1981, 41(1):155. Appl. Environ. Microbiol.

B. Cajipe and E. C. Laserna

E. C. Epifanio, R. L. Veroy, F. Uyenco, G. J.

Bacteriological Media
(Schmitz) in striatum
Eucheuma Carrageenan from
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A P P L I E D A ND E NV I R O NM E NT A L M I C R O B I O L O G Y , J a n . 1 9 8 1 , p . 1 5 5 - 1 5 8
0 0 9 9 - 2 2 4 0 / 8 1 / 0 1 0 1 5 5 - 0 4 $ 0 2 . 0 0 / 0
V o l . 4 1 , No . 1
C a r r a g e e n a n f r o m E uche um a s t r i a t um ( S chm i t z ) i n
B a ct e r i o l o g i ca l M e di a
E . C . E P I FA NI O , R . L . V E R O Y , F. UY E NC O , G . J . B . C A J I P E , A ND E . C . L A S E R NA *
M a r i n e S ci e n ce s C e n t e r , Un i v e r s i t y o f t he P hi l i p p i n e s , D i l i m a n , Que z o n C i t y D - 3 0 0 4 , P hi l i p p i n e s
T he us e o f ca r r a g e e n a n f r o m t he r e d a l g a E uche um a s t r i a t um a s a p o s s i b l e
s ub s t i t ut e f o r b a ct e r i o l o g i ca l a g a r wa s i n v e s t i g a t e d. T he ca r r a g e e n a n m e di um wa s
co m p a r e d wi t h s e v e r a l co m m e r ci a l l y a v a i l a b l e m e di a i n t e r m s o f b o t h t he i r
p hy s i ca l
p r o p e r t i e s
a n d t he co l o n y cha r a ct e r i s t i cs o f 1 6 m i cr o o r g a n i s m s g r o wn o n
t he m e di a .
T hi s s t udy wa s p r o m p t e d b y t he s t e a di l y i n -
cr e a s i n g co s t o f a g a r cul t ur e m e di a . T hi s hi g h
co s t ha s b e co m e t he b a n e o f m i cr o b i o l o g i s t s ,
p a r t i cul a r l y i n de v e l o p i n g co un t r i e s whe r e cul -
t ur e m e di a a r e i m p o r t e d a n d b udg e t s a r e un a -
v o i da b l y l o w. T he co m p ul s i o n t o l o o k f o r a n a g a r
s ub s t i t ut e i s q ui t e i r r e p r e s s i b l e , e s p e ci a l l y i n t he
P hi l i p p i n e s , whe r e t he r e d s e a we e d E uche um a ,
s o ur ce o f t he i n dus t r i a l g um ca r r a g e e n a n , i s
b e i n g f a r m e d o n a co m m e r ci a l s ca l e . T hi s p a p e r
r e p o r t s o ur a t t e m p t t o us e ca r r a g e e n a n e x t r a ct e d
f r o m E uche um a s t r i a t um ( S chm i t z ) a s a m e -
di um f o r b a ct e r i a l cul t ur e s .
T hi s r e p o r t i s n o t t he f i r s t o f i t s k i n d. I n 1 9 4 3 ,
W a l k e r a n d D a y ( 4 ) r e p o r t e d o n t he i r wo r k wi t h
ca r r a g e e n a n f r o m I r i s h m o s s , ci t i n g t he o ccur -
r e n ce o f s y n e r e s i s a s a m a j o r dr a wb a ck t o i t s us e
a s a b a ct e r i o l o g i ca l m e di um . M o r e t ha n t wo
de ca de s l a t e r , W a t s o n a n d A p i r i o n ( 5 ) , us i n g
co m m e r ci a l l y a v a i l a b l e k a p p a - ca r r a g e e n a n a l s o
e x t r a ct e d f r o m I r i s h m o s s , f o un d t he p o t a s s i um
s a l t t o b e a n a de q ua t e a g a r s ub s t i t ut e f o r co m -
m o n b a ct e r i o l o g i ca l us a g e s ; A l t ho ug h t he y co n -
f i n e d t he i r s t udy t o m ut a n t s t r a i n s o f E s che -
r i chi a co l i , t he y p o i n t e d t o t he l i k e l i ho o d t ha t
ca r r a g e e n a n ca n a de q ua t e l y s e r v e a s a s up p o r t -
i n g m e di um f o r o t he r b a ct e r i a a s we l l . A y e a r
l a t e r , L i n e s ( 2 ) r e p o r t e d t he us e o f t he s a m e
ca r r a g e e n a n s a l t i n t he cul t ur e o f 1 5 o t he r b a c-
t e r i a , ci t i n g t he di f f i cul t y e n co un t e r e d i n p r e p a r -
i n g b l o o d p l a t e s wi t h t hi s m e di um a s a m a j o r
l i m i t a t i o n . T he r e s ul t s we o b t a i n e d wi t h 1 6 o r -
g a n i s m s f ur t he r co n f i r m t he s ui t a b i l i t y o f ca r -
r a g e e n a n a s a n a g a r s ub s t i t ut e i n m o s t r o ut i n e
b a ct e r i o l o g i ca l m e di a .
M A T E R I A L S A ND M E T HO D S
M i cr o o r g a n i s m s .
T he
f o l l o wi n g m i cr o o r g a n i s m s
we r e o b t a i n e d f r o m t he C ul t ur e C o l l e ct i o n o f t he
Un i v e r s i t y o f t he P hi l i p p i n e s Na t ur a l S ci e n ce R e -
s e a r ch C e n t e r , f r o m t he Un i v e r s i t y o f t he P hi l i p p i n e s
I n s t i t ut e o f P ub l i c He a l t h, a n d f r o m C l a r a Y . L . S y -
l i a n co . o f t he D e p a r t m e n t o f C he m i s t r y : B a ci l l us s ub -
t i l i s , E s che r i chi a co l i , K l e b s i e l l a p n e um o n i a e , M y co -
b a ct e r i um a v i um , P r o t e us s p . , P s e udo m o n a s a e r ug i -
n o s a , R ho do s p i r i l l um r ub r um , S a l m o n e l l a cho l e r a -
s ui s , S a l m o n e l l a p a r a t y p hi A , S . t y p hi , S a l m o n e l l a
t y p hi m ur i um , S . t y p hi m ur i um ( m ut a n t s t r a i n ) , S e r -
r a t i a m a r ce s ce n s , S t a p hy l o co ccus a l b us , S t a p hy l o -
co ccus a ur e us , a n d S t a p hy l o co ccus ci t r e us . S e l e ct i o n s
we r e m a de o n t he b a s i s o f p i g m e n t p r o duct i o n a n d
r a t e o f g r o wt h. T hi s i n f o r m a t i o n wa s de r i v e d f r o m
B e r g e y ' s M a n ua l o f D e t e r m i n a t i v e B a ct e r i o l o g y ( 1 ) .
S o l i di f y i n g a g e n t s . T wo ca r r a g e e n a n p r e p a r a -
t i o n s , I a n d I I , b o t h f r o m E . s t r i a t um , we r e o b t a i n e d
f r o m t he M a r i n e S ci e n ce s C e n t e r ' s S e a we e d P r o ce s s -
i n g P r o j e ct . C a r r a g e e n a n H i s a ct ua l l y a p H- a dj us t e d
v e r s i o n o f I . A dj us t m e n t o f p H wa s a cco m p l i s he d
dur i n g t he e x t r a ct i o n p r o ce s s i t s e l f . M e di a p r e p a r e d
f r o m a g a r ( D i f co L a b o r a t o r i e s , D e t r o i t , M i ch. ) , de hy -
dr a t e d n ut r i e n t a g a r ( D i f co ) , a n d n ut r i e n t a g a r ( S i g m a
C he m i ca l C o . , S t . L o ui s , M o . ) we r e a l s o us e d.
P r e p a r a t i o n o f m e di a . B o t h a g a r a n d ca r r a g e e n a n
m e di a we r e p r e p a r e d s i m ul t a n e o us l y a n d, e x ce p t f o r
t ha t p r e p a r e d f r o m de hy dr a t e d D i f co n ut r i e n t a g a r ,
we r e co m p o s e d o f t he f o l l o wi n g : a g a r o r ca r r a g e e n a n ,
1 5 g ; p e p t o n e ( D i f co ) , 5 g ; s o di um chl o r i de , 8 g ; b e e f
b r o t h, 3 g ; di s t i l l e d wa t e r , 1 , 0 0 0 m l . T he a b o v e co n -
s t i t ue n t s we r e di s s o l v e d i n a b o i l i n g - wa t e r b a t h, a n d
t he r e s ul t i n g s o l ut i o n s we r e s t e r i l i z e d a t 1 2 1 C f o r 1 5
m n . S o l i d p l a t e s , s l a n t s , a n d b ut t s we r e p r e p a r e d.
Nut r i e n t m e di a us e d f o r p l a t e co un t s we r e m a i n t a i n e d
i n t ub e s a t 5 0 C un t i l n e e de d. D i f co n ut r i e n t a g a r
m e di um wa s p r e p a r e d a cco r di n g t o i n s t r uct i o n s o n t he
p r o duct l a b e l . B l o o d a g a r p l a t e s we r e p r e p a r e d b y
a ddi n g 1 0 m l o f s t e r i l e s he e p b l o o d t o 1 0 0 m l o f t he
m e di um a t 4 5 t o 4 8 C .
P r e p a r a t i o n o f di l ut i o n s f o r b a ct e r i a l p l a t e
co un t s . A l o o p f ul o f t he m i cr o o r g a n i s m s t o b e t e s t e d
wa s s us p e n de d a s e p t i ca l l y o n t he m o i s t wa l l o f a t e s t
t ub e co n t a i n i n g 1 0 m l o f s t e r i l e di s t i l l e d wa t e r j us t
a b o v e t he l i q ui d l e v e l a n d wo r k e d do wn b y t i l t i n g t he
t ub e . O n e m i l l i l i t e r wa s de l i v e r e d wi t h a s t e r i l e
s t r a i g ht - s i de d p i p e t t e di p p e d 0 . 5 i n . ( 1 . 2 7 cm ) i n t o t he
f i r s t di l ut i o n b l a n k co n t a i n i n g 9 m l o f s t e r i l e di s t i l l e d
wa t e r . M i x i n g wa s e f f e ct e d b y s uck i n g t he l i q ui d up
a n d do wn 1 0 t i m e s wi t h a f r e s h s t e r i l e p i p e t t e di p p e d
0 . 5 i n . i n t he l i q ui d, a f t e r whi ch 1 m l wa s t r a n s f e r r e d
t o t he n e x t di l ut i o n b l a n k . T hi s p r o ce s s wa s co n t i n ue d
a s e p t i ca l l y t o t he 1 0 ` 1 di l ut i o n . O n l y t ho s e o f e v e n
di l ut i o n ( 1 0 - 2 , 1 0 - 4 , 1 0 - 6 , 1 0 - 8 , a n d 1 0 - 1 0 ) we r e us e d f o r
p l a t e co un t i n g . D up l i ca t e p l a t e s co n t a i n i n g 1 m l o f t he
1 5 5

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1 5 6 E P I FA NI O E T A L .
i n o cul um o f t he p r o p e r di l ut i o n we r e p r e p a r e d b y t he
p o ur - p l a t e m e t ho d. T he p l a t e s we r e i n cub a t e d un de r
co n di t i o n s r e q ui r e d b y t he o r g a n i s m s . C o l o n y co un t s
we r e m a de wi t h a n A m e r i ca n O p t i ca l da r k - f i e l d Que -
b e c co l o n y co un t e r .
I n o cul a t i o n o f m e di a . D up l i ca t e p e t r i di s he s co n -
t a i n i n g a g a r o r ca r r a g e e n a n m e di a we r e i n o cul a t e d b y
t he s t r e a k p l a t e m e t ho d. D up l i ca t e s l a n t cul t ur e s o f
b a ct e r i a we r e p r e p a r e d a s e p t i ca l l y b y s t r e a k i n g t he
i n o cul um o n t he s l a n t f r o m b o t t o m t o t o p wi t h a wi r e
l o o p . D up l i ca t e s t a b cul t ur e s we r e p r e p a r e d wi t h a
s t r a i g ht n e e dl e i n t ub e s o f un s l a n t e d n ut r i e n t a g a r o r
ca r r a g e e n a n . T he s t a b l i n e wa s ce n t e r e d wi t ho ut l a t -
e r a l m o v e m e n t . T he i n o cul a t e d m e di a we r e i n cub a t e d
a s r e q ui r e d b y t he o r g a n i s m s . T he cul t ur e r e s p o n s e
a n d r a t e o f g r o wt h o f t he b a ct e r i a we r e o b s e r v e d. T he
G r a m - s t a i n i n g t e chn i q ue wa s us e d i n t he m i cr o s co p i c
e x a m i n a t i o n o f b a ct e r i a l g r o wt h.
R E S UL T S
P hy s i ca l p r o p e r t i e s . T he p hy s i ca l p r o p e r -
t i e s o f t he di f f e r e n t m e di a us e d a r e co m p a r a b l e
e x ce p t p e r ha p s f o r t he hi g he r p H a n d t he s l i g ht
t ur b i di t y o f ca r r a g e e n a n ( T a b l e 1 ) .
T he ca r r a g e e n a n g e l s we r e s uf f i ci e n t l y f i r m t o
p e r m i t e f f e ct i v e a n d co n v e n i e n t s t r e a k i n g o n
p l a t e s a n d s l a n t s , r e q ui r i n g a b r e a k f o r ce o f 5 2 0
t o 8 6 8 g / cm 2 . T he a g a r g e l s r e q ui r e d a b r e a k
f o r ce o f 5 3 6 t o 8 0 0 g / cm 2 . M e a s ur e m e n t s we r e
m a de a t r o o m t e m p e r a t ur e wi t h a M a r i n e C o l -
l o i ds G T - 1 g e l t e s t e r e q ui p p e d wi t h a 1 . 0 9 - cm
p l un g e r whi ch ha s a de s ce n t a n d r e t ur n r a t e o f
1 6 t o 1 8 cm / m i n .
A b s o r p t i o n o f wa t e r f r o m t he e x t e m a l e n v i -
r o n m e n t a n d f o r m a t i o n o f wa t e r o f co n de n s a t i o n
we r e o cca s i o n a l l y o b s e r v e d i n s o m e o f t he s l a n t s
a n d p l a t e s p r e p a r e d f r o m a l l o f t he m e di a us e d.
T o a v o i d t hi s , t he p r e p a r e d m e di a we r e k e p t i n
a n o v e n a t 5 0 0 C b e f o r e t he y we r e p o ur e d o n t o
p l a t e s . T he s l a n t s we r e m a i n t a i n e d f o r 1 da y
b e f o r e i n o cul a t i o n i n a s l a n t e d up s i de - do wn p o -
s i t i o n s o t ha t m o i s t ur e co ul d b e a b s o r b e d b y t he
co t t o n p l ug . No s y n e r e s i s wa s o b s e r v e d i n a n y o f
t he m e di a whe n t he s e p r e ca ut i o n s we r e t a k e n .
A P P L . E NV I R O N. M I C R O B I O L .
S up p o r t o f g r o wt h. R a t e o f g r o wt h, co l o n y
m o r p ho l o g y , v i a b i l i t y , a n d p i g m e n t p r o duct i o n
o f t he b a ct e r i a g r o wn o n b o t h a g a r a n d ca r r a -
g e e n a n m e di a we r e e v a l ua t e d a f t e r i n cub a t i o n
p e r i o ds o f 2 4 h. O f t he p hy s i ca l p r o p e r t i e s l i s t e d
i n T a b l e 1 , t he de g r e e o f a l k a l i n i t y a p p e a r s t o
ha v e a n e f f e ct o n t he g r o wt h o f b a ct e r i a l co l o -
n i e s . W he r e a s t he m o r e a l k a l i n e ca r r a g e e n a n ( I )
di d n o t s i g n i f i ca n t l y a f f e ct i n cub a t i o n r e q ui r e -
m e n t s , i t di d n o t s up p o r t b a ct e r i a l g r o wt h a s
we l l a s t he a g a r m e di a . T hus , whe r e a s g r o wt hs
we r e l ux ur i a n t o n a g a r p l a t e s , t he y we r e o n l y
m o de r a t e o n ca r r a g e e n a n I p l a t e s , a n d whe r e a s
co l o n i e s r e a che d a m a x i m um di a m e t e r o f 6 m m
o n t he f o r m e r , t he y g r e w t o a m a x i m um o f o n l y
2 m m o n t he l a t t e r . A t t e m p t s t o l o we r t he p H o f
t he m e di a p r e p a r e d f r o m I b y t he a ddi t i o n o f
p ho s p ha t e b uf f e r r e s ul t e d i n t he f o r m a t i o n o f
p r e ci p i t a t e s . Fo r t ho s e r e a s o n s , s t udi e s o n m e di a
p r e p a r e d f r o m ca r r a g e e n a n I we r e l i m i t e d t o 1 1
b a ct e r i a .
A s o l ut i o n t o t he p r o b l e m wa s f o un d i n ca r -
r a g e e n a n I I , a we a k l y a l k a l i n e f o r m o f I . G r o wt hs
o f b o t h p a t ho g e n i c a n d n o n p a t ho g e n i c b a ct e r i a
o n p l a t e s , s l a n t s , a n d b ut t s p r e p a r e d f r o m t hi s
ca r r a g e e n a n we r e co n s i s t e n t l y co m p a r a b l e t o
cul t ur e s i n a g a r m e di a .
M i cr o s co p i c e x a m i n a t i o n o f t he b a ct e r i a r e -
v e a l e d n o s i g n i f i ca n t m o r p ho l o g i ca l di f f e r e n ce s
b e t we e n t he b a ct e r i a g r o wn o n a g a r a n d t ho s e
g r o wn o n ca r r a g e e n a n p l a t e s . T he o n l y m i n o r
di f f e r e n ce wa s s e e n i n R . r ub r um . M i cr o s co p i c
e x a m i n a t i o n o f t he cul t ur e s g r o wn o n D i f co n u-
t r i e n t a n d D i f co a g a r p l a t e s r e v e a l e d t he m t o b e
g r a m - n e g a t i v e , s p i r a l - s ha p e d o r g a n i s m s m e a s -
ur i n g 0 . 5 b y 9 , um . O n ca r r a g e e n a n I I p l a t e s , t he
o r g a n i s m s we r e s m a l l e r ( 0 . 5 b y 4
A m )
a n d l e s s
co i l e d. T hi s o b s e r v a t i o n , ho we v e r , i n n o wa y
r e f l e ct e d p o o r l y o n t he ca r r a g e e n a n m e di um a s
co l o n i e s o f R . r ub r um g r o wn o n S i g m a a g a r
p l a t e s we r e s i m i l a r l y l e s s co i l e d a n d o n l y s l i g ht l y
l o n g e r ( 0 . 5 b y 5
A m ) .
P i g m e n t p r o duct i o n wa s v e r y s i m i l a r i n a l l
T A B L E 1 . P hy s i ca l p r o p e r t i e s o f cul t ur e m e di a p r e p a r e d f r o m a g a r a n d f r o m E uche um a ca r r a g e e n a n
P hy s i ca l p r o p e r t y
p H C l a r i t y
C ul t ur e m e di um
C o l o r e r
B e f o r e
C f e t r uo l o r i n a f t e r t e i l z a
S y n e r e s i s S o hi di t y '
s t e r i l i z a -
i z a f t r s e - a t o a o n g B e o r
t e i l i z a
A f t e r s t e r i l i z a t i o n
D i f co n ut r i e n t a g a r ( de - 6 . 6 2 - 6 . 6 3 6 . 5 6 - 6 . 5 8 D a r k s t r a w C l e a r C l e a r No n e Fi r m
hy dr a t e d)
D i f co a g a r 6 . 5 - 6 . 7 5 6 . 5 - 6 . 9 8 D a r k s t r a w C l e a r C l e a r No n e Fi r m
S i g m a a g a r 7 . 1 0 - 7 . 2 8 7 . 0 0 - 7 . 3 9 S t r a w T ur b i d T ur b i d No n e Fi r m
E uche um a ca r r a g e e n a n
I 7 . 3 7 - 8 . 2 6 7 . 2 4 - 8 . 2 4 S t r a w S l i g ht l y t ur b i d S l i g ht l y t ur b i d No n e Fi r m
I I 7 . 1 8 - 7 . 4 1 7 . 2 5 - 7 . 7 0 S t r a w S l i g ht l y t ur b i d S l i g ht l y t ur b i d No n e Fi r m
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C A R R A G E E NA N I N B A C T E R I O L O G I C A L M E D I A 1 5 7
m e di a e x ce p t i n t he ca s e o f P . a e r ug i n o s a , whi ch
t ur n e d a g r e e n e r hue i n ca r r a g e e n a n m e di a .
T he g e n e r a l co l o n y cha r a ct e r i s t i cs a n d r a t e s
o f g r o wt h o n s l a n t s a n d b ut t s di d n o t di f f e r
s i g n i f i ca n t l y f r o m t ho s e o b s e r v e d o n s o l i d p l a t e s .
T he e f f e ct s o f t he hi g he r a l k a l i n i t y o f ca r r a -
g e e n a n I we r e l i k e wi s e e v i de n t . T hus , g r o wt h o f
b a ct e r i a o n s l a n t s p r e p a r e d f r o m t hi s m e di um
we r e s ca n t . B ut t s p r e p a r e d f r o m ca r r a g e e n a n I I
we r e cl e a r e r t ha n t ho s e p r e p a r e d f r o m S i g m a
a g a r . T he g r o wt h cha r a ct e r i s t i cs o f co l o n i e s
g r o wn o n t he l a t t e r m e di um we r e t he r e f o r e n o t
di s ce r n i b l e .
P l a t e co un t s . P l a t e co un t s a t di f f e r e n t di l u-
t i o n s o f b a ct e r i a we r e m a de a f t e r i n cub a t i n g t he
cul t ur e s o v e r n i g ht . T he co m p a r i s o n g i v e n i n T a -
b l e 2 s ho ws t ha t , e x ce p t p e r ha p s f o r t he p l a t e
co un t o f S . a ur e us a t t he 1 0 2 di l ut i o n , t he r e
we r e n o m a j o r di f f e r e n ce s i n p l a t e co un t .
E a s e o f p r e p a r a t i o n . A 1 . 5 % s o l ut i o n o f E u-
che um a ca r r a g e e n a n ca n b e di s p e n s e d a s e a s i l y
a s a s i m i l a r s o l ut i o n o f a g a r . B o t h s o l ut i o n s we r e
f o un d b y t he t e chn i q ue o f T ho m a s a n d K r i s h-
n a m ur t hy ( 3 ) t o g e l a t co m p a r a b l e t e m p e r a t ur e s ,
D i f co a n d S i g m a a g a r g e l l i n g a t 3 4 t o 3 6 0 C a n d
E uche um a ca r r a g e e n a n g e l l i n g a t 3 3 t o 3 6 0 C .
P o t a s s i um ca r r a g e e n a n f r o m S i g m a wa s f o un d
b y t he s a m e t e chn i q ue t o g e l a t 4 0 t o 4 2 C . I t
s ho ul d b e n o t e d t ha t g e l l i n g t e m p e r a t ur e a s
de t e r m i n e d b y t he t e chn i q ue us e d he r e do e s n o t
n e ce s s a r i l y r e f e r t o t he o n s e t o f g e l a t i o n b ut
r a t he r t o t he t e m p e r a t ur e a t whi ch a 1 . 5 % a g a r
o r ca r r a g e e n a n s o l ut i o n ha s s e t e n o ug h t o ho l d
a g l a s s b e a d dr o p p e d i n t o i t . M e di a p r e p a r e d
f r o m t he s e s o l i di f y i n g a g e n t s a r e m o s t co n v e n -
i e n t l y di s p e n s e d a t t e m p e r a t ur e s 1 0 t o 1 5 0 C
hi g he r t ha n t he r e p o r t e d g e l l i n g t e m p e r a t ur e s .
T hus , p o t a s s i um ca r r a g e e n a n n e e ds t o b e di s -
p e n s e d a t hi g he r t ha n t he 4 5 t o 5 0 0 C r e q ui r e d
f o r a g a r , a s o t he r a ut ho r s ha v e f o un d ( 1 , 2 ) .
A l t ho ug h m e di a f r o m E uche um a ca r r a g e e n a n
co ul d b e di s p e n s e d a t 4 5 t o 4 8 0 C , a t e m p e r a t ur e
r a n g e o f 5 0 t o 6 0 C wa s us e d i n m o s t p r e p a r a -
t i o n s t o co m p e n s a t e f o r t he i n t r i n s i ca l l y hi g he r
v i s co s i t y o f t he ca r r a g e e n a n s o l ut i o n ( 7 7 v e r s us
1 5 cp s f o r a g a r a t 4 5 0 C a s m e a s ur e d wi t h a
B r o o k f i e l d m o de l L V F v i s co m e t e r ) .
L i k e a g a r g e l s , t he g e l s p r e p a r e d f r o m E u-
che um a ca r r a g e e n a n co ul d b e r e m e l t e d a n d us e d
f o r t he p r e p a r a t i o n o f n e w p l a t e s . M e l t i n g t e m -
p e r a t ur e s a s de t e r m i n e d b y a p r e v i o us l y
r e -
p o r t e d m e t ho d ( 3 ) we r e 6 4 t o 6 8 C f o r E u-
che um a ca r r a g e e n a n g e l s a n d 9 6 t o 9 9 C f o r
D i f co a n d S i g m a a g a r g e l s . B a ct e r i a l g r o wt hs o n
p l a t e s p r e p a r e d f r o m r e m e l t e d m e di a we r e a s
l ux ur i a n t a s t ho s e o n p r i m a r y p l a t e s .
A r a t he r e x p l o r a t o r y e x p e r i m e n t r e v e a l e d t ha t
b l o o d a g a r p l a t e s co ul d b e a s co n v e n i e n t l y p r e -
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A P P L . E NV I R O N. M I C R O B I O L .
p a r e d f r o m ca r r a g e e n a n I I a s f r o m n ut r i e n t a g a r .
A l l o f t he p r e p a r e d p l a t e s s up p o r t e d t he g r o wt h
o f S . a ur e us , b ut s i n ce t he o r g a n i s m us e d wa s
n o t o f t he v i r ul e n t t y p e a s i n di ca t e d b y i t s i n a -
b i l i t y t o l i q ue f y g e l a t i n , t o f e r m e n t m a n n i t o l ,
a n d t o co a g ul a t e p l a s m a , t he z o n e o f he m o l y s i s
n o r m a l l y f o r m e d wa s n o t o b s e r v e d.
B a ct e r i a cul t ur e d o n s l a n t s p r e p a r e d f r o m I I
co ul d b e s t o r e d un de r m i n e r a l o i l a t 4 C . S ub -
cul t ur e s f r o m s t o ck we r e f o un d t o e x hi b i t t he
s a m e co l o n y cha r a ct e r i s t i cs a s t ho s e g r o wn o n
t he i n i t i a l s l a n t s . T he co l o n y cha r a ct e r i s t i cs o f
s ub cul t ur e s p r e p a r e d f r o m s t o ck e v e r y 3 m o n t hs
r e m a i n e d un cha n g e d, s ho wi n g t ha t s t o ck cul -
t ur e s o n ca r r a g e e n a n s t o r e d i n t hi s m a n n e r ca n
r e t a i n t he i r v i a b i l i t y o v e r a p r o l o n g e d p e r i o d o f
t i m e .
D I S C US S I O N
C a r r a g e e n a n f r o m E . s t r i a t um i s o f t he k a p p a
t y p e . K a p p a - ca r r a g e e n a n i s a s ul f a t e d p o l y s a c-
cha r i de co n s i s t i n g o f a l t e r n a t i n g un i t s o f g a l a c-
t o s e 4 - s ul f a t e a n d 3 , 6 - a n hy dr o g a l a ct o s e . I t s g e l l -
i n g cha r a ct e r i s t i cs v a r y wi t h m a n uf a ct ur i n g
p r o ce s s e s a n d f o r m ul a t i o n s a n d a r e s e n s i t i v e t o
a l k a l i ca t i o n co n t e n t . C a r r a g e e n a n I I , whi ch wa s
p r o ce s s e d f r o m t he s a m e s e a we e d s p e ci e s i n
di f f e r e n t b a t che s , wa s f o un d b y a t o m i c a b s o r p -
t i o n s p e ct r o p ho t o m e t r y t o co n t a i n , o n t he a v e r -
a g e , 0 . 7 2 % s o di um , 2 . 5 % p o t a s s i um a n d 4 . 5 %
ca l ci um ( b y we i g ht ) . I t i s t he r e f o r e a m i x e d s a l t ,
un l i k e t he p o t a s s i um s a l t us e d b y W a t s o n a n d
A p i r i o n ( 5 ) a n d L i n e s ( 2 ) .
I t ha s b e e n p o i n t e d o ut t ha t t he n e ce s s i t y t o
m a i n t a i n a n o p t i m um p H ca n p r e s e n t a p r o b l e m
i n t he p r e p a r a t i o n o f s o m e m e di a f r o m ca r r a -
g e e n a n . T he co n s i de r a b l e f a l l i n p H o b s e r v e d
up o n t he a ddi t i o n o f a p ho s p ha t e b uf f e r i n g s y s -
t e m ( 2 ) a n d t he p r e ci p i t a t i o n we o b s e r v e d o n
t he a ddi t i o n o f a s i m i l a r b uf f e r t o ca r r a g e e n a n I
i n de e d i n di ca t e t ha t a l t e r a t i o n s t o e x i s t i n g m e t h-
o ds o f p H a dj us t m e n t wi l l ha v e t o b e i n t r o duce d.
T he us e o f a ca r r a g e e n a n ( I I ) wi t h a n i n t r i n s i -
ca l l y l o we r p H wa s a n o p t i o n a v a i l a b l e t o us .
T hi s b ui l t - i n p H a dj us t m e n t a p p e a r e d t o s o l v e
t he p r o b l e m s a s s o ci a t e d wi t h a t t e m p t s t o r e duce
a l k a l i n i t y , a t l e a s t i n t he ca s e s we i n v e s t i g a t e d.
Fut ur e a t t e m p t s t o i m p r o v e t he m a i n t a i n a b i l i t y
o f o p t i m um p H m us t t a k e i n t o co n s i de r a t i o n t he
f a ct t ha t ca r r a g e e n a n i s s t a b l e un de r a l k a l i n e
co n di t i o n s a n d de g r a de s a t a l o w p H, e s p e ci a l l y
wi t h t he a p p l i ca t i o n o f he a t .
I n m o s t o t he r r e s p e ct s , o ur r e s ul t s i n di ca t e
t ha t ca r r a g e e n a n f r o m E . s t r i a t um ha n dl e s a s
we l l a s a g a r . T he e a s e wi t h whi ch b l o o d a g a r
p l a t e s co ul d b e p r e p a r e d a t 4 5 t o 4 8 C wa s m o s t
e n co ur a g i n g , p a r t i cul a r l y i n v i e w o f t he di f f i cul -
t i e s e n co un t e r e d b y L i n e s ( 2 ) . Fur t he r , ca r r a -
g e e n a n wa s us e d a t t he s a m e co n ce n t r a t i o n a s
a g a r i n a l l o f t he m e di a p r e p a r a t i o n s .
A l t ho ug h i t i s cl e a r t ha t m o r e s t udi e s a r e
ca l l e d f o r , t he r e s ul t s o f i n v e s t i g a t i o n s un de r -
t a k e n t o da t e p o i n t t o t he p o t e n t i a l o f ca r r a -
g e e n a n a s a n a g a r s ub s t i t ut e , a t l e a s t i n co m m o n
b a ct e r i o l o g i ca l m e di a . T he de v e l o p m e n t o f s uch
a n a p p l i ca t i o n wi l l v e r y l i k e l y cr e a t e a n i m p a ct ,
e s p e ci a l l y i n de v e l o p i n g co un t r i e s whe r e n a t ur a l
s o ur ce s o f k a p p a - ca r r a g e e n a n a b o un d.
A C K NO W L E D G M E NT S
W e t ha n k t he M i n i s t r y o f Na t ur a l R e s o ur ce s f o r g e n e r o us
s up p o r t o f t hi s s t udy a n d B e r n a r di t a B . A r a n z a n s o f o r a s s i s t -
a n ce i n t he p r e p a r a t i o n o f t he m a n us cr i p t .
L I T E R A T UR E C I T E D
1 . B r e e d, R . S . , a n d E . G . D . M ur r a y ( e d. ) . 1 9 5 7 . B e r g e y ' s
m a n ua l o f de t e r m i n a t i v e b a ct e r i o l o g y . T he W i l l i a m s &
W i l k i n s C o . , B a l t i m o r e .
2 . L i n e s , A . D . 1 9 7 7 . V a l ue s o f t he K + s a l t o f ca r r a g e e n a n a s
a n a g a r s ub s t i t ut e i n r o ut i n e b a ct e r i o l o g i ca l m e di a .
A p p l . E n v i r o n . M i cr o b i o l . 3 4 : 6 3 7 - 6 3 9 .
3 . T ho m a s , P . C . , a n d V . K r i s hn a m ur t hy . 1 9 7 6 . A g a r
f r o m cul t ur e d G r a ci l a r i a e dul i s ( G m e l . ) S i l v a . B o t .
M a r . 1 9 : 1 1 5 - 1 1 7 .
4 . W a l k e r , A . W . , a n d A . A . D a y . 1 9 4 3 . E x t r a ct s f r o m I r i s h
M o s s a s a s ub s t i t ut e f o r a g a r i n b a ct e r i o l o g i ca l cul t ur e
m e di a . Fo o d R e s . 8 : 4 3 5 - 4 4 3 .
5 . W a t s o n , N. , a n d D . A p i r i o n . 1 9 7 6 . S ub s t i t ut e f o r a g a r i n
s o l i d m e di a f o r co m m o n us a g e s i n m i cr o b i o l o g y . A p p l .
E n v i r o n . M i cr o b i o l . 3 1 : 5 0 9 - 5 1 3 .
1 5 8 E P I FA NI O E T A L .

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