i on 1 %.
At t h i s s t a g e i t w a s n ot k n ow n w h e t h e r t h e g l y c og e n ol y s i s i n t h e l i v e r b re i
u n d e r t h e s e c on d i t i on s w a s d u e ma i n l y t o a n a my l a s e or t o t h e p h os p h ory l a s e .
Ex rp e ri me n t s w e re t h e re f ore c a rri e d ou t t o t e s t t h i s b y me a n s of s p e c i f i c a my l a s e
a n d p h os p h ory l a s e i n h i b i t ors .
Amy l a s e s a re k n ow n t o b e s t ron g l y i n h i b i t e d b y ma l t os e , w h i c h i s a p rod u c t
of t h e i r a c t i on on g l y c og e n , a n d p h os p h ory l a s e s a re i n h i b i t e d b y p h l ori d z i n .
Gi l l &; Le h ma u n [ 1 9 3 9 ] h a v e re c e n t l y ma d e a n e x rt e n s i v e s t u d y of t h e a c t i on of
i n h i b i t ors on t h e mu s c l e p h os p h ory l a s e . Th e i r ob s e rv a t i on s on t h e i n h i b i t i on
of mu s c l e p h os p h ory l a s e b y g l u c os e , ma l t os e a n d c op p e r w e re c on f i rme d . Th e
LIVER AMYLASE
a c t i on s of 6
%
g l u c os e , 1 2
%
ma l t os e , 1
%
p h l ori d z i n a n d 0 4 1 mg . / ml . c op p e r on
( a ) p a n c re a t i c a my l a s e , ( b ) b l ood a my l a s e a n d ( c ) mu s c l e p h os p h ory l a s e w e re
t h e n c omp a re d w i t h t h e i r e f f e c t s on ( d ) t h e t ot a l g l y c og e n ol y s i s a n d ( e ) t h e
p h os p h ory l y s i s me a s u re d s i mu l t a n e ou s l y u n d e r t h e s a me c on d i t i on s i n f re s h l y
p e rf u s e d ra b b i t l i v e r b re i ( Ta b l e 1 ) .
Ta b l e 1 . Pe rc e n t a g e i n h i b i t i on s b y ma l t os e , g l u c os e , p h l ori d z i n a n d c op p e r
Li v e r b re i
Pa n -
c re a t i c Bl ood Mu s c l e Tot a l
In h i b i t or a my l a s e a my l a s e p h os p h ory l a s e g l y c og e n ol y s i s Ph os p h ory l y s i s
6 % g l u c os e 0 2 1 0 0 ; 7 3 ; 1 0 0 5 ; 0 ; 1 1 8 2 ; 1 0 0 ; 4 1
1 2 % ma l t os e 8 5 3 3 5 0 ; 1 0 0 ; 6 7 6 6 ; 4 5 6 0
1 % p h l ori d z i n 2 8 5 0 1 3 ; 0 ; 8 5 6 ; 4 7 ; 2 4
0 - 1
mg . / ml .
c op p e r 8 3 1 0 0 ; 1 0 0 ; 7 8 0 ; 0 ; 0 2 9 ; 1 9 ; 2 6
Th e l i v e r b re i w a s p re p a re d f rom ra b b i t l i v e r w h i c h g a v e a b re a k d ow n of 1 5 - 2 5 mg . g l y c og e n
p e r g . l i v e r p e r h r. Th e c op p e r w a s a d d e d a s Cu SO 4 .
Th e p a n c re a t i c a my l a s e w a s p re p a re d f rom s h e e p p a n c re a s a n d p u ri f i e d b y
t h e me t h od of Ha n e s & Ca t t l e [ 1 9 3 8 ] . O x b l ood w a s u s e d a s a s ou rc e of b l ood
a my l a s e . Mu s c l e p h os p h ory l a s e w a s u s e d i n t h e f orm of a n e x t ra c t ma d e f rom
ra b b i t mu s c l e a s d e s c ri b e d b y Me y e rh of [ 1 9 2 6 ] . Th e e n z y me s ol u t i on s w e re
d i l u t e d s o a s t o g i v e a g l y c og e n b re a k d ow n of a b ou t 5 0
%
i n 2 h r. w i t h a n i n i t i a l
c on c e n t ra t i on of 1 - 2
%
g l y c og e n . Th e a my l a s e e x p e ri me n t s w e re d on e i n t h e
p re s e n c e of 1 0 mg . / ml . Na Cl a n d M/ 3 0 p h os p h a t e b u f f e r p H 7 . Th e c on d i t i on s
of t h e e x p e ri me n t s w i t h mu s c l e e x t ra c t a n d l i v e r b re i w e re a s d e s c ri b e d a b ov e .
Ma l t os e i n h i b i t e d t h e p h os p h ory l a s e a s w e l l a s t h e a my l a s e a n d s o f a i l e d t o
d i f f e re n t i a t e b e t w e e n t h e m b u t t h e i n h i b i t i on s ob s e rv e d w i t h g l u c os e , c op p e r
a n d p h l ori d z i n g a v e c l e a r e v i d e n c e t h a t a n a my l a s e w a s p re s e n t i n t h e l i v e r
b re i a n d w a s ma i n l y re s p on s i b l e f or t h e g l y c og e n ol y s i s ob s e rv e d u n d e r t h e s e
c on d i t i on s . Th i s w a s c on f i rme d b y t h e f i g u re s g i v i n g t h e p h os p h ory l y s i s c a l c u l a t e d
f rom me a s u re me n t s of t h e p h os p h a t e u p t a k e ( Ta b l e 2 ) .
Ta b l e 2 . Gl y c og e n ol y s i s a n d p h os p h ory l y s i s i n p e rf u s e d ra b b i t l i v e r b re i
Tot a l
Ex p . In c u b a t i on g l y c og e n ol y s i s Ph os p h ory l y s i s
n o. h r. mg . / g . / h r. mg - / g - / h r.
1
2 i
1 0 - 7 1 - 0 7
2 2 1 5 - 0 ' 0 - 9 8
3
II
2 5 * 6 3 . 9 4
4 1 i 3 . 4 0 - 8 6
5
i
2 4 . 0 4 * 2 3
6 2 j 2 6 * 0 1 - 0 6
Con d i t i on s a s d e s c ri b e d f or me a s u ri n g t ot a l g l y c og e n ol y s i s a n d p h os p h ory l y s i s s i mu l t a n e ou s l y .
Th e f i g u re s f or t ot a l g l y c og e n ol y s i s a n d p h os p h ory l y s i s re p re s e n t mg .
g l y c og e n b rok e n d ow n p e r g . f re s h l i v e r p e r h r. Th e p h os p h ory l y s i s w a s a l w a y s
mu c h l e s s t h a n t h e t ot a l g l y c og e n ol y s i s , i n d i c a t i n g a g a i n t h a t mos t of t h e
g l y c og e n ol y s i s u n d e r t h e s e c on d i t i on s w a s d u e t o t h e a my l a s e .
Th e ra t e s of t ot a l g l y c og e n ol y s i s a n d p h os p h ory l y s i s w e re a l s o me a s u re d i n
t h e s a me w a y i n t h e b re i p re p a re d f rom u n p e rf u s e d ra b b i t l i v e r. Th e b l ood w a s
rou g h l y re mov e d b y p re s s i n g ou t on f i l t e r p a p e r.
Th e re s u l t s w i t h u n p e rf u s e d l i v e r ( Ta b l e 3 ) w e re v e ry s i mi l a r t o t h os e ob t a i n e d
w i t h p e rf u s e d l i v e r a n d s h ow e d t h a t t h e p re s e n c e or a b s e n c e of b l ood d i d n ot
p rod u c e a n y v e ry s t ri k i n g d i f f e re n c e s u c h a s mi g h t h a v e b e e n e x p e c t e d i f t h e
Bi oc h e m. 1 9 4 0 , 3 4 2 3
3 5 7
M. LEE AND D. RICHTER
Ta b l e 3 . Gl y c og e n ol y s i s a n d p h os p h ory l y s i s i n u n p e rf u s e d ra b b i t l i v e rs
Ex p . In c u b a t i on
n o. h r.
1 i
2 2
3 I1
4
i f
5 1
6
i t
7 1
Tot a l
g l y c og e n ol y s i s
mg . / g - / h r.
2 1 - 6
4 - 8
5 5 . 0
5 - 3
2 4 ' 0
2 1 * 6
1 4 - 4
Ph os p h ory l y s i s
mg . / g . / h r.
2 - 0 1
1 - 0 4
2 - 5 0
2 - 2 4
2 - 9 4
2 * 0 1
1 * 0 0
Con d i t i on s a s d e s c ri b e d f or me a s u ri n g t ot a l g l y c og e n ol y s i s a n d p h os p h ory l y s i s s i mu l t a n e ou s l y .
b l ood a my l a s e w e re a n i mp ort a n t f a c t or. Th e re w a s a l s o n o e v i d e n c e of a n y l os s
of a my l a s e or p h os p h ory l a s e a c t i v i t y d u ri n g t h e p e rf u s i on .
In ot h e r e x p e ri me n t s w i t h f re s h u n p e rf u s e d l i v e rs f rom ot h e r s p e c i e s t h e
a b s e n c e of a n y c on s i d e ra b l e i n h i b i t i on of g l y c og e n ol y s i s b y g l u c os e , p h l ori d z i n
or c op p e r a g a i n s h ow e d t h a t u n d e r t h e s e c on d i t i on s mos t of t h e g l y c og e n
b re a k d ow n i n t h e l i v e r b re i w a s d u e t o " a my l ol y s i s " ra t h e r t h a n t o p h os -
p h ory l y s i s .
An i m
Gu i n e i
Sh e e p
La mb
Tot a l
In c u b a t i on g l y c og e n ol y s i s
. a l h r. mg . Ig . / h r.
a - p i g 2 1 2 - 8
2 3 - 2
2 3 - 2
Pe rc e n t a g e i n h i b i t i on
Gl u c os e Cop p e r Ph l ori d z i n
1 6 0
o 0
0
0
0
Th e s h e e p a n d l a mb l i v e rs w e re u s e d w i t h i n 4 5 mi n . of s l a u g h t e ri n g . Th e i n h i b i t or c on c e n t ra -
t i on s a n d ot h e r c on d i t i on s w e re t h e s a me a s d e s c ri b e d f or ra b b i t l i v e r.
Di s t ri b u t i on of a my l a s e b e t w e e n t i s s u e a n d b l ood
Th e f ore g oi n g e x p e ri me n t s g a v e e v i d e n c e of t h e e x i s t e n c e of a n a c t i v e
a my l a s e i n t h e l i v e r t i s s u e . Th e s i mi l a r re s u l t s ob t a i n e d w i t h p e rf u s e d a n d u n -
p e rf u s e d l i v e rs ma d e i t i mp rob a b l e t h a t t h e a my l a s e f ou n d i n t h e l i v e r c ou l d
b e a t t ri b u t e d t o t ra c e s of b l ood re ma i n i n g i n t h e l i v e r a f t e r t h e p e rf u s i on , b u t
i t w a s d e s i re d t o h a v e more d e f i n i t e e v i d e n c e on t h i s p oi n t a n d i n a n u mb e r of
e x p e ri me n t s t h e a my l a s e c on t e n t s of t h e b l ood a n d p e rf u s e d l i v e r f rom t h e s a me
a n i ma l w e re t e s t e d u n d e r t h e s a me c on d i t i on s a n d a t t h e s a me t i me .
Ta b l e 4 . Amy l a s e a c t i v i t i e s of l i v e r a n d b l ood f rom t h e s a me a n i ma l
Ex p .
n o. An i ma l
1 Ra b b i t
2
, ,
9 , ,
3 , ,
4 , ,
i ,
5
Gu i n e a - p i g
, , P
6
In c u b a t i on
t i me
mi n .
6 5
6 5
6 5
1 0 5
1 0 5
1 5 0
1 5 0
6 0
6 0
Gl y c og e n ol y s i s
_
Ad d i t i on s
6 % g l u c os e
1 %p h l ori d z i n
6 % g l u c os e
1 %p h l ori d z i n
, ,9 6 5
Li v e r
mg . / g . / h r.
9 - 2
5 5 - 0
5 2 - 0
3 . 4
3 - 4
1 0 - 7
9 - 8
4 2
4 5
Bl ood
mg . / g . / h r.
1 0 . 1
5 0 0
5 0 - 0
5 - 7
5 - 7
9 - 8
9 - 8
9 9
9 9
Re ma rk s
Not p e rf u s e d
, , p
2 3 - 4 2 7 - 6 Not p e rf i s e d
Th e l i v e rs w e re p e rf u s e d e x c e p t w h e re s t a t e d . Con d i t i on s a s d e s c ri b e d .
3 5 8
LIVER AMYLASE
In f i v e ou t of s i x e x p e ri me n t s ( Ta b l e 4 ) t h e a my l a s e a c t i v i t i e s of t h e b l ood
a n d l i v e r, e x p re s s e d a s mg . g l y c og e n b rok e n d ow n p e r g . p e r h r. , w e re v e ry
s i mi l a r.
In v i v o a b ou t 3 0
%
of t h e l i v e r w e i g h t i s d u e t o b l ood , b u t a f t e r e x c i s i on a n d
p re s s i n g ou t t h i s f i g u re ma y b e re d u c e d t o 5 - 1 0 %. Th e a mou n t of b l ood re ma i n i n g
a f t e r p e rf u s i on w a s e s t i ma t e d a s l e s s t h a n 0 3 %. It w a s t h e re f ore e v i d e n t t h a t
t h e a my l a s e a c t i v i t y of t h e b l ood l e f t i n t h e org a n c ou l d n ot p os s i b l y a c c ou n t
f or t h e a c t i v i t y f ou n d i n t h e l i v e r. It w a s c l e a r t h a t t h e a my l a s e mu s t b e p re s e n t
i n t h e l i v e r t i s s u e a n d t h a t t h e c on c e n t ra t i on i n t h e t i s s u e w a s s i mi l a r t o t h a t i n
t h e b l ood .
Si mi l a r e x p e ri me n t s i n w h i c h t h e d i s t ri b u t i on of t h e p h os p h ory l a s e w a s
t e s t e d s h ow e d t h a t i t w a s p re s e n t e x c l u s i v e l y i n t h e t i s s u e s : n o p h os p h ory l a s e
a c t i v i t y w a s f ou n d i n t h e b l ood .
Di s t ri b u t i on of a my l a s e b e t w e e n c e l l s a n d i n t e rc e l l u l a r f l u i d
In s t a i n e d s e c t i on s p re p a re d f rom c a t , ra b b i t a n d p i g l i v e rs a f t e r f i x a t i on i n
f orma l i n t h e v ol u me of t h e i n t e rc e l l u l a r or l y mp h s p a c e s b e t w e e n t h e c e l l s a n d
s i n u s oi d a l me mb ra n e s a l w a y s a p p e a re d t o b e s ma l l ; b u t t h i s ma y b e d u e t o
s h ri n k a g e of t h e me mb ra n e s on t o t h e c e l l s i n t h e f i x i n g a n d s t a i n i n g . Th e re i s
e v i d e n c e t h a t t h e ra t i o of i n t e rc e l l i 4 a r s p a c e t o c e l l v ol u me ma y v a ry c on s i d e ra b l y
i n v i v o u n d e r d i f f e re n t p h y s i ol og i c a l c on d i t i on s a n d t h e ma rk e d c h a n g e i n l i v e r
v ol u me p rod u c e d b y a d re n a l i n e s u g g e s t e d t h a t s u c h a c h a n g e mi g h t b e re l a t e d
t o t h e h y p e rg l y c a e mi c a c t i on a n d ma d e i t a p p e a r d e s i ra b l e t o t ry t o ob t a i n
e v i d e n c e a s t o w h e t h e r t h e a my l a s e i s n orma l l y p re s e n t i n t h e c e l l s or i s p re s e n t
on l y i n t h e i n t e rc e l l u l a r f l u i d .
In ord i n a ry l i v e r b re i p re p a re d b y g ri n d i n g i n a mort a r t h e t e x t u re i s g e n e ra l l y
u n e v e n , a n d mi c ros c op i c e x a mi n a t i on a f t e r s t a i n i n g w i t h t ol u i d i n e b l u e s h ow s
a c on s i d e ra b l e p rop ort i on of d a ma g e d c e l l s a n d c e l l f ra g me n t s . Af t e r s e v e ra l
d i f f e re n t me t h od s h a d b e e n t ri e d i t w a s f ou n d t h a t b y g e n t l y p re s s i n g l i v e r
s l i c e s of a b ou t 1 - 2 mm. t h i c k n e s s f i rs t t h rou g h a c oa rs e n e t of 2 5 h ol e s p e r s q . c m.
a n d t h e n t h rou g h a f i n e n e t of 1 7 0 h ol e s p e r s q . c m. a n d s u s p e n d i n g i n n orma l
s a l i n e a c e l l s u s p e n s i on c ou l d b e ob t a i n e d c on s i s t i n g ma i n l y of s i n g l e c e l l s a n d
s ma l l c l u s t e rs of c e l l s i n w h i c h v e ry f e w d a ma g e d c e l l s or c e l l f ra g me n t s c ou l d
b e f ou n d . Th e c e l l s q u i c k l y s e p a ra t e d ou t on c e n t ri f u g i n g a n d i n t h i s w a y a rou g h
s e p a ra t i on of t h e c e l l s f rom t h e i n t e rc e l l u l a r f l u i d w a s ob t a i n e d . Th e s u s p e n d i n g
f l u i d ma y b e e x p e c t e d t o c on t a i n mos t of t h e e n z y me s p re s e n t i n t h e l y mp h
a n d i n t e rc e l l u l a r f l u i d a s w e l l a s a n y e n z y me s w a s h e d ou t of t h e c e l l s .
For t e s t i n g t h e a my l a s e a c t i v i t i e s t h e l i v e r w h i c h w a s c ool e d on i c e i mme -
d i a t e l y a f t e r p e rf u s i on w a s s l i c e d a s ra p i d l y a s p os s i b l e , p re s s e d t h rou g h n e t
i n t o a c ool e d c e n t ri f u g e t u b e , s h a k e n ra p i d l y w i t h a n e q u a l v ol u me of n orma l
s a l i n e a n d t h e s u s p e n s i on i mme d i a t e l y c e n t ri f u g e d a t h i g h s p e e d . Th e t i me t a k e n
f rom s t a rt i n g t o c u t t h e s l i c e s t o c e n t ri f u g i n g w a s a b ou t 2 mi n . Th e s e p a ra t e d
c e l l s w e re g rou n d w i t h s a n d a n d ma d e i n t o a b re i w i t h a n e q u a l v ol u me of w a t e r.
Th e a my l a s e a c t i v i t i e s of t h e c e l l s a n d s u s p e n d i n g s ol u t i on w e re t h e n t e s t e d
i n t h e u s u a l w a y . In mos t e x p e ri me n t s 6 % g l u c os e or 1 % p h l ori d z i n w a s
a d d e d t o i n h i b i t t h e p h os p h ory l a s e , b u t t h i s d i d n ot a p p e a r t o b e n e c e s s a ry a s
t h e p h os p h ory l a s e w a s re l a t i v e l y i n a c t i v e u n d e r t h e c on d i t i on s u s e d , w h i c h w e re
n ot op t i ma l f or s h ow i n g p h os p h ory l a s e a c t i v i t y . Tw o e x p e ri me n t s a re g i v e n i n
w h i c h 6
%
g u m a c a c i a i n n orma l s a l i n e w a s u s e d a s a s u s p e n d i n g me d i u m f or t h e
c e l l s ( Ta b l e 5 ) . Con t rol e x p e ri me n t s s h ow e d t h a t t h e g u m a c a c i a d i d n ot i n h i b i t
t h e a my l a s e .
2 3 - 2
3 5 9
3 6 0 M. LEE AND D. RICHTER
Ta b l e 5 . Pe rc e n t a g e
d i s t ri b u t i on of a my l 7 e b e t w e e n
l i v e r c e l l s a n d s u s p e n d i n g f l u i d
Gl y c o- In c u b a - Di s t ri b u t i on of
g e n ol y t i c t i on a my l a s e ( %)
Ex p . a c t i v i t y t i me - - - -
n o. An i ma l mg . / g . / h r. Ad d i t i on s mi n . Ce l l s Fl u i d Re ma rk s
1 Gu i n e a - p i g 2 7 - 2 6 0 6 6 3 4
2 7 - 2 1 % p h l ori d z i n 6 0 6 7 3 3
2 , , 2 4 9 5 5 3 4 7 Ce l l s w a s h e d
3 1 0 . 2 1 % p h l ori d z i n 6 0 7 2 2 8 Ce l l s w a s h e d
4 Ra b b i t 4 - 8 6 0 5 2 4 8
5 2 4 - 0 6 % g l u c os e 6 0 5 4 4 6 Not p e rf u s e d
6 2 5 6 - 7 5 8 5 1 5 Gu m s a l i n e
7 La mb 3 - 2 6 % g l u c os e 1 5 0 6 6 3 4 Gu m s a l i n e ;
n ot
p e rf u s e d
In e x p s . 3 a n d 4 t h e c e l l s w e re w a s h e d b y ra p i d l y re s u s p e n d i n g i n s a l i n e a n d re c e n t ri f u g i n g
b e f ore e s t i ma t i n g t h e a my l a s e a c t i v i t y . Con d i t i on s a s d e s c ri b e d .
In e v e ry e x p e ri me n t more a my l a s e w a s f ou n d i n t h e c e l l s t h a n i n t h e s u s -
p e n d i n g f l u i d c on t a i n i n g t h e l y mp h a n d i n t e rc e l l u l a r f l u i d b e l on g i n g t o t h e m.
Th e a c t i v i t y of t h e s u s p e n d i n g f l u i d w a s p rob a b l y d u e i n p a rt t o a my l a s e w a s h e d
ou t of t h e c e l l s , a s b y w a s h i n g t h e c e l l s a t t h e ord i n a ry t e mp e ra t u re t h e a my l a s e
w a s s oon re mov e d f rom t h e m; b u t i n t w o e x p e ri me n t s i n w h i c h t h e c e l l s w e re
ra p i d l y re s u s p e n d e d i n s a l i n e a t 0 0 a n d c e n t ri f u g e d of f a g a i n t h e a mou n t of
a my l a s e l e f t i n t h e c e l l s w a s s t i l l g re a t e r t h a n t h a t i n t h e ori g i n a l s u s p e n d i n g
f l u i d .
It w a s c on c l u d e d t h a t t h e a my l a s e oc c u rs t o a g re a t e r e x t e n t i n s i d e t h e l i v e r
c e l l s , or c l os e l y a t t a c h e d t o t h e m, t h a n i n t h e i n t e rc e l l u l a r f l u i d or l y mp h .
Di s t ri b u t i on of p h os p h ory l a s e
Si mi l a r e x p e ri me n t s c a rri e d ou t t o t e s t t h e d i s t ri b u t i on of t h e p h os p h ory l a s e
i n d i c a t e d t h a t i t i s a l s o ma i n l y p re s e n t i n t h e c e l l s . In t h e s e e x p e ri me n t s s od i u m
f l u ori d e w a s a d d e d a n d t h e p h os p h ory l a s e a c t i v i t y w a s me a s u re d b y t h e i n org a n i c
p h os p h a t e u p t a k e u n d e r t h e c on d i t i on s d e s c ri b e d .
In c u b a - Di s t ri b u t i on of
t i on Ph os p h ory - p h os p h ory l a s e ( %)
Ex p . t i me l y s i s &
n o. An i ma l h r. mg . / g . / h r. Ce l l s Fl u i d Re ma rk s
1 Ra b b i t 1 2 - 9 6 2 3 8
2 , ,
1
6 - 3 7 2 2 8
3 , ,
i t
3 * 9 6 3 3 7 Gu m s a l i n e
Ef f e c t of d ry i n g w i t h a c e t on e on
g l y c og e n ol y t i c
s y s t e m
Ma n y p re v i ou s i n v e s t i g a t ors h a v e u s e d " a c e t on e p ow d e rs
" ma d e b y g ri n d i n g
t h e l i v e r w i t h a c e t on e i n s t u d y i n g t h e p rop e rt i e s of l h v e r "
g l y c og e n a s e " .
Hod g s on [ 1 9 3 6 ] c l a i me d t h a t t h e a c e t on e p ow d e r p re p a re d f rom l i v e r i s f re e
f rom b l ood a my l a s e s i n c e t h e b l ood a my l a s e i s d e s t roy e d i n t h i s p roc e s s . It
a p p e a re d of i n t e re s t t o t e s t w h e t h e r a re a l s e p a ra t i on of t h e e n z y me s c ou l d b e
ob t a i n e d i n t h i s w a y .
A d ry a c e t on e p ow d e r w a s p re p a re d f rom ra b b i t l i v e r a s d e s c ri b e d b y Hod g s on .
Th e p ow d e r ( 1 g . i n 5 ml . ) w a s t h e n i n c u b a t e d w i t h g l y c og e n a n d t h e t ot a l g l y c og e n
LIVER AMYLASE 3 6 1
b re a k d ow n a n d p h os p h ory l y s i s me a s u re d u n d e r t h e c on d i t i on s d e s c ri b e d f or t h e
f re s h l i v e r b re i .
Ti me of Tot a l
i n c u b a t i on g l y c og e n ol y s i s Ph os p h ory l y s i s
h r. mg . / g . / h r. mg . / g . / h r.
1 + 0 - 6 5 0 4 3
Th e g l y c og e n ol y s i s a n d p h os p h ory l y s i s f i g u re s , w h i c h g i v e t h e a c t i v i t i e s
p e r g . of t h e ori g i n a l f re s h l i v e r, i n d i c a t e d t h a t t h e p re p a ra t i on c on t a i n e d b ot h
a my l a s e a n d p h os p h ory l a s e w i t h re l a t i v e l y more p h os p h ory l a s e t h a n i s u s u a l l y
p re s e n t i n f re s h l i v e r; b u t t h e a c t i v i t y of t h e p re p a ra t i on w a s l ow a n d s u g g e s t e d
a c on s i d e ra b l e l os s d u ri n g t h e p re p a ra t i on . Con t ra ry t o Hod g s on , a n a c e t on e
p ow d e r p re p a re d i n t h e s a me w a y f rom b l ood s h ow e d c on s i d e ra b l e a my l a s e
a c t i v i t y .
Amy l a s e i n mu s c l e a n d ot h e r org a n s
Gi l l & Le h ma n n [ 1 9 3 9 ] h a v e s u g g e s t e d t h a t t h e a my l a s e f ou n d i n mu s c l e
ma y p rov i d e a n a l t e rn a t i v e p a t h of g l y c og e n b re a k d ow n t o t h e n orma l p h os -
p h ory l y s i s . Pa rn a s [ 1 9 3 7 ] on t h e ot h e r h a n d w a s u n a b l e t o f i n d a n y a my l a s e
i n mu s c l e , w h i c h s u g g e s t s t h a t , a s i n l i v e r, t h e a mou n t of a my l a s e p re s e n t ma y
b e v e ry v a ri a b l e .
W e w e re a b l e t o c on f i rm t h e p re s e n c e of a my l a s e i n mu s c l e e x t ra c t s p re p a re d
b y t h e me t h od of Me y e rh of [ 1 9 2 6 ] f rom t h e l e g mu s c l e s of ra b b i t s w h i c h h a d
b e e n p e rf u s e d i n v i v o w i t h s a l i n e t h rou g h t h e d e s c e n d i n g a ort a :
In c u b a t i on Tot a l
Ex p . t i me g l y c og e n ol y s i s Ph os p h ory l y s i s
n o. h r. mg . / g . / h r. mg . / g . / h r. Re ma rk s
1 1 + 1 2 - 0 1 - 3 Pe rf u s e d
2 3 6 - 7 0 5 3 Not p e rf u s e d
3 3 5 . 3 0 7 4 Pe rf u s e d
U n d e r t h e c on d i t i on s of t h e s e e x p e ri me n t s , w h i c h w e re t h e s a me a s t h os e
d e s c ri b e d f or me a s u ri n g g l y c og e n ol y s i s a n d p h os p h ory l y s i s s i mu l t a n e ou s l y i n
l i v e r, t h e p h os p h ory l y s i s w a s mu c h t oo l ow t o a c c ou n t f or t h e t ot a l g l y c og e n ol y s i s .
It s h ou l d p e rh a p s b e e mp h a s i z e d t h a t t h e l ow p h os p h ory l y s i s ra t e s s h ow n i n
t h e s e e x p e ri me n t s , a s i n t h os e w i t h l i v e r, d o n ot me a n t h a t a c t i v e p h os p h ory l a s e s
w e re n ot p re s e n t i n t h e t i s s u e s . Th e p h os p h ory l y s i s ra t e s a p p e a r l ow b e c a u s e
t h e c on d i t i on s w e re c h os e n a s b e i n g op t i ma l f or t h e a my l a s e a n d w e re u n s u i t a b l e
f or op t i ma l p h os p h ory l a s e a c t i v i t y . Th e p h os p h ory l a s e s a re v e ry l a b i l e a n d s oon
d e s t roy e d u n d e r t h e s e c on d i t i on s , b u t b y u s i n g s h ort i n c u b a t i on p e ri od s a n d
h i g h e r p h os p h a t e c on c e n t ra t i on s h i g h ra t e s of p h os p h ory l y s i s of ov e r 1 5 mg .
p e r g . p e r h r. w e re e a s i l y ob t a i n e d w i t h b ot h l i v e r a n d mu s c l e [ Le e & Ri c h t e r,
1 9 4 0 ] .
In a n u mb e r of ot h e r e x p e ri me n t s t h e ra t e s of g l y c og e n ol y s i s w e re me a s u re d
i n b re i p re p a re d f rom ot h e r a n i ma l org a n s . Th e c on d i t i on s w e re a s d e s c ri b e d
f or me a s u ri n g a my l a s e a c t i v i t y ; u n d e r t h e s e c on d i t i on s p h os p h ory l y s i s w a s
a l w a y s v e ry s ma l l a n d t h e g l y c og e n b re a k d ow n w a s ma i n l y d u e t o a my l ol y s i s :
In c u b a d In c u b a -
t i on t i on
t i me Gl y c og e n ol y s i s t i me Gl y c og e n ol y s i s
O rg a n h r. mg . / g . / h r. O rg a n h r. mg . / g . / h r.
O x b l ood i 3 1 - 8 La mb b ra i n 2 0
Ra b b i t b l ood 2 j 3 4 - 5 La mb p a n c re a s i 5 7 8 , 0 0 0
La mb b l ood 2 j 0 La mb l i v e r 2 j 4 - 3
3 6 2 M. LEE AND D. RICHTER
It a p p e a re d t h a t e v i d e n c e of t h e a b i l i t y of t h e a my l a s e t o d i f f u s e t h rou g h
me mb ra n e s mi g h t b e ob t a i n e d b y t e s t i n g i f t h e b l ood a my l a s e i s a b l e t o p a s s
t h rou g h t h e h a e mot oe n c e p h a l i c b a rri e r i n t o t h e c e re b ros p i n a l f l u i d . Ma rc h i on i n i
[ 1 9 3 5 ] h a s d e s c ri b e d t h e p re s e n c e of a my l a s e i n t h e C. S. F. a n d i n ord e r t o c on f i rm
t h i s t h re e s p e c i me n s of C. S. F. w h i c h h a d b e e n s e n t t o t h i s l a b ora t ory f or
W a s s e rma n n t e s t s a n d f ou n d t o b e n orma l w e re i n c u b a t e d ( a ) w i t h s t a rc h a n d
( b ) w i t h g l y c og e n a t 3 7 . Ea c h t u b e c on t a i n e d 1 ml . M/ 1 5 p h os p h a t e b u f f e r
p H 7 * 4 , 1 ml . n orma l s a l i n e , 0 - 2 ml . 1 %s t a rc h or g l y c og e n , 1 ml . C. S. F. or w a t e r,
1 ml . 5 0
%
g l u c os e or w a t e r a n d 0 - 0 2 ml . t ol u e n e . W h e n t e s t e d w i t h i od i n e a s l ow
d i s a p p e a ra n c e of s t a rc h or g l y c og e n , w h i c h w a s n ot i n h i b i t e d b y g l u c os e , w a s
ob s e rv e d i n t h e t u b e s c on t a i n i n g C. S. F.
DISCU SSIO N
O ri g i n of l i v e r a my l a s e . Ev i d e n c e h a s b e e n ob t a i n e d t h a t a n a my l a s e oc c u rs
n ot on l y i n t h e b l ood c on t a i n e d i n t h e l i v e r b u t a l s o i n t h e l i v e r t i s s u e . Pre v i ou s
i n v e s t i g a t ors h a v e g e n e ra l l y c on c l u d e d t h a t t h e a my l a s e a c t i v i t y i s mu c h g re a t e r
i n t h e b l ood t h a n i n t h e l i v e r [ Ma c l e od , 1 9 2 6 ; Da v e n p ort , 1 9 2 6 ] b u t t h i s ma y b e
d u e t o t h e l os s of l i v e r a my l a s e d u ri n g t h e p e rf u s i on or t h rou g h i n c omp l e t e
e x t ra c t i on . In f i v e ou t of s i x e x p e ri me n t s i n w h i c h t h e a my l a s e a c t i v i t i e s i n
t h e l i v e r a n d b l ood f rom t h e s a me a n i ma l w e re me a s u re d a t t h e s a me t i me t h e
a my l a s e a c t i v i t i e s , e x p re s s e d a s mg . g l y c og e n b rok e n d ow n p e r g . t i s s u e p e r h r. ,
s h ow e d a c l os e d a g re e me n t ( Ta b l e 4 ) .
Ma c l e od & Pe a rc e [ 1 9 0 9 ] , w h o c omp a re d t h e b l ood a n d l i v e r a my l a s e a c t i v i t i e s
i n a n u mb e r of a n i ma l s , f ou n d t h a t t h e b l ood w a s g e n e ra l l y , b u t n ot
a l w a y s ,
t h e more a c t i v e a n d t h e y f a i l e d t o f i n d a n y re l a t i on b e t w e e n t h e m e x c e p t f or
n ot i n g t h a t i n t h re e e x p e ri me n t s i n t h e p i g , ra b b i t a n d s h e e p t h e b l ood a n d l i v e r
a my l a s e a c t i v i t i e s a p p e a re d t o ru n p a ra l l e l . Th e f a i l u re of Ma c l e od & Pe a rc e
t o ob s e rv e a more d e f i n i t e re l a t i on s h i p b e t w e e n t h e b l ood a n d l i v e r a my l a s e
a c t i v i t i e s ma y b e d u e t o t h e i r g e n e ra l l y omi t t i n g t o ma k e t h e c omp a ri s on a t t h e
s a me p H, f or i n f ou r e x p e ri me n t s c a rri e d ou t f or a n ot h e r p u rp os e i n w h i c h
b u f f e r w a s a d d e d [ Ma c l e od & Pe a rc e , 1 9 1 1 ] t h e i r f i g u re s , re c a l c u l a t e d i n t e rms of
mg . g l y c og e n b rok e n d ow n p e r g . p e r h r. , a g re e w i t h t h e p re s e n t ob s e rv a t i on s
i n i n d i c a t i n g a s i mi l a ri t y i n t h e b l ood a n d l i v e r a c t i v i t i e s :
Gl y c og e n ol y s i s Gl y c og e n ol y s i s
Ex p . i n b l ood i n l i v e r
n o. mg . / g . / h r. mg - / g . / h r.
1 4 8 - 6 4 1 * 8
2 4 5 . 0 5 3 . 0
3 3 4 . 7 1 6 4 1
4 2 7 - 2 2 7 - 6
It i s g e n e ra l l y a c c e p t e d t h a t t h e b l ood a my l a s e i s d e ri v e d ma i n l y f rom t h e
p a n c re a s , s i n c e t h e b l ood a my l a s e a c t i v i t y i s re d u c e d b y p a n c re a t e c t omy a n d i s
c on s i d e ra b l y a f f e c t e d i n d i s e a s e of t h e p a n c re a s . If , a s h a s b e e n w i d e l y b e l i e v e d ,
t h e l i v e r a my l a s e i s s p e c i a l l y s y n t h e s i z e d i n t h e c e l l s a n d h a s n o c on n e x i on w i t h
t h e a my l a s e i n t h e b l ood , t h e re w ou l d b e n o re a s on t o e x p e c t a n y re l a t i on b e t w e e n
t h e m a n d t h e ra t i o of t h e i r a c t i v i t i e s mi g h t l i e a l mos t a n y w h e re w i t h i n a w i d e
ra n g e . Th e ob s e rv a t i on t h a t i n s p i t e of t h e g re a t i n d i v i d u a l v a ri a t i on i n t h e i r
a b s ol u t e a mou n t s t h e a my l a s e c on c e n t ra t i on s i n t h e b l ood a n d l i v e r s o f re q u e n t l y
a g re e c a n h a rd l y b e d u e t o c h a n c e . It i s c on c l u d e d t h a t t h e t w o a re p rob a b l y
re l a t e d a n d t h a t t h e l i v e r a my l a s e i s d e ri v e d f rom, a n d n orma l l y i n e q u i l i b ri u m
w i t h , t h a t i n t h e b l ood .
LIVER AMYLASE
3
If t h e a my l a s e c on c e n t ra t i on i n t h e l i v e r i s ma i n t a i n e d e q u a l t o t h a t i n t h e
b l ood s i mp l y b y d i f f u s i on f rom t h e b l ood , t h e a my l a s e mu s t b e a b l e t o d i f f u s e
i n t o t h e l i v e r c e l l s w h i c h oc c u p y t h e g re a t e r p a rt of t h e l i v e r v ol u me . In d e -
p e n d e n t e v i d e n c e t h a t t h e a my l a s e oc c u rs i n t h e c e l l s w a s ob t a i n e d b y e s t i ma t i n g
t h e d i s t ri b u t i on of a my l a s e b e t w e e n t h e c e l l s a n d i n t e rc e l l u l a r f l u i d . It ma y b e
q u e s t i on e d w h e t h e r i t i s p os s i b l e f or a n e n z y me t o p a s s t h rou g h t h e c e l l me m-
b ra n e s i n t o t h e c e l l s , b u t t h e a my l a s e i s k n ow n t o d i f f u s e f rom t h e p a n c re a s i n t o
t h e b l ood a n d t h rou g h t h e me mb ra n e s of t h e k i d n e y i n t o t h e u ri n e : i t i s a l s o
f ou n d i n t h e l y mp h a n d c a n p a s s t h rou g h t h e h a e ma t oe n c e p h a l i c b a rri e r i n t o
t h e c e re b ros p i n a l f l u i d . Th i s g i v e s e v i d e n c e t h a t t h e a my l a s e i s p a rt i c u l a rl y
e a s i l y d i f f u s i b l e . Th e a my l a s e i s k n ow n t o d i f f u s e ra p i d l y ou t of t h e t i s s u e w h e n
l i v e r s l i c e s a re s u s p e n d e d i n n orma l s a l i n e [ W i l l s t a i t t e r & Roh d e w a l d , 1 9 3 6 ]
a n d t h e re i s e v i d e n c e t h a t i t ma y d i f f u s e ou t of t h e l i v e r on p e rf u s i on . It d oe s
n ot t h e re f ore a p p e a r i mp os s i b l e t h a t t h e a my l a s e ma y d i f f u s e a t a s i g n i f i c a n t
ra t e i n t h e re v e rs e d i re c t i on s o t h a t i n t h e c ou rs e of t i me t h e c on c e n t ra t i on i n t h e
c e l l s i n v i v o ma y a p p rox i ma t e t o t h a t i n t h e b l ood .
Fu n c t i on of l i v e r a my l a s e . Th e a c t i v i t y of t h e a my l a s e i n t h e ra b b i t l i v e r w a s
f re q u e n t l y v e ry l ow a n d g e n e ra l l y t oo l ow t o a c c ou n t f or t h e ra t e of g l y c og e n ol y s i s
oc c u rri n g i n t h e more i n t e n s e f orms of h y p e rg l y c a e mi a i n v i v o [ Le e & Ri c h t e r,
1 9 4 0 ] ; b u t i n ma n y a n i ma l s t h e a c t i v i t y of t h e l i v e r a my l a s e w a s s u f f i c i e n t t o
a c c ou n t f or a b re a k d ow n of 2 0 - 5 0 mg . g l y c og e n p e r g . p e r h r.
It i s p rob a b l e h ow e v e r t h a t s u c h h i g h a c t i v i t i e s d o n ot oc c u r i n v i v o s i n c e
i t h a s b e e n s h ow n p re v i ou s l y t h a t t h e l i v e r a my l a s e i s a c t i v a t e d b y c h l ori d e
i on s a n d re q u i re s a c on s i d e ra b l e c h l ori d e c on c e n t ra t i on f or op t i ma l a c t i v i t y .
Th e a c t i v i t y ra p i d l y f a l l s of f a t c h l ori d e c on c e n t ra t i on s b e l ow 3 5 mg . Cl / 1 0 0 ml .
[ Ea d i e , 1 9 2 7 ] . Ba n g [ 1 9 1 3 ] ob t a i n e d e x p e ri me n t a l e v i d e n c e t h a t t h e c h l ori d e
c on c e n t ra t i on i n t h e c e l l s i n t h e f rog ' s l i v e r i s w e l l b e l ow t h e op t i ma l f or a my l a s e
a c t i v i t y s i n c e , a f t e r p e rf u s i n g t h e l i v e r w i t h i s ot on i c s od i u m s u l p h a t e or s u g a r
s ol u t i on , t h e a my l a s e w a s s t ron g l y a c t i v a t e d b y a d d i n g s od i u mc h l ori d e . Ev i d e n c e
h a s re c e n t l y b e e n a c c u mu l a t i n g t h a t t h e c on c e n t ra t i on of f re e c h l ori d e i on s i n s i d e
t h e c e l l s i n ma mma l i a n mu s c l e , l i v e r a n d ot h e r org a n s i s e x t re me l y l ow a n d i t i s
f re q u e n t l y a c c e p t e d t h a t p ra c t i c a l l y t h e w h ol e of t h e c h l ori d e i n t h e t i s s u e s i s
e x t ra c e l l u l a r [ Fe n n , 1 9 3 6 ; Bou rd i l l on , 1 9 3 7 ; Amb e rs on e t a l . 1 9 3 8 ] . Th e l i v e r
g l y c og e n i s k n ow n t o b e c on f i n e d t o t h e c e l l s , a p a rt f rom t h e re l a t i v e l y s ma l l
a mou n t s p re s e n t i n t h e b l ood a n d i n t h e l e u c oc y t e s , b u t t h e re i s re a s on t o
b e l i e v e t h a t t h e a my l a s e p re s e n t i n t h e c e l l s ma y b e i n a c t i v e , or mu c h l e s s a c t i v e
t h a n t h e a my l a s e a c t i v i t i e s w h i c h h a v e b e e n d e s c ri b e d w ou l d i n d i c a t e , ow i n g t o
t h e a b s e n c e of a s u f f i c i e n t c on c e n t ra t i on of f re e c h l ori d e i on s i n t h e c e l l s .
It h a s b e e n s h ow n e l s e w h e re t h a t t h e a c t i v i t y of t h e l i v e r p h os p h ory l a s e ,
w h e n e x a mi n e d u n d e r s u i t a b l e c on d i t i on s , i s v e ry h i g h a n d s u f f i c i e n t t o a c c ou n t
f or t h e mos t i n t e n s e f orms of h y p e rg l y c a e mi a k n ow - n i n v i v o [ O s t e rn e t a l . 1 9 3 9 ;
Le e & Ri c h t e r, 1 9 4 0 ] ; t h e re i s t h e re f ore n o n e e d t o a s s u me t h a t t h e a my l a s e
i s c on c e rn e d i n a n y n orma l h y p e rg l y c a e mi c me c h a n i s m. Th e b l ood a my l a s e
mi g h t p os s i b l y h a v e a f u n c t i on i n t h e d e t ox i c a t i on of p ol y s a c c h a ri d e s of b a c t e ri a l
ori g i n , b u t w e h a v e n o e v i d e n c e of t h i s a n d i t c a n h a rd l y b e a f u n c t i on t h a t i s
g e n e ra l t o a l l t h e ma mma l i a s i n c e Ma c l e od & Pe a rc e [ 1 9 0 9 ] f ou n d , a n d w e h a v e
c on f i rme d , t h a t i n t h e s h e e p t h e a my l a s e c on c e n t ra t i on s i n t h e b l ood a n d t i s s u e s
a re a l w a y s v e ry s ma l l a n d f re q u e n t l y n on e c a n b e f ou n d a t a l l i n t h e b l ood or
l i v e r i n t h e l a mb .
If t h e d i s t ri b u t i on of a my l a s e i s c on s i d e re d i n t h e a n i ma l a s a w h ol e i t i s
e v i d e n t t h a t b y f a r t h e h i g h e s t a my l a s e c on c e n t ra t i on s a re i n t h e p a n c re a s a n d
- s a l i v a ry g l a n d s . In on e e x p e ri me n t i n t h e s h e e p t h e a my l a s e a c t i v i t y i n t h e
3 6 3
M. LEE AND D. RICHTER
p a n c re a s w a s f ou n d t o b e 5 7 8 , 0 0 0 c omp a re d w i t h 3 - 4 i n t h e l i v e r. It i s c l e a r t h a t
e v e n t h e h i g h e s t a c t i v i t i e s f ou n d i n t h e b l ood , l i v e r a n d ot h e r org a n s w e re on l y
of t h e ord e r of 1 / 1 0 , 0 0 0 of t h e a my l a s e a c t i v i t y of t h e p a n c re a s a n d t h e re f ore
s ma l l i n c omp a ri s on .
Th e a my l a s e s of t h e p a n c re a s a n d s a l i v a ry g l a n d s h a v e a c l e a rl y d e f i n e d
f u n c t i on i n t h e d i g e s t i on of s t a rc h y f ood s i n t h e s t oma c h a n d i n t e s t i n e , b u t i t i s
d i f f i c u l t t o a s c ri b e a n y i mp ort a n t f u n c t i on i n c a rb oh y d ra t e me t a b ol i s m t o t h e
re l a t i v e l y s ma l l a n d v e ry v a ri a b l e a mou n t s of a my l a s e t h a t a re f ou n d i n t h e
b l ood a n d ot h e r org a n s . Th e re w ou l d a p p e a r t o b e n o n e e d t o re g a rd t h e s ma l l
a mou n t s of a my l a s e f ou n d i n t h e l i v e r a n d ot h e r org a n s a s c on s i s t i n g of a n y t h i n g
more t h a n t ra c e s of t h e v e ry a c t i v e p a n c re a t i c a n d s a l i v a ry a my l a s e s w h i c h h a v e
d i f f u s e d i n t o t h e b l ood a n d t h rou g h ou t t h e s y s t e m.
SU MMARY
1 . Th e a my l a s e a c t i v i t y i n t h e l i v e r i n t h e ra b b i t i s v e ry v a ri a b l e . Th e a c t i v i t y
ma y b e h i g h e n ou g h t o c a u s e a b re a k d ow n of 5 0 mg . g l y c og e n p e r g . l i v e r p e r h r.
2 . Me t h od s a re d e s c ri b e d f or d i s t i n g u i s h i n g b e t w e e n t h e g l y c og e n b re a k d ow n
d u e t o t h e a my l a s e a n d t h a t d u e t o p h os p h ory l y s i s .
3 . In f i v e ou t of s i x e x p e ri me n t s t h e a my l a s e c on c e n t ra t i on i n t h e l i v e r w a s
s i mi l a r t o t h a t i n t h e b l ood .
4 . Th e l i v e r a my l a s e i s n ot c on f i n e d t o t h e b l ood or l y mp h s p a c e s , b u t i s
p re s e n t i n s i d e or c l os e l y b ou n d t o t h e c e l l s .
5 . Th e g l y c og e n p h os p h ory l a s e a l s o oc c u rs i n s i d e or c l os e l y b ou n d t o t h e c e l l s .
6 . Th e p h os p h ory l a s e i s p re s e n t i n re l a t i v e l y l a rg e r a mou n t t h a n t h e a my l a s e
i n t h e d ry p ow d e r ob t a i n e d b y t re a t i n g l i v e r w i t h a c e t on e .
7 . It i s c on c l u d e d t h a t t h e a my l a s e f ou n d i n t h e l i v e r i s d e ri v e d f rom t h e
b l ood a n d i s n ot c on c e rn e d i n a n y n orma l h y p e rg l y c a e mi c me c h a n i s m.
Th e a u t h ors w i s h t o t h a n k Dr H. Le h ma n n f or u s e f u l a d v i c e a n d t h e Roc k e -
f e l l e r Fou n d a t i on f or s u p p ort i n g t h i s i n v e s t i g a t i on .
REFERENCES
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1 , 2 1 3 .
3 6 4