Eficincia de um kit de ELISA na

deteco e quantificao de aflatoxina

M1 em leite e investigao da
ocorrncia no estado de Minas Gerais1
Scheilla V. C. SOUZA2,3, Eugnia A. VARGAS4,
Roberto G. JUNQUEIRA3,*

RESUMO
Procedimentos para validao intralaboratorial
de kits de ELISA foram adotados na verificao
da eficincia de um kit para deteco e
quantificao de aflatoxina M1 em leite. Foram
realizados ensaios com solues padres
fornecidas pelo kit, amostras artificialmente
contaminadas e amostras naturalmente
contaminadas. Os valores mdios de
recuperao obtidos para os padres do kit
apresentaram-se entre 85,6 e 114,8%, com
valores de coeficiente de variao entre 11,6 e
23,1%. Nos ensaios com amostras
artificialmente contaminadas, foi definida uma

faixa tima de trabalho para anlises

quantitativas entre 0,019 e 0,090g/L. A
presena de aflatoxina M1 em 110 amostras de
leite do estado de Minas Gerais foi investigada.
Cinco das 27 amostras positivas na triagem por
ELISA foram confirmadas por cromatografia
em camada delgada.
Palavras-chave: leite, aflatoxina M1,
validao, ELISA.
SUMMARY
Efficiency of an ELISA kit on the detection
and quantification of aflatoxin M1 in milk
and it's occurrence in the state of Minas
Gerais. Procedures for intralaboratory
validation of an ELISA kit were adopted to
verify its efficiency in aflatoxin M1 detection
and quantification in milk. Assays were
accomplished with standard solutions provided
with the kit, spiked samples and naturally
contaminated samples. The mean recovery
values obtained for the kit standard solutions
were between 85.6 and 114.8%, with
coefficient of variation ranging from 11.6 to
23.1%. Working with spiked samples, a
concentration range for quantitative analysis
(0.019 to 0.090g/L) was defined. The
occurrence of aflatoxin M1 in 110 milk samples
from the State of Minas Gerais was
investigated. Five of the 27 positive samples in

the screening for ELISA were confirmed by

thin layer chromatography.
Keywords: milk, aflatoxin M1, validation,
ELISA.

1 INTRODUO
A aflatoxina M1 o principal metablito hidroxilado da
aflatoxina B1 presente em leite de animais que ingeriram rao
contaminada por B1 [11]. Estas toxinas apresentam potencial
carcinognico e genotxico e toxicidades semelhantes [24].
A possibilidade de contaminao do leite e de produtos lcteos
com aflatoxina M1 uma questo de sade pblica,
principalmente por serem produtos amplamente consumidos
pelo homem e constiturem a base da alimentao infantil [3].
Pesquisas sobre os nveis de contaminao do leite existente
no mercado com aflatoxina M1 tm sido realizadas nos pases
mais desenvolvidos, objetivando a verificao da extenso da
contaminao e uma maior conscientizao. Frente aos
resultados obtidos, cada pas tem tentado definir limites
mximos de tolerncia [3], sendo considerados ainda fatores
polticos e econmicos [31]. A Unio Europia adotou o limite
de tolerncia mximo de 0,05g/L [4]. O regulamento tcnico
do MERCOSUL sobre limites mximos de aflatoxinas
estabeleceu os nveis de 0,5g/L e 5,0g/kg para leite fluido e
em p, respectivamente [19], sendo estes os limites
internalizados pelo Brasil [9].
Pesquisas sobre a incidncia de aflatoxina M1 em leite e

produtos lcteos j foram realizadas no Brasil. PRADO et al.

[23] verificaram contaminao em duas das 38 amostras de
leite cru do Estado de Minas Gerais, no detectando aflatoxina
M1 em 60 amostras de leite em p analisadas. MALLMANN
et al. [17] obtiveram resultados positivos para 11 das 240
amostras de leite cru analisadas no Estado do Rio Grande do
Sul. SABINO et al. [25] detectaram contaminao em uma das
100 amostras de leite pasteurizado e em nove das 50 amostras
de leite cru analisadas no Estado de So Paulo. Entretanto,
existe ainda uma lacuna de informaes sobre a aflatoxina M1,
tanto em relao metodologia quanto sua ocorrncia [28].
Como o leite existente no comrcio uma mistura de leites de
diferentes procedncias, os nveis de aflatoxina M1 so, muitas
vezes, inferiores aos limites de deteco dos mtodos de
anlise utilizados [25, 31]. De acordo com VISCONTI et al.
[33], a maioria dos resultados negativos obtidos em estudos
sobre incidncia de aflatoxina M1 pode ser atribuda baixa
sensibilidade dos mtodos analticos empregados. Portanto,
um controle eficiente da aflatoxina M1 em leite requer
mtodos analticos de elevada sensibilidade, especificidade,
preciso e exatido, alm de rapidez e facilidade [7]. Segundo
SYLOS & RODRIGUEZ AMAYA [28], estudos relativos
metodologias para determinao de micotoxinas em alimentos
so necessrios e urgentes, visando a confiabilidade dos
resultados relativos ocorrncia.
Os mtodos para determinao de aflatoxina M1 em leite
utilizam, em sua maioria, extrao com clorofrmio e
purificao cromatogrfica. Tanto a cromatografia em camada
delgada (CCD) como a cromatografia lqida de alta eficincia
(CLAE) constituem as tcnicas oficiais e convencionais para
separao, deteco e quantificao de aflatoxina M1 em

extratos de leite [32].

A dcada de 80 trouxe avanos em conhecimentos relativos a
biotecnologia e aos mtodos de automao para deteco de
contaminantes em alimentos, destacando-se, no caso das
micotoxinas, as tcnicas imunoenzimticas [22]. Estas
tcnicas, que constituem imunoensaios os quais envolvem
interaes entre micotoxinas e anticorpos especficos contra
homlogos de micotoxinas, tm sido utilizadas principalmente
em triagens para determinao destes contaminantes. Os dois
tipos de imunoensaios mais utilizados em anlises de
micotoxinas so ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)
e radioimunoensaios [12, 15].
Na determinao de aflatoxinas por ELISA pode-se contar
com elevada sensibilidade [5] e, muitas vezes, no so
necessrias as etapas de extrao e purificao [2, 6], o que
confere rapidez e simplicidade tcnica [22]. Existem,
entretanto, desvantagens como o prazo de validade limitado e
a possibilidade de resultados falso positivos devido s reaes
cruzadas [29], que podem ser minimizadas pela utilizao de
anticorpos monoclonais de boa preparao [22]. Para
monitoramentos de rotina tm-se dado preferncia a estas
tcnicas simplificadas em substituio s convencionais, que
so mais complexas e demoradas [30].
De qualquer forma, independente da tcnica analtica
empregada no mtodo, procedimentos de validao devem ser
adotados, permitindo avaliar a eficincia de cada metodologia,
conhecendo seu potencial aplicativo e limitaes.
O objetivo do presente trabalho foi avaliar a eficincia de um
kit comercial de ELISA na determinao e quantificao de
aflatoxina M1 em leite e investigar a ocorrncia de
contaminao por esta micotoxina em amostras de leite
produzido no Estado de Minas Gerais.

2 MATERIAL E MTODOS
2.1 Kit de ELISA
O kit avaliado foi da marca Ridascreen, produzido pela
empresa R-Biopharm, o qual foi mantido embalado, protegido
da luz e sob refrigerao at a execuo dos ensaios,
observando o prazo de validade.
2.2 Padres
Os padres de aflatoxina M1 utilizados foram da marca Sigma
(St. Louis, MO), mantidos sob temperatura de congelamento,
devidamente protegidos da luz e vedados, at o momento do
preparo das solues. As solues padres foram preparadas e
padronizadas conforme descrito pela AOAC [1].
2.3 Amostras artificialmente contaminadas
Foram colhidas amostras de leite cru, aleatoriamente, aps
ordenhas manuais dirias, na fazenda experimental do
Ministrio da Agricultura e do Abastecimento/Escola de
Veterinria da UFMG. Estas amostras foram artificialmente
contaminadas com quantidades conhecidas de solues
padres de aflatoxina M1.
2.4 Amostras do Estado de Minas Gerais
No perodo de 1996 a 1997, foram colhidas 110 amostras de
leite do estado de Minas Gerais, sendo recebidas 48 em 1996 e
62 em 1997, incluindo leite tipos A (3), B (12), C (82),
vitaminado (6), esterilizado (UHT) integral (5) e desnatado
(2). A colheita foi realizada sob superviso do Servio de
Inspeo Federal (SIF) do Ministrio da Agricultura e do
Abastecimento.
Para amostragem representativa do leite produzido no Estado
de Minas Gerais utilizou-se a diviso territorial (oito
mesorregies) e produo leiteira publicados pela Fundao
Instituto Brasileiro de Geografia e Estatstica IBGE [13, 14].

2.5 Experimental
Foram utilizados kits de um mesmo lote, sendo um para os
ensaios iniciais de validao, empregando os padres do kit e
amostras artificialmente contaminadas, e trs para anlises das
amostras do Estado de Minas Gerais.
Alquotas de 10 mL das amostras de leite, devidamente
homogeneizadas, foram pipetadas para centrifugao a 3,5 x g,
por 10 minutos a 10oC, objetivando remoo da camada de
gordura. Os demais procedimentos analticos foram realizados
de acordo com indicaes do fabricante, contidas no manual
que acompanha o kit. As medidas de absorbncia foram
realizadas, contra branco de ar, empregando leitora Sigma
Diagnostics EIA Multi-well Reader, com filtro de 450nm.
2.5.1 - Ensaios de recuperao
Foi feita uma curva de calibrao aplicando-se cada um dos
seis padres enviados (0,0; 0,005; 0,010; 0,020; 0,040 e
0,080g/L) em oito diferentes microcavidades. Os valores de
absorbncia obtidos para os padres foram multiplicados por
100 e divididos pela mdia dos valores determinados para o
padro 0,0g/L, calculando-se a porcentagem de absoro. A
curva de calibrao foi determinada por anlise de regresso,
relacionando o logaritmo natural da concentrao (eixo das
abcissas) com a porcentagem de absoro (eixo das
ordenadas).
Ensaios de recuperao foram realizados utilizando amostras
artificialmente contaminadas, em nveis dentro e acima do
intervalo da curva fornecida pelo fabricante do kit (0,0097;
0,019; 0,050; 0,058; 0,070; 0,078; 0,090; 0,200 e 0,970g/L).
Cada amostra artificialmente contaminada foi aplicada em
cinco diferentes microcavidades. Em paralelo foram
analisados brancos da amostra de leite utilizada, em duplicata,
para verificao da ausncia de contaminao prvia.

Com base nos valores de concentrao obtidos pela equao

da curva, foram calculados os valores de recuperao e
coeficiente de variao para os padres do kit e amostras
artificialmente contaminadas.
2.5.2 - Anlise das amostras do Estado de Minas
Gerais
As amostras de leite do Estado de Minas Gerais, o ensaio
controle (constitudo de um branco e uma amostra
artificialmente contaminada) e os seis padres do kit foram
aplicados em duplicata.
As amostras que apresentaram resultados positivos na triagem
tiveram seus resultados confirmados por uma metodologia de
CCD, baseada nas metodologias descritas pela AOAC [1] e
KAMIMURA [16], envolvendo extrao com clorofrmio,
purificao em cartuchos de florisil e quantificao
densitomtrica [26]. As amostras positivas por CCD foram
analisadas por cromatografia bidimensional [1], para nova
confirmao. Nestas anlises confirmatrias tambm foi
realizado um ensaio controle constitudo de branco e amostra
artificialmente contaminada.
2.5.3 - Valores de referncia
Os valores adotados como referncia para avaliao da
exatido e preciso foram os estabelecidos CODEX [28] e
internalizados pelo MERCOSUL [18], descritos na Tabela 1.

3 RESULTADOS E DISCUSSO
A curva de calibrao para aflatoxina M1, representada na
Figura 1, indica linearidade da resposta com coeficiente de
correlao de 0,9494. Os valores mdios de recuperao para
cada padro e os coeficientes de variao entre os resultados
obtidos para um mesmo padro aplicado em diferentes
microcavidades esto descritos na Tabela 2. Os valores de
recuperao mdios apresentaram-se entre 85,6 e 114,8% e os
de CV entre 11,6 e 23,1%, todos dentro dos intervalos
estabelecidos como aceitveis (Tabela 1). Na tcnica de
ELISA a preciso, determinada pelos coeficientes de variao,
dependente de fatores como erros indeterminados no
procedimento analtico, preparo de reagentes, volumes
aplicados, homogeneizao e diferenas entre as
microcavidades ou conjuntos, devidas cobertura irregular
com anticorpos [34].

O estudo com amostras artificialmente contaminadas permitiu

verificar a sensibilidade e eficincia qualitativa do kit, j que
todas as amostras artificialmente contaminadas apresentaram
resultados positivos, mesmo aquelas com nveis
correspondentes a 0,0097g/L. Foram confirmadas as

informaes do fabricante de que o limite de deteco do

mtodo menor que 0,010g/L. De acordo com PARK et al.
[21] o mnimo de quantificao para o ensaio de ELISA pode
ser estimado assumindo uma variao de 0,1 unidades de
absorbncia abaixo do valor mdio obtido para o padro zero.
Portanto, aplicando o valor de A450 = 0,853 curva de
calibrao, obteve-se o limite de quantificao terico de
0,0063g/L.
Nos ensaios com amostras artificialmente contaminadas nos
nveis 0,0097; 0,019; 0,050; 0,058; 0,070; 0,078; 0,090; 0,200
e 0,970g/L foi determinada a faixa de linearidade da resposta,
considerando-se interferncias da matriz, entre 0,019 e
0,090g/L. Para os nveis de contaminao 0,0097; 0,200 e
0,970g/L, os valores de recuperao obtidos foram 37,0; 35,9
e 7,5% respectivamente, fora dos valores considerados
aceitveis (Tabela 1) e significativamente menores (p < 0,05;
teste de Duncan [32]) que os obtidos para os outros nveis
estudados. Para 0,019; 0,050; 0,058; 0,070; 0,078 e 0,090g/L
os valores de recuperao apresentaram-se dentro dos
intervalos estabelecidos como aceitveis (Tabela 1), variando
de 70,0 a 104,9% (Figura 2). Quando analisadas amostras
contaminadas entre 0,200 e 0,970g/L valores de recuperao
muito baixos foram obtidos. Deve-se ressaltar que o limite
mximo de tolerncia estabelecido pelo MERCOSUL [6]
encontra-se nesta faixa, o que demonstra a necessidade de
confirmao, repetindo-se o teste de ELISA com amostras
diludas ou empregando-se outra tcnica analtica, sempre que
resultados positivos forem obtidos.

Das 110 amostras do Estado de Minas Gerais analisadas, 27

apresentaram resultados positivos por ELISA, correspondendo
a 24,5% do total das amostras analisadas. Foram considerados
positivos somente os resultados superiores ao limite de
quantificao terico, que foi de 0,0063g/L. Somente 5 das
27 amostras que apresentaram resultados positivos na triagem
foram confirmadas pelo mtodo cromatogrfico [26] e pela
anlise bidimensional (Tabela 3). A proporo de amostras
destinadas confirmao da partida analisada, 24,5%, indica
especificidade para a aplicao do referido kit, entretanto,
somente 18,5% das amostras positivas por ELISA tiveram
seus resultados confirmados por CCD. A no deteco da
contaminao nas outras amostras pode ser atribuda
diferena entre os limites de quantificao das duas tcnicas e

 reaes cruzadas com outras aflatoxinas ou molculas

semelhantes. Esta possibilidade de resultados presuntivos
positivos reafirmam a necessidade de confirmao dos
resultados aps execuo do ensaio de ELISA.

Das cinco amostras positivas duas eram da mesorregio

Noroeste, duas do Sul/Sudoeste/Campo das Vertentes e uma
da Metropolitana de Belo Horizonte. Em relao ao tipo de
leite, foram positivas duas do tipo C, duas de leite vitaminado
e uma do tipo B. Estas cinco amostras apresentaram nveis de
contaminao abaixo de 0,5g/L, limite estabelecido pelo
MERCOSUL [19], embora em quatro delas tenha sido
verificada uma contaminao superior permitida pela Unio
Europia, 0,05g/L [4]. Nos procedimentos de confirmao
por CCD, os resultados de recuperao obtidos para o controle
foram de 90,0 e 86,9% para as quantificaes visual e
densitomtrica respectivamente, entretanto, os valores
apresentados no foram corrigidos.
No foram observadas diferenas significativas (p > 0,05; teste

de t pareado) entre os resultados de recuperao obtidos para

as tcnicas de CCD quantificao densitomtrica e ELISA
(Tabela 3). SABINO et al. [27] observaram concordncia
entre as tcnicas CCD e ELISA quanto deteco de
aflatoxina B1. OLIVEIRA et al. [20] observaram correlao
entre os resultados obtidos por CCD e ELISA na quantificao
de aflatoxina B1 em milho.

4 CONCLUSES
O kit de ELISA para anlise de aflatoxina M1 em leite
empregado demonstrou eficincia qualitativa, sensibilidade
elevada e especificidade considervel, caractersticas
satisfatrias e esperadas para este tipo tcnica. A linearidade
da resposta do kit foi observada pela avaliao dos valores de
coeficientes de correlao obtidos para as curvas de
calibrao. Com base nos parmetros de exatido
(recuperao) e preciso (coeficiente de variao) foi
verificada eficincia quantitativa do kit na faixa de 0,019 a
0,090g/L. Nos nveis de contaminao pesquisados entre
0,200 e 0,970g/L esta eficincia no observada. Portanto,
para avaliaes quantitativas em amostras de contaminao
desconhecida h necessidade de um procedimento
confirmatrio, sempre que resultados positivos forem obtidos.
Das cento e dez amostras de leite analisadas no estado de
Minas Gerais cinco apresentaram contaminao por aflatoxina
M1. Todas obtiveram nveis de contaminao inferiores ao
determinado pelo MERCOSUL e quatro continham nveis de
toxina superiores ao estabelecido pela Unio Europia.

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Recebido para publicao em 07/05/99. Aceito para

publicao em 26/01/2000.
2 Setor de Cromatografia Gasosa e Lqida, Laboratrio
Regional de Apoio Animal (LARA/MG), Ministrio da
Agricultura e do Abastecimento (MAAb), Tel. (31) 6613000,
Fax (31) 6612383, e-mail laramg@defesaagropecuaria.gov.br
3 Departamento de Alimentos, Faculdade de Farmcia
(FAFAR), Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG),
Tel. (31) 3397634, Fax (31) 3397666, e-mail
junkeira@dedalus.lcc.ufmg.br
4 Laboratrio de Micotoxinas, Laboratrio Regional de Apoio
Vegetal (LAV/MG), Ministrio da Agricultura e do
Abastecimento (MAAb), Tel. (31) 6613000, Fax (31) 6612383,
e-mail gena@cdlnet.com.br
* A quem a correspondncia deve ser enviada.