1968, 16(9):1326. Appl. Microbiol.

Hammer
J. Orvin Mundt and James L.

Lactobacilli on Plants
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APPLID M IC R O B IO LO G Y , S e p t . 1 9 6 8 , p . 1 3 2 6 - 1 3 3 0 V o l . 1 6 , N o . 9
C o p y r i g h t @ 1 9 6 8 Am e r i c a n S o c i e t y f o r M i c r o b i o l o g y Pr i n t e d i n U . S . A.
La c t o b a c i l l i o n Pl a n t s
J . O R V IN M U N DT AD J AM ES L. HAM M ER
De p a r t m e n t s o f M i c r o b i o l o g y a n d F o o d Te c h n o l o g y , U n i v e r s i t y o f Te n n e s s e e , K n o x v i l l e , Te n n e s s e e 3 7 9 1 6
R e c e i v e d f o r p u b l i c a t i o n 5 J u n e 1 9 6 8
Th e d i s t r i b u t i o n , e n u m e r a t i o n , a n d i d e n t i f i c a t i o n o f l a c t o b a c i l l i o n v e g e t a b l e
p l a n t s w e r e s t u d i e d i n a n a r e a d e s c r i b e d g e o g r a p h i c a l l y a s b e i n g s u b t r o p i c a l a n d
m o i s t . Th e l a c t o b a c i l l i w e r e o b t a i n e d , b y m e a n s o f q u a n t i t a t i v e e n r i c h m e n t p r o -
c e d u r e s i n R o g o s a ' s S L b r o t h , f r o m 3 5 . 3 % o f a l l s a m p l e s i n c u b a t e d a t 3 2 C , a n d
f r o m 1 5 . 4 % , o f t h e s a m p l e s i n c u b a t e d a t 4 5 C . Le s s t h a n 1 0 l a c t o b a c i l l i / g o f p l a n t
m a t e r i a l w e r e e n u m e r a t e d i n 5 4 % o f a l l p o s i t i v e s a m p l e s . Th e l a c t o b a c i l l i w e r e f o u n d
m u c h l e s s f r e q u e n t l y a n d i n l o w e r n u m b e r s t h a n w e r e s t r e p t o c o c c i o r Le u c o n o s t o c
m e s e n t e r o i d e s . Th e m o s t f r e q u e n t l y i s o l a t e d l a c t o b a c i l l u s w a s v e r y s i m u l a r t o , b u t
n o t i d e n t i c a l w i t h , La c t o b a c i l l u s f e r m e n t i . It w a s a e r o g e n i c , g r e w w e l l a t b o t h 1 5
a n d 4 5 C , f e r m e n t e d a r a b i n o s e , l a c t o s e , a n d s u c r o s e , a n d l i b e r a t e d a m m o n i a f r o m
a r g i n i n e . O f t h e i d e n t i f i e d s p e c i e s , L. p l a n t a r u m , L. f e r m e n t i , a n d L. b r e v i s w e r e t h e
m o s t f r e q u e n t l y i s o l a t e d , w h e r e a s L. c a s e i , L. v i r i d e s c e n s , L. c e l l o b i o s u s , L. s a l i v a r i u s ,
a n d L. b u c h n e r i w e r e o b t a i n e d f r o m s m a l l n u m b e r s o f s a m p l e s . Th e w i d e s p r e a d b u t
s p o r a d i c d i s t r i b u t i o n o f l a c t o b a c i l l i i n l o w n u m b e r s s e e m s t o i n d i c a t e t h a t t h e s e
o r g a n i s m s d o n o t n o r m a l l y t h r i v e o n p l a n t s u r f a c e s . A t e r n a r y c y c l e , b e g i n n i n g w i t h
i n t e s t i n a l w a s t e , f o l l o w e d b y m e c h a n i c a l d i s t r i b u t i o n t o a n d a m o n g p l a n t s , a n d
r e t u r n t o t h e h o s t v i a t h e o r a l c a v i t y , i s s u g g e s t e d .
F e w s y s t e m a t i c s t u d i e s o f t h e d i s t r i b u t i o n ,
e n u m e r a t i o n , a n d i d e n t i t y o f l a c t o b a c i l l i o n p l a n t s
h a v e b e e n c a r r i e d o u t . S o m e k n o w l e d g e h a s b e e n
g a i n e d b y s t u d y i n g t h e s p e c i e s w h i c h w e r e m o s t
p r e v a l e n t d u r i n g f e r m e n t a t i o n s o r b y s t u d y i n g
p l a n t m n a t e r i a l s u n d e r e s s e n t i a l l y a r t i f i c i a l c o n d i -
t i o n s w h i c h e n a b l e d t h e m o s t a d a p t a b l e s p e c i e s t o
i n c r e a s e i n n u m b e r s ( 3 ) . S t u d i e s b y K r o u l i k ,
B u r k e y , a n d W i s e m a n ( 1 5 ) a n d b y S t i r l i n g a n d
W h i t t e n b u r y ( 2 4 ) i n d i c a t e t h a t , i n a n a t u r a l
p l a n t e n v i r o n m e n t , l a c t o b a c i l l i a r e p r e s e n t i n
l o w n u m b e r s . N i l s s o n a n d N i l s s o n ( 2 0 ) , Al l e n
e t a l . ( 4 ) , a n d W o e l l e r ( 2 6 ) f o u n d t h a t l a c t o -
b a c i l l i m a y b e a b s e n t u n d e r c e r t a i n c o n d i t i o n s ,
o r t h a t t h e y m a y b e p r e s e n t o n p l a n t s i n v e r y
l a r g e n u m b e r s u n d e r o t h e r c o n d i t i o n s . W h e n i d e n -
t i f i c a t i o n h a s b e e n m a d e , t h e m a i n , i f n o t t h e o n l y ,
s p e c i e s r e p o r t e d h a s b e e n La c t o b a c i l l u s p l a n -
t a r u m .
In t h i s p a p e r , w e r e p o r t s t u d i e s o f t h e d i s t r i b u -
t i o n , e n u m e r a t i o n , a n d i d e n t i f i c a t i o n o f l a c t o -
b a c i l l i o c c u r r i n g o n p l a n t s ; t h e s e s t u d i e s a r e
c o m p a r a b l e t o t h o s e w h i c h h a v e b e e n d o n e o n t h e
o r a l c a v i t y ( 8 , 2 2 ) a n d o n i n t e s t i n a l c o n t e n t s
( 1 6 ) . Th e c l i m a t e o f t h e a r e a i n w h i c h o u r s t u d i e s
w e r e c o n d u c t e d i s d e s c r i b e d g e o g r a p h i c a l l y a s
b e i n g s u b t r o p i c a l t o m o i s t , w i t h 1 0 0 t o 1 3 0 c m
o f r a i n f a l l p e r y e a r . Th e r a i n f a l l i s i n e q u i t a b l y
d i s t r i b u t e d , w i t h t h e g r e a t e r q u a n t i t y f a l l i n g
d u r i n g t h e l a t e w i n t e r a n d s p r i n g .
M ATER IALS AN D M ETHO DS
S a m p l e s . S a m p l e s w e r e o b t a i n e d f r o m f i e l d s , g a r -
d e n s , a n d p r o c e s s i n g p l a n t s . W i t h t h e e x c e p t i o n o f
s q u a s h a n d c u c u m b e r , f r o m w h i c h s u r f a c e p o r t i o n s
w e r e r e m o v e d f o r u s e w i t h a s l o t t e d p a r i n g k n i f e , a l l
s a m p l e s w e r e u s e d a s r e c e i v e d , w i t h o u t w a s h i n g o r
t r i m m i n g . R a w p r o c e s s i n g s a m p l e s , w h i c h r e c e i v e d
p a r t i a l t r e a t m e n t , w e r e o b t a i n e d p r i o r t o b l a n c h i n g ,
a n d p r o c e s s e d s a m p l e s w e r e o b t a i n e d p r i o r t o o r a f t e r
f r e e z i n g .
Pr i m a r y m e d i u m . R o g o s a ' s S L b r o t h w a s p r e p a r e d
w i t h 0 . 0 4 % c y c l o h e x i m i d e a n d w i t h 1 0 % l e s s w a t e r
t h a n s p e c i f i e d , f o r u s e a t 4 5 C . To r e s t r i c t o v e r g r o w t h
b y Le u c o n o s t o c m e s e n t e r o i d e s a t 3 2 C , 9 5 % e t h y l
a l c o h o l w a s a d d e d t o c o m p r i s e 7 % o f t h e s a m e
m e d i u m a f t e r b o i l i n g , a c i d i f i c a t i o n , a n d c o o l i n g ( 1 9 ) .
Th e m e d i a w e r e t u b e d i n t o s t e r i l e s c r e w - c a p p e d t u b e s
i n 9 . 0 - a n d 4 . 5 - m l q u a n t i t i e s .
M o d i f i e d M R S m e d i u m ( M M R S ) . Th e m e d i u m o f
De M a n , R o g o s a , a n d S h a r p e ( 1 7 ) w a s p r e p a r e d w i t h
d i - r a t h e r t h a n t r i - a m m o n i u m p h o s p h a t e , 1 . 5 % a g a r ,
a n d 0 . 0 1 % 2 , 3 , 5 - t r i p h e n y l t e t r a z o l i u m - HC l ( TTC ) .
W h e n u s e d a s a l i q u i d , t h e b e e f e x t r a c t a n d t h e TTC
w e r e o m i t t e d . O t h e r m o d i f i c a t i o n s a r e d e s c r i b e d i n
t h e t e x t .
An a e r o b i o s i s . Al l p l a t e m e d i a w e r e i n c u b a t e d a f t e r
i n o c u l a t i o n i n l a r g e k e t t l e s f i t t e d w i t h g a s t a p s . A
m i x t u r e o f 9 5 % N 2 a n d 5 % C O 2 r e p l a c e d t h e a i r o f
t h e v e s s e l s a f t e r a s i n g l e e v a c u a t i o n w i t h a m e c h a n i c a l
p u m p .
En u m e r a t i o n a n d i s o l a t i o n . A 1 - m l a m o u n t o f 1 0 %
a q u e o u s h o m o g e n a t e o f p l a n t m a t e r i a l w a s a d d e d t o
9 m l o f S L m e d i a i n t r i p l i c a t e f o r e a c h t e m p e r a t u r e .
1 3 2 6

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LAC TO B AC ILLI O N PLAN TS
In t e r n a l , d e c i m a l d i l u t i o n s w e r e c o n t i n u a l l y m a d e i n
t u b e s o f t h e r e s p e c t i v e m e d i a p r e p a r e d i n 4 . 5 - m l q u a n -
t i t i e s . Th e s i m p l e S L m e d i u m w a s i n c u b a t e d a t 4 5 C
i n a w a t e r b a t h , w h e r e a s t h e m e d i u m c o n t a i n i n g e t h y l
a l c o h o l w a s i n c u b a t e d i n a i r a t 3 2 C . U p o n d e v e l o p -
m e n t o f m i n i m a l t u r b i d i t y , s t r e a k s w e r e m a d e o n
M M R S a g a r f r o m t h o s e t u b e s i n w h i c h l a c t o b a c i l l i
w e r e o b s e r v e d i n s t a i n e d p r e p a r a t i o n s . In c u b a t i o n o f
t h e b r o t h w a s t h e n c o n t i n u e d f o r s e v e r a l d a y s t o
a s c e r t a i n t h e m o s t p r o b a b l e n u m b e r s ( 1 1 ) .
S e l e c t i o n s o f e a c h t y p e o f c o l o n y a p p e a r i n g o n t h e
M M R S a g a r w e r e m a d e a f t e r 3 d a y s o f i n c u b a t i o n a t
3 2 C . O u t g r o w t h s i n M M R S b r o t h w h i c h w e r e
b a c i l l a r y , g r a m - p o s i t i v e , a n d c a t a l a s e - n e g a t i v e o r
w e a k l y p o s i t i v e w e r e a s s u m e d t o b e l a c t o b a c i l l i a n d
w e r e s t o r e d f o r l a t e r s t u d y . C u l t u r e s w e r e r e s t r e a k e d
f o r p u r i t y u p o n r e a c t i v a t i o n .
S t o r a g e . He a v y s u s p e n s i o n s o f y o u n g , m a t u r e c u l -
t u r e s w e r e m a d e i n Tr y p t i c a s e s o y - 0 . 1 % y e a s t e x t r a c t
( TG Y E) c o n t a i n i n g 1 6 % g l y c e r o l ( 2 5 ) . Th e s e s u s -
p e n s i o n s w e r e p r o m p t l y f r o z e n a n d m a i n t a i n e d a t
- 1 8 C . Th e y w e r e r e a c t i v a t e d b y i n t r o d u c t i o n o f
0 . 1 m l o f t h a w e d l i q u i d i n t o M M R S b r o t h .
Id e n t i f i c a t i o n . Th e c r i t e r i a u s e d a n d t h e k e y s g i v e n
b y Ab o - El n a g a a n d K a n d l e r ( 1 , 2 ) , R o g o s a a n d
S h a r p e ( 2 1 ) , a n d S h a r p e ( 2 3 ) w e r e u s e d i n t h e i d e n t i -
f i c a t i o n o f t h e l a c t o b a c i l l i .
M M R S b r o t h w a s t h e b a s e m e d i u m u s e d t o d e t e r -
m i n e t h e a b i l i t y o f t h e o r g a n i s m s t o f e r m e n t c a r b o -
h y d r a t e s a n d t o d e t e r m i n e t o l e r a n c e t o 6 . 5 % N a C l .
B i l e t o l e r a n c e w a s d e t e r m i n e d o n M M R S a g a r c o n -
t a i n i n g 4 % s o d i u m t a u r o c h o l a t e . TG Y E r e p l a c e d t h e
n u t r i t i v e p o r t i o n o f t h e m e d i u m o f B a l l a n d S e l l e r s ( 5 )
f o r d e t e c t i o n o f m o t i l i t y a t 2 4 h r a n d d i g e s t i o n o f
g e l a t i n a t 7 d a y s . Te s t s f o r p r o d u c t i o n o f c a t a l a s e w e r e
p e r f o r m e d o n t h e r e s t r i c t e d c a r b o h y d r a t e m e d i u m o f
Ev a n s a n d N i v e n ( 1 0 ) , a c c o r d i n g t o t h e m e t h o d o f
Da c r e a n d S h a r p e ( 7 ) . Pr e s e n c e o f i n d o l e a n d n i t r i t e
w a s d e t e r m i n e d w i t h K o v a c ' s r e a g e n t a n d w i t h
a - n a p h t h y l a m i n e a n d s u l f a n i l i c a c i d , a f t e r g r o w t h i n
t h e s t a n d a r d i n d o l e - n i t r a t e m e d i u m . Th e p r i n c i p l e o f
t h e p r o c e d u r e o f G i b s o n a n d Ab d e l - M a l e k ( 1 3 ) w a s
u s e d f o r d e t e c t i o n o f a e r o g e n e s i s . To d e t e r m i n e t h e
r e l e a s e o f a m m o n i a , a m m o n i u m c i t r a t e w a s r e p l a c e d
b y a r g i n i n e i n M M R S m e d i u m . Hy d r o l y s i s o f e s c u l i n
w a s d e t e c t e d b y t h e f o r m a t i o n o f w h i t e , c o r a l - l i k e
c r y s t a l s i n t h e m e d i u m o f G e m m e l l a n d Ho d g k i s s
( 1 2 ) .
C e l l w a l l s o f c u l t u r e s i d e n t i f i e d a s o r s u s p e c t e d o f
b e i n g s i m i l a r t o L. p l a n t a r u m w e r e h y d r o l y z e d a c c o r d -
i n g t o t h e m e t h o d o f C u m m i n s a n d Ha r r i s ( 6 ) , a n d
c h r o m a t o g r a m s w e r e m a d e a c c o r d i n g t o t h e p r o c e d u r e
o f Ab o - El n a g a a n d K a n d l e r ( 1 ) f o r t h e d e t e c t i o n o f
d i a m i n o p i m e l i c a c i d .
In o c u l a c o n s i s t e d o f s i n g l e d r o p s o f 1 - d a y - o l d b r o t h
c u l t u r e s i n l i q u i d m e d i a , s h a k e n l o o p s t r e a k s o n a g a r
m e d i a , a n d n e e d l e s t a b s . W a t e r b a t h s w e r e u s e d f o r
i n c u b a t i o n s a t 1 5 a n d 4 5 C .
R ES U LTS AN D DIs c u s s Io N
Di s t r i b u t i o n . La c t o b a c i l l i w e r e o b t a i n e d f r o m
6 0 ( 3 5 . 3 % ) o f 1 6 0 s a m p l e s i n c u b a t e d w i t h S L-
e t h y l a l c o h o l b r o t h a t 3 2 C ,
a n d f r o m 2 5
( 1 5 . 4 % )
o f t h e s a m p l e s i n c u b a t e d a t 4 5 C ( Ta b l e 1 ) .
Th e s e o r g a n i s m s w e r e r e c o v e r e d m o s t f r e q u e n t l y
f r o m c o r n , a n d w e r e n o t p r e v a l e n t o n g r a s s e s ,
c e r e a l p l a n t s , p e p p e r s , o r l e a v e s .
S t i r l i n g a n d W h i t t e n b u r y ( 2 4 ) r e p o r t e d a n
i n c r e a s e i n p e r c e n t r e c o v e r y o f l a c t o b a c i l l i f r o m
p l a n t s w h i c h h a d b e e n i n c o n t a c t w i t h h a r v e s t i n g
e q u i p m e n t . Th e p r o c e s s i n g o f h a r v e s t e d v e g e -
t a b l e s a l s o r e s u l t e d i n a n i n c r e a s e i n t h e n u m b e r
o f s a m p l e s f r o m w h i c h l a c t o b a c i l l i w e r e r e -
c o v e r e d ( Ta b l e 2 ) , b o t h p r i o r t o b l a n c h i n g f o r
f r e e z i n g a n d i n t h e f i n i s h e d p r o d u c t . Th e p r e s e n c e
o f l a c t o b a c i l l i i n t h e f i n i s h e d p r o d u c t , e i t h e r
i m m e d i a t e l y p r i o r t o o r a f t e r f r e e z i n g , i s p r o b a b l y
t h e r e s u l t o f a i r b o r n e t r a n s f e r f r o m r a w p r o d u c t
a r e a s a n d s u b s e q u e n t g r o w t h o n p r o c e s s i n g
e q u i p m e n t ( 1 8 ) .
TAB LE 1 . F r e q u e n c y o f o c c u r r e n c e a n d n u m b e r s o f
l a c t o b a c i l l i o n p l a n t s
Pl a n t s o u r c e
C e r e a l p l a n t s . .
S o r g h u m , S u -
d a n . . . . . . . . .
C o r n , f l o w e r s
a n d l e a v e s . . .
G r e e n s , r a w . . . .
G r e e n s , p r o c -
e s s e d . . . . . . . .
O k r a , r a w . . . . .
O k r a , p r o c e s s e d
G r e e n b e a n s ,
r a w . . . . . . . . .
G r e e n b e a n s ,
p r o c e s s e d . . . .
S q u a s h , r a w . . . .
S q u a s h , p r o c -
e s s e d . . . . . . . .
Li n i a b e a n s ,
p o d . . . . . . . . .
Li m a b e a n s ,
h u l l e d . . . . . . .
Li m a b e a n s ,
r a w p r o c -
e s s e d . . . . . . . .
Li m a b e a n s ,
f r o z e n . . .
Pe p p e r , g r e e n . .
Pe a s ( S o u t h e r n )
p o d s . . . . . . . .
Pe a s , h u l l e d . . . .
Pe a s , p r o c e s s e d .
C u c u m b e r . . . . .
Le t t u c e . . . . . . . .
Le a v e s , m i s -
c e l l a n e o u s b . .
To t a l . . . . . . . . .
N o . o f
s a m -
p l e s
8
1 1
1 6
5
5
6
2
5
2
2 1
1 5
5
5
2
4
1 4
8
2
7
2
1 4
1 6 0
N o . w i t h
g r o w t h
3 2 C
0
2
1 3
0
2
2
2
1
6
1 2
0
1
0
0
4
8
0
3
6 0
I
M o s t p r o b a b l e n u m b e r s .
b
Le a v e s i n c l u d e En g l i s h
r h u b a r b , t u r n i p , a n d p o t a t o .
4 5 C
o
0
2
0
2
0
2
1
3
8
0
1
0
0
0
4
0
0
0
0
2 5
M PN 5 p e r g r a m
3 2 C
0
2 3 - 4 3
3 . 6 - 4 6 0
3 . 6 - 7 . 3
3 . 0 - 9 . 1
2 4 0 - 4 6 0
2 3
2 3
3 . 6 - 7 . 3
3 . 6 - 7 . 3
4 3
2 3
3 . 6 - 4 . 3
3 . 6 - 4 6 0
3 . 6 - 7 . 3
7 . 3
3 . 6
4 5 C
3 . 6
0
2 3
3 . 6
0
2 3 - 9 3
3 . 6
9 . 1
3 . 6
3 . 6
o v e r 4 6 0
0
0
4 3 - 2 4 0
p e a , b e e t , r a d i s h , s t r a w b e r r y ,
V O L. 1 6 , 1 9 6 8 1 3 2 7

o
n

S
e
p
t
e
m
b
e
r

7
,

2
0
1
3

b
y

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h
t
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/
/
a
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m
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a
s
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r
g
/
D
o
w
n
l
o
a
d
e
d

f
r
o
m

M U N DT AN D HAM M ER
TAB LE 2 . F r e q u e n c y o f o c c u r r e n c e o f l a c t o b a c i l l i
a c c o r d i n g t o s o u r c e o f s a m p l e a n d t e m p e r a t u r e
o f i n c u b a t i o n
La c t o b a c i l l i
S o u r c e o f s a m p l e
s N o o f
( n c u b a - p r e s e n t S o u r c e o f
s a m p l e s
t i o n t e m p
_______
N o . Pe r c e n t
F i e l d 1 2 0 3 2 3 3 2 7 . 5
1 2 0 4 5 7 5 . 8
R a w p r o d u c t i n 1 4 3 2 1 0 7 1 . 4
p r o c e s s 1 4 4 5 5 3 5 . 7
Pr o c e s s e d f o r f r e e z - 2 8 3 2 1 7 6 0 . 7
i n g 2 8 4 5 1 3 4 6 . 4
N u m b e r s . Th e m o s t p r o b a b l e n u m b e r s o f l a c t o -
b a c i l l i p e r g r a m o f s a m p l e a r e l i s t e d i n Ta b l e 1 .
Th e n u m b e r s m a y h a v e e x c e e d e d 4 . 6 x 1 0 2 / g
i n o n l y s i x s a m p l e s , t h r e e o f w h i c h w e r e o f c o r n .
Le s s t h a n 1 0
l a c t o b a c i l l i / g w e r e r e c o v e r e d f r o m
5 4 % o f t h e p o s i t i v e s a m p l e s . Th e v e r y l o w n u m -
b e r s a c c o u n t f o r t h e l e s s e x t e n s i v e r e c o v e r y w h e n
s o l i d i s o l a t i n g m e d i a w e r e u s e d , s i n c e t h e m a x i -
m a l a m o u n t o f m a t e r i a l i n t r o d u c e d t o t h e p l a t e s
w a s e i t h e r 0 . 1 o r 0 . 0 1 g . Th e l o w n u m b e r s s u g -
g e s t a m e c h a n i c a l d i s t r i b u t i o n o f t h e
l a c t o b a c i l l i ,
w i t h o u t s u b s e q u e n t g r o w t h . Ha d t h e r e b e e n
a n y d e g r e e o f c o l o n i z a t i o n , t h e n u m b e r s p e r g r a m
o f s a m p l e w o u l d h a v e b e e n
m a t e r i a l l y g r e a t e r .
Id e n t i f i c a t i o n . Th e l a c t o b a c i l l i w e r e d i s t r i b u t e d
a m o n g e i g h t i d e n t i f i e d s p e c i e s a n d o n e o t h e r
g r o u p ( Ta b l e 3 ) . L. p l a n t a r u m , L. b r e v i s , a n d
L. f e r m e n t i w e r e p r e s e n t m o s t f r e q u e n t l y a n d i n
t h e g r e a t e s t n u m b e r s . L.
c e l l o b i o s u s , f i r s t i s o -
l a t e d f r o m s a l i v a ( 2 2 ) , w a s i s o l a t e d f r o m f i v e
s a m p l e s o f c o r n . L. v i r i d e s c e n s a n d L. s a l i v a r i u s ,
w h i c h h a v e n o t b e e n r e p o r t e d p r e v i o u s l y t o o c c u r
o n p l a n t s , w e r e i s o l a t e d o n c e . Th e l a t t e r s p e c i e s
w a s t h e o n l y m e m b e r o f t h e t h e r m a l s u b g r o u p
o f t h e g e n u s t o b e i s o l a t e d i n t h i s s t u d y . W i t h t h e
e x c e p t i o n o f c u c u m b e r s , w h i c h y i e l d e d o n l y L.
p l a n t a r u m , m o r e t h a n o n e s p e c i e s o c c u r r e d w i t h i n
e a c h o f t h e p l a n t g r o u p s . L. c a s e i w a s i s o l a t e d
o n c e f r o m e a c h o f t h r e e d i f f e r e n t p l a n t s , a n d L.
b u c h n e r i w a s i s o l a t e d o n c e .
N e a r l y 1 0 0 o f t h e u n i d e n t i f i e d c u l t u r e s c o m -
p r i s e d a b a s i c a l l y h o m o g e n e o u s , a e r o g e n i c
g r o u p w h i c h g r e w w e l l a t b o t h 1 5 a n d 4 5 C .
Th e s e c u l t u r e s f e r m e n t e d a r a b i n o s e a n d s u c r o s e ,
a n d m o s t o f t h e m f e r m e n t e d l a c t o s e a n d l i b e r -
a t e d a m m o n i a f r o m a r g i n i n e . Al t h o u g h t h e s e
c u l t u r e s a r e s i m i l a r t o L. f e r m e n t i , m a n y o f t h e m
f e r m e n t e d m a n n i t o l , w h i c h i s a d i s t i n g u i s h i n g
f e a t u r e o f L. s a l i v a r i u s , m e l e z i t o s e , w h i c h i s
c h a r a c t e r i s t i c o f L. b u c h n e r i , o r c e l l o b i o s e , a
p r o p e r t y o f L. c e l l o b i o s u s . M o r e t h a n 5 0 % o f t h e
c u l t u r e s p r o d u c e d n i t r i t e f r o m n i t r a t e . Th e c u l -
t u r e s w e r e i s o l a t e d f r o m a v a r i e t y o f p l a n t s ,
i n c l u d i n g c o r n , g r e e n s , l i m a b e a n s , o k r a , a n d
s q u a s h .
C o m p a r i s o n o f o c c u r r e n c e o f l a c t o b a c i l l i a n d
s t r e p t o c o c c i . To o b t a i n a c o m p a r i s o n i n t h e
f r e q u e n c y o f t h e s e t w o g r o u p s , f r u i t i n g h e a d s o f
g r a s s e s a n d c e r e a l s , r e p r e s e n t i n g a l l s t a g e s o f
m a t u r i t y , w e r e p l a c e d i n t o t u b e s o f M M R S -
0 . 0 2 % N a N 3 o r i n t o TG Y E- 0 . 0 2 % N a N 3
b r o t h s . O t h e r s a m p l e s w e r e p l a t e d a f t e r h o m o g e -
n i z a t i o n o n M M R S a g a r c o n t a i n i n g N a N 3 .
O u t g r o w t h s w e r e i s o l a t e d a n d i d e n t i f i e d , w i t h t h e
r e s u l t s s h o w n i n Ta b l e 4 .
M e m b e r s o f t h e g e n e r a S t r e p t o c o c c u s a n d Le u -
c o n o s t o c w e r e o b t a i n e d f r o m 5 2 . 3 % o f 1 0 9
s a m p l e s , w h e r e a s l a c t o b a c i l l i w e r e o b t a i n e d f r o m
4 , o r
3 . 7 % , o f t h e s a m p l e s . S p h e r i c a l b a c t e r i a
w e r e o n l y o b t a i n e d f r o m s a m p l e s f r o m w h i c h
t h e p l a t e c o u n t s r a n g e d b e t w e e n 5 X 1 0 6 t o
3 . 4 X 1 0 7 / g o f m a t e r i a l . W o e l l e r ( 2 6 ) r e p o r t e d
v e r y l a r g e p o p u l a t i o n s o f l a c t o b a c i l l i o n c e r e a l s ;
h o w e v e r , i n r e a c h i n g t h i s c o n c l u s i o n , h e a p p e a r s
t o h a v e r e l i e d u p o n m o r p h o l o g y o f r a n d o m o b -
s e r v a t i o n s , r a t h e r t h a n u p o n n u m e r i c a l d i s -
t i n c t i o n b e t w e e n t h e l a c t o b a c i l l i a n d s t r e p t o -
c o c c i . Th u s , i t s e e m s l i k e l y t h a t , a s i n t h i s s t u d y ,
m o s t o f t h e l a c t i c a c i d - p r o d u c i n g b a c t e r i a w h i c h
h e r e p o r t e d b e l o n g t o t h e s p h e r i c a l , r a t h e r t h a n
t h e b a c i l l a r y , g e n e r a .
Th e c u m u l a t i v e l i t e r a t u r e o n t h e s u b j e c t o f
l a c t o b a c i l l i o n p l a n t s i s n o t i n a c c o r d w i t h t h e
c o n c e p t t h a t p l a n t s a r e a n a t u r a l r e s e r v o i r o f t h e
l a c t o b a c i l l i . N o t a l l s p e c i e s o f l a c t o b a c i l l i c o n -
s i d e r e d t o b e t y p i c a l " p l a n t t y p e s " ( 1 4 ) w e r e i s o -
l a t e d i n o u r s t u d y , n o r w e r e t h e i d e n t i f i e d s p e c i e s
r e s t r i c t e d t o " p l a n t t y p e s . " Th e l a c t o b a c i l l a r y
f l o r a d o n o t a p p e a r t o b e a n y m o r e c h a r a c t e r i s t i c
f o r p l a n t s t h a n f o r t h e o r a l c a v i t y ( 8 , 2 2 ) o r f o r t h e
i n t e s t i n a l t r a c t ( 1 6 ) . Th e " p l a n t t y p e s " a r e f o u n d
i n a l l e n v i r o n m e n t s , a n d t h e y a r e q u i t e s u s c e p t i b l e
t o i m p l a n t a t i o n i n t o t h e i n t e s t i n a l t r a c t ( 1 6 ) .
Da v i s ( 9 ) h a s s u g g e s t e d t h a t t h e i n t e s t i n a l t r a c t
i s t h e n a t u r a l h a b i t a t o f t h e l a c t o b a c i l l i , a n d t h a t
t h e s e o r g a n i s m s e s c a p e t h r o u g h w a s t e s a n d t h r i v e
i n n a t u r e u n d e r u n i q u e e n v i r o n m e n t a l c o n d i t i o n s .
Th e s t u d i e s o f N i l s s o n a n d N i l s s o n i n S w e d e n
( 2 0 ) i m p l i c a t e t e m p e r a t u r e , s i n c e l a c t o b a c i l l i
w e r e r e c o v e r e d f r o m c e r e a l s , c l o v e r s , a n d g r a s s e s
a f t e r t h e b e g i n n i n g o f J u l y . W o e l l e r ' s s t u d i e s i n
G e r m a n y ( 2 6 ) s u g g e s t t h e i n f l u e n c e o f r a i n f a l l a n d
h u m i d i t y ; h e r e p o r t e d t h a t t h e p r e s e n c e o f l a c t o -
b a c i l l i o n c e r e a l s w a s i n f r e q u e n t o r i n l o w n u m -
b e r s d u r i n g a r e l a t i v e l y d r y y e a r , b u t g e n e r a l l y
p r e s e n t i n h i g h n u m b e r s d u r i n g a y e a r o f g r e a t e r
r a i n f a l l . W o e l l e r ' s o b s e r v a t i o n a p p e a r s t o b e m o s t
a p p l i c a b l e t o t h e s o u t h e a s t e r n p a r t o f t h e U n i t e d
S t a t e s . Th e i n f r e q u e n t o c c u r r e n c e o f l a c t o b a c i l l i
i n l o w n u m b e r s t h r o u g h o u t t h e g r o w i n g s e a s o n
1 3 2 8 APPL. M IC R O B IO L.

o
n

S
e
p
t
e
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7
,

2
0
1
3

b
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/
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d

f
r
o
m

LAC TO B AC ILLI O N PLAN TS
TAB LE 3 . F r e q u e n c y o f o c c u r r e n c e o f s p e c i e s o f La c t o b a c i l l u s o n p l a n t s
N o . o f s a m p l e s c o n t a i n i n g v a r i o u s s p e c i e s o f La c t o b a c i l l u s
p l a n t -
a r u m
1
0
5
2
2
1
1 0
1
0
1 1
1
1
3 5
2 1 . 9
b r e v i s
0
1
7
0
0
0
3
1
0
6
0
3
2 1
1 3 . 1
TAB LE 4 . O c c u r r e n c e o f s p h e r i c a l l a c t i c a c i d -
p r o d u c i n g b a c t e r i a a s c o m p a r e d w i t h o c c u r r e n c e
o f l a c t o b a c i l l i o n p l a n t s
N o . o f N o . o f s p h e r i c a l N o . o f
Ty p e o f s a m p l e
s a m p l e s
b a c t e r i a l a c t o b a c i l l i
s a p s
o b t a i n e d o b t a i n e d
G r a s s e s a . . . . . . 1 3 7 1
F o d d e r s b . . . . . . 3 6 2 5 1
Le g u m e s . . . . . . 6 3 1
V e g e t a b l e s . . . . 1 3 5 0
C e r e a l s c . . . . 4 1 1 7 1
To t a l s . . . . . . . . 1 0 9 5 7 4
Pe r c e n t 5 2 . 3 3 . 7
a
F e s c u e , o r c h a r d , a n d r y e g r a s s e s .
b
C o r n a n d s o r g h u m s u d a n .
c
B a r l e y , o a t s , r y e , a n d w h e a t .
m a k e s t h e c o n c e p t o f a t e r n a r y c y c l e , f r o m i n -
t e s t i n a l w a s t e t o p l a n t s t o r e i m p l a n t a t i o n
v i a t h e
o r a l c a v i t y , t e n a b l e .
AC K N O W LEDG M EN T
Th i s i n v e s t i g a t i o n w a s s u p p o r t e d b y Pu b l i c He a l t h
S e r v i c e g r a n t U I- 0 0 2 8 3 f r o m t h e Di v i s i o n o f En v i r o n -
m e n t a l En g i n e e r i n g a n d F o o d Pr o t e c t i o n .
LITER ATU R E C ITED
1 . Ab o - El n a g a , I. G . , a n d 0 . K a n d l e r . 1 9 6 5 . Zu r
Ta x o n o m i e d e r G a t t u n g La c t o b a c i l l u s B e i j e r -
i n c k . I. Da s S u b g e n u s S t r e p t o b a k t e r i u m
O r l a -
J e n s e n . Ze n t r . B a k t e r i o l . Pa r a s i t e n k . Ab t . II
1 1 9 : 1 - 3 6 .
2 . Ab o - El a n a g a , I. G . , a n d 0 . K a n d l e r . 1 9 6 5 . Zu r
Ta x o n o m i e d e r G a t t u n g La c t o b a c i l l u s B e i j e r -
i n c k . II. Da s S u b g e n u s
B e t a b a k t e r i u m O r l a -
f e r -
u z e n t i
0
0
0
2
1
1
1 3
0
0
4
0
2
2 3
1 4 . 4
v i r i d e s -
c e n s
0
0
1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
0 . 6
c e l l o -
b i o s u s
0
0
5
0
0
0
0
0
0
0
0
0
5
3 . 1
b u c h n e r i
0
0
0
1
0
0
0
0
0
0
0
0
1
0 . 6
c a s e i
0
0
0
0
1
1
0
0
0
1
0
0
3
1 . 9
s a l i -
v a r s u s
0
0
0
0
0
1
0
0
0
0
0
0
1
0 . 6
U n i d e n -
t i f i e d
0
0
4
2
1
1
1 2
2
0
7
0
2
3 3
2 0 . 6
J e n s e n . Ze n t r . B a k t e r i o l . Pa r a s i t e n k . Ab t . l I
1 1 9 : 1 1 7 - 1 2 9 .
3 . Al l e n , L. A. , a n d J . Ha r r i s o n . 1 9 3 6 . A c o m p a r a -
t i v e s t u d y o f l a c t o b a c i l l i f r o m g r a s s s i l a g e a n d
o t h e r s o u r c e s . An n . Ap p l . B i o l . 2 3 : 5 4 6 - 5 5 7 .
4 . Al l e n , L. A. , J . Ha r r i s o n , S . J . W a t s o n , a n d
W . S . F e r g u s o n . 1 9 3 7 . A s t u d y o f t h e c h e m i c a l
a n d b a c t e r i o l o g i c a l c h a n g e s o c c u r r i n g i n g r a s s
s i l a g e . J . Ag r . S c i . 2 7 : 2 7 1 - 2 9 3 .
5 . B a l l , R . J . , a n d W . S e l l e r s . 1 9 6 6 . Im p r o v e d m o -
t i l i t y m e d i u m . Ap p l . M i c r o b i o l . 1 4 : 6 7 0 - 6 7 3 .
6 . C u m m i n s , C . S . , a n d H. Ha r r i s . 1 9 5 6 . Th e c h e m i -
c a l c o m p o s i t i o n o f t h e c e l l w a l l i n s o m e G r a m -
p o s i t i v e b a c t e r i a a n d i t s p o s s i b l e v a l u e a s a
t a x o n o m i c c h a r a c t e r . J . G e n . M i c r o b i o l . 1 4 :
5 8 3 - 6 0 0 .
7 . Da c r e , J . C . , a n d M . E. S h a r p e . 1 9 5 6 . C a t a l a s e
p r o d u c t i o n b y l a c t o b a c i l l i . N a t u r e 1 7 8 : 7 0 0 .
8 . Da v i s , G . H. G . 1 9 5 5 . Th e c l a s s i f i c a t i o n o f l a c t o -
b a c i l l i f r o m t h e h u m a n m o u t h . J . G e n . M i c r o -
b i o l . 1 3 : 4 8 1 - 4 9 3 .
9 . Da v i s , G . H. G . 1 9 5 9 . La c t o b a c i l l i o f t h e h u m a n
m o u t h . J . Ap p l . B a c t e r i o l . 2 2 : 3 5 0 - 3 5 9 .
1 0 . Ev a n s , J . B . , a n d C . F . N i v e n , J r . 1 9 5 1 . N u t r i t i o n
o f t h e h e t e r o f e r m e n t a t i v e l a c t o b a c i l l i t h a t c a u s e
g r e e n i n g o f c u r e d m e a t p r o d u c t s . J . B a c t e r i o l .
6 5 : 5 9 9 - 6 0 3 .
1 1 . F a r b e r , L. 1 9 6 0 . S t a n d a r d m e t h o d s f o r t h e e x a m i -
n a t i o n o f w a t e r a n d w a s t e w a t e r , 1 1 t h e d . Am e r i -
c a n Pu b l i c He a l t h As s o c i a t i o n , In c . , N e w Y o r k .
1 2 . G e m m e l l , M . , a n d W . Ho d g k i s s . 1 9 6 4 . Th e
p h y s i o l o g i c a l c h a r a c t e r s a n d f l a g e l l a a r r a n g e -
m e n t o f m o t i l e h o m o f e r m e n t a t i v e l a c t o b a c i l l i .
J . G e n . M i c r o b i o l . 3 5 : 5 1 9 - 5 2 6 .
1 3 . G i b s o n , T. , a n d Y . Ab d e l - M a l e k . 1 9 4 5 . Th e f o r -
m a t i o n o f c a r b o n d i o x i d e b y l a c t i c a c i d b a c -
t e r i a a n d B a c i l l u s l i c h e n i f o r m i s a n d a c u l t u r a l
m e t h o d o f d e t e c t i n g t h e p r o c e s s . J . Da i r y R e s .
1 4 : 3 5 - 4 4 .
1 4 . K a n d l e r , 0 . 1 9 6 6 . Ta x o n o m i e u n d t e c h n o l o g i s c h e
Pl a n t s o u r c e
C e r e a l p l a n t s . . . . . . . . .
S o r g h u m , s u d a n .
C o r n . . . . . . . . . . . . . . . . .
G r e e n s . . . . . . . . . . . . . . .
O k r a . . . . . . . . . . . . . . . . .
G r e e n b e a n s . . . . . . . . . .
S q u a s h . . . . . . . . . . . . . . .
Li m a b e a n s . . . . . . . . . . .
Pe p p e r , g r e e n . . . . . . . . .
Pe a s , S o u t h e r n . . . . . . .
C u c u m b e r . . . . . . . . . . . .
Le a v e s . . . . . . . . . . . . . . .
To t a l . . . . . . . . . . . . . . . . .
Pe r c e n t . . . . . . . . . . . . . .
N o . o f
s a m p l e s
8
1 1
1 6
1 0
8
7
3 6
1 3
4
2 4
7
1 6
1 6 0
1 3 2 9 V O L. 1 6 , 1 9 6 8

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B e d e u t u n g d e r G a t t u n g La c t o b a c i l l u s B e i j e r -
i n c k . In Ar b e i t s m e t h o d e n u n d a c t u e l l e Er g e b -
n i s s e d e r t e c h n i s c h e n M i k r o b i o l o g i e . 3 r d
S y m p o s i u m d e r G e s e l l s c h a f t , B e r l i n , p . 1 3 8 -
1 6 4 .
1 5 . K r o u l i k , J . T. , L. A. B u r k e y , a n d H. G . W i s e m a n .
1 9 5 5 . Th e m i c r o b i a l p o p u l a t i o n s o f t h e g r e e n
p l a n t a n d o f t h e c u t f o r a g e p r i o r t o e n s i l i n g .
J . Da i r y S c i . 3 8 : 2 5 6 - 2 6 2 .
1 6 . Le r c h e , M . , a n d G . R e u t e r . 1 9 6 2 . Da s V o r k o m -
m e n a e r o b w a c h s e n d e r g r a m p o s i t i v e S t a b c h e n
d e s G e n u s La c t o b a c i l l u s B e i j e r i n c k i m Da r m -
h a l d e r w a c h s e n e r M e n s c h e n . Ze n t r . B a k t e r i o l .
Pa r a s i t e n k . Ab t . I O r i g . 1 8 5 : 4 4 6 - 4 8 1 .
1 7 . M a n , J . C . d e . , M . R o g o s a , a n d M . E. S h a r p e .
1 9 6 0 . A m e d i u m f o r t h e c u l t i v a t i o n o f l a c t o -
b a c i l l i . J . Ap p l . B a c t e r i o l . 2 3 : 1 3 0 - 1 3 5 .
1 8 . M u n d t , J . 0 . , E. J . An a n d a m , a n d I. E. M c C a r t y .
1 9 6 6 . S t r e p t o c o c c e a e i n t h e a t m o s p h e r e o f
p l a n t s p r o c e s s i n g v e g e t a b l e s f o r f r e e z i n g .
He a l t h La b . S c i . 3 : 2 0 7 - 2 1 3 .
1 9 . M u n d t , J . O . , a n d J . L. Ha m m e r . 1 9 6 6 . S u p p r e s -
s i o n o f Le u c o n o s t o c m e s e n t e r o i d e s d u r i n g i s o l a -
t i o n o f l a c t o b a c i l l i . Ap p l . M i c r o b i o l . 1 4 : 1 0 4 4 .
2 0 . N i l s s o n , G . , a n d P. E. N i l s s o n . 1 9 5 6 . Th e m i c r o -
N ] D HAM M ER APPL. M Ic R O B IO L.
f l o r a o n t h e s u r f a c e o f s o m e f o d d e r p l a n t s a t
d i f f e r e n t s t a g e s o f m a t u r i t y . Ar c h . M i k r o b i o l .
2 4 : 4 1 2 - 4 2 2 .
2 1 . R o g o s a , M . , a n d M . E. S h a r p e . 1 9 5 9 . An a p -
p r o a c h t o t h e c l a s s i f i c a t i o n o f t h e l a c t o b a c i l l i .
J . Ap p l . B a c t e r i o l . 2 2 : 3 2 9 - 3 4 0 .
2 2 . R o g o s a , M . , R . F . W i s e m a n , J . A. M i t c h e l l ,
M . N . Di s r a e l y , a n d A. J . B e a m a n . 1 9 5 3 .
S p e c i e s d i f f e r e n t i a t i o n o f o r a l l a c t o b a c i l l i f r o m
m a n i n c l u d i n g d e s c r i p t i o n s o f La c t o b a c i l l u s
s a l i v a r i u s n o v . s p e c . a n d La c t o b a c i l l u s c e l l o b i o -
s u s n o v . s p e c . J . B a c t e r i o l . 6 5 : 6 8 1 - 6 9 9 .
2 3 . S h a r p e , M . E. 1 9 6 0 . Ta x o n o m y o f t h e l a c t o -
b a c i l l i . Da i r y S c i e n c e Ab s t r . 2 4 : 1 0 9 - 1 1 8 .
2 4 . S t i r l i n g , A. C . , a n d R . J . W h i t t e n b u r y . 1 9 6 3 .
S o u r c e s o f l a c t i c a c i d b a c t e r i a o c c u r r i n g i n
s i l a g e . J . Ap p l . B a c t e r i o l . 2 6 : 8 6 - 9 0 .
2 5 . Tu g g l e , J . M . , J . B . W h i t e , J . H. Lo m a x , a n d
H. E. Du n c a n . 1 9 5 8 . A s i m p l i f i e d m e t h o d o f
m a i n t a i n i n g b a c t e r i a i n s t o c k c u l t u r e . M e d .
Te c h n o l . B u l l . 9 : 2 1 5 - 2 1 6 .
2 6 . W o e l l e r , H. 1 9 2 9 . U e b e r d i e e p i p h y t i s c h e B a k -
t e r i e n f l o r a g e s u n d e r g r u e n e r Pf l a n z e n . Ze n t r .
B a k t e r i o l . Pa r a s i t e n k . Ab t . II 7 9 : 1 7 3 - 1 7 7 .

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