PESQUISA DE BACILO LCOOL - CIDO RESISTENTE BAAR 1.

. FUNDAMENTO O diagnstico das Micobactrias patognicas (Mycobacterium tuberculosis e Mycobacterium leprae), por bacterioscopia direta feito atravs dos mtodos de colorao de Ziehl-Neelsen e de Kinyoun, os quais utilizam a caracterstica destas bactrias de possurem paredes celulares com alto teor de lipdeos (cerca de 60%, principalmente de cido miclico), que quando tratadas pelo corante Fucsina fenicada, coram-se de vermelho e persistem ao descoramento subseqente por uma soluo de lcool-cido forte (diferenciador). por isto que so conhecidas por Bacilos lcool-cido Resistentes (BAAR). As outras bactrias, que no possuem tais paredes celulares ricas em lipdeos, tm a sua colorao pela Fucsina descorada pela soluo de lcool-cido e coram-se em azul pela colorao de fundo do Azul de metileno (contra-corante). 2. METODOLOGIAS DE COLORAO 2.1. MTODO DE COLORAO QUENTE MTODO DE ZIEHL-NEELSEN

2.1.1.

Preparar um esfregao homogneo, delgado e identificado em uma lmina nova desengordurada, limpa e seca; 2.1.2. Deixar secar temperatura ambiente; 2.1.3. Fixar o material do esfregao passando 3 a 4 vezes pela chama do bico de Bunsen; 2.1.4. Cobrir a totalidade da superfcie do esfregao com soluo de Fucsina fenicada, previamente filtrada ou filtrado sobre a lmina no momento da colorao; 2.1.5. Deixar agir por cerca de 5 minutos, aquecendo brandamente utilizando algodo umedecido em lcool ou com a chama do bico de Bunsen, passando lentamente por baixo da lmina, at que se produza emisso de vapores e, quando estes so visveis, cessar o aquecimento. Repetir essa operao at completar trs emisses sucessivas. Evitar a fervura e secagem do corante (adicionar mais corante, se preciso, dentro deste perodo para evitar que a lmina seque porque o esfregao precisa estar coberto permanentemente durante o aquecimento.). Este aquecimento deve ser intermitente, pois importante manter a soluo aquecida durante o tempo previsto; 2.1.6. Lavar em gua corrente para eliminar a Fucsina. Toma-se a lmina pelo extremo numerado, inclinar para frente e lavar deixando cair um jato dgua de baixa presso sobre a pelcula corada, de maneira que essa no se desprenda; 2.1.7. Cobrir toda a superfcie do esfregao com a soluo de lcool-cido. Tomar a lmina entre o polegar e o indicador e fazer um movimento de vai-e-vem, de modo que o lcool-cido v descorando suavemente a Fucsina. Se o esfregao estiver ainda com a cor vermelha ou rosada, descora-se novamente. Considera-se descorado o esfregao, quando suas partes mais grossas conservarem somente um ligeiro tom rosado. Essa operao dura, em geral, dois minutos; 2.1.8. Terminada a fase de descolorao e eliminado o lcool-cido, lavar a lmina da mesma forma como se procedeu depois da colorao com a Fucsina, com cuidado para no desprender a pelcula; 2.1.9. Cobrir toda a superfcie do esfregao com soluo de Azul de metileno durante 30 segundos a 1 minuto; 2.1.10. Lavar, da mesma forma como se indicou para a Fucsina, tanto o esfregao como a parte inferior da lmina; 2.1.11. Colocar a lmina com o esfregao para cima, sobre o papel limpo, para secar temperatura ambiente ou estufa a 35 C; 2.1.12. Observar ao microscpio com objetiva de imerso (100 x). 2.2. MTODO DE COLORAO FRIO MTODO DE KINYOUN 2.2.1. 2.2.2. 2.2.3. 2.2.4. Preparar um esfregao homogneo, delgado e identificado em uma lmina nova desengordurada, limpa e seca; Deixar secar temperatura ambiente; Fixar o material do esfregao passando 3 a 4 vezes pela chama do bico de Bunsen; Cobrir a totalidade da superfcie do esfregao com soluo de Fucsina fenicada (Kinyoun), previamente filtrada ou filtrado sobre as lminas no momento da colorao,

deixando agir por cerca de 5 minutos, adicionando mais corante se preciso dentro deste perodo, evitando que a lmina seque; 2.2.5. Lavar em gua corrente para eliminar a Fucsina. Toma-se a lmina pelo extremo numerado, inclinar para frente e lavar deixando cair um jato dgua de baixa presso sobre a pelcula corada, de maneira que essa no se desprenda; 2.2.6. Cobrir toda a superfcie do esfregao com a soluo de lcool-cido. Tomar a lmina entre o polegar e o indicador e fazer um movimento de vai-e-vem, de modo que o lcool-cido v descorando suavemente a Fucsina. Se o esfregao estiver ainda com a cor vermelha ou rosada, descora-se novamente. Considera-se descorado o esfregao, quando suas partes mais grossas conservarem somente um ligeiro tom rosado. Essa operao dura, em geral, dois minutos; 2.2.7. Terminada a fase de descolorao e eliminado o lcool-cido, lavar a lmina da mesma forma como se procedeu depois da colorao com a Fucsina, com cuidado para no desprender a pelcula; 2.2.8. Cobrir toda a superfcie do esfregao com soluo de Azul de metileno durante 30 segundos a 1 minuto; 2.2.9. Lavar, da mesma forma como se indicou para a Fucsina, tanto o esfregao como a parte inferior da lmina; 2.2.10. Colocar a lmina com o esfregao para cima, sobre o papel limpo, para secar temperatura ambiente ou estufa a 35 C; 2.2.11. Observar ao microscpio com objetiva de imerso (100 x). Observao: Na colorao do Mycobacterium leprae , segue-se o mesmo procedimento mas a descolorao deve ser feita com cido sulfrico a 4% em gua, pois esse microrganismo sensvel a descolorao alcolica. Ao realizar uma colorao de esfregao, em qualquer mtodo, alguns procedimentos devem ser observados a fim de evitar cometer erros por utilizar: (a) substncias corantes no certificadas; (b) substncias corantes precipitadas; (c) corantes com concentrao inadequada; (d) esfregaos demasiados espessos, concentrados ou delgados; (e) metodologia incorreta. 3. TABELA DE INTERPRETAO DO RESULTADO DA BACTERIOSCOPIA PARA BAAR: A leitura deve ser feita no mnimo em cem campos microscpios, o que corresponde, aproximadamente, a leitura de uma linha reta que vai do extremo, onde est a numerao, at o extremo oposto, isso corresponde aproximadamente a mais ou menos 5 minutos de observao. Recomenda-se: um intervalo de 10 minutos de descanso para cada dez lminas lidas e utilizar um desenho quadriculado para ir anotando o nmero de bacilos encontrados em cada campo microscpio e o resultado deve ser informado em nmero de cruzes segundo as normas do Ministrio da Sade em vigor. Manual de Bacteriologia da Tuberculose Ministrio da Sade / FNS / CENEPI / CNPS / Centro de Referncia Prof. Hlio Fraga 2 Edio Revisada e Ampliada 1994. Nmero Total de Campos Observados 100 100 50 20 Nmero de bacilo lcool-cido resistente observados por campo No foram encontrados Menos de 1 BAAR por campo De 1 a 10 BAAR por campo Mais de 10 BAAR por campo Resultado Negativo Positivo (+) Positivo (++) Positivo (+++)

Observao: Nos casos de diagnstico, ao encontrar de 1 a 4 bacilos em 100 campos observados, deve-se ampliar a leitura para mais 100 campos. Se a quantidade de bacilos encontrados depois de observar os 200 campos se mantiver entre 1 a 4 bacilos, informar o resultado como NEGATIVO e solicitar nova amostra. Se nos materiais subseqentes deste paciente persistir a negatividade, proceder a cultura.

4. PREPARAO DOS CORANTES 4.1. Corantes de Ziehl Neelsen 4.1.1. Fucsina fenicada de Ziehl-Neelsen: 0.3g 10ml 5,75ml 100ml

Fucsina bsica lcool etlico 95 % Fenol fundido gua destilada ou deionizada q.s.

Na preparao dos corantes de Fucsina fenicada (Ziehl Neelsen e Kinyoun), dissolver em um gral o corante (Fucsina) no lcool etlico 95, juntar aos poucos o Fenol fundido. Misturar sempre de modo a obter uma soluo bem homognea. Juntar a gua, pouco a pouco, lavando o gral. Filtrar aps 24 horas de repouso. Estocar em frasco escuro. Segundo Langeron, a prtica seguida por outros autores de misturar a soluo alcolica saturada do corante com gua fenolada no d solues to estveis e dotadas de poder corante to intenso como esta tcnica descrita acima. Observao: Para manter o fenol fundido, adicionar-lhe 15% de gua destilada. De tal soluo (de gua em fenol) , na frmula acima, tomar-se-o 5,75 ml ao invs de 5 ml. 4.1.2. lcool-cido: cido clordrico, densidade 1.19 lcool etlico 95 % 3ml 97ml

Com uma pipeta deixar escorrer o cido clordrico pelas paredes do frasco contendo o lcool e agitar suavemente. Observao: Alguns autores recomendam lcool-cido 1%. 4.1.3. Azul de metileno: Azul de metileno lcool etlico 95 % gua destilada ou deionizada q.s. 0.3g 3ml 100ml

Dissolver o Azul de metileno com lcool por agitao e juntar gua destilada ou deionizada at completar 100 ml. Deixar repousar por 24 horas. Filtrar e estocar em frasco escuro. 4.2. Corantes do mtodo de Kinyoun: 4.2.1. Fucsina fenicada de Kinyoun: Fucsina bsica lcool etlico 95 % Fenol fundido gua destilada ou deionizada q.s. 4g 20ml 9,75ml 100ml

Na preparao dos corantes de Fucsina fenicada (Ziehl Neelsen e Kinyoun), dissolver em um gral o corante (Fucsina) no lcool etlico 95, juntar aos poucos o Fenol fundido. Misturar sempre de modo a obter uma soluo bem homognea. Juntar a gua, pouco a pouco, lavando o gral. Filtrar aps 24 horas de repouso. Estocar em frasco escuro. Segundo Langeron, a prtica seguida por outros autores de misturar a soluo alcolica saturada do corante com gua fenolada no d solues to estveis e dotadas de poder corante to intenso como esta tcnica descrita acima.

Observao: Para manter o fenol fundido, adicionar-lhe 15% de gua destilada. De tal soluo (de gua em fenol) , na frmula acima, tornar-se-o 9,75 ml ao invs de 9 ml. 4.2.2. lcool-cido: 3ml 97ml

cido clordrico, densidade 1.19 lcool etlico 95 %

Com uma pipeta deixar escorrer o cido clordrico pelas paredes do frasco contendo o lcool e agitar suavemente. 4.2.3. Azul de metileno: Azul de metileno lcool etlico 95 % gua destilada ou deionizada q.s. 0.3g 3ml 100ml

Dissolver o Azul de metileno com lcool por agitao e juntar gua destilada ou deionizada quente at completar 100 ml. Deixar repousar por 24 horas. Filtrar e estocar em frasco escuro. Observao: Para a colorao de fundo, outras solues de Azul de metileno podem ser usadas, tais como a de Azul de metileno segundo Leffler (Azul alcalino de Leffler) e Azul de metileno segundo Khne (Azul fenicado de Khne). 4.3. Azul de metileno segundo Leffler (Azul alcalino de Leffler): Soluo A: Azul de metileno lcool etlico 95 % Dissolver o Azul de metileno com lcool por agitao. Soluo B: Hidrxido de sdio 0,01 N gua destilada ou deionizada q.s. Dissolver o Hidrxido de sdio com gua destilada ou deionizada. Soluo C - para uso: Misturar solues A e B em partes iguais. Observao: Para o mtodo de Ziehl-Neelsen, diluir na proporo de 1/10 com gua destilada ou deionizada antes de usar. 4.4. Azul de metileno segundo Khne (Azul fenicado de Khne): Azul de metileno lcool etlico 95 % Fenol fundido gua destilada ou deionizada q.s. 1.5g 10ml 5,75ml 100ml 0,3ml 100ml 0.3g 30ml

Dissolver o Azul de metileno com lcool por agitao e juntar o Fenol e gua destilada ou deionizada quente at completar o volume de 100 ml. Deixar repousar por 24 horas. Filtrar e estocar em frasco escuro. Observaes: 1- Para manter o fenol fundido, adicionar-lhe 15% de gua destilada. De tal soluo (de gua em fenol) , na frmula acima, tomar-se-o 5,75 ml ao invs de 5 ml. 2- Para o mtodo de Ziehl-Neelsen, diluir na proporo de 1/10 com gua destilada ou deionizada antes de usar. 5. CONTROLE DE QUALIDADE DOS CORANTES: 5.1. Todos os corantes, preparados ou comprados prontos, utilizados no Laboratrio Clnico, devem ser submetidos a um controle da qualidade, para a verificao do seu desempenho. 5.2. Preparar uma suspenso de Mycobacterium tuberculosis ATCC 25177 cultivando em tubo com meio de cultura 7H9. Fazer um esfregao em uma lmina com a suspenso e deixe secar ao ar. Deve-se preparar vrias lminas em cmaras de fluxo laminar e deixar estocadas em temperatura ambiente numa caixa fechada. Fixar e corar da mesma maneira que uma lmina com amostra desconhecida. Examinar ao microscpio com objetiva de imerso (100x). A micobactria ir corar-se de vermelho, as demais bactrias e artefatos em azul. 5.3. As lminas estocadas e no coradas serviro como controle do desempenho para cada nova bateria de corantes e a cada semana de intervalo. 5.4. Na falta de bactrias padronizadas, podem ser utilizadas as dos esfregaos enviados pelo Programa Nacional de Controle de Qualidade PNCQ, ou solicitar nos Postos de Sade dos Estado ou Municpios, os frascos utilizados para estocagem das Vacinas BCG, e, com as gotas restantes fazer o esfregao para testar a qualidade do corante. 6. CAUSAS DE ERROS NO EXAME MICROSCPIO DIRETO DE ESCARRO: 6.1. Amostra insuficiente em quantidade e qualidade; 6.2. Identificao inadequada no pote/frasco. No deve colocar a identificao na tampa, e sim no corpo do pote/frasco; 6.3. rea de trabalho inadequada ou mal iluminada; 6.4. Troca das lminas por falta de procedimento no trabalho; 6.5. Processamento de uma srie muito grande de amostras simultaneamente; 6.6. Esquecer de misturar os escarros se as eliminaes so poucas e se esto separadas dentro do pote/frasco; 6.7. Esfregaos muito espessos ou muito delgados; 6.8. Uso de lminas arranhadas ou que tenham sido utilizadas anteriormente podem simular bacilos pela deposio de corantes nas ranhuras; 6.9. Fucsina seca e cristalizada no fundo do frasco. Deve-se usar Fucsina recentemente filtrada e colocada em frasco bem lavado; 6.10. Descuido no aquecimento da Fucsina (mtodo de Ziehl-Neelsen), permitindo que seque e cristalize no esfregao; 6.11. Descoramento insuficiente das lminas pode deixar corados em vermelho outros bacilos, que assim confundem com o BAAR; 6.12. Tempo de descoramento muito prolongado pode levar ao descoramento do BAAR; 6.13. No revisar a numerao das lminas ou no identificar se apagar o nmero durante a colorao; 6.14. No limpar a lente de imerso depois de cada exame positivo; 6.15. Existncia de bacilos no leo de imerso devido ao mau costume de tocar o esfregao com o conta-gotas do frasco; 6.16. Anotao errada do resultado na folha de trabalho dirio; 6.17. Transcrio errada da planilha de trabalho dirio para o impresso a ser fornecido ao setor de laudo.