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Marcadores Moleculares
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Marcadores Moleculares
Resumo
Marcadores moleculares so amplamente utilizados para estudos de gentica
populacional, mapeamento e anlises de similaridade e ainda, distncia gentica. Alm
disso possvel, com
estes,
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Tamanha a importncia dos inmeros estudos desenvolvidos a respeito desses
marcadores, que existem diversos bancos de dados especficos para diferentes tipos de
marcados. A disponibilidade dessas ferramentas acrescenta e facilita exponencialmente
o andamento dessas pesquisas em todo o mundo.
O objetivo principal deste trabalho de reviso elucidar de forma completa e
simplificada as diferentes tcnicas utilizadas para analisar similaridades entre genomas,
com base nos marcadores moleculares, e caracterizar os detalhes incomuns que cada
uma delas apresenta, alm de suas vantagens e aplicaes particulares.
Diferentes Tcnicas de Anlise de Polimorfismos
Single Nucleotide Polymorphism (SNP Cho et al., 1999) Os marcadores do
tipo Polimorfismo de Base nica se baseiam nas alteraes mais elementares da
molcula de DNA (Fig. 1), isto , mutaes em apenas uma das bases nitrogenadas da
cadeia (Adenina, Citosina, Timina e Guanina). As mutaes mais recorrentes so as do
tipo transio, em que h troca de purina por outra purina (A <-> G) ou de uma
pirimidina por outra pirimidina (C <-> T). As transverses so menos freqentes e
acontecem quando h troca de uma purina por uma pirimidina, ou vice-versa (C <-> G,
C <->A, T <-> G ou T <-> A). Os marcadores SNP so geralmente bi-allicos, ou seja,
normalmente so encontrados apenas dois variantes em uma espcie (Ex: um alelo
corresponde a um par de bases A/T e o outro a um G/C). Os SNPs podem ocorrer em
regies codificadoras ou com funo regulatria, porm, na maior parte das vezes so
encontrados em espaos intergnicos, sem funo determinada.
Os SNPs so a base molecular de vrios tipos de marcadores moleculares que
foram desenvolvidos com diferentes metodologias ao longo das ltimas trs dcadas,
como RFLPs, RAPDs, AFLPs, entre outros.
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Figura 1: representao de um
polimorfismo de base nica
(SNP).
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Figuras 2 e 3: esquematizao de
mutao no-sinnima.
Figura 4: esquematizao de
mutao silenciosa.
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Os marcadores SNPs so utilizados para mapeamento gentico, genotipagem,
alm de serem a grande aposta para a aplicao da medicina individualizada. No
entanto, sua aplicao mais relevante a utilizao na comparao de genomas de
coortes.
As tcnicas de biologia molecular com utilizao dos SNPs podem se basear em
sequenciamento e comparao de alinhamentos de sequncias. No entanto, essas
tcnicas, alm de laboriosas, exigem que haja uma sequncia consenso, a qual permita a
comparao. Para isso necessrio que o genoma do organismo estudado j tenha sido
sequenciado. A genotipagem de SNPs pode tambm ser feita pela utilizao de Real
Time PCR, microarranjos cuja principal limitao a dificuldade de padronizao ,
equipamentos de espectrometria de massa (MALD-TOF) ou de metodologias para
genotipar de dezenas de milhares at um milho de SNPs em um nico ensaio
(Affymetrix/ParAllele, Illumina IScan).
Essas vrias tecnologias vem sendo desenvolvidas para tentar superar as
barreiras descritas em realao aplicao da tcnica ao longo dos anos como tcnicas
modernas de sequenciamento, por exemplo , permitindo mais rapidez, praticidade e
menos custo na aplicao do mtodo. Entretanto, esta ainda uma rea em
desenvolvimento, carente de novas tecnologias que garantam a otimizao dos
processos.
Single Strand Conformation Polymorphism (SSCP Orita, M., et al.,1989)
uma tcnica capaz de diferenciar segmentos de DNA de comprimentos idnticos,
atravs da induo de mudanas nas sequncias, as quais so feitas por algumas
condies experimentais. Com isso, possvel distinguir por eletroforese em gel de
poliacrilamida no-desnaturante marcada com nitrato de prata (Figura 6), as diferentes
sequncias pelas suas diferenas conformacionais e a partir da identificar mutaes ou
polimorfismos, nestas mesmas sequncias.
Esta tcnica foi descrita inicialmente com o intuito de analisar apenas molculas
de DNA, porm possvel tambm obter uma boa analise de molculas de RNA, pois
esta ultima, tambm possui estruturas secundrias com diferenas conformacionais
possibilitando assim a aplicao deste tipo de marcador molecular. Porm importante
salientar que aps a deteco pela SSCP necessrio fazer um sequenciamento para
confirmar os resultados obtidos.
Centro de Desenvolvimento Tecnolgico - UFPel
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Esta tcnica foi testada por Peters et al., em 2000, para analisar a variabilidade
das populaes bacterianas, sendo que este pesquisador e sua equipe chegaram a um
resultado positivo, afirmando que a tcnica era potencialmente satisfatria para este
objetivo.
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sendo que a alta pureza desse DNA amostral um fator essencial para o sucesso da
digesto total (necessrio um excelente mtodo de extrao e quantificao de DNA).
O processo de digesto pela combinao das enzimas de corte raro e de corte
frequente vai gerar 3 tipos diferentes de fragmentos, que so: os fragmentos de corte
frequente/frequente, frequente/raro e raro/raro; sendo que haver uma predominncia
dos fragmentos de corte frequente/frequente, se comparada com os fragmentos de corte
raro/raro, porm j os fragmentos de corte frequente/raro so preferencialmente
amplificados pois h uma baixa eficincia na hibridizao dos inciadores da enzima de
corte frequente comparando-a com a hibridizao dos inciadores da enzima de corte
raro, somado ao fato de que os fragmentos de corte frequente/frequente possuem uma
extremidade terminal invertida (amplificado por um nico iniciador) o que vai favorecer
a formao de loop, sendo que este ultimo competir com os inciadores pelo
anelamento.
As enzimas de restrio deixam extremidades coesivas de sequncia conhecida,
aps a clivagem do DNA, sendo com isso possvel a construo de sequncias
nucleotdicas fita dupla (adaptadores) que iro se ligar s extremidades dos fragmentos
de restrio. Partindo do conhecimento das sequncias dos adaptadores e do stio de
restrio possvel construir iniciadores especficos para estas sequncias e com isso
pr-amplificar os fragmentos de restrio (Figura 5). Os primers, por sua vez, so
construdos a partir de uma sequncia complementar ao do adaptador seguida de outra
sequncia especifica para o stio de restrio da enzima e ainda uma extenso de
nucleotdeos seletivos na regio 3' terminal. O resultado da digesto e da pramplificao podem ser verificados a partir de uma eletroforese em gel de agarose 1%
(p/v), sendo esta verificao importante, pois evita que possveis erros na digesto ou na
pr-amplificao sejam detectados apenas no final de todo procedimento, j a anlise
final dos resultados feita em gel de poliacrilamida desnaturante corado com nitrato de
prata (Figura 6).
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A tcnica de utilizao de SCARs como marcadores moleculares uma sada
para o problema de baixa reprodutibilidade enfrentado no emprego do mtodo de
RAPD-PCR. Como ilustram as figuras 8 e 9, os fragmentos submetidos tcnica de
RAPD so clonados e sequenciados, e, ento, so desenhados primers maiores (fig. 9A),
os quais justamente por conterem sequncias mais longas sero provavelmente
especficos para o locus de interesse, e espera-se que no amplifiquem outros loci.
Entretanto, pode ser que esses primers amplifiquem os dois alelos (fig. 9B), e ser
possvel detectar polimorfismos internos e esses primers, os quais so polimorfismos
entre os dois alelos (fig. 9C). Caso esses polimorfismos possam ser identificados, ento
deve ser possvel sintetizar novos primers, os quais amplificaro uma regio de apenas
um dos alelos (fig. 9D). esse novo marcador baseado em PCR que denominado
SCAR.
Figuras 8 e 9: esquematizaes do
procedimento SCAR.
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Restriction Fragment Length Polymorphism DNA (RFLP - Grodzicker et al.,
1974) este polimorfismo, derivado de mutao pontual, insero ou deleo, uma
diferena em sequncias de DNA homlogas que pode ser detectada pela presena de
fragmentos com diferentes comprimentos, aps a digesto das amostras de DNA em
questo com endonucleases de restrio especficas. Enquanto marcador molecular, o
RFLP especfico para cada combinao clone/enzima de restrio. A maioria dos
marcadores RFLP alm de serem altamente locus-especficos so codominantes, isto ,
ambas as amostras de alelos em heterozigose sero detectadas.
Um ou mais fragmentos da amostra de DNA digerida, depois de separados por
eletroforese, hibridizam-se sonda de RFLP, revelando, assim, um padro nico de
bandas, caracterstico de um gentipo especfico, num locus especfico. Essa sonda se
constitui de uma sequncia marcada de DNA (geralmente uma cpia curta, simples ou
de baixo peso de DNA genmico ou clones de cDNA), complementar aos fragmentos
hbridos.
A anlise de RFLP atravs de sondas frenquentemente utilizada em
mapeamento gentico e na anlise de variaes (genotipagem, forense, testes de
paternidade, diagnstico de doenas hereditrias, etc). Vale ressaltar que a preciso da
tcnica muito maior para seqncias que ocorrem uma s vez no genoma,
denominadas de cpia nica (single copy).
A tcnica funciona da seguinte maneira (Fig. 10): 1) a amostra de DNA
extrada da clula e purificada, para ento ser 2) clivada por enzimas de restrio. Em
seguida, 3) os fragmentos resultantes da clivagem so separados por eletroforese e 4)
transferidos para a membrana (tcnica chamada Southern Blot) marcada com as sondas
de DNA radioativo, as quais 5) se ligaro a fragmentos complementares. A ltima etapa,
chamada 6) autoradiografia, trata-se da exposio da membrana hibridizada com a
sonda radioativa a um filme de Raio X, que queimado somente onde houve as
hibridizaes. A sonda, sendo radioativa, emite radiao que pode ser detectada por
filmes de Raio X. Levando-se em considerao que a sonda s hibridiza com
fragmentos complementares, pode-se afirmar que h preciso na tcnica. Os resultados
dos padres radioativos sero, finalmente, comparados com padres conhecidos.
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uma com sete nucleotdeos e todas com sequncias muito similares, indicando uma
origem gentica comum.
Em 1985, Alec. J. Jeffreys encontrou regies menores contendo seqncias de
DNA repetitivo, as quais chamou de minisatlites, que consistiam de repeties de 15
ou mais pares de bases. Jeffreys e seus colegas tambm determinaram que o nmero de
repeties de um dado minisatlite diferia entre indivduos, um procedimento que levou
a inveno posterior da tcnica de DNA-fingerprinting.
Minissatlites ou Variable Number of Tandem Repeats (VNTR Jeffreys, 1985)
as seqncias minissatlites variam de 12 a 100 pares de base em comprimento e so
encontradas em conjuntos contendo cerca de 3.000 repeties. Assim, estas seqncias
ocupam seguimentos consideravelmente mais curtos do genoma do que as sequncias
satlites, por exemplo, TTAGGG TTAGGG TTAGGG. Por uma razo desconhecida, os
minissatlites tendem a ser instveis, e o nmero de cpias de uma sequncia particular
frequentemente aumenta ou diminui de uma gerao outra. Cada repetio em tandem
se constitui em um loco de minissatlite cujos alelos se diferenciam por variaes no
tamanho total do minissatlite Como resultado, o comprimento de um lcus particular
de minissatlite altamente varivel na populao, mesmo entre membros da mesma
famlia. Como eles so to polimrficos, as sequncias de minissatlites so utilizadas
como marcador gentico para identificar indivduos em casos criminais ou de
paternidade atravs da tcnica de identificao individual pelo DNA (DNA
fingerprinting). Mudanas nas sequncias de minissatlites podem alterar a expresso
(transcrio) de genes vizinhos, o que pode ter conseqncias srias (por exemplo,
mudanas de certos loci de minissatlites tm sido apontadas como causadoras de
cncer e diabetes. A sua utilizao nas tcnicas moleculares permite seguir taxas de
mutao, localizar regies especficas para splicing alternativo, regulao na expresso
gnica.
No fim dos anos 80s, um grupo de pesquisadores isolou satlites compostos de
repeties de bases ainda menores e chamaram essas repeties de microssatlites. Um
microssatlite remanescente de um minissatlite, exceto se as unidades repetidas
estiverem menores.
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Microssatlites ou short tandem repeats (STRs Weber et al., 1990) tambm
chamados sequncias simples repetitivas (SSRs do ingls, simple sequence repeats),
os microssatlites consistem em motivos de sequncias de 1 a 6 pares de bases que se
repetem em tandem (Fig. 11), por exemplo, CA CA CA CA e totalizando menos de 150
pares de bases (Tabela 1).
Tabela 1: Exemplos de microssatlites.
Tipo
Monmeros
Dmeros
Motivo/Arranjo
(A)n
(AT)n
(CG)n
Loco
AAAAAAAAAAAAAAAA
ATATATATATATATATATAT
CGCGCGCGCGCGCGCGCG
Trmeros
(ATG)n
(CCG)n
(CGTA)n
(TATC)n
(ATGGC)n
(CGCAA)n
(ATTGGC)n
ATGATGATGATGATGATG
CCGCCGCCGCCGCCGCCG
CGTACGTACGTACGTACGTA
TATCTATCTATCTATCTATC
ATGGCATGGCATGGCATGGC
CGCAACGCAACGCAACGCAA
ATTGGCATTGGCATTGGC
Tetrmeros
Pentmeros
Hexmeros
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no contm (ChoP-). Entretanto mostrou-se tambm que as bactrias ChoP- so mais
resistentes ao ataque do sistema imune. A maioria dos micrbios encontrados so
ChoP+, os ChoP-, produzidos pelo deslizamento da polimerase, no conseguem se
manter no trato respiratrio pois aderem-se menos eficientemente. Entretanto, quando as
clulas hospedeiras contraem uma infeco viral, a inflamao pode aumentar a
exposio da bactria ao sistema imune e a as formas ChoP- tero vantagem. Uma vez
que a infeco terminar mutantes ChoP+ podem ser produzidos por um novo
deslizamento, tornando-se rapidamente predominantes (Moxon and Wills, 1999).
Os microssatlites esto espalhados de forma bem homognea no DNA- pelo
menos 30.000 loci diferentes de microssatlites esto presentes no genoma humano.
Enzimas que duplicam o DNA tm problemas para copiar as regies do genoma que
contm essas repeties , o que faz com que elas apresentem taxa de mutao alta. Por
causa de sua variabilidade nas populaes, os microssatlites tm sido utilizados para
analisar as relaes entre diferentes etnias humanas. Muitos antroplogos argumentam
que a espcie humana moderna se originou na frica. Se isso for verdade, os membrros
das diferentes populaes africanas devero ter uma maior variao nas sequncias de
DNA do que as populaes que vivem em outros continentes porque os genomas das
populaes africanas tiveram um tempo maior para divergir. O argumento para a gnese
na frica tem recebido suporte de estudos de sequncias de DNA humano. Em um
desses estudos quee analisou 60 loci diferentes de microssatlites, foi constatado que os
membros das populaes africanas tinham uma divergncia gentica maior do que
populaes da sia ou da Europa.
Mudanas no nmero de cpias de certas sequncias de microssatlites so
responsveis por vrias doenas debilitantes herdadas como a distrofia miotnica, a
doena de Kennedy, a ataxia espinocerebelar (SCA) tipos 1, 2 e 3, a doena de
Huntington e a atrofia dentatorubral-palidoluisiana so causadas por alteraes no
nmero de repeties de tripletes (Heringa, 1998). Grande parte dessas doenas envolve
funes neurolgicas e nenhuma delas foi ainda demonstrada em outros primatas, como
o chimpanz. Se essas doenas so nicas humanidade elas podem representar um
custo gentico acarretado pela rpida evoluo de nossos crebros. possvel que
longos microssatlites dentro ou perto de certos genes possam ter contribudo para a
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funo cerebral e podem ter persistido ao longo do tempo evolutivo mesmo que
ocasionalmente aumentem muito e causem doenas (Moxon and Wills, 1999).
Combinao entre SNPs e STRs/microssatlites (SNPSTR Mountain et al.,
2002) SNPSTRs so marcadores genticos que combinam um microssatlite (STR)
com um ou mais SNPs intimamente ligados. Nessa combinao, os microssatlites e
SNPs tem menos de 250 pb, de modo que cada SNPSTR pode ser considerado um
pequeno hapltipo, sem ocorrncia de recombinao entre os dois marcadores
individuais. Cada um desses pequenos segmentos autossmicos, isto , os marcadores,
inclui um ou mais SNPs e um locus STR.
Com taxas de mutaes extremamente diferentes, esses dois tipos de marcadores
oferecem informaes evolutivas complementares. Visto que desafios tcnicos e a
recombinao tem limitado os estudos e aplicaes sobre a variao gentica, os
SNPSRTs so apontados como potencialmente capazes de se tornarem mais uma
ferramenta til no campo da gentica de populaes. A tcnica consiste em 1) consultar
os STRs presentes no genoma de interesse, atravs de busca aos bancos de dados
disponveis; 2) determinar se h presena de pelo menos um SNP na distncia de
~400pb na regio flanqueadora
desenhados primers de forma que abranjam um alvo o mais prximo possvel do STR,
com 400pb a mais na regio upstream e 400pb a mais na regio downstream. A regio
amplificada ser, ento, examinada por um mtodo barato de screening. Aps a
descoberta do SNP, deve ser feito 3) design de primers alelo-especficos, cada um
marcado com uma cor fluorescente diferente. Os primers reversos no sero marcados
com fluorescncia e o produto da PCR mostrar o SNP numa extremidade e o STR na
outra. H variao entre os cromossomos no comprimento do produto da PCR,
dependendo exclusivamente do nmero de cpias de repeties na STR.
Uma vez que os primers e correspondentes parmetros de PCR estejam
otimizados, poder-se- determinar o geno-hapltipo de cada indivduo, atravs de
eletroforese, em um instrumento de anlise gentica que utilize deteco fluorescente.
Para assegurar a determinao acurada do nmero de repeties de alelos STR, a cada
locus SNPSTR, ao menos um produto individual de PCR deve ser tambm sequenciado,
possibilitando comparaes.
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Short Insterspersed Elements (SINEs A maior parte da frao de DNA
moderadamente repetitiva no codifica nenhum tipo de produto. Em vez de ocorrerem
como conjuntos de sequncias em cadeia, os membros dessas famlias so dispersos
dentro do genoma como elementos individuais. Muitas dessas sequncias repetitivas
podem se encaixar numa classe referida como SINEs, que tm tipicamente menos que
500 pares de bases de comprimento (o nmero varia de 100 a 400 pares de base). As
sequncias de nucleotdeos desses elementos variam muito de uma espcie para outra.
Os SINEs so a classe mais abundante de elementos mveis no genoma humano,
constituindo cerca de 13% do total do DNA. No codificam protenas, porm contm
uma sequncia rica em A/T na extremidade 3. So transcritos pela RNA polimerase III,
a mesma RNA polimerase nuclear que transcreve os genes que codificam os tRNAs, os
5S rRNAs, e outros pequenos RNAs estveis. Aparentemente, as protenas ORF1 e
ORF2, expressas pelos LINEs (sequncias de DNA repetitivas sem funes
codificadoras, semelhantes aos SINEs, porm mais longas, com mais de 1.000 pares de
base de comprimento) promovem a transposio dos SINEs pelo mecanismo de
retrotransposio representado na figura 13.
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mutaes se torna possvel uma combinao dos sinais filogenticos com o elevado
polimorfismo de suas sequncias e, com isso, utilizar regies haploides destes STRs
para revelar, por meio de estimativas, as haploidias individuais na genealogia. Estes
STRs apresentam sinais genealgicos claros, porm sofrem uma grande desvantagem,
que reflete diretamente nas reconstrues microevoluvionrias, que so as taxas
evolutivas muito lentas, sendo ento necessria uma comparao das suas sequencias
atravs da utilizao de regies codificantes do DNA para argumentar sobre a filogenia.
Comparativo entre as tcnicas utilizando marcadores moleculares
Algumas caractersticas peculiares a cada espcie de marcador puderam ser
observadas, como no caso dos RFLPs, seu alto custo por dado gerado, baixa
distribuio pelo genoma e dificuldade de uso, o que o torna uma das tcnicas mais
laboriosas e complexas. J os polimorfismos de nucleotdeo nico (SNPs), pela
facilidade de aplicao da tcnica, extensa distribuio no cdigo gentico e baixo custo
na gerao de dados, so o grande alvo das pesquisas em biologia molecular e genmica
funcional. Num futuro muito prximo representaro ferramentas indispensveis da
medicina personalizada. Conclui-se, do mesmo modo, que as vrias tcnicas
envolvendo os demais marcadores moleculares so aplicadas de acordo com
caractersticas e limitaes nicas de cada tipo. Este fator exemplifica a importncia de
se ter uma gama opes de marcadores, visto que dificilmente uma variedade suprir
todas as prticas de gentica e biologia molecular que os empregam. Anlises
comparativas entre essas tcnicas esto evidenciadas nas tabelas 2 e 3.
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Concluses
Esta reviso de literatura relacionada s diversas espcies de marcadores
moleculares existentes permitiu um maior aprofundamento nos estudos destes, que cada
vez mais vm sendo aplicados em diagnsticos mdicos, anlises genticas, dentre
outros focos de interesse biotecnolgico.
Com o advento das tecnologias modernas de gentica e biologia molecular,
surgiram diversas tcnicas que utilizam estes tipos de marcadores moleculares para
detectar o polimorfismo gentico diretamente no DNA. Assim, o princpio da utilizao
dos marcadores moleculares baseado no dogma central da biologia molecular e na
pressuposio de que diferenas genticas no DNA significam, na maioria das vezes,
diferenas fenotpicas. Aps a reviso e estudo do tema, possvel afirmar que dentre as
vantagens dos marcadores podemos citar a obteno de um nmero praticamente
ilimitado de polimorfismos genticos, a identificao direta do gentipo sem influncia
do ambiente, a possibilidade de deteco em qualquer estdio do desenvolvimento do
organismo ou a partir de cultura de clulas ou tecidos e a possibilidade de gerar maior
quantidade de informao gentica por loco no caso de marcadores co-dominantes.
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Por fim, ressalta-se que os marcadores moleculares, em um futuro prximo,
podero exercer um papel fundamental como ferramenta auxiliar no melhoramento
animal e vegetal. Isto pode ser ressaltado ainda mais devido aos avanos nos estudos do
seqenciamento dos genomas de vrias espcies de interesse, levando a um maior
conhecimento sobre suas caractersticas genticas. O uso de marcadores para estas
caractersticas, mais o uso de mtodos de seleo quantitativa, podem aumentar a
acurcia da correlao entre o fentipo e o gentipo das diversas comunidades de
organismos.
Referncias bibliogrficas
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Marcadores Moleculares
VIDOR, M. A. Marcadores moleculares em estudos de caracterizao de
erva-mate (Ilex paraguariensis St.Hil.): O sabor, 2002.
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melhoramento de plantas.
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