TESTE PARA ENZIMAS NADH

Procedimento Tcnico manual

Espectrofotmetro UV com cubeta termostatizada;

Tubos e Pipetas;

Cronmetro.

A - Condies de Reao
Leitura: Comprimento de onda 340 nm
Temperatura: ??C (VOC DEFINE)
Tipo de Reao: Cintica contnua decrescente.

Reagente de Trabalho
Amostra
Volume final

1000 l
100 L
1100 L

1 Tenha mo todos os reagentes preparados

2 - Homogeneizar e inserir a cubeta no porta-cubetas termostatizado na
temperatura de ensaio desejada e acionar o cronmetro.
3 - Aps 1 minuto, fazer a leitura da absorbncia inicial (A0).
4 Adicionar o NADH
5 - Fazer novas leituras de absorbncia, aps exatamente 1, 2 e 3
minutos ou a cada 10 segundos (esse tempo voc ter que ajustar que varia
em funo da atividade da enzima no material e da concentrao da enzima no
meio de reao)
6 - As diferenas entre as absorbncias (A/minuto mdio) devem ser
praticamente iguais, indicando a linearidade do mtodo.
6 - Calcular o decrscimo de absorbncia mdio por minuto (A/minuto
mdio).
Obs: o tempo pode variar de minuto ou segundo.

Obs: considerando que o coeficiente de absoro milimolar do NADH em 340

nm 6, 3, deduz-se a seguinte frmula para calcular a atividade enzimtica:
U/L de enzima em 340 nm = A/minuto mdio x 1746
Sendo que A/min mdio = Variao mdia da absorbncia por minuto
O fator 1746 calculado com base nas condies da reao cintica
contnua de manuteno de certa proporcionalidade Tempo X Consumo do
Substrato. Esse fator deve ser recalculado sempre que se fizer qualquer
modificao nos parmetros da reao.
Para clculo do fator:
Exemplo:
A/minuto do teste = 0,0285
Atividade em U/L= A teste X 1746
Atividade = 0,0285 X 1746 = 50 U/L

Clculo do Fator:
Fator = VT X 1000/ X Va X d
Exemplo:
Vt = volume total do ensaio (1100 L)
Va = volume da amostra (100 L)
1000 = converso de U/mL para U/L
d = espessura da soluo/cubeta (1 cm)
= Absortividade milimolar do NADH em 340nm = 6,3
Fator = 1100 X 1000/6,3 X 100 X 1 = 1746