Biossistemas e Biorreaes

Prof. Maria Alice Zarur Coelho Programa de Ps-graduao em Tecnologia de Processos Qumicos e Bioqumicos Escola de Qumica UFRJ

O conceito da Anlise de Fluxo Metablico (MFA) til para estudar as interaes entre os diferentes caminhos metablicos e quantificar as distribuies de fluxo em torno do pontos de bifurcao no possibilita medidas quantitativas do controle do fluxo metablico!!! O controle do fluxo metablico importante para: (i) balancear a taxa de sntese e converso dos metablitos face a uma dada condio ambiental no permitindo um aumento ou uma queda catastrfica nas concentraes intracelulares destes compostos (ii) modificao racional dos fluxos metablicos

Mecanismos moleculares que possuem papel importante no controle do fluxo metablico (1950s): ! Inibio por feed-back ! Cooperatividade enzimtica ! Modificaes enzimticas por ligao covalente ! Controle da sntese enzimtica Controle metablico normalmente descrito de forma qualitativa, i.e.:
fosfofrutoquinase a enzima que controla a maior parte do fluxo gliclitico nos msculos.

ou
o primeiro passo de uma caminho metablico a taxa cintica limitante.

No necessariamente correto!!!

Anlise do Controle Metablico (MCA)

Ao invs de assumir a existncia de uma nica etapa limitante, assume-se que existe uma quantidade definida do controle do fluxo metablico se encontra espalhada ao longo do caminho atravs das enzimas, sendo formalmente conhecido como Teoria do Controle Metablico , intimamente relacionada com Anlise de Sensibilidade. Na essncia, MCA aplicao da teoria da perturbao linear de um problema inerentemente no-linear da cintica enzimtica das redes metablicas. Abordagens possveis para o estudo do comportamento cintico de sistemas multienzimticos: Teoria orientada por fluxo abordagem desenvolvida por E. A. Newsholme, B. Crabtree et al. Alternativa ao MCA, do qual difere quando incorpora o conceito de reguladores parcialmente externos, cujas concentraes so parcialmente variveis e parcialmente constantes. Teoria dos sistemas bioqumicos abordagem desenvolvida por M. A. Savageau et al. Teoria geral do controle metablico que inclui tanto a anlise do controle (MCA) como a teoria orientada por fluxo como casos especiais. nfase dada na predio de como os sistemas iro se comportar quando as condies se modificam, mas do que entender os termos fsicos pelos quais so controlados.

Fundamentos da MCA
! Aplicvel apenas a condies de estado estacionrio (ou pseudo estado-estacionrio) as concentraes do primeiro substrato e do produto final de cada caminho metablico podem ser mantidas constante tanto pelo controle das condies ambientais ou como resultado da regulao intracelular. ! Um estado estacionrio estvel definido unicamente pelas atividades das enzimas catalisadoras dos passos individuais do caminho atividades das enzimas = parmetros do sistema propriedades que so determinadas pelos valores destes parmetros (p.ex. fluxo atravs do caminho metablico ou concentrao de intermedirios intracelulares) = variveis do sistema

Um dos objetivos da MCA relacionar as variveis do sistema metablico com os seus parmetros

Coeficientes do Controle de Fluxo (FCC)

A sensitividade de uma varivel do sistema (fluxo) com respeito aos parmetros do sistemas (atividades enzimticas) pode ser determinada.

As sensitividades resumem a extenso do controle do fluxo exercido pela atividade de uma enzima no caminho metablico, i.e. como um parmetro afeta as variveis do sistema

Tais sensitividades podem ser descritas por um conjunto de coeficientes os Coeficientes do Controle de Fluxo definidos como a mudana relativa no fluxo do estado estacionrio resultante de uma alterao infinitesimal na atividade de uma enzima do caminho metablico dividido pela mudana relativa da atividade enzimtica

E dJ d (ln J ) C= = J dE d (ln E )

Certa perturbao na atividade de uma enzima aumenta em 5% a taxa da reao isolada. Esta mesma perturbao quando includo o sistema metablico leva a um aumento no fluxo de 2%... dito que o coeficiente do controle de fluxo desta enzimas igual a 2/5 ou 0,4. Se a mesma perturbao causa um decrscimo de 10% na concentrao do substrato da enzima, esta enzima tem um coeficiente do controle de concentrao para este metablito de -10/5 ou -2.

Coeficientes de Elasticidade
A elasticidade uma propriedade local de uma enzima isolada que expressa como sua taxa varia com a concentrao de qualquer metablito que a afeta: substrato, produto ou qualquer outro metablito. Uma elasticidade de 0.5 com respeito ao substrato significa que um aumento de 2% na concentrao de susbstrato ir aumentar em 1% a taxa da reao catalisada por esta enzima (0.5 x 2%). ! elasticidades para o substrato so positivas (exceto sob condies de inibio pelo substrato); ! elasticidades para o produto so negativas (exceto sob condies de inibio pelo produto); ! elasticidades para ativadores so positivas e para inibidores so negativas

Sujando as mos: Abordagens Experimentais

Mtodos para determinao dos FCCs: ! mtodos diretos coeficientes de controle so determinados diretamente do fluxo e as medidas de atividade seguem pequenas (mas finitas) mudanas na atividade; ! mtodos indiretos coeficientes de elasticidade e de controle so calculados a partir dos teoremas da MCA; ! a partir de medidas nas concentraes dos metablitos em estado transiente (i.e. entre uma perturbao e o estado estacionrio), Delgado & Liao (1992a, b).

Mtodos Diretos Mtodos de Perturbao

A forma bvia de determinar os coeficientes de controle seguir a definio dos mesmos, i.e. perturbar um passo metablico, deixar o sistema encontrar um novo estado estacionrio e; ento medir a alterao na varivel de interesse. Existem vrias formas de perturbar a taxa de uma reao... (i) Mudana na concentrao da enzima por meios genticos tcnicas de biologia molecular permitem o controle da expresso da enzima a nvel gentico (ex. Flint et al. (1981) e Niederberger et al. (1992) ou Fell (1992)) (ii) Titulao com enzima purificada extratos livres de clulas so usados no procedimento onde se considera que todas as demais enzimas do caminho metablico (enzimas auxiliares) sao fornecidas em excesso e portanto a respectiva contribuio no controle do fluxo reduzida (ex. Torres et al. (1986) ou Fell (1992) ) (iii) Titulao com inibidores especficos quando o fluxo resultante da titulao da atividade da enzima in vivo mensurado, estima-se o coeficiente de resposta com relao ao inibidor (ex. Groen et al. (1982), Westerhoff & Kell (1988), Small (1993) ou Fell (1992))

Uso de inbidor especfico

Titulao com enzima

Cada perturbao deve afetar apenas um passo do caminho metablico. Para fazer uma fotografia completa do controle de uma dada varivel, o mesmo procedimento deve ser repetido em cada passo do sistema. Problemas associados com estas abordagens: (i) perturbaes devem ser pequenas (1%) o estado estacionrio muda quando as perturbaes so finitas existindo erros associados a estas perturbaes (quanto maior a perturbao, maior o erro). Porem, perturbaes muito pequenas so difceis de serem mensuradas usual: 10%. (ii) inibidores devem ser especficos no afetar outras reaes do sistema (nem sempre se consegue preencher este requisito). (iii) taxa de reao deve mudar linearmente com a concentrao da enzima, se queremos usar a concentrao enzimtica como parmetro a perturbar. Os coeficientes de controle so normalmente definidos como coeficientes de resposta pois as enzimas sofrem influncia de efetores externos.

MCA da Biossntese de Penicilina

ACVS:
!sofre inibio por feedback do produto LLD-ACV !efetores da taxa de reao ATP, AMP, pirofosfato, fosfato, CoA e Mg2+ !ATP estimula a reao !AMP e pirofosfato inibem a reao

IPNS:
!ferro dependente !sensvel a variaes na [OD] cintica 1a. ordem

Coeficientes de Elasticidade:
ACVS negativo, i.e. aumento na concentrao de LLD-ACV diminui a taxa de sntese deste produto e a magnitude do coeficiente de elasticidade aumenta durante a conduo do processo em batelada alimentada devido ao aumento da concentrao deste composto. IPNS positivo, i.e. o efeito do aumento na concentrao de LLD-ACV positivo e magnitude deste efeito diminui ao longo da batelada devido saturao de IPNS pelo seu substrato

Tempos de batelada muito longos prejudicam o processo!!!

Coeficientes de Controle de Fluxo: ACVS inicialmente alto (prximo a 1) dada a baixa inibio pelo produto Conforme a [LLD-ACV] aumenta, o controle do fluxo metablico troca de forma gradual da enzima ACVS para a enzima IPNS. Aps 70 h de processo, o fluxo controlado primariamente por IPNS. Nenhuma das duas enzimas pode ser identificada como responsvel pela etapa limitante do processo. FCCs no so constantes para um dado caminho metablico

Referncias

http://dbkgroup.org/mca_home.htm http://bip.cnrs-mrs.fr/bip10/mcafaq.htm#index Metabolic Engineering Principles and Methodologies, Stephanopoulos G.N., Aristidou, A.A. & Nielsen, J., Academic Press, 1998, Cap. 11 Metabolic Control Analysis, pp. 461 533.