INSTITUTO DE PESQUISAS ENERGTICAS E NUCLEARES Autarquia associada Universidade de So Paulo

DETERMINAO DE ENDOTOXINA BACTERIANA (PIROGNIO) EM RADIOFRMACOS PELO MTODO DE FORMAO DE GEL. VALIDAO.

NEUZA TAEKO OKASAKI FUKUMORI

Dissertao apresentada como parte dos requisitos para obteno do Grau de Mestre em Cincias na rea de Tecnologia Nuclear Aplicaes. Orientadora: Dra. Constancia Pagano Gonalves da Silva

SO PAULO 2008

AGRADECIMENTOS

Ao Instituto de Pesquisas Energticas e Nucleares, IPEN-CNEN/SP, por possibilitar a realizao deste trabalho. Dra. Constancia Pagano Gonalves da Silva, mulher valorosa, excelente profissional, pioneira no desenvolvimento da Radiofarmcia no Brasil e minha orientadora, pela convivncia harmoniosa, pelos ensinamentos, pelo exemplo de vida, conselhos, apoio e confiana em mim depositados contribuindo para o meu crescimento pessoal e profissional. Dra. Nilda Petrona Sosa de Pereira, minha amiga, pelo apoio, pelo incentivo, pela pacincia, por me conduzir nos primeiros passos da radiofarmcia, pelos ensinamentos, conselhos e maravilhosas experincias de vida transmitidos. Ao MSc. Jair Mengatti, gerente do Centro de Radiofarmcia do IPEN-CNEN/SP, pelo inestimvel apoio e colaborao. Dra. Margareth Mie Nakamura Matsuda, pelos conselhos, ensinamentos e colaborao durante a execuo do trabalho. querida Adriana Vidal Fernandes pelo inestimvel apoio, carinho e colaborao na parte experimental e anlise estatstica. Aos funcionrios do Centro de Radiofrmacia, especialmente Domingos Gomes de Campos e Natanael Gomes da Silva, que muito contriburam na realizao deste trabalho, A todos os colegas e professores das disciplinas de ps-graduao do IPEN, pelo agradvel convvio, incentivo, amizade e conhecimentos adquiridos.

 Luzia de Fatima Pereira, funcionria da Alko do Brasil, fornecedora da maior parte do material utilizado nos experimentos, pelo inestimvel apoio e colaborao. minha querida famlia, pelo amor, compreenso e encorajamento em todos os momentos de minha vida.

"...se buscares a sabedoria como a prata e como a tesouros escondidos a procurares, ento, entenders o temor do Senhor e achars o conhecimento de Deus." (Provrbios 2:4-5)

DETERMINAO DE ENDOTOXINA BACTERIANA (PIROGNIO) EM RADIOFRMACOS PELO MTODO DE FORMAO DE GEL. VALIDAO.

Neuza Taeko Okasaki Fukumori RESUMO

Antes do Ensaio do Lisado de Amebcitos do Limulus (LAL), a nica forma de se avaliar a pirogenicidade em drogas parenterais e dispositivos mdicos era o ensaio de pirognio em coelhos da Farmacopia Americana (USP). Especialmente para radiofrmacos, o ensaio LAL a escolha para a determinao de endotoxina bacteriana (pirognio). O objetivo deste trabalho foi validar o mtodo de formao de gel para alguns radiofrmacos sem uma interferncia mensurvel. O guia do mtodo LAL do Food and Drug Administration (FDA) define interferncia como uma condio que causa uma diferena significativa entre os pontos finais de gelificao das sries de controle positivo da gua e controle positivo do produto utilizando-se um endotoxina padro. Os experimentos foram realizados de acordo com o teste de endotoxinas bacterianas da USP na m-iodobenzilguanidina-131I, nos radioistopos Glio-67 e Tlio-201, nos reagentes liofilizados DTPA, Fitato, GHA, SAH e Sn Coloidal. A Mxima Diluio Vlida (MDV) foi calculada para cada produto com base na sua dose clnica e diluies seriadas abaixo da MDV foram avaliadas em duplicata para a deteco de interferncias. A sensibilidade declarada do reagente de LAL foi de 0,125 UE mL-1 (Unidades de Endotoxina por mililitro). Para a validao, uma srie de diluies foi feita utilizando-se padro de endotoxina (PE) nas concentraes de 0,5 a 0,03 UE mL-1 para a confirmao da sensibilidade do reagente de LAL, em quadruplicata. A mesma srie de diluies foi feita com o PE e o produto diludo 100 vezes em trs lotes consecutivos de cada radiofrmaco. Os produtos m-iodobenzilguanidina-131I, Glio-67, Tlio-201, DTPA, SAH e Sn Coloidal foram compatveis com o mtodo no fator de diluio 1:100. Fitato e GHA apresentaram interferncia no ensaio de formao de gel. Outras tcnicas para determinar endotoxinas como o ensaio cromognico (desenvolvimento de cor) e o turbidimtrico (desenvolvimento de turbidez) foram avaliadas para obter informaes qualitativas e quantitativas sobre as concentraes de endotoxinas nas amostras.

DETERMINATION OF BACTERIAL ENDOTOXIN (PYROGEN) IN RADIOPHARMACEUTICALS BY THE GEL CLOT METHOD. VALIDATION. Neuza Taeko Okasaki Fukumori

ABSTRACT
Before the Limulus amebocyte lysate (LAL) test, the only available means of pirogenicity testing for parenteral drugs and medical devices was the United States Pharmacopoeia (USP) rabbit pyrogen test. Especially for radiopharmaceuticals, the LAL assay is the elective way to determine bacterial endotoxin. The aim of this work was to validate the gel clot method for some radiopharmaceuticals without measurable interference. The FDA s LALTest guideline defines interference as a condition that causes a significant difference between the endpoints of a positive water control and positive product control series using a standard endotoxin. Experiments were performed in accordance to the USP bacterial endotoxins test in the
131

I- m-iodobenzylguanidine; the radioisotopes Gallium-67 and

Thallium-201; the liophylized reagents DTPA, Phytate, GHA, HSA and Colloidal Tin. The Maximum Valid Dilution (MVD) was calculated for each product based upon the clinical dose of the material and a twofold serial dilution below the MVD was performed in duplicate to detect interferences. The labeled sensitivity of the used LAL reagent was 0.125 EU mL -1 (Endotoxin Units per milliliter). For validation, a dilution series was performed, a twofold dilution of control standard endotoxin (CSE) from 0.5 to 0.03 EU mL-1, to confirm the labeled sensitivity of the LAL reagent being tested in sterile and non pyrogenic water, in quadruplicate. The same dilution series was performed with the CSE and the product in the 1:100 dilution factor, in three consecutive batches of each radiopharmaceutical. The products
131

I-m-iodobenzylguanidine, Gallium-67, Thallium-201, DTPA, HSA and Colloidal

Tin were found compatible with the LAL test at a 1:100 dilution factor. Phytate and GHA showed some interference in the gel clot test. Other techniques to determine endotoxins as the chromogenic (color development) and the turbidimetric test (turbidity development), were also assessed to get valuable quantitative and qualitative information about the endotoxin concentration in samples.

SUMRIO Pgina 1 INTRODUO .................................................................................... 10 1.1 Radiofrmacos .................................................................................. 11 1.2 Pirognio e Endotoxina ..................................................................... 14 1.3 Estrutura, Funo e Atividade da Endotoxina .................................. 1.4 Processos de Despirogenizao ....................................................... 16 18

1.5 Ensaio de Pirognio pelo Mtodo in vivo .......................................... 22 1.5.1 Histrico ......................................................................................... 23 1.6 Determinao de Endotoxinas Bacterianas pelo Mtodo in vitro ..... 24 1.6.1 Histrico ......................................................................................... 27 1.7 Validao do Ensaio do LAL ............................................................. 30 1.8 Interferncias .................................................................................... 32 1.9 Outros Mtodos para Determinao de Endotoxina ......................... 34 1.9.1 Mtodo Turbidimtrico Quantitativo ............................................... 34 1.9.2 Mtodo Colorimtrico de Protena ................................................. 1.9.4 Mtodo Cromognico Quantitativo ................................................ 35 35 1.9.3 Mtodo Nefelomtrico .................................................................... 35 2 OBJETIVO .......................................................................................... 37 3 REVISO DA LITERATURA .............................................................. 38 4 MATERIAIS E MTODOS .................................................................. 40 4.1 Materiais ............................................................................................ 42 4.1.1 Materiais Utilizados no Mtodo in vitro de Determinao de Endotoxina por Formao de Gel .............................................................. 4.1.2 Materiais Utilizados no Mtodo Cromognico PTS de Determinao de Endotoxina Bacteriana .................................................. 4.1.3 Materiais Utilizados no Mtodo Turbidimtrico de Determinao de Endotoxina Bacteriana .............................................................................. 4.2 Mtodos ............................................................................................. 42 42 44 44

4.2.1 Mtodo de Formao de Gel ........................................................... 44 4.2.1.1 Preparao das Diluies Sucessivas de Padro de Endotoxina. 46 4.2.1.2 Preparao das Diluies Sucessivas do Produto com Padro de Endotoxina ........................................................................................... 46 4.2.1.3 Determinao da Sensibilidade do Reagente LAL ...................... 47

4.2.2 Mtodo Cromognico - PTS ........................................................... 5 RESULTADOS E DISCUSSO ......................................................... 5.1 Validao dos Produtos pelo Mtodo de Formao de Gel ............. 5.1.2 Inibio ou Potencializao ........................................................... 5.1.3 Sries de Diluio do Padro de Endotoxina ................................ 5.1.3.1 Determinao da Sensibilidade do Reagente LAL ...................... 5.2 Validao pelo Mtodo Cromognico

48 50 50 51 54 54

4.2.3 Mtodo Turbimtrico ...................................................................... 49

5.1.1 Clculo de MDV ............................................................................. 50

PTS ..................................... 56 58 66 66 73 74 75

5.2.1 Clculo de MDV ............................................................................. 58 5.2.2 Inibio ou Potencializao ........................................................... 5.3 Validao pelo Mtodo Turbimtrico ................................................ 5.3.2 Inibio ou Potencializao ........................................................... 6 CONCLUSES ................................................................................. ANEXO 1 - Modelo de Ficha para Validao ....................................... REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS .......................................................

5.3.1 Clculo de MDV ............................................................................. 66

LISTA DE ABREVIATURAS E/OU SIGLAS BCG BPF CDRH CEP CPP CV DTPA FDA GHA HIMA IgG KTS LAL LPS MBq MCV MDV MIBG nm PE PET pNA PRE PTS RCCP RDC SAH UE USP Bacilo de Calmette e Gurin Boas Prticas de Fabricao Center for Devices and Radiological Health Concentrao de Endotoxina no Produto Controle Positivo do Produto Coeficiente de Variao cido Dietilenotriaminopentactico Food and Drug Administration Glucoheptonato de Clcio Health Industry Manufacturers Association Imunoglobulina G Sistema Cintico Turbidimtrico Lisado do Amebcito de Limulus Lipopolissacardeo Megabecquerel Mnima Concentrao Vlida Mxima Diluio Vlida Metaiodobenzilguanidina Nanmetro Padro de Endotoxina Tomografia por Emisso de Psitron para-nitroanilina Padro de Referncia de Endotoxina Sistema de Teste Porttil Recuperao do Controle Positivo do Produto Resoluo da Diretoria Colegiada Soro Albumina Humano Unidade de Endotoxina Farmacopia Americana

10

1 INTRODUO O conceito de controle total de qualidade de produtos farmacuticos, correlatos e cosmticos consiste no esforo organizado dentro de uma empresa, no sentido de projetar, produzir, manter e assegurar as caractersticas especificadas em cada unidade do produto distribudo para comercializao. A atividade de prover, em toda a amplitude, a evidncia necessria para estabelecer confiabilidade de que a funo qualidade est sendo adequadamente efetuada e administrada faz parte do Sistema de Gesto da Qualidade.[1] A preocupao relativa qualidade, quando associada atividade produtiva, foi sempre inerente ao ser humano, que busca aperfeioar, desenvolver, superar limites, independentemente da atividade que exera, a fim de atender aos anseios da sociedade.[1] Na fabricao de produtos estreis devem ser tomadas medidas para se evitar a contaminao, tanto particulada como microbiana.[1,2] A rea produtiva deve seguir rgidos conceitos de engenharia, deve apresentar paredes e teto lisos e impermeveis; superfcies e equipamentos devem ser de fcil limpeza e construdos de material que resista desinfeco qumica. Deve ser previsto sistema de circulao e de tratamento de ar que auxilie na manuteno da limpeza da rea, promovendo renovaes expressas em nmero de vezes que o volume total do ar da sala trocado por hora.[1]

Para garantir que os produtos farmacuticos tenham e mantenham as caractersticas de estrutura, identidade, pureza, concentrao, potncia e inocuidade requeridas para o seu uso existe um conjunto de normas e atividades relacionadas entre si denominado Boas Prticas de Fabricao (BPF). No Brasil, a Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria o rgo normativo que regulamenta as Boas Prticas de Fabricao de Medicamentos por meio da RDC (Resoluo da Diretoria Colegiada) n 210, de 04 de agosto de 2003.[3]

11 A abrangncia das Boas Prticas de Fabricao est direcionada s instituies da rea de sade e tambm atividade industrial dos produtores de medicamentos, correlatos, cosmticos, domissanitrios e alimentos.[1] Para estabelecer evidncia documentada, que proporcione com alto grau de segurana, de que determinado procedimento quando executado sob condies pr-estudadas e definidas seja capaz de reproduzir um servio ou bem dentro das especificaes e qualidade desejveis, as BPF recomendam que seja realizada a validao dos processos e das metodologias analticas. parte integrante do Sistema de Qualidade e tem por escopo a confiabilidade dos processos e sistemas. [1,4]

1.1 Radiofrmacos Todo produto a ser administrado em humanos deve reunir requisitos de qualidade, segurana e eficcia. Os radiofrmacos devem cumprir os requisitos exigidos aos produtos farmacuticos convencionais, como as BPF e ainda outros especficos, por se tratarem de substncias radioativas.[5] Radiofrmaco um medicamento especial ou produto que, quando pronto para uso, contm um radioistopo em sua constituio e utilizado em seres humanos para o diagnstico e tratamento de enfermidades.[6,7] Com uma filosofia similar, as Boas Prticas de Fabricao em Radiofarmcia ou Boas Prticas Radiofarmacuticas so recomendaes ou conjunto de normas e atividades que conjugam os princpios das BPF e as normas de Proteo Radiolgica. As Boas Prticas Radiofarmacuticas destinam-se a garantir que os produtos terminados de uso radiofarmacutico tenham e mantenham as caractersticas necessrias para a utilizao segura e correta dos radiofrmacos a serem administrados nos seres humanos no mbito dos servios de Medicina Nuclear.[6] A maioria dos radiofrmacos utilizados administrada aos pacientes por via parenteral e, portanto, devem ser estreis e livres de pirognio.[6,7] Alm disso, a

12 preparao do radiofrmaco feita com o uso de solues radioativas, sendo mister que se tomem medidas necessrias para evitar contaminao direta do operador e do ambiente de trabalho.[6] Embora o termo radiofrmaco seja o mais usado, outras designaes, a saber, radiotraador, agente radiodiagnstico ou simplesmente traador tambm so encontradas.[7] O radiofrmaco deve ser seguro e no txico para administrao em humanos, as radiaes emitidas pelo radioistopo devem ser facilmente detectadas por instrumentos adequados e a dose de radiao ao paciente deve ser mnima.[7] Os radioistopos utilizados em medicina nuclear so na sua maioria, artificiais e so produzidos principalmente em ciclotron ou reator.[7,8] Os compostos marcados com radioistopos emissores emissores e
+

tm sido utilizados

em experimentos in vitro e em terapia, enquanto que os que so marcados com possuem aplicaes mais amplas e so teis na obteno de imagens in vivo de diferentes rgos.[7] Mais de 80% dos radiofrmacos usados em medicina nuclear so compostos marcados com tecncio-99m (99mTc). O seu uso clnico decorre de suas caractersticas fsicas favorveis. A meia vida fsica de 6 horas e a baixa porcentagem de emisso de eltrons permitem a administrao de miliCuries de
99m

Tc sem uma dose de radiao significativa ao paciente. Os ftons

99m

monocromticos de 140 keV so colimados e fornecem imagens com boa resoluo espacial. Alm disso, o Tc est disponvel facilmente em um estado livre de carregador, estril e apirognico a partir dos geradores de 99Mo-99mTc.[7, 9] O uso dos reagentes liofilizados para marcao com comercializados e armazenados antes de sua preparao.[7] O pertecnetato de sdio (Na99mTcO4), que a forma qumica do
99m 99m

Tc facilitou a prtica

nas radiofarmcias hospitalares por causa do prazo de validade, podendo ser

Tc

disponvel no gerador, empregado na cintilografia de glndulas salivares e de tireide8. Os reagentes liofilizados cido Dietilenotriaminopentactico (DTPA),

13 Fitato, Glucoheptonato de Clcio (GHA), Soro Albumina Humano (SAH) e Estanho Coloidal (Sn Coloidal) marcados com
99m

Tc so usados, respectivamente, para

cintilografia renal (estudo do fluxo renal e medida da velocidade de filtrao glomerular); cintilografia heptica e localizao de linfonodo sentinela; cintilografia renal e cerebral; estudos circulatrios e cintilografia hepato-esplnica.[7,8,9] Glio-67 (67Ga) na forma de citrato utilizado na deteco de doenas malignas, a saber: doena de Hodgkin, linfomas e carcinoma broncognico. tambm utilizado para localizar doenas inflamatrias agudas e infeces.[7,8] Tlio-201 (201Tl) na forma de cloreto empregado na obteno de imagem de perfuso miocrdica na diferenciao entre miocrdio isqumico e infartado. indicado para a deteco de hiperparatireoidismo e tumores cerebrais.[7,8] O composto metaiodobenzilguanidina (MIBG) marcado com Iodo-131 pelo mtodo de troca isotpica e usado para imagem da medula adrenal e tumores neuroendcrinos (deteco neuroblastomas).[7,8] Entre os radiofrmacos descritos para uso em tomografia por emisso de psitron (PET) encontra-se o Flor-18 (18F) como marcador do anlogo da glicose, a flor-18-deoxiglicose (FDG), com ampla aplicao em cintilografia cerebral, cardaca e em deteco de uma variedade de tumores em todo o corpo.[7,9] O controle de qualidade envolve vrios ensaios especficos que asseguram a pureza, potncia, identidade do produto, segurana biolgica e eficcia dos radiofrmacos. Todos os procedimentos de controle de qualidade que so aplicados aos frmacos no radioativos so igualmente aplicados aos radiofrmacos, com o acrscimo dos ensaios de pureza radioqumica e radionucldica.[7,10] Os ensaios biolgicos so realizados essencialmente para avaliar a esterilidade, apirogenicidade e toxicidade dos radiofrmacos antes da sua administrao parenteral em seres humanos. Enquanto os radiofrmacos perdem a esterilidade devido ao crescimento de bactria, fungo e levedura, a pirogenicidade advm de certos produtos metablicos (endotoxina) destes microorganismos. A esterilidade de uma soluo no garante a sua apirogenicidade e nem a de feocromocitomas e tratamento de

14 esterilizao destri o pirognio num radiofrmaco. Desde que o pirognio se origina do metabolismo da bactria, o melhor recurso para prevenir a contaminao utilizar material estril, solues e equipamento sob condies asspticas em qualquer procedimento de preparao.[7] 1.2 Pirognio e Endotoxina Substncias que induzem febre so chamadas pirognios. A palavra pirognio relacionada palavra grega pyro, que significa ardente ou fogo, uma descrio adequada para substncias que produzem elevao da temperatura do corpo.[11] Os pirognios so divididos em duas classes. Pirognios exgenos so aqueles originrios fora do corpo e induzem elevaes trmicas quando injetados em humanos e animais. Embora o lipopolissacardeo (endotoxina) seja o mais presente e importante pirognio exgeno, h outros de constituio qumica diversa, que causam elevao de temperatura quando injetados sob condies especficas. Classes gerais de pirognios exgenos incluem bactria, fungos e vrus, como tambm pirognios no microbianos, por exemplo, alguns frmacos, esterides, fraes do plasma e o adjuvante sinttico muramil dipeptdeo.[1,11] O pirognio endgeno, entretanto, produzido internamente pelo hospedeiro em resposta ao estmulo de vrios pirognios exgenos. O pirognio endgeno uma substncia homognea sintetizada por diferentes clulas de hospedeiros aps exposio aos pirognios exgenos como a endotoxina. Hoje, est bem estabelecido que o pirognio endgeno o mediador central da febre.[11]

Os nveis de pirognio tornaram-se cruciais na liberao de produtos farmacuticos. Sob o ponto de vista de controle de qualidade, todos os injetveis, bem como os acessrios para transfuso, infuso e todos os dispositivos implantveis ou descartveis empregados em terapia parenteral devem oferecer segurana ao paciente, sob o ponto de vista de contaminantes pirognicos. Produtos injetveis de grande volume e de pequeno volume, assim como produtos na forma de aerossol, para uso respiratrio devem ser analisados. O potencial de

15 periculosidade maior quando se trata de injetvel de uso exclusivo por via intravenosa. O risco ser ainda maior quando se trata de produto com inoculao intratecal, em que a experincia demonstrou ser a endotoxina 1000 vezes mais potente que na via intravenosa.[1] Endotoxinas so complexos de alto peso molecular associados membrana externa de bactrias Gram-negativas, sejam elas patognicas ou no, e se constituem na mais significante fonte de pirognio para a indstria farmacutica. [1,2,12] Apesar de a maior parte da endotoxina permanecer associada parede celular at a desintegrao da bactria, quantidades nfimas de endotoxinas so liberadas, na forma solvel, por culturas de bactrias jovens ou tambm por bactrias Gram-negativas como E.coli, Salmonella, Shigella, Pseudomonas, Neisseria, Haemophilus e outros agentes patognicos, em crescimento.[1] Endotoxinas no purificadas podem conter lipdeos, carboidratos e protenas. Como podem ser encontradas unidades no purificadas nas fases em processo ou nos produtos farmacuticos terminados, prefere-se utilizar a terminologia endotoxina. A denominao de lipopolissacardeo (LPS) aplicada endotoxina purificada, para enfatizar a sua natureza qumica.[1]

Na FIG. 1, est representada a estrutura da parede celular de uma bactria Gram-negativa. (endotoxina). A membrana externa composta de lipopolissacardeo

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LIPOPOLISSACARDEO Cadeias laterais O-especficas Polissacardeo Lipdeo A Fosfolipdeo Protena Lipoprotena Peptdeoglicano Espao periplsmico Membrana interna Citoplasma

FIGURA 1

Estrutura da parede celular de bactria Gram-negativa. (Fonte: Charles

River Laboratories)

1.3 Estrutura, Funo e Atividade da Endotoxina As endotoxinas so txicas maioria dos mamferos. Estudos tm demonstrado que a injeo de clulas de bactrias Gram-negativas vivas ou mortas, ou LPS purificados causa uma srie de reaes patofisiolgicas que podem variar de uma leve alterao de temperatura (febre), mudana na contagem de clulas brancas do sangue, coagulao intravascular disseminada, hipotenso, choque, at mesmo a morte. Por isso, a deteco e a eliminao de endotoxina bacteriana em frmacos de uso in vivo so de vital importncia aos pacientes.[1,10,13] O mecanismo de induo de febre envolve a fagocitose do lipdeo A, sendo produzido pirognio endgeno, que atravessa a barreira hematoenceflica e altera o ponto de equilbrio dos neurnios reguladores de temperatura do hipotlamo anterior. Um significante aumento na concentrao de prostaglandina E2 e adenosina monofosfato cclica (cAMP) foi encontrado no fluido cerebrospinal de

17 coelhos nos quais foi induzida febre por injeo intravenosa de lipdeo A, indicando que ambos ocupam papel importante na induo de febre.[11] O lipdeo A, considerado a poro ativa da membrana da bactria Gram negativa, composto de um dissacardeo de glicosamina, altamente substitudo por cidos graxos de cadeia longa com grupamentos amida e ster. Tipicamente, o lipdeo A ligado ao ncleo de heteropolissacardeo pelo cido 2-ceto-3deoxioctnico, um acar cido de 8 carbonos, exclusivo de lipopolissacardeo bacteriano.[11] unidade lipdeo A da endotoxina so atribudas diversas atividades biolgicas como: pirogenicidade, toxicidade letal, leucopenia seguida de leucocitose, fenmeno de Shwartzman, necrose da medula ssea, reabsoro do osso embrionrio, ativao do complemento, queda de presso sangunea, agregao plaquetria, ativao do fator de Hagemen, induo do fator plasminognio, toxicidade aumentada pelo pr-tratamento com BCG, toxicidade aumentada pela adrenalectomia, reatividade drmica aumentada epinefrina, induo de resistncia no especfica infeco, induo de tolerncia endotoxina, induo de sntese de IgG em camundongos neonatos, induo produo de interferon, induo produo de fator de tumor necrtico, induo produo de quinase-piruvato em fgado de camundongo, hipotermia em camundongos, gelificao do lisado do amebcito de Limulus (LAL).[11] A determinao da sensibilidade relativa de coelhos e humanos a vrias endotoxinas foi considerada de grande importncia, uma vez que o teste de pirogenicidade era feito objetivando segurana no uso de medicamento parenteral em humanos. Embora se admita equivalncia para dose-limite na reao pirognica de coelhos e do homem, quando sob doses consistentemente mais altas, a relao dose-resposta observada no homem mais intensa, podendo ser at 10 vezes maior.[11,13] Esses estudos foram realizados utilizando-se preparaes purificadas, enquanto que as endotoxinas que ocorrem naturalmente como contaminantes de produtos farmacuticos apresentam comportamentos distintos; a pirogenicidade pode depender do tipo de endotoxina, assim como do nvel de dose utilizado.[1]

18 A HIMA (Health Industry Manufacturers Association) nos Estados Unidos escolheu E. coli 055:B5 como padro de referncia de endotoxina aps conduzir um estudo colaborativo entre os laboratrios que realizavam teste de pirognio em coelhos nos Estados Unidos. O estudo estabeleceu com 95% de confiana que uma mdia de 50% de resultados passa ou no passa ocorre em concentraes acima de 98 pg mL-1 (aproximadamente 0,1 ng mL-1). Assim, a HIMA recomendou estabelecer 0,1 ng mL-1 de endotoxina como um padro de referncia contra o qual o ensaio do LAL poderia ser comparado.[11,13,14] O padro de referncia de endotoxina mais comumente chamado EC-5 e pode ser obtido do Office of Biologics, National Center for Drugs and Biologics, por fabricantes licenciados de LAL.[11] A escolha da preparao de E. coli 055:B5 pelo Bureau of Medical Devices foi o resultado de um esforo cooperativo com o propsito de desenvolver guias para a utilizao do ensaio do LAL em dispositivos mdicos.[11] Se um fabricante escolher utilizar uma preparao de endotoxina que no seja o Padro de Referncia de Endotoxina (PRE), este Padro de Endotoxina (PE) deve ser padronizado contra o PRE.[11,12] As relaes entre PE e PRE devem ser determinadas antes da comercializao de um novo lote de LAL, ou um novo lote ou fabricante de PE.[11] 1.4 Processos de Despirogenizao A endotoxina notoriamente resistente destruio pelo calor, dessecao, pH extremos e vrios tratamentos qumicos, por isso a validao do processo de destruio ou remoo da endotoxina na produo de injetveis um fator crtico para o fabricante.[4] Duas grandes classes de processos de despirogenizao que podem ser aplicadas a componentes, dispositivos, materiais que entram em contato com injetveis e s prprias drogas incluem a inativao e a remoo da endotoxina. [1,4,11] A inativao pode ser obtida pela detoxificao da molcula de LPS usando tratamentos qumicos que quebrem pontes lbeis ou bloqueiem stios necessrios

19 atividade pirognica: hidrlise cida, oxidao com perxido de hidrognio, hipoclorito de sdio, periodato de sdio, permanganato de potssio diludo, alquilao com anidrido actico e succnico, ou mesmo xido de etileno. Outros processos que levam inativao de endotoxinas so: tratamento por calor seco, radiao ionizante e tratamento com o antibitico polimixina B.[1,11] A hidrlise cida ocorre na ligao do lipdeo A com o ncleo de polissacardeos separando o lipdeo A do restante da molcula, que isolado e insolvel em meio aquoso tem sua atividade pirognica reduzida ou eliminada. A hidrlise cida tambm pode agir sobre a frao lipdeo A, alterando a conformao da molcula em stios funcionais essenciais, ou clivando cidos graxos, afetando a solubilidade e pirogenicidade do lipdeo.[1,4,11] Na despirogenizao de materiais utiliza-se HCl 0,05 N por 30 minutos a 100 C ou cido actico glacial 1,0% por 2 a 3 horas a 100 C.[1,4,11] No processo de oxidao, o perxido de hidrognio efetivo na eliminao do pirognio da gua Estril para Injeo USP, soluo salina normal e salinadextrose, com vantagem adicional da ausncia de perxidos em seu final. O processo dependente do tempo, pH e concentrao.[1,4,11] O tratamento de endotoxinas com agentes alquilantes, como anidrido actico e succnico, promove reduo de atividade pela acetilao e succinilao, respectivamente.[1,4,11] O xido de etileno um forte agente alquilante com ao eficaz na destruio de endotoxinas. [1,4,11] Para materiais resistentes temperatura, como frascos de vidro e instrumentos metlicos, o mtodo de escolha para inativao de endotoxina o tratamento por calor seco obtido em estufas ou tneis de conveco, conduo ou irradiao (Infravermelho). incinerao.[1,4,11] O mtodo padro de exposio a no menos de 250 C, por no menos que 30 minutos, sendo o mecanismo de inativao a

20 Para verificar a eficcia do processo de despirogenizao por calor seco, devem ser realizados experimentos utilizando quantidades conhecidas de endotoxina de Escherichia coli.[1] A toxicidade de endotoxinas bacterianas reduzida com Cobalto-60, sendo que as alteraes fsicas e biolgicas relatadas so dependentes da dose. Como este processo aumenta a possibilidade de alteraes qumicas desconhecidas em frmacos e solues parenterais, o uso de radiao ionizante na despirogenizao de materiais no tem sido considerado. Os riscos de toxicidade decorrentes do processo superam os benefcios.[1,4,11] A polimixina B um antibitico catinico que pode anular a atividade biolgica da endotoxina, embora mais estudos sejam necessrios para esclarecer a sua ao.[1,4,11] A remoo de endotoxinas pode ocorrer por diferentes mtodos, baseada em caractersticas fsicas da endotoxina, a saber, tamanho, peso molecular, carga eletrosttica ou afinidade da endotoxina a diferentes superfcies: lavagem com gua estril para injeo USP, destilao, ultrafiltrao (o tamanho da subunidade bsica do LPS cerca de 10.000 a 20.000 daltons), osmose reversa, adsoro em carvo ativo ou em asbestos, por atrao eletrosttica, ou em membrana hidrofbica. [1,4,11] A lavagem com solvente livre de pirognio, como gua Estril para Injeo USP, um dos mtodos mais simples e antigos para a remoo de endotoxina de superfcies slidas. Com procedimentos adequados de lavagem podem-se remover nveis baixos de endotoxina superficial de vidraria, tampas e dispositivos.[1,4,11] Na destilao, as molculas de lipopolissacardeos permanecem na fase lquida enquanto a gua pela fervura passa ao estado de vapor. Molculas de LPS que estiverem nas gotculas de gua transportadas pelo vapor tendem a cair por gravidade devido ao seu elevado peso molecular. Sabe-se que a gua recm destilada, coletada e mantida em frascos despirogenizados estreis, apirognica. [1,4,11]

21 Membranas de ultrafiltrao so efetivas como filtros despirogenizantes pois seu mecanismo fundamentado em limites de excluso de peso molecular. Endotoxinas so retidas na superfcie da membrana quando excedem um valor limite de peso molecular, normalmente 10.000 daltons. A ultrafiltrao como mtodo de remoo de pirognios tem sido aplicada com sucesso a uma ampla faixa de frmacos e solues de baixo e mdio peso molecular.[1,4,11] Membranas convencionais de osmose reversa (com porosidade nominal de cerca de 10 A) removem endotoxinas por simples excluso de tamanho, j que os poros da membrana so pequenos o suficiente para impedir a passagem de pirognios. So extremamente efetivas na remoo de endotoxinas da gua, porm o seu uso na despirogenizao tem sido limitado, porque muitas molculas distintas da gua tambm passam atravs dos poros na membrana de osmose reversa. [1,4,11] O procedimento mais adotado para a despirogenizao de solues pela adsoro de endotoxinas ao carvo ativo a sua adio soluo e aps agitao, o carvo removido por filtrao ou precipitao. Como o carvo possui grande afinidade por substncias no ionizadas de elevado peso molecular, a sua aplicao limitada.[1,4,11] Os agregados de endotoxina so negativamente carregados e se comportam como nions em pH acima de 2. No passado, o asbestos em pH abaixo de 8,3, foi empregado para remoo de endotoxinas por adsoro, por apresentar superfcie com carga positiva. Atualmente, procura-se adotar material sinttico base de poliamidas ou aminas. Produtos microporosos com carga modificada, utilizando membranas com potencial negativo so comercialmente disponveis e empregados com sucesso na despirogenizao de vrias solues farmacuticas.[1,4,11] Polipropileno, polietileno, fluoreto de polivinilideno e politetrafluoretileno apresentam afinidade para ligao endotoxina. Estudos deste mecanismo de ao sugeriram que interaes inicas ou hidrfobas contribuem para a adsoro de endotoxina.[1,4,11]

22 1.5 Ensaio de Pirognio pelo Mtodo in vivo O ensaio in vivo aplicado aos produtos que podem ser tolerados pelo animal em uma dose mxima de 10 mL por kg e envolve a medida do aumento na temperatura em coelhos aps a injeo intravenosa de uma soluo. So utilizados coelhos adultos e saudveis, acomodados individualmente em uma rea com temperatura uniforme entre 20 e 23 C e livre de distrbios que possam excit-los. [4,15] Cada animal deve ser pesado e colocado em gaiola individual seguindo-se a introduo do par termoeltrico para medio da temperatura retal. Determina-se a temperatura corporal, de 40 a 90 minutos antes da injeo para selecionar os coelhos que sero utilizados no ensaio. A disperso da temperatura de controle, entre os animais de cada grupo, no deve ser maior que 1 C, embora sejam valores compreendidos entre 38,0 e 39,8 C.[1,4] As amostras so injetadas na veia marginal da orelha e a temperatura corporal registrada durante pelo menos 3 horas. As determinaes, em caso descontnuo, ao menos trs, devem ser realizadas a intervalos de uma hora aps a inoculao da amostra, ou em maior nmero, a intervalos de tempo menor. O registro grfico contnuo oferece melhores condies para a deciso final pela anlise do perfil da curva.[1] Pelo critrio de interpretao atualmente empregado em pases europeus, cada amostra deve ser avaliada em um grupo de trs animais e quando a soma das elevaes trmicas individuais mximas for inferior a 1,15 C a amostra ser aprovada e caso seja superior a 2,65 C ser rejeitada. Quando o valor da somatria estiver entre estes valores, a amostra ser injetada em outros trs animais.[1] Pelo critrio adotado pela USP, se nenhum coelho apresentar um aumento individual de temperatura de 0,5 C ou mais, acima da respectiva temperatura de controle, o produto atende aos requisitos para ausncia de pirognio. Se o aumento individual for 0,5 C, o ensaio deve ser repetido em outros cinco coelhos. Se no mximo trs dos oito coelhos mostrarem aumentos individuais de temperatura de

23 0,5 C ou mais, e se a soma dos oito aumentos mximos individuais no exceder 3,3 C, o produto atende aos requisitos para ausncia de pirognio.[13,15] O ensaio de pirognio em coelhos, embora seja utilizado quando a metodologia do LAL no aplicada, ainda mantido porque tem a seu favor a situao do envolvimento de toda a reao fisiolgica do animal, constituindo um teste de segurana para os produtos injetveis, lquidos para infuso e perfuso, materiais cirrgicos e descartveis em geral. (FIG. 2)[9]

FIGURA 2

Mtodo in vivo. (Fonte: Charles River Laboratories)

1.5.1 Histrico A maior parte da informao cientfica sobre pirognio foi adquirida nos ltimos 70 anos, mas o estudo da febre, suas causas, mecanismos e efeitos so to antigos quanto a medicina, datando de mais de 2000 anos atrs com os primeiros mdicos gregos.[1,11] Em 1912, Hort e Penfold realizaram importantes investigaes sobre a ento denominada febre da injeo e foram os primeiros a planejar e padronizar um ensaio de pirognio em coelhos.[1,11]

24 Em meados de 1920, Seibert completou uma srie de estudos que comprovou que febres ocasionadas por injees associadas terapia intravenosa resultavam de substncias de origem bacteriana, termoestveis e filtrveis, comumente chamadas de pirognios.[4] A Segunda Guerra Mundial ocasionou uma grande demanda de parenterais de grande volume, levantando a necessidade de um ensaio oficial da Farmacopia Americana (USP). Em 1941, o Comit de Reviso da USP autorizou a realizao do primeiro estudo colaborativo sobre pirognio na Diviso de Bacteriologia do FDA (Food and Drug Administration), envolvendo rgos do governo e 14 indstrias farmacuticas. Os resultados desse estudo levaram incorporao do primeiro ensaio oficial de pirognio em coelhos na 12 edio da USP em 1942.[4]

1.6 Determinao de Endotoxinas Bacterianas pelo Mtodo in vitro O procedimento mais simples e amplamente usado para deteco de endotoxinas baseia-se na gelificao. Volumes iguais de reagente LAL e da soluo a ser analisada so transferidos a tubos de ensaio. A mistura homogeneizada incubada em banho de gua a 37 oC por uma hora. O ponto final da reao facilmente verificado pela remoo dos tubos e inverso a 180. A presena do gel que se mantm slido durante a inverso considerada positiva para endotoxinas. O ensaio se constitui em teste limite, levando-se em considerao a sensibilidade do LAL empregado, que varia de 0,25 a 0,015 UE mL-1. (UE = Unidade de Endotoxina)[1,16] O mtodo se baseia na reao entre os amebcitos e a endotoxina, produzindo um gel opaco facilmente reconhecido.[1] O reagente LAL um extrato aquoso dos amebcitos, que so as clulas sanguneas da hemolinfa azul da espcie de caranguejo ferradura Limulus polyphemus, composto de enzimas que reagem em presena de pequenas quantidades de endotoxina.[2,16] O Limulus habita em alguns locais na costa do Oceano Atlntico dos Estados Unidos at o Golfo do Mxico.[2]

25 Na preparao do lisado do amebcito de Limulus (LAL), os caranguejos so submetidos sangria introduzindo-se uma agulha atravs do msculo entre as regies cefalo-torcica e abdominal. A hemolinfa ento submetida aos processos de estabilizao e purificao para a obteno dos amebcitos.[11,17] A FIG. 3 mostra a seqncia do processo de obteno do sangue do Limulus polyphemus.

(a)

(b)

(c)

(d)

26

(e)

(f)

(g)

(h)

FIGURA 3 (a) Limulus em praia da costa leste dos Estados Unidos, (b) e (c) lavagem dos animais, (d) preparao para extrao do sangue, (e) Limulus polyphemus, (f) extrao da hemolinfa, (g) recolhimento da hemolinfa e (h) tratamento do extrato. (Fonte: Charles River Laboratories)

Os trabalhos de Levin e Bang indicaram que a formao de gel ocorre quando a enzima de coagulao dos amebcitos ativada pela endotoxina, na presena de ctions divalentes, adicionada protena coagulante (coagulognio) (Esquema 1).[2,18] A reao entre o lisado de amebcito e a endotoxina dependente da concentrao de endotoxina, temperatura e pH.[13,18]

27

Endotoxina (LPS) + Ca2+

Fator C

Fator C ativado

(1-3)-glucano

Fator B

Fator B ativado

Fator G ativado

Fator G

Enzima Procoagulante

Enzima Coagulante

Coagulognio

Coagulina (Gel)

Esquema 1

Representao da reao em cascata entre LAL e endotoxina.[2]

1.6.1 Histrico Em 1885, Howell observou que o sangue do Limulus polyphemus, o caranguejo ferradura, formava um gel slido quando retirado do animal. Um ano mais tarde, Loeb relatou que quando as clulas sanguneas do Limulus eram coletadas e expostas a uma substncia estranha, elas se liquefaziam e em seguida coagulavam. Este foi o primeiro de uma srie de artigos que Loeb publicou detalhando vrios aspectos da coagulao com referncia particular aos amebcitos, a nica clula circulante encontrada no sangue do Limulus.[4,11] Posteriormente, Shirodkar e col. informaram que uma bactria marinha gramnegativa no identificada causava uma doena fulminante no caranguejo ferradura caracterizada por uma coagulao intravascular considervel e morte.[4,11]

28

Em 1964, Levin e Bang verificaram que preparaes de endotoxina termoestveis isoladas de Escherichia coli e um Vibrio marinho induziam a coagulao extracelular da hemolinfa (sangue) do Limulus. Embora a endotoxina no causasse coagulao do soro livre, a atividade coagulante podia ser restaurada pela adio de amebcitos ao soro. As seguintes concluses puderam ser tiradas do estudo: amebcitos so necessrios para coagulao, o rompimento dos amebcitos potencializava a reao e quantidades de endotoxinas eram provavelmente inativadas pela reao de coagulao.[4,11] A habilidade dos amebcitos de coagular na presena de bactrias Gramnegativas ou suas endotoxinas no restrita somente ao Limulus e foi demonstrado na lagosta, caranguejo e ostra.[4,11] Num estudo subseqente, Levin e col. desenvolveram um ensaio sensvel para endotoxina em plasma humano usando material lisado dos amebcitos de Limulus. Neste trabalho, conseguiu-se detectar 0,0005 g de endotoxina por mililitro e verificou-se que a velocidade de reao era dependente da concentrao de endotoxina. Yin e col. refinaram o ensaio de endotoxina original de Levin para determinar picogramas de endotoxina e demonstraram que a poro do lipdeo A do lipopolissacardeo era responsvel pela gelificao do lisado.[4,11]

A necessidade de um teste de pirognio apropriado para os radiofrmacos, de meia vida curta, levou Cooper e colaboradores a utilizar o mtodo do LAL para estudar outras drogas. Um estudo comparativo feito em 1970 demonstrou que a intensidade de formao do gel estava diretamente relacionada concentrao da endotoxina, porm, alguns cuidados deveriam ser observados: a reao do LAL requer pH neutro e dependente do tempo e da concentrao, alm de ser limitada s solues aquosas ou aos extratos aquosos de produtos descartveis.[1,2] Em 1980, o Bureau of Drugs publicou um ensaio cujo ttulo era Guidelines for Validation of the Limulus Amebocyte Lysate Test as an End Product Test for Human and Veterinary Injectable Drugs and Medical Devices.[5,19]

29 O manual do Food and Drug Administration (FDA), dos Estados Unidos, de 1987 e o Teste para Endotoxinas Bacterianas da USP descrevem recomendaes sobre critrios necessrios no uso do LAL para a validao de produtos para o uso humano, ou em animais, e equipamentos mdicos, em substituio ao ensaio de pirognio realizado nos coelhos.[1] Devido natureza crtica da deteco de endotoxinas pelo LAL em produtos farmacuticos, o FDA Office of Biologics estabeleceu condies padronizadas para a produo e ajuste da potncia de LAL. Desde setembro de 1997, obteve-se a globalizao do padro internacional da endotoxina, e do padro de referncia de endotoxina (PRE), contendo 10.000 unidades internacionais de endotoxina por ampola. Conforme estudos colaborativos envolvendo teste animal e LAL, um nanograma de endotoxina de E.coli 055:B5 similar em potncia a 5 Unidades de Endotoxina (UE) do PRE da USP. Alm disso, quando um LPS padronizado em UE com um lote especfico de LAL e PRE, torna-se um PE (do ingls Control Standard Endotoxin (CSE)), o que permite correlaes entre PRE (UE mL-1) e PE (mg mL-1).[1] Como mtodo de deteco de endotoxinas bacterianas, o ensaio de LAL foi pela primeira vez introduzido na USP XX (1980).[1,15] No Brasil, foi incluso na 4. Edio da Farmacopia em 1996.[1] A adoo do ensaio de LAL passou a permitir limites quantitativos de endotoxina. O limite de endotoxina para liberao de produtos parenterais, com base na dose, corresponde a K/M, onde K igual a 5 UE por Kg de peso corpreo, e M igual dose mxima humana recomendada por Kg, que pode ser administrada no perodo de uma hora. Conforme definido pelo Center for Devices and Radiological Health (CDRH) do FDA, os limites atuais para dispositivos mdicos so de 0,5 UE mL-1 e 0,06 UE mL-1 para aqueles em contato com o fluido cerebrospinal. Os clculos de dose so baseados em peso corpreo humano de 70 kg.[1,14,19]

30 A Farmacopia Americana (USP) adotou limites especficos para diversos produtos como, por exemplo, o de 175 UE por dose para os radiofrmacos. [10,15,17] A metodologia apresentada na Farmacopia Brasileira [20] admite o mtodo de gelificao, turbidimtrico ou colorimtrico do tipo cintico ou leitura final para determinao de pirognio/endotoxina. Para a tcnica de gelificao, exigida a validao, incluindo o teste de sensibilidade do reagente LAL, utilizando srie de diluio do Padro de Referncia de Endotoxina (PRE) ou Padro de Endotoxina (PE), padronizado em relao ao PRE, com razo geomtrica igual a 2, para obter as concentraes de 0,25 0,5 e 2 em que a sensibilidade declarada do reagente LAL em UE mL-1 (Unidade de Endotoxina por mililitro), e o ensaio de inibio ou potencializao de resposta, executado para avaliar a compatibilidade do produto. A validao dever ser repetida em caso de mudana de fornecedor do LAL [1,20,21], ou de mudana significativa na formulao da amostra.[1,20] 1.7 Validao do Ensaio do LAL Historicamente, fabricantes de parenterais de grande volume tm se dedicado principalmente ao desenvolvimento de ensaios de endotoxina bacteriana devido problemtica de concentraes mnimas de endotoxina bacteriana em solues administradas em grandes quantidades. Porm, muitos dos problemas atuais se referem recuperao do controle positivo do padro de endotoxina, exacerbada pela natureza qumica dos materiais que esto sendo validados.[4] Alguns tipos comuns de compostos que apresentam problemas nos ensaios de endotoxina para parenterais de pequeno volume incluem drogas insolveis em gua, drogas com atividade que simula a de endotoxina, drogas que contm endotoxina (que deve ser removida antes da validao), drogas com potncias variadas, drogas mltiplas num mesmo recipiente, e drogas com grande potencial de interferncia como os quimioterpicos.[4]

31 O grande desafio de um laboratrio de anlise de parenterais o desenvolvimento de um ensaio de LAL que seja robusto, reprodutvel e automatizado para uso rotineiro.[4,22] Sob o ponto de vista legal, o ensaio de LAL deve atender aos requisitos dos compndios oficiais e no necessita ser quantitativo exceto na sua capacidade de demonstrar a deteco da concentrao limite de endotoxina (mtodo de formao de gel).[4] As caractersticas de uma boa validao do ensaio de LAL que contempla em termos gerais, os mtodos cinticos e de formao de gel, incluem ausncia de interferncia (positivos so positivos e negativos so negativos), solubilidade adequada do produto quando reconstitudo e diludo ou simplesmente diludo, demonstrao de que o mtodo escolhido no reduz ou destri a endotoxina que pode estar presente caso sejam empregadas condies drsticas ou solventes, meio de pH neutro da amostra com o reagente LAL (6,0 a 8,0), documentao dos artigos consumveis no ensaio atestando a condio livre de endotoxina, registros apropriados dos equipamentos utilizados.[4] Ao se estabelecer um mtodo para o ensaio de LAL para um frmaco devese identificar uma concentrao de amostra compatvel para a anlise de rotina. A compatibilidade do LAL uma condio onde um padro de endotoxina detectado com a mesma eficincia numa amostra de produto ou em gua para injeo.[23] necessrio realizar a validao do Ensaio de Gelificao ou Formao de Gel em radiofrmacos para administrao parenteral. Mtodos oficiais de vrios pases e o Guia para o Ensaio de LAL do FDA (Food and Drug Administration) requerem um mnimo de 3 lotes de cada produto para a validao com um fornecedor especfico de reagente LAL.[19,24] Uma validao deve demonstrar que as amostras no interferem no ensaio de LAL considerando dois fatores importantes: (1) determinao da sensibilidade do LAL e (2) determinao da potencializao ou inibio do teste de LAL.[12]

32

A validao do ensaio de LAL garante que independentemente do mtodo ou lote, em determinadas diluies do produto no h interferncias e, portanto a quantificao de endotoxinas em uma dada amostra confivel. [2,15,20] O que se valida a amostra e a sua diluio, e no se trata, por exemplo, de realizar ensaios de linearidade, exatido ou preciso como se descreve para a maioria dos mtodos analticos.[2] 1.8 Interferncias Dentre as fontes comuns de interferncia no ensaio de determinao de endotoxina incluem-se condies em que se realiza a reao enzimtica de gelificao, ou que alteram a disperso da endotoxina . Entretanto, alguns produtos podem provocar a inibio ou a potencializao da reao. Muitas destas substncias que causam interferncias so compostos de peso molecular relativamente alto formados de unidades repetidas, com elevada incidncia de polissacardeos. Por isso, a inibio ou a potencializao devem ser determinadas para cada formulao.[25] Podemos incluir tambm como fontes de interferncia: condies no timas de pH, agregao ou adsoro da endotoxina, concentraes no adequadas de ctions divalentes, modificao da enzima ou protena, ativao no especfica do reagente LAL.[4,25] A reao LAL-endotoxina otimizada na faixa de pH 6,4 a 8,0. Abaixo ou acima da neutralidade, a reatividade do LAL diminui. A utilizao de tampes e diluies minimiza esse problema.[4,25] A endotoxina uma molcula grande com regies lipoflicas e hidroflicas permitindo interaes com outras molculas de endotoxina e certas substncias formando micelas. Com o aumento da agregao molecular, diminui a reatividade do LAL. So utilizados agentes catinicos dispersantes em soluo a 2%, mas geralmente, diluies minimizam os efeitos inicos a uma faixa permissvel.[25]

33 Os tubos de diluio da endotoxina devem ser de vidro borossilicato de alta qualidade para evitar adsoro da endotoxina nas paredes e, em caso de lavagem e reutilizao, deve-se tomar cuidado para remover todos os traos de detergente para evitar formao de micela. O uso de tubos de plstico, principalmente de polipropileno, no recomendado.[4,25,26,27] Os ctions divalentes desempenham um importante papel na reatividade do LAL e na disperso da endotoxina. A reatividade do LAL ser diminuda ou aumentada se as concentraes de clcio e magnsio no estiverem otimizadas. [25,28,29] Quelantes orgnicos esto em frmulas de medicamentos com o propsito de complexar ctions de metais pesados que contribuem para a instabilidade. Anticoagulantes tambm, como a heparina sdica e o citrato ligam-se ao clcio por quelao e inibem o teste de LAL, havendo necessidade de reposio de ctions divalentes. A melhor forma de corrigir a depleo de clcio calcular a quantidade de clcio necessria e acrescentar cloreto de clcio livre de pirognio. Ctions divalentes so adicionados aos lisados para aumentar a sensibilidade do LAL.[25] Porm os nveis de clcio devem ser ajustados cuidadosamente para evitar um clculo exagerado dos nveis de endotoxina quando analisar drogas que contenham sais de Ca ou Mg.[25,30] O fenmeno da gelificao baseado numa cascata de coagulao enzimtica que envolve serina proteases (Esquema 1). A inativao da enzima devido a oxidantes, antioxidantes, agentes proteolticos ou inativantes especficos causar inibio. A propriedade desnaturante de lcoois e fenis limita seus nveis no produto analisado. O caminho prtico para resolver esses problemas, mais do que diluio aplicar tcnicas especficas, por exemplo, inativao qumica ou por calor.[25] Eluies ou extratos de certos materiais celulsicos podem conter traos de um agente conhecido como material reativo do LAL ou (1-3) D-glucano. Esta substncia aparentemente inicia a reao de gelificao do LAL por um caminho enzimtico alternativo. Foi verificada a presena de glucanos em filtrados provenientes de filtros de acetato de celulose. Esta interferncia pode ser evitada, substituindo-se a fonte de glucano por outro tipo de filtro.[25,31]

34

1.9 Outros Mtodos para Determinao de Endotoxinas Embora o ponto final de gelificao seja o mais amplamente usado dentre os mtodos de LAL, apresenta a desvantagem de impedir a quantificao da endotoxina em nveis abaixo daqueles em que se forma o gel consistente.[1,11] Assim, existem outros mtodos, entre eles, turbimtrico quantitativo, colorimtrico de protena, nefelomtrico e cromognico quantitativo que proporcionam informaes quantitativas e qualitativas acerca da concentrao de endotoxina nas amostras.[1,11] 1.9.1 Mtodo Turbidimtrico Quantitativo Este ensaio baseado no fato de que qualquer aumento na concentrao de endotoxinas causa um aumento proporcional na turbidez devido precipitao de protena coagulvel (coagulognio) no lisado. Procede-se leitura da densidade ptica de vrias diluies da substncia a ser analisada contra curva-padro e so obtidas medidas quantitativas de endotoxinas, em grande faixa de concentraes. [1,11] Nesta tcnica cintica, mede-se o tempo necessrio para se atingir uma absorbncia pr-determinada da mistura de reao ou a velocidade de desenvolvimento da turbidez.[4,12] Levin e Bang em 1968 foram os primeiros a propor um mtodo cintico turbidimtrico para a determinao de endotoxinas com o reagente LAL.[18] Inicialmente este mtodo era pouco empregado devido provavelmente carncia de equipamentos capazes de manipular vrias amostras ao mesmo tempo. Algumas modificaes foram feitas para simplificar e facilitar a aplicao desta metodologia, a saber, o emprego de um leitor de microplacas de alta resoluo dotado de um incubador a 37 C, o uso de um programa de computador para a aquisio e processamento dos dados e uma formulao de reagente LAL mais sensvel.[2]

35 1.9.2 Mtodo Colorimtrico de Protena Conforme o mtodo de formao do gel, quantidades da amostra e lisado so misturadas em tubos, incubadas por 1 hora a 37 oC e ento centrifugadas. No sobrenadante, a protena do coagulognio determinada pelo mtodo de Lowry, com a utilizao de um espectrofotmetro, com leituras em 660 nm.[1,11] 1.9.3 Mtodo Nefelomtrico Tem sido utilizado principalmente na determinao de endotoxinas em solues parenterais de grande volume. baseado na disperso relativa de luz, utilizando-se um nefelmetro a laser Hyland. Assim como o mtodo colorimtrico, o mtodo nefelomtrico no tem se mostrado promissor.[1,11] 1.9.4 Mtodo Cromognico Quantitativo Baseia-se na ao da endotoxina bacteriana para ativao da enzima de coagulao, que reage com um substrato cromognico sinttico incolor. Este substrato composto por um pequeno peptdeo ligado pela arginina C-terminal a uma molcula do cromforo p-nitroanilina (pNA). Uma vez ativada a reao enzimtica em cascata, a enzima de coagulao provoca a liberao da molcula de pNA de cor amarela. O desenvolvimento da cor proporcional concentrao de endotoxina na amostra.[2] A liberao do cromforo pode ser monitorada espectrofotometricamente, em 405 nm.[1] Nesta tcnica cintica, mede-se o tempo necessrio para se atingir uma absorbncia pr-determinada da mistura de reao ou a velocidade de desenvolvimento da cor.[4,12] O esquema que descreve o princpio do mtodo pode ser representado pelas equaes 1 e 2:

36

Pr-enzima Enzima + substrato cromognico

Endotoxina

Enzima Peptdeo + p-nitroanilina ( =405 nm)

(1) (2)

Esquema 2

Fases envolvidas na determinao de endotoxina bacteriana,

pelo mtodo cromognico. (Fonte: Charles River Laboratories) Embora pelo mtodo cromognico a faixa de concentrao de endotoxina seja ampla, a velocidade da reao lenta e proibitiva quando necessrio realizar grande nmero de amostras, o que pode ser superado com um sistema semiautomtico cintico, por exemplo, leitor de ELISA e programa especfico de computador.[1] Para assegurar a validao das tcnicas cinticas turbidimtricas e cromognicas, so necessrios ensaios para verificar se os critrios para a curva padro so vlidos e que a amostra no inibe ou potencializa a reao. Uma revalidao do mtodo de ensaio necessrio quando as condies que influenciam o ensaio so alteradas.[4]

37

2 OBJETIVO O objetivo deste trabalho foi validar o mtodo de determinao de endotoxina bacteriana para os radiofrmacos m-iodobenzilguanidina-131I (MIBG-131I), citrato de Glio-67 (67Ga), cloreto de Tlio-201 (201Tl) e reagentes liofilizados cido Dietilenotriaminopentactico (DTPA), Fitato, Glucoheptonato de Clcio (GHA), Soro Albumina Humano (SAH) e Estanho Coloidal (Sn Coloidal).

38

3 REVISO DA LITERATURA Zijlstra e col. (1997) [10] realizaram a validao em amostras de radiofrmacos de meia vida curta, como o Fluordeoxiglicose-18F, Acetato-11C e Amnia-13 N, pelo mtodo cintico turbidimtrico do LAL. A sensibilidade do reagente LAL utilizado foi de 0,03 UE mL-1 e o limiar da densidade ptica foi definido em 0,02 unidades de absorbncia. O tempo de reao foi calculado por anlise de regresso e foi estabelecido em 1800 s. Os resultados demonstraram que o ensaio inibido pelo pH e potencializado por nions para Amnia-13N. McCullough e Weidner-Loeven (1992) [32] estudaram a variabilidade no Ensaio do LAL comparando trs mtodos cinticos para avaliao de treze produtos farmacuticos injetveis. Para todos os ensaios foi construda uma curva padro na faixa de 0,05 a 5,0 UE mL-1. A sensibilidade lambda ( ) ou o menor ponto da curva padro foi 0,05 UE mL-1. Foram utilizados dois mtodos para o ensaio turbidimtrico que diferiam somente na proporo de amostra e reagente LAL, com leitura espectrofotomtrica em 340 nm, e o mtodo cintico cromognico com leitura em 405 nm. Cada produto foi analisado em trs concentraes: diluio da MDV (Mxima Diluio Vlida), metade da MDV e 0,10 da MDV. Foi verificado que a maioria das amostras foi inibitria e que a diluio simples com gua apirognica mostrou-se maneira fcil e efetiva de minimizar as interferncias. Recuperaes satisfatrias dos controles positivos dos produtos (RCPP) foram observadas para cada um dos 13 produtos avaliados em no mnimo um dos trs mtodos cinticos utilizados, sugerindo que problemas causados pela variabilidade da %RCPP podem ser facilmente controlados no laboratrio pela flexibilidade na escolha do mtodo. McCullough (1990) [33] observou que h diferenas na formulao de lisados de diferentes fabricantes na capacidade tamponante, presena e concentrao de agentes tensoativos e concentrao de ctions divalentes. Cada uma dessas diferenas pode afetar os perfis de inibio/potencializao (interferncias) observados durante a validao do produto. Foi tambm reconhecido que a compatibilidade do lisado com o produto pode mudar de acordo com o mtodo

39 escolhido: formao de gel, turbidimtrico ou cromognico, e o Guia do FDA recomenda que os produtos sejam revalidados sempre que o mtodo for alterado. Podem ocorrer ainda, variaes de lote a lote no pH das solues parenterais, concentrao do sal, concentrao de ction divalente, tampes, conservantes, fonte da matria prima e mesmo outras possveis endotoxinas. Foram feitas vrias consideraes para se evitar tais problemas. Murata e col. (1976) [34] avaliaram a sensibilidade do ensaio do Limulus e os fatores inibitrios em 21 radiofrmacos comumente utilizados no Japo. A sensibilidade verificada foi de 1 g mL-1 para a endotoxina de E. coli, sendo cerca de dez vezes a sensibilidade do ensaio em coelhos adotado pelas Farmacopias Americana e Japonesa. O ensaio de LAL foi aplicvel sem reao inibitria na avaliao de
131 111 99m

TcO4-, albumina -99mTc, MAA -99mTc, Sn Coloidal -99mTc, Hippuran67

I, Na131I, Na251CrO4, Citrato de

Ga e Bleomicina-57Co. Por outro lado, DTPA59

In, Fitato-99mTc, Pirofosfato-99mTc, PVP-99mTc,

FeCl3, Na332PO4,

198

Au Coloidal e

Selenometionina-75Se necessitaram de ajuste de pH com tampo Tris-HCl para evitar inibio na reao de gelificao. A faixa tima de pH encontrada para a reao foi 6,0-7,5. Para anlise de rotina, o ensaio do Limulus mostrou-se mais simples, rpido e sensvel do que o ensaio em coelhos e 19 dos 21 radiofrmacos estudados apresentaram condies para a sua utilizao. Cooper e col. (1971) [13] estudaram os mtodos in vitro (LAL) e in vivo (coelhos) para a deteco de endotoxina em radiofrmacos de meia vida curta, comparando quantitativamente a sensibilidade endotoxina do ensaio de Limulus com a resposta pirognica em coelhos usando lipopolissacardeos purificados de E. coli e Klebsiella. A sensibilidade dos coelhos aos efeitos pirognicos de endotoxinas purificadas foi avaliada com 4 diferentes doses. No ensaio LAL, foi observado que foram necessrias quantidades menores da endotoxina de Klebsiella do que da endotoxina de E. coli para provocar a formao do gel. A velocidade de gelificao e/ou aumento da viscosidade foi proporcional concentrao de endotoxina. O ensaio LAL detectou concentraes menores de endotoxina do que o uso dos coelhos.

40

4 MATERIAIS E MTODOS Os protocolos de validao foram estabelecidos para os radiofrmacos m-iodobenzilguanidina-131I (MIBG-131I), citrato de Glio-67 (67Ga), cloreto de Tlio-201 (201Tl) e para os reagentes liofilizados cido Dietilenotriaminopentactico (DTPA), Fitato, Glucoheptonato de Clcio (GHA), Soro Albumina Humano (SAH) e Estanho Coloidal (Sn Coloidal). As frmulas dos produtos radioativos expressam a concentrao radioativa da soluo (MBq mL-1) por lote. A composio dos reagentes liofilizados para marcao com 99mTc apresentada por lote e por frasco analisado. (TAB. 1)

TABELA 1

Frmulas dos produtos

Produtos Radioativos
Produto MIBG- 131I pH final: 4,0-6,0 Reagente MIBG Na131I (NH4)2SO4 Etanol:gua Purificada (1:1) CuSO4 1% NaCl 0,9%-lcool benzlico 1%
67 67

Quantidade/lote 2,0 4,0 20,0 40,0 14,0 mg 14,0 mg 40,0 L 50,0 mL

Concentrao radioativa/lote 51,8 1110 MBq mL-1

1295 - 16650 MBq 0,2 - 0,25 mL

Ga

pH final: 4,5-8,0

Cloreto de Ga Citrato de sdio 3,8% HCl 3,5 mol L-1 H2O2 30 % gua purificada Cloreto de 201Tl NaCl 0,9% Volume final da soluo

55500 MBq 47,0 mL 2,0 mL 1,0 mL 67,0 mL 11100 - 12950 MBq 120,0 mL 40,0 mL

407 MBq mL

-1

201

Tl

111 MBq mL-1

pH final: 5,5-7,0

41

Reagentes Liofilizados para Marcao com 99mTc

Produto DTPA pH final: 4,0

Reagente cido dietilenotriaminopentactico SnCl2.2H2O cido para-aminobenzico (PABA) NaOH 1 mol L

-1

Quantidade/lote 7,0 g 0,700 g 1,4 g q.s. 663,0 mL 700,0 mL (para 700 frascos de 1 mL) 14,0 g 0,700 g
-1

Quantidade/ frasco 10,0 mg 1,0 mg 2,0 mg ----1 mL 20,0 mg 1,0 mg ------1 mL 100,0 mg 2,0 mg ----1 mL 10,0 mg 0,04 mg ------1 mL 1,0 mg 0,125 mg 0,5 mg --1 mL

gua Purificada Volume final da soluo Fitato pH final: 6,0 cido Ftico SnCl2.2H2O HCl 0,1 mol L HCl 2 mol L
-1

10,0 mL 28,0 mL 662,0 mL 700,0 mL (para 700 frascos de 1 mL) 8,0 g 0,180 g 80,0 mL q.s. 80,0 mL (para 80 frascos de 1 mL) 10,0 mL 0,133 g 187,0 mL

gua Purificada Volume final da soluo GHA pH final: 5,0 6,0 Glucoheptonato de clcio TINAST (ascorbato de estanho) NaCl 0,9% NaOH 1 mol L
-1

Volume final da soluo SAH pH final: 5,0 Soro Albumina Humano 20% SnCl2.2H2O NaCl 0,9% HCl 1 mol L
-1 -1

q.s. 2,0 mL 200,0 mL (para 200 frascos de 1mL) 0,700 g 0,0875 g 0,318 g 700,0 mL 700,0 mL (para 700 frascos de 1 mL)

HCl 0,1 mol L

Volume final da soluo Sn Coloidal pH final: 4,0 6,0 Fluoreto de sdio (NaF) Fluoreto de Sn (SnF2) Polivinilpirrolidona-40 (PVP-40) gua Purificada Volume final da soluo

42 4.1 Materiais 4.1.1 Materiais utilizados no Mtodo in vitro de Determinao de Endotoxina Bacteriana por Formao de Gel

No mtodo de formao de gel, foi utilizado Reagente do Lisado de Amebcito de Limulus (LAL) com licena de registro no Ministrio da Sade, combinado com o Padro de Endotoxina (PE) com Certificado de Anlise do fabricante (LAL e PE da Endosafe, Charleston, EUA). A sensibilidade lambda ( ) do LAL declarada pelo fabricante foi de 0,125 UE mL-1. Todas as diluies foram feitas em frascos de vidro despirogenizados no IPEN (tratados termicamente a 250 C por 30 minutos) com ponteiras estreis livres de pirognio (MLA) e gua livre de pirognio (Sterile Water for Injection - Endosafe, Inc.TM, Charleston, SC). Tubos plsticos despirogenizados com tampa (Endosafe, Inc.TM, Charleston, SC) contendo 0,1 mL de amostra e 0,1 mL de LAL foram incubados em banho-maria Eletrolab a 371 C, por 602 minutos.[4,15] Os dados dos materiais utilizados foram registrados em ficha conforme modelo no Anexo 1.

4.1.2 Materiais utilizados no Mtodo Cromognico Endotoxina Bacteriana

PTS de Determinao de

Para os ensaios quantitativos cromognicos foram utilizados cartuchos (Endosafe, Inc.TM, Charleston, SC) com 4 canais contendo o reagente LAL e um substrato cromognico. Dois canais so os controles negativos do produto e dois com endotoxina na concentrao de 0,3 UE mL-1 so os controles positivos do produto (FIG. 4). As leituras das amostras foram feitas utilizando Sistema de Teste Porttil (PTS) (Endosafe, Inc.TM, Charleston, SC) a 371 C (FIG. 5).

43

FIGURA 4 - Representao do Cartucho PTS para Determinao de Endotoxina. (Fonte: Alko do Brasil)

FIGURA 5 - Sistema de Teste Porttil (PTS). (Fonte: Alko do Brasil)

44 4.1.3 Materiais utilizados no Mtodo Turbidimtrico de Determinao de Endotoxina Bacteriana

Para o ensaio quantitativo turbidimtrico, foram utilizados: reagente LAL KTS (Kinetic Turbidimetric System) com sensibilidade de 0,05 UE mL-1 (Endosafe, Inc.TM, Charleston, SC), Padro de Endotoxina utilizado no mtodo de formao de gel em concentraes de curva padro de 5,0, 0,5 e 0,05 UE mL-1, placas apirognicas descartveis de poliestireno com 96 poos para leitura dos padres e das amostras, espectrofotmetro TECAN SUNRISE (FIG. 6) com programa Endoscan-V (Endosafe, Inc.TM, Charleston, SC) para leitura em 340 nm.

FIGURA 6 - Espectrofotmetro TECAN SUNRISE. (Fonte: Charles River Laboratories)

4.2 MTODOS 4.2.1 Mtodo de Formao de Gel As amostras foram preparadas conforme o Teste de Endotoxinas Bacterianas (TEB) descrito na Farmacopia Americana.[15]

45 O controle negativo do produto foi preparado adicionando-se gua em uma proporo definida e conhecida, o controle positivo do produto foi preparado com o dobro da concentrao do controle negativo mais a mesma quantidade de Padro de Endotoxina (PE) em concentrao de 0,50 UE mL-1. Nos ensaios de verificao de interferncias, o controle negativo do produto, o controle positivo do produto e o controle negativo da gua foram realizados em duplicata. Em cada frasco dos reagentes liofilizados DTPA, Fitato, GHA, SAH e Sn Coloidal, adicionou-se gua livre de pirognio para a reconstituio, diluio e preparao dos controles negativo e positivo dos ensaios de inibio ou potencializao. As sries de diluies sucessivas de cada produto com a endotoxina tambm foram preparadas a partir de um nico frasco e a quantidade de gua adicionada variou com o fator de diluio. Para uma diluio de 16 vezes, acrescentou-se 4 mL de gua no frasco, retirou-se 1 mL para outro frasco e adicionou-se 3 mL de gua. O volume das amostras dos radiofrmacos MIBG-131I,
67

Ga e

201

Tl foi de 0,1

mL. Adicionaram-se 0,9 mL de gua em cada frasco, resultando um fator de diluio de 1:10. A partir da, foram feitas diluies para o controle negativo e positivo do produto para os ensaios de inibio ou potencializao. Para as sries de diluies sucessivas do produto e endotoxina, o volume de gua acrescentado amostra inicial foi 4,9 mL (Diluio 1:50).

Procedeu-se aos ensaios de inibio ou de potencializao e aos ensaios para a determinao da sensibilidade do reagente LAL, em que os produtos foram submetidos a ensaios em diluies seriadas, com a preparao das diluies sucessivas de padro de endotoxina em gua e diluies sucessivas de padro de endotoxina com o produto.[19] O resultado interpretado como positivo ou negativo. Um resultado positivo apresenta a formao de um gel firme capaz de manter a sua integridade aps

46 retirar cuidadosamente cada tubo do banho-maria e inverte-lo 180 (FIG. 7). O resultado negativo para endotoxina quando no h formao de gel ou formao de um gel que no adere ao fundo quando o tubo invertido.[1,4,15]

FIGURA 7 - Inverso a 180 do tubo de reao.

4.2.1.1 Preparao das Diluies Sucessivas de Padro de Endotoxina Diluies do PE de 0,5 UE mL-1 em gua foram preparadas diluindo-se 1 mL de PE de 1 UE mL-1 com 1 mL de gua. Para se obter a diluio de 0,25 UE mL-1, 1 mL do PE de 0,5 UE mL-1 foram posteriormente diludos com 1 mL de gua. Em seguida, diluies dobradas sucessivas (0,125, 0,06 e 0,03 UE mL-1 de PE em gua) foram feitas conforme Esquema 3 e as amostras foram incubadas em quadruplicata.

4.2.1.2 Preparao das Diluies Sucessivas do Produto com Padro de Endotoxina De modo semelhante ao item anterior, diluies sucessivas do produto com endotoxina foram preparadas com quantidades iguais de amostra do produto em uma diluio definida e concentrao em dobro do PE (Esquema 3). 0,1 mL de cada uma das diluies foi incubado em quadruplicata com 0,1 mL de LAL.

47

Foram observadas as menores concentraes de endotoxina em que ocorreu a formao de gel firme em duas sries paralelas de diluies sucessivas de Padro de Endotoxina em gua e de Padro de Endotoxina no produto na diluio definida. Os resultados em 3 lotes consecutivos de cada produto foram registrados.[15]

1 mL gua 1 mL 1 mL

1 mL gua 1 mL

1 mL gua 1 mL

1 mL gua 1 mL

1 mL gua

PE
1 UE mL -1

s/A

s/A

s/A

s/A

s/A

0,5UE mL-1

0,25UE mL-1 0,125UE mL-1 0,06UE mL-1 0,03UE mL-1

Diluies Sucessivas do Padro de Endotoxina

0,5 mL

0,5 mL

0,5 mL

0,5 mL

0,5 mL

0,5UE mL-1 0,5 mL A

0,25UE mL-1 0,125UE mL-1 0,06UE mL-1 0,03UE mL -1 0,5 mL A 0,5 mL A 0,5 mL A

0,5 mL A

Diluies Sucessivas do Produto com Padro de Endotoxina

dobro da concentrao da amostra do controle negativo Representao das Diluies da Curva Padro em gua e no Produto

Esquema 3

4.2.1.3 Determinao da Sensibilidade do Reagente LAL Os reagentes LAL foram padronizados quanto sensibilidade para endotoxina de E. coli (concentrao de endotoxina detectada pelo reagente).[1] A sensibilidade do reagente LAL (em UE mL-1) foi calculada pela mdia geomtrica da menor concentrao de endotoxina em que ocorreu a gelificao, conforme a equao 3:

48

Mdia Geomtrica da Concentra o do Ponto Final

antilog

e f

(3)

onde

o log das concentraes do ponto final de gelificao das sries de

diluies e f o nmero de replicatas. A sensibilidade do lisado foi obtida a cada novo lote de Reagente LAL ou quando ocorreu alterao nas condies experimentais.[15] 4.2.2 Mtodo Cromognico - PTS Introduziu-se volume de 25 microlitros ( L) de amostra na diluio do ensaio nos quatro reservatrios de cada cartucho que foi inserido no PTS. As amostras foram aspiradas e misturadas com os reagentes, sendo ento incubadas. Cada lote de cartucho possui um cdigo de calibrao que est relacionado com uma curva padro do log do tempo de reao pelo log da concentrao de endotoxina, construda na faixa de 2 log. Depois que a reao ocorre, a intensidade da cor medida e a densidade ptica comparada com a curva padro arquivada internamente especfica para cada lote de cartucho. O tempo de cada anlise foi de 15 a 20 minutos, com leitura da intensidade de cor em 405 nm. Pela interpolao do tempo de reao necessrio para alcanar determinada densidade ptica foram calculados a Concentrao de Endotoxina no Produto (CEP) e o Controle Positivo do Produto (CPP).[1] Os critrios para a validao em uma determinada diluio so: Coeficiente de Variao (CV) e Recuperao do Controle Positivo do Produto (RCPP). O coeficiente de variao (CV) a diferena percentual de leitura entre as amostras. A porcentagem de recuperao do controle positivo do produto (RCPP) representa a relao entre a concentrao de endotoxina do controle positivo do produto e uma concentrao especfica de endotoxina (0,3 UE mL-1).[15]

49

4.2.3 Mtodo Turbidimtrico Foram introduzidos em duplicata, nos poos de uma placa de poliestireno, 0,1 mL de cada concentrao do Padro de Endotoxina, 0,1 mL de amostra diluda para o controle negativo do produto, 0,1 mL de amostra contaminada com endotoxina na concentrao de 0,5 UE mL-1 para o controle positivo do produto, e 0,1 mL de gua para o controle negativo da gua. A seguir, pipetou-se rapidamente 0,1 mL de LAL KTS reconstitudo com gua, iniciando pelo controle negativo em direo concentrao mais alta de endotoxina. A placa foi colocada na cmara do espectrofotmetro para dar incio reao. Os parmetros de ensaio foram definidos em: tempo de coleta 3600 segundos, intervalo de tempo para obteno de leitura 30 segundos, temperatura da placa 371 C. Foram obtidos os valores de: Tempo Mdio de Reao (s), %CV e Valor Calculado (UE mL-1) para cada uma das concentraes de endotoxina (5,0; 0,5 e 0,05 UE mL-1). Foi construda a curva padro do log do tempo de reao pelo log da concentrao de endotoxina, na faixa de 2 log e foram calculados os parmetros de coeficiente angular, coeficiente linear e coeficiente de correlao (R) da curva padro. Pela interpolao do tempo de reao necessrio para alcanar determinada densidade ptica foram calculados a Concentrao de Endotoxina no Produto (CEP) e o Controle Positivo do Produto (CPP).[1] Os critrios para a validao do produto em uma determinada diluio so: Coeficiente de Variao (CV) e Recuperao do Controle Positivo do Produto (RCPP).[15]

50 5 RESULTADOS E DISCUSSO

Para evitar interferncias devido s condies do teste e reduzir a probabilidade de se detectar nveis de endotoxina clinicamente insignificantes, podem ser feitas diluies do produto. So utilizados limites para se determinar a extenso da diluio (Mxima Diluio Vlida MDV) que pode ser aplicada para evitar um problema de interferncia, e cujo resultado de concentrao de endotoxina no produto no exceda a concentrao limite de endotoxina.[15,19] O limite de endotoxina estabelecido para radiofrmacos 175 UE por dose, onde a dose (volume mximo recomendado) 7,0 mL.[10,15,17]

5.1 Validao dos Produtos pelo Mtodo de Formao de Gel 5.1.1 Clculo de MDV A MDV a mxima diluio vlida permitida de um produto, na qual o limite de endotoxina pode ser determinado. A equao geral para determinar a MDV [19]

MDV

Limite de Endotoxina x Potncia do P roduto sensibilidade declarada (UE por mL) do Reagente LAL
67 201

(4)

Para MIBG-131I,

Ga,

Tl, DTPA, Fitato, GHA, SAH e Sn Coloidal, a

concentrao limite de endotoxina (L.E.) 175 UE por dose, resultando em limite de endotoxina de 25 UE mL-1 . Aplicando na Equao 4 onde a potncia 1,00 mL por mL para drogas administradas em volume por quilograma e a sensibilidade declarada do Reagente LAL utilizado ( = 0,125 UE mL-1) obtm-se o fator de MDV. [19] O fator o limite de diluio do produto para o ensaio ser vlido. O resultado do clculo de MDV para os radiofrmacos MIBG-131I,
67

Ga,

201

Tl,

DTPA, Fitato, GHA, SAH e Sn Coloidal pelo mtodo de formao de gel, utilizando a sensibilidade declarada do LAL de 0,125 UE mL-1, foi 200, isto , os produtos

51 podem ser diludos at 200 vezes de modo que a endotoxina ainda pode ser detectada. Para produtos que no tm uma concentrao limite de endotoxina oficial publicada (USP ou FDA), a equao de MDV considera a Mnima Concentrao Vlida (MCV). A MCV a menor concentrao da amostra que pode ser analisada e ainda possuir a sensibilidade adequada. MCV XM K (5)

MDV

Potncia do produto MCV

(6)

onde M a dose humana mxima por kg no perodo de uma hora (dose de 7 mL para radiofrmacos e considerando 70 kg o peso mdio de um homem adulto) e K 5,0 UE kg-1 para drogas parenterais.[19] Considerando K = 2,5 EU kg-1 para radiofrmacos conforme a Farmacopia Europia [12], utilizando as equaes 5 e 6, o resultado de Mxima Diluio Vlida para os radiofrmacos 200, confirmando o valor obtido atravs da Equao 4.

5.1.2 Inibio ou Potencializao Para que o mtodo de formao de gel seja considerado vlido, deve ser confirmado se o produto inibe ou potencializa a reao de LAL para a deteco de endotoxinas. Vrios lotes de MIBG-131I,
67

Ga,

201

Tl, DTPA, Fitato, GHA, SAH e Sn

Coloidal foram submetidos ao teste USP realizando-se diluies seriadas para verificao de interferncias de inibio ou potencializao. Ocorre inibio quando h quantidade suficiente de endotoxina para a formao de gel, porm a amostra impede a sua formao. Ocorre potencializao quando h formao de gel mesmo sem haver quantidade suficiente de endotoxina. [35] A TAB. 2 apresenta os resultados dos ensaios de interferncia nas diluies seriadas dos produtos DTPA, GHA, Fitato, SAH e Sn Coloidal.

52 TABELA 2 - Resultados dos Ensaios de Interferncia nas Diluies Seriadas de DTPA, Fitato, GHA, SAH e Sn Coloidal
Produto Diluio do Produto 1:4 1:8 DTPA 1:16 1:32 1:64 1:100 1:120 Fitato 1:150 1:200 1:240 1:2 1:4 GHA 1:6 1:8 1:16 1:32 1:4 1:8 SAH 1:16 1:32 1:64 1:4 1:8 Sn Coloidal 1:16 1:32 1:64 + = Gel firme = Nenhum gel ou gel no firme ++ ++ ++ ++ ++ ++ 7,0 7,0 7,0 ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ 7,0 7,0 7,0 7,0 7,0 ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ 7,0 7,0 7,0 7,0 7,0 7,0 ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ 7,0 7,0 7,0 7,0 7,0 ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ 7,0 7,0 7,0 7,0 7,0 Controle Negativo Controle Positivo pH 7,0 7,0

As diluies que no apresentaram interferncia para DTPA, Fitato, GHA, SAH e Sn Coloidal foram a partir de, respectivamente, 1:16, 1:200, 1:4, 1:4 e 1:8.

53 McCullough [33] recomendou que a concentrao de escolha para o teste seja abaixo da MDV, mas acima da concentrao no interferente definida porque permite uma maior flexibilidade. A TAB. 3 apresenta os resultados dos ensaios de interferncia nas diluies seriadas de MIBG-131I, 67Ga e 201Tl.

TABELA 3 - Resultados dos Ensaios de Interferncia nas Diluies Seriadas de MIBG-131I, 67Ga e 201Tl
Produto Diluio do Produto 1:10 MIBG131

Controle Negativo

Controle Positivo

pH

++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ = Nenhum gel ou gel no firme

++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++

7,0 7,0 7,0 7,0 7,0 7,0 7,0 7,0 7,0

1:50 1:100 1:10

67

Ga

1:50 1:100 1:10

201

Tl

1:50 1:100

+ = Gel firme

MIBG-131I e diluio 1:100.

201

Tl atenderam individualmente os requisitos para o teste sem

67

ajuste de pH a partir da diluio 1:10.

Ga atendeu os requisitos para o teste na

Como as preparaes de amostras nessas diluies no so de fcil aplicao na rotina de controle de qualidade, foi definido o fator de diluio 1:100 para a validao dos produtos (com exceo do Fitato) pela praticidade. Recomenda-se que os procedimentos de operao padro (POP) sejam padronizados o mximo possvel considerando os esquemas de diluies e etapas do teste para evitar variaes excessivas.[33]

54 Twohy e col. [36] avaliaram os radiofrmacos citrato de Glio-67, 99mTc-DTPA, Gerador de 99mTc e cloreto de Tlio-201 e as diluies no interferentes encontradas foram 2, 8, sem diluio e 2 vezes, respectivamente.

5.1.3 Sries de Diluio do Padro de Endotoxina A Srie de Diluio do Padro de Endotoxina com o produto foi feita em 3 lotes consecutivos no fator de diluio 1:100 para MIBG-131I, Endotoxina em gua, conforme mostrado na TAB. 4.
67

Ga,

201

Tl, DTPA,

GHA, SAH e Sn Coloidal, em paralelo com a Srie de Diluio do Padro de

5.1.3.1 Determinao da Sensibilidade do Reagente LAL A USP estabelece que a sensibilidade declarada do lisado vlida quando o resultado da Mdia Geomtrica do Ponto Final de Gelificao (equao 3) estiver entre 0,5 0,06 UE mL-1) e 2 0,25 UE mL-1).[15] Utilizando os resultados (TAB. 4) das sries do Padro de Endotoxina em gua, foi calculada a sensibilidade do LAL e o valor obtido foi =0,06 UE mL-1, dentro da faixa aceitvel.

A proposta inicial do trabalho era realizar a validao de SAH-131I, porm devido pequena demanda comercial, no houve produto suficiente para o ensaio como havia sido programado, sendo assim, foi substitudo pelo reagente liofilizado SAH. A validao para o produto em uma determinada diluio considerada vlida quando: O resultado para a menor concentrao das solues padres (0,03 UE mL-1) for negativo em todas as replicatas.[12,15] A diferena entre o ponto final de gelificao das sries de diluies em gua e no produto for de, no mximo, um fator de diluio.[4,19] O pH da mistura amostra-lisado estiver na faixa de 6,0 a 8,0.[4]

Tabela 4 - Resultados dos Testes de Formao de Gel para MIBG-1

I,

Ga,

Tl, DTPA, GHA, SAH e Sn Coloidal

-1

-1

131

67

201

56 Considerando que a sensibilidade calculada do reagente LAL foi 0,06 UE mL-1, e substituindo-se esse valor na Equao 4, obtm-se MDV igual a 400. No caso do Fitato, diluies maiores que 200 at 400 vezes apresentaram interferncia na Srie de Diluio do Padro de Endotoxina (dados no apresentados). O GHA no apresentou resultados satisfatrios porque o valor calculado foi menor que 0,5 (TAB. 4). Os produtos MIBG-131I, 67Ga, descritos. O controle negativo e o controle positivo do produto devem ser realizados diariamente. Qualquer alterao na formulao, reagente ou mtodo de produo necessita ser avaliada quanto aos nveis de endotoxina.[17,20] Para o mtodo de formao de gel com critrio de aceitao passa ou no passa, estudos de estimativa da incerteza de medio so importantes para a verificao das probabilidades de respostas falsas, particularmente falsos-positivos e falsos-negativos.[35] Todos os lotes com resultados vlidos para o mtodo de formao de gel foram analisados pelo mtodo cromognico e alguns tambm foram submetidos ao ensaio turbidimtrico. Entre os reagentes liofilizados, o Fitato e o GHA apresentaram interferncia com resultados no vlidos no mtodo de formao de gel e foram avaliados nos mtodos cinticos cromognico e turbidimtrico para verificar a influncia das diluies nos resultados.
201

Tl, DTPA, SAH e Sn Coloidal foram validados

no mtodo de formao de gel, na diluio 1:100, porque atenderam aos requisitos

5.2 Validao pelo Mtodo Cromognico

PTS

O mtodo cromognico usado para medir a liberao do cromforo de um peptdeo cromognico adequado pela reao da endotoxina com o lisado e baseia-

57 se na relao quantitativa entre a concentrao de endotoxina e a quantidade de cromforo liberado no final de um perodo de incubao (Esquema 2). Como existe uma relao linear entre o log da concentrao de endotoxina e o log do tempo de reao, medido o tempo necessrio para a mistura de reao atingir uma absorbncia pr-determinada ou a velocidade do desenvolvimento da cor.[12] Desta forma, as concentraes de endotoxina no produto (CEP) e no controle positivo do produto (CPP) na diluio analisada so obtidas pela interpolao da curva padro arquivada. A curva arquivada vlida apenas para a mesma combinao de endotoxina e LAL. Os critrios de aceitao para o mtodo cromognico esto expressos na TAB. 5.[12] TABELA 5 - Critrios de Aceitao para o Mtodo Cromognico [12] Parmetro Coeficiente de Correlao da Curva Padro Arquivada (R) Recuperao do Controle Positivo do Produto (RCPP) Coeficiente de Variao (CV) Critrio de Aceitao -0,980 50 a 200% < 25%

A porcentagem de recuperao do controle positivo do produto (RCPP) representa a relao entre a concentrao de endotoxina do controle positivo do produto e uma concentrao especfica de endotoxina (0,3 UE mL-1). Se o valor de % de recuperao estiver fora da faixa de 50 a 200, significa que, na diluio estudada, est ocorrendo interferncia do produto. Para ser considerada livre de fatores interferentes sob as condies do ensaio, a concentrao medida da endotoxina adicionada soluo da amostra deve estar entre 50 e 200% da concentrao conhecida de endotoxina adicionada.[4] O coeficiente de variao (CV) a diferena percentual de leitura entre as amostras. A durao do ensaio o tempo necessrio para que se atinja um valor de densidade ptica pr-estabelecido. [4,15]

58 5.2.1 Clculo de MDV Os clculos de MDV para o mtodo cromognico so feitos conforme a equao 4, considerando a sensibilidade do LAL como o menor ponto da curva padro arquivada ( = 0,05 UE mL-1).[33] Como a sensibilidade do LAL menor, pode-se utilizar uma diluio 2,5 vezes maior que no mtodo de formao do gel, ou seja, 500 vezes.

5.2.2 Inibio ou Potencializao Foram feitos ensaios nas diluies 1:5, 1:100, 1:150, 1:200, 1:300 e 1:400 em 4 lotes de Fitato, para verificar em qual diluio no ocorre interferncia. Os resultados esto relacionados na TAB. 6 e representados no Grfico 1.

200 175 150 125 100 75 50 25 0 50 100 150 200

Limite superior

Lote 1 Lote 2 Lote 3 Lote 4

Limite inferior

250

300

350

400

450

fator de diluio
Grfico 1 - Efeito da Diluio de Fitato na % de RCPP no Mtodo Cromognico.

59

TABELA 6 - Resultados dos Testes de Interferncia em Fitato pelo Mtodo Cromognico-PTS.

Fitato Lote

Diluio 1:5 1:100

CEP (UE mL ) 0,595 <5,00 <7,50 <10,0 <15,0 <15,0 <20,0 <15,0 <20,0 0,321 <5,00 <7,50 <10,0 <15,0 <20,0
-1

%CV Produto 2,9 0,0 2,9 0,0 0,0 0,0 26,8 2,9 0,0 6,1 35,0 0,0 0,0 0,0 0,0

CPP (UE mL ) 0,344 0,137 0,174 0,092 0,216 0,155 0,407 0,158 0,614 0,194 0,104 0,218 0,216 0,351 0,520
-1

%CV do CPP 14,0 9,9 3,1 4,9 11,7 1,3 1,0 3,0 1,7 28,4 7,2 3,3 6,6 0,4 7,3

% RCPP 111 44 56 30 70 50 66 51 99 62 33 70 70 133 84

1 1:150 1:200 1:300 2 1:300 1:400 3 1:300 1:400 1:5 1:100 4 1:150 1:200 1:300 1:400

Observa-se no Grfico 1 e na TAB. 6 que nos lotes estudados no ocorreu interferncia, isto , % RCPP maior ou igual a 50 na diluio de 1:300. A concentrao de endotoxina (CEP) encontrada em todos os produtos nas diluies estudadas (exceo na diluio 1:5) foi menor que a menor concentrao da curva padro multiplicada pelo fator de diluio (TAB. 6).

60 A TAB. 7 mostra os resultados obtidos no mtodo cromognico dos produtos MIBG-131I,

67

Ga,

201

Tl, DTPA, GHA, SAH e Sn Coloidal na diluio 1:100, que foi

estabelecida no mtodo de formao de gel. TABELA 7 - Resultados de MIBG-131I,

67

Ga,

201

Tl, DTPA, GHA, SAH e Sn

Coloidal na Diluio 1:100 no Mtodo Cromognico-PTS.

Lote Produto 3 MIBG-131I 4 5 4

67

CEP (UE mL ) <5,0 <5,0 <5,0 <5,0 <5,0 <5,0 <5,0 <5,0 <5,0 <5,0 <5,0 <5,0 <5,0 <5,0 <5,0 <5,0 <5,0 <5,0 <5,0 <5,0 <5,0
-1

CPP (UE mL ) 0,658 1,070 0,813 0,391 0,374 0,257 0,260 0,327 0,333 0,192 0,243 0,255 0,369 0,339 0,546 0,271 0,218 0,285 0,480 0,339 0,417
-1

% CV do CPP 2,3 9,7 1,2 1,3 7,9 0,4 3,1 7,1 6,3 6,0 3,8 5,4 1,8 7,2 7,9 0,4 10,6 1,2 1,4 4,6 5,4

% RCPP

106 173 131 126 83 120 84 105 107 62 78 82 60 109 88 87 70 92 155 109 134

Ga

5 6 4

201

Tl

5 6 1

DTPA

2 3 4

GHA

2 3 1

SAH

2 3 1

Sn Coloidal

2 3

61

Os resultados de % RCPP dos trs lotes de cada produto esto entre 50 e 200%, e % CV do CPP < 25, e por isso foram validados no mtodo cromognico. A % CV do CEP foi menor que 0,1 em todas as amostras analisadas. O mtodo cromognico bastante interessante pela rapidez dos ensaios com tempo total de anlise de cerca de 20 minutos, por isso foi tambm desenvolvida a metodologia para determinao de endotoxina em radiofrmaco de meia-vida fsica curta utilizado em Tomografia por Emisso de Psitron (PET), como o FDG-18F. Na TAB. 8 esto descritos os resultados de interferncia em FDG-18F. Foram analisados trs lotes de FDG-18 F utilizando fatores de diluio: sem diluio, 1:5, 1:10, 1:20 e 1:50. TABELA 8 - Resultados dos Testes de Interferncia em FDG-18F no Mtodo Cromognico-PTS.
FDG-18F Lote 1:1 1:5 1 1:10 1:20 1:50 1:1 1:5 2 1:10 1:20 1:50 1:1 1:5 3 1:10 1:20 1:50 <2,50 <2,50 <2,50 0,572 0,205 0,387 13,7 3,9 8,0 185 66 125

Diluio

CEP (UE mL ) <2,50 <2,50 <2,50 <2,50 <2,50 <2,50 <2,50 <2,50 <2,50 <2,50 <2,50 <2,50
-1

CPP (UE mL ) 0,082 0,374 0,241 0,229 0,302 0,0 0,264 0,374 0,262 0,292 0,074 0,229
-1

%CV do CPP 10,5 16,6 0,4 6,3 6,5 0,0 2,3 2,6 3,5 8,0 4,9 2,6

% RCPP

26 120 78 74 98 0,0 85 120 84 94 24 74

62 O grfico 2 mostra a variao da % de RCPP nas diluies: sem diluio, 5, 10, 20 e 50 vezes em 3 lotes de FDG-18F.

200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0 0

26% 24% <0% 85%

185%

Limite superior

1 Teste 2 Teste 3 Teste

120% 120%

125%

98% 78% 74% 84% 74% 66% 94%

Limite inferior

10

20

30

40

50

60

Diluio

Grfico 2 - Efeito da Diluio de FDG-18F na % de RCPP no Mtodo Cromognico-PTS.

Os melhores resultados foram obtidos a partir da diluio 1:5, mas foi escolhida a diluio de 1:50 para analisar mais nove lotes de FDG-18F (TAB. 9). A concentrao de endotoxina (CEP) encontrada foi menor que a menor concentrao da curva padro multiplicada pelo fator de diluio.

63

TABELA 9 - Resultados dos ensaios para determinao de endotoxina em 9 lotes de FDG-18F pelo mtodo cromognico-PTS, utilizando diluio 1:50.
FDG-18F Lote A B C D E F G H I

CEP (UE mL ) <2,50 <2,50 <2,50 <2,50 <2,50 <2,50 <2,50 <2,50 <2,50
-1

CPP (UE mL ) 0,178 0,243 0,330 0,534 0,098 0,436 0,198 0,377 0,336
-1

%CV do CPP

% RCPP

8,2 4,5 2,5 5,9 7,0 8,8 6,0 6,6 5,1

58 78 106 172 32 141 64 122 108

Observou-se que, com exceo do lote E de FDG-18F, todos os demais apresentaram % RCPP dentro da faixa especificada e % CV menor que 25. Como os reagentes liofilizados para radiodiagnstico marcados com Nuclear, foram feitos ensaios em eludos de trs lotes de geradores de verificao de interferncias pelo mtodo cintico cromognico-PTS. Na TAB. 10 esto relacionados os resultados dos ensaios em trs lotes do produto nos fatores de diluio: sem diluio, 1:5, 1:10, 1:20, 1:50, 1:100 e 1:200.
99m 99m

Tc

so amplamente utilizados para obteno de imagens cintilogrficas em Medicina Tc para

64

Tabela 10 - Resultados dos Testes de Interferncia em Geradores de 99mTc pelo Mtodo Cromognico.

Gerador Lote

Diluio

CEP (UE mL-1)

CPP (UE mL-1) 0,020 0,382 0,476 0,692 0,560 0,678 0,565 0,026 0,414 0,624 0,795 0,849 0,560 0,576 0,082 0,533 0,560 0,582 0,940 0,807 0,729

%CV do CPP 5,1 4,4 1,9 1,1 4,6 3,3 0 2,9 3,2 3,2 4,1 3,0 2,6 1,0 0,9 0 1,5 3,6 5,0 1,2 0,6

% RCPP

1:1 1:5 1:10 1 1:20 1:50 1:100 1:200 1:1 1:5 1:10 2 1:20 1:50 1:100 1:200 1:1 1:5 1:10 3 1:20 1:50 1:100 1:200

<0,050 <0,250 <0,500 <1,00 <2, 50 <5,00 <10,00 <0,050 <0,250 <0,500 <1,00 <2,50 <5,00 <10,00 <0,060 <0,250 <0,500 <1,00 <2,50 <6,46 <10,00

3 55 69 100 81 98 82 4 60 90 115 123 81 84 12 77 81 84 136 117 106

65 Nos trs lotes analisados, o produto no diludo apresentou % de RCPP abaixo do limite estabelecido, mas a partir do fator de diluio 1:5 at 1:200, a % RCPP mostrou resultados satisfatrios. Em todas as amostras a % CV foi menor que 25. O grfico 3 mostra a variao da % de RCPP no mtodo cromognico nas diluies: sem diluio, 5, 10, 20, 50, 100 e 200 vezes em trs lotes consecutivos de geradores de 99mTc.

200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200
115% 100% 136%

645 646 647 123%

117% 106% 98% 84% 84% 81% 82%

81%

Diluio

Grfico 3 - Efeito da Diluio em Eludos de Geradores de 99mTc na % de RCPP no Mtodo Cromognico-PTS.

Observa-se pelo grfico 3 que os trs lotes de geradores de

99m

Tc

apresentaram perfil de % de RCPP semelhante nas sries de diluies estudadas.

66 5.3 Validao pelo Mtodo Turbidimtrico A tcnica turbidimtrica baseia-se na relao quantitativa entre a

concentrao de endotoxina e a turbidez (absorbncia ou transmitncia) da mistura de reao no final do perodo de incubao.[12] Como existe uma relao linear entre o log da concentrao de endotoxina e o log do tempo de reao, medido o tempo necessrio para a mistura de reao atingir uma absorbncia pr-determinada ou a velocidade do desenvolvimento da turbidez.[12] Desta forma, utilizando concentraes conhecidas de endotoxina obtm-se a curva padro em que as concentraes de endotoxina no produto (CEP) e no controle positivo do produto (CPP) na diluio analisada so determinadas pela interpolao da curva padro. Os critrios de aceitao para o mtodo turbidimtrico so: R de 50 a 200% e CV < 10%. -0,980, RCPP

5.3.1 Clculo de MDV Os clculos de MDV para o mtodo turbidimtrico so feitos conforme a equao 4, considerando a sensibilidade do LAL como o menor ponto da curva padro ( = 0,05 UE mL-1), similar ao mtodo cromognico. Como a sensibilidade do LAL menor, pode-se utilizar uma diluio 2,5 vezes maior que no mtodo de formao do gel, ou seja, 500 vezes.

5.3.2 Inibio ou Potencializao Para clculo da CEP e do % RCPP em diluies do produto, foi necessria a obteno da curva padro com 3 concentraes conhecidas de endotoxina (5; 0,5 e 0,05 UE mL-1). A TAB. 11 apresenta os dados da curva padro no ensaio turbidimtrico, com os quais foi construdo o grfico log da concentrao do padro de endotoxina versus log do tempo (Grfico 4).

67 O Tempo Mdio de Reao o tempo necessrio para o produto atingir uma absorbncia pr-determinada. Tabela 11 - Dados da Curva Padro no Mtodo Turbidimtrico.

Concentrao do Padro (UE mL-1) 5 0,5 0,05

Tempo Mdio de Reao (s) 445,3 1030,1 2137,8

% CV

Valor Calculado (UE mL-1)

2,72 2,44 4,85

>5,2730 0,4496 <0,0527

A quantidade de endotoxina presente proporcional ao tempo de reao.

na amostra inversamente

A partir do grfico 4, foram obtidos os parmetros R igual a -0,9992, coeficiente angular -0,03407 e coeficiente linear 2,8946. Como o coeficiente de variao para cada uma das concentraes foi < 10% e R foi considerada vlida. -0,980, a curva padro

Tempo Log (s)

Log [End]

Grfico 4 - Curva Padro (log-log) de Endotoxina nas Concentraes de 5; 0,5 e 0,05 UE mL-1 pelo Tempo de Reao.

68 Na TAB. 12 esto relacionados os resultados dos ensaios realizados em vrias diluies de 67Ga, Fitato, GHA e SAH pelo mtodo turbidimtrico. TABELA 12 - Resultados dos Testes de Interferncia de SAH no Mtodo Turbidimtrico.
Tempo Mdio de Reao (s) >2249,0 >2249,0 >2249,0 >2249,0 >2249,0 >2249,0 >2249,0 >2249,0 >2249,0 >2249,0 >2249,0 >2249,0 >2249,0 >2249,0 >2249,0 Tempo Mdio de Reao (s) 1368,5 1310,9 1336,1 1448,2 1256,5 1374,3 1324,6 1270,1 1246,4 1274,7 1412,1 1416,1 1286,4 1320,3 ---67

Ga, Fitato, GHA e

Produto

Diluio

CEP (UE mL-1) <5,00 <7,50 <5,00 <7,50 <10,00 <5,00 <7,50 <7,50 <10,00 <15,00 <5,00 <7,50 <5,00 <10,00 <0,0500

CPP (UE mL-1) 0,1953 0,2216 0,2095 0,1654

% CV do CPP 1,15 0,52 2,96 0,56 3,02 1,84 1,09 0,14 0,88 0,05 0,91 0,10 0,78 1,46 0,00

% RCPP 58 69 64 46 64 57 66 77 83 76 51 51 74 67 ----

Resultado

67

Ga

1:100 1:150 1:100

Vlido Vlido Vlido No Vlido Vlido Vlido Vlido Vlido Vlido Vlido Vlido Vlido Vlido Vlido Vlido

Lote 7

67

Ga 1:150

Lote 8 1:200
67

0,2093
0,1929 0,2149 0,2431 0,2569 0,2406 0,1781 0,1767 0,2342 0,2170 <0,0500

Ga

1:100 1:150 1:150

Lote 9

Fitato 1:200 Lote 5 1:300 GHA Lote 5 SAH Lote 4 gua 1:100 1:150 1:100 1:200 ----

Tempo Mdio de Reao do Produto

Tempo Mdio de Reao do Controle Positivo do Produto

69 Pelo mtodo turbidimtrico, foi verificado que para

67

Ga, GHA e SAH, o

ensaio na diluio 1: 100 foi vlido. O Fitato, diferentemente do mtodo de formao de gel, no apresentou problemas de interferncia nas diluies estudadas. Os resultados de validao dos produtos nos mtodos de formao de gel, cromognico-PTS e turbidimtrico esto apresentados na TAB. 13. TABELA 13 - Resultados de Validao dos Produtos nos Mtodos de Formao de Gel, Cromognico-PTS e Turbidimtrico. Mtodo Produto MIBG-131I
67

Formao de Gel Vlido* Vlido* Vlido* Vlido* --------------Vlido* Vlido* ---------------

Cromognico-PTS Vlido* Vlido* Vlido* Vlido* Vlido** Vlido* Vlido* Vlido* Vlido*** Vlido****

Turbidimtrico ------Vlido* ------------Vlido** Vlido* Vlido* -------------------

Ga Tl

201

DTPA Fitato GHA SAH Sn Coloidal

FDG-18F

Gerador de 99mTc * Diluio 1:100

** Diluio 1:300

*** Diluio 1:50

**** Diluio 1:5

Os resultados da TAB. 13 mostram que os produtos com resultados vlidos no mtodo de formao de gel confirmaram a validao quando foram submetidos ao cromognico-PTS, enquanto que Fitato e GHA apresentaram no mtodo turbidimtrico a confirmao dos resultados vlidos obtidos no mtodo cromognicoPTS.

70 A concentrao de endotoxina em todos os lotes de produtos estudados estava abaixo do limite de endotoxina especificado nos compndios oficiais. A TAB. 14 apresenta um estudo comparativo entre os mtodos de formao de gel, cromognico-PTS e turbidimtrico. TABELA 14 - Estudo Comparativo dos Mtodos de Formao de Gel, Cromognico-PTS e Turbidimtrico para Determinao de Endotoxina.[1,4] Formao de Gel semi-quantitativo simples, rpido (60 minutos) 100 L amostra no necessita de equipamento especializado (banho-maria) para radiofrmacos de meia-vida fsica curta, anlise de gua, produto em processo e acabado sensibilidade do LAL 0,25 a 0,015 UE mL-1 requer preparao de 5 concentraes de padro de endotoxina curva padro 0,50; 0,25; 0,125; 0,06; 0,03 UE mL-1 critrio de aceitao: passa/no passa Cromognico-PTS quantitativo (densidade ptica a 405 nm) simples, mais rpido (15 a 20 minutos), porttil 25 L amostra fotomtrico (PTS) para radiofrmacos de meia-vida fsica curta, anlise de gua, produto em processo e acabado sensibilidade do LAL 0,05 UE mL-1 no requer preparao de padro de endotoxina Turbidimtrico quantitativo (densidade ptica a 340 nm) Rpido (60 minutos) 100 L amostra fotomtrico (TECAN SUNRISE)

ponto final de gelificao leitura e registro manual fatores interferentes

no caso de radiofrmacos, impossibilidade de acmulo de amostras (96 poos por placa) sensibilidade do LAL 0,05 UE mL-1 requer preparao de 3 concentraes de padro de endotoxina curva padro arquivada curva padro 5,0; 0,5; 0,05 5,0; 0,5; 0,05 UE mL-1 UE mL-1 critrio de aceitao: critrio de aceitao: coeficiente de correlao coeficiente de correlao -0,980, recuperao do -0,980, recuperao do controle positivo do controle positivo do produto (RCPP) de 50 a produto (RCPP) de 50 a 200% e Coeficiente de 200% e Coeficiente de Variao (CV) < 25% Variao (CV) < 10% desenvolvimento de cor desenvolvimento de turbidez automatizado, automatizado, armazena os dados armazena os dados eletronicamente eletronicamente limitao de amostras limitao de amostras opacas ou coloridas opacas ou coloridas

71 Em vista da necessidade de realizao de muitos ensaios de rotina no controle de qualidade, foi feito um levantamento de custos dos materiais utilizados nos trs mtodos estudados para comparar o custo por lote de produto em cada mtodo. Na TAB. 15 esto discriminados os materiais, os custos individuais e o custo por lote de produto. TABELA 15 - Comparao dos Custos dos Materiais utilizados nos Ensaios de Formao de Gel, Turbidimtrico e Cromognico-PTS (Base outubro de 2007).

Reagente/Material LAL 50 testes Endotoxina gua apirognica 50 tubos de reao Placa 96 testes Cartucho Custo Total Custo/teste N testes/lote Custo/lote

R$ Formao de gel 410,00 310,00 205,00 280,00 ----1.205,00 24,10 08 192,80 Turbidimtrico 430,00 x 2 310,00 205,00 --65,00 --1.440,00 14,40 12 172,80 Cromognico-PTS ----------157,00 ----01 157,00

O clculo do nmero total de testes realizados para cada lote de produto em procedimento de rotina : mtodo de formao de gel totalizando 8 testes; duplicatas de controle positivo do produto, controle negativo, controle positivo da gua e controle negativo da gua,

72 mtodo turbidimtrico - duplicatas de 3 concentraes da curva padro, controle positivo do produto, controle negativo do produto e controle negativo da gua totalizando 12 testes; mtodo cromognico-PTS - um cartucho para cada lote de produto. Analisando os custos apresentados na TAB. 15, embora o mtodo de formao de gel apresente o maior custo por lote analisado, deve-se levar em considerao que somente a cada novo lote de Padro de Endotoxina e Reagente LAL a sensibilidade do reagente deve ser confirmada com quadruplicatas de 5 concentraes de padro de endotoxina. No mtodo turbidimtrico, a placa de incubao pode ser utilizada a cada 96 testes e a curva padro obtida a cada novo lote de Padro de Endotoxina e Reagente LAL. As consideraes feitas tornam os custos dos ensaios de formao de gel e turbidimtrico menores do que os descritos na TAB. 15 quando se analisa concomitantemente vrios lotes utilizando parte dos mesmos materiais.

73 6 CONCLUSES O Ensaio do LAL mostrou-se sensvel, prtico e de fcil utilizao em Medicina Nuclear devido aos pequenos volumes de anlise, menor tempo e simplicidade quando comparado com o Ensaio USP de Pirognio in vivo. Para radiofrmacos de meia vida fsica curta os quais devem ser produzidos prximo ao local de uso e preparados em pequenos volumes com alta atividade especfica, particularmente adequado.[13,17] O fato de que alguns produtos propostos neste trabalho, como o Fitato e GHA, no apresentaram bons resultados no mtodo de formao de gel, requer uma investigao para a determinao das causas da interferncia. O reagente LAL utilizado em todos os ensaios era tamponado e as medidas de pH estavam dentro da faixa especificada, descartando a possibilidade da interferncia do pH. Ctions divalentes, como o clcio, tambm podem influenciar no teste, mas alguns estudos realizados no comprovaram, de forma definitiva, essa interferncia. Algumas questes de interferncia foram evitadas de maneira simples, como diluio da amostra, utilizao de LAL tamponado e recipientes adequados, amostragem, calibrao e qualificao de equipamentos, calibrao de micropipeta e treinamento em pipetagem. A flexibilidade na escolha de um mtodo adequado para determinao de endotoxina bacteriana uma alternativa para solucionar ou reduzir problemas de interferncia.[32] Em vista dos resultados obtidos neste estudo, o mtodo cromognico-PTS pode ser aplicado para o Fitato e o GHA em substituio ao mtodo de formao de gel.

A simplicidade dos mtodos de determinao de endotoxinas bacterianas in vitro encoraja seu uso em solues utilizadas em processo, matrias-primas, assim como em produtos finais de drogas e materiais descartveis. A aplicao se estende tambm avaliao de procedimentos de limpeza, objetivando minimizar concentraes de endotoxina nos produtos acabados.[1,11]

74 ANEXO 1 Modelo de Ficha para Validao do Teste de Endotoxina Bacteriana

pelo Mtodo de Formao de Gel para Produto Acabado

LIMULUS AMEBOCYTE LYSATE (LAL) Produto: Limite endotoxina: Lote: MDV: VALIDAO DO TESTE DE ENDOTOXINA BACTERIANA PARA PRODUTO ACABADO Potncia endotoxina: Concentrao teste:

Reagente Fabricante LAL 0,125 UE/mL Padro de Endotoxina gua apirognica Tubos apirognicos Ponteiras 1mL

Lote IPEN

Data Reidratao

Data Validade

Condies do teste Hora incio: Preparao da amostra Hora final: pH Temperatura Incio: .......C Fim : .......C

RESULTADOS Concentrao de endotoxina UE/mL Padro de Endotoxina em gua Controle positivo do produto + = GEL FIRME VLIDO NO VLIDO Obs.:

0,50 4

0,25 2

0,125

0,06

0,03

Controle negativo da gua

Ponto final gelificao

Mdia Geomtrica Log 10 Antilog 10

- = NENHUM GEL OU GEL NO FIRME

Tcnico Operador:....................

Data:..../...../......

Gerncia do Controle de Qualidade:___________________________________________

75 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS1 1. PINTO, T. J. A; KANEKO, T. M; OHARA, M. T. Controle biolgico de qualidade de produtos farmacuticos, correlatos e cosmticos. 2. ed., So Paulo: Atheneu , p. 179-215, 2003. 2. MORALES, R. P. Ensayo del lisado de amebcitos del Limulus (LAL). Rev. Cub. Farm. v. 38, n.1, p. 1-1 , 2004. 3. RESOLUO DA DIRETORIA COLEGIADA (RDC) N 210. AGNCIA NACIONAL DE VIGILNCIA SANITRIA (ANVISA), 2003. 4. WILLIAMS, K. L. Endotoxins Pyrogens, LAL Testing and Depyrogenation. 2. ed., New York, NY: Marcel Dekker Inc., p.113, 165-173, 180-183, 193-222, 311-312, 328-335, 2001. 5. MANUAL DE PROTOCOLOS DE CALIDAD DE RADIOFARMACOS. So Paulo: ARCAL XV, p.10, 1999. 6. MANUAL DE BUENAS PRACTICAS RADIOFARMACEUTICAS. Montevideo: ARCAL XV, p.12, 1998. 7. SAHA, G. B. Fundamentals of Nuclear Pharmacy. 5. ed., New York: Springer, p. 46-171, 2004. 8. OWUNWANNE, A., PATEL, M., SADEK, S. The Handbook of Radiopharmaceuticals. 1. ed., London: Chapman & Hall Medical, p. 16-19, 92-130, 1995. 9. THRALL, J. H.; ZIESSMAN, H. A. Medicina Nuclear. 2. ed., Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, p. 57-59, 2003. 10. ZIJLSTRA, S; GERHEN, P; RECHIN, C; WORTMANN, R.; NOLOTRAMIPRODJO, G. Validation of the Limulus Amebocyte Lysate (LAL) Test for Routine PET Radiopharmaceuticals. Appl. Radiat. Isot., v. 48, p. 5154, 1997. 11. PEARSON, F. C. Pyrogens Endotoxins, LAL Testing and Depyrogenation. New York, NY: Marcel Dekker, p. 3-7, 11-14, 23-44, 89214, 1985. 12. EUROPEAN PHARMACOPOEIA, 5. ed., Strasbourg, Council of Europe, v. 1, p. 161-168, 2004. 13. COOPER, J. F.; LEVIN, J.; WAGNER JR, H.N. Quantitative Comparison of in vitro and in vivo Methods for the Detection of Endotoxin. J. Lab. Clin. Med., v. 78, p. 138-145, 1971;
1

Norma ABNT NBR 6023

76

14. WEARY, M. Understanding and Setting Endotoxin Limits. J. Parent. Sci. Tech., v. 44, n.1, p. 16-17, 1990. 15. UNITED STATES PHARMACOPOEIA, 30. ed., Rockville, United States Pharmacopeial Convention, v. 1, 2007. 16. COOPER, J. F.; LEVIN, J.; WAGNER JUNIOR, H. N. New, Rapid, In Vitro Test for Pyrogen in Short-Lived Radiopharmaceuticals. J. Nucl. Med., v. 11, p. 310, 1970. 17. WILLIAMS, C. C.; BORCHERT, R. D.; CLANTON, J. A. The Bacterial Endotoxin Test in the PET Facility. J. Nucl. Med., v. 34, p. 469-473, 1993. 18. LEVIN, J.; BANG, F. B. Clottable protein in Limulus: its localization and kinetics of its coagulation by endotoxin. Thromb. Diath. Haemorr., v. 19, p.186, 1968. 19. GUIDELINE ON VALIDATION OF THE LIMULUS AMEBOCYTE LYSATE TEST AS AN END-PRODUCT ENDOTOXIN TEST FOR HUMAN AND ANIMAL PARENTERAL DRUGS, BIOLOGICAL PRODUCTS AND MEDICAL DEVICES. U.S. Department of Health and Human Services, Public Health Service, Food and Drug Administration, 1987. 20. FARMACOPIA BRASILEIRA, 4. ed., So Paulo, Atheneu , parte II, 1. fascculo, 1996. 21. TWOHY, C. W.; NIERMAN, M. L.; DURAN, A. P. Comparison of Limulus Amebocyte Lysates from Different Manufacturers. J. Parent. Sci. Tech., v. 37, n. 3, p. 93-96, 1983. 22. JORGENSEN, J. H.; REICHLER, A. S. Automation of Limulus Amoebocyte Lysate Pyrogen Testing. J. Parent. Sci. Tech., v. 36, n. 3, p. 96-98, 1982. 23. COOPER, J. F. LAL Interference Screening of In-process Materials and Finished Products. LAL Times, v. 5, n. 1, 1998. 24. COOPER, J. F. Documenting Validation of a BET Application. LAL Times, v. 6, n. 3, 1999. 25. COOPER, J.F. Resolving LAL Test Interferences. J. Pharm. Sci. Tech., v. 44, n. 1, p. 13-15, 1990. 26. ROSLANSKY, P. F.; DAWSON, M. E.; NOVITSKY, T. J. Plastics, Endotoxins, and the Limulus Amebocyte Lysate Test. J. Parent. Sci. Tech., v. 45, n. 2, p. 83-87, 1991.

77 27. NOVITSKY, T. J.; SCHMIDT-GENGENBACH, J.; REMILLARD, J. F. Factors Affecting Recovery of Endotoxin Adsorbed to Container Surfaces. J. Parent. Sci. Tech., v. 40, n. 6, p. 284-286, 1986. 28. SULLIVAN JR, J. D.; WATSON, S. W. Factors Affecting the Sensitivity of Limulus Lysate. Appl. Microbiol., v. 28, n. 6, p. 1023-1026, 1974. 29. TSUJI, K.; STEINDLER, K. A. Use of Magnesium to Increase Sensitivity of Limulus Amoebocyte Lysate for Detection of Endotoxin. Appl. Environ. Microbiol. , v. 45, p. 1342-1350, 1983. 30. STEINDLER, K. A.; TSUJI, K.; ENZINGER, R. M. Potentiating Effect of Calcium Gluconate on the Limulus Amebocyte Lysate (LAL) GelationEndpoint Assay for Endotoxin. J. Parent. Sci. Tech., v. 35, n. 5, p. 242-247, 1981. 31. COOPER, J. F.; WEARY, M. E.; JORDAN, F. T. The Impact of Non-endotoxin LAL-Reactive Materials on Limulus Amebocyte Lysate Analyses. J. Pharm. Sci. Tech., v. 51, p. 2-6, 1997. 32. McCULLOUGH, K. Z.; WEIDNER-LOEVEN, C. Variability in the LAL Test: Comparison of Three Kinetic Methods for the Testing of Pharmaceutical Products. J. Parent. Sci. Tech., v. 46, n.3, p. 69-72, 1992. 33. McCULLOUGH, K. Z. Variability in the LAL Test. J. Parent. Sci. Tech., v. 44, n.1, p. 19-21, 1990. 34. MURATA, H.; KOBAYASHI, M.; IIO, M.; YAMADA, H.; CHIBA, K.; MATSUI, K.; KAWAGUCHI, S. Sensitivity of the Limulus Test and Inhibitory Factors in the Radiopharmaceuticals. J. Nucl. Med., v. 17, p. 1088-1092, 1976. 35. LOURENO, F. R.; KANEKO, T. M.; PINTO, T. J. A. Estimativa da Incerteza em Ensaio de Deteco de Endotoxina Bacteriana pelo Mtodo de Gelificao. Rev. Bras. Cienc. Farm., v. 41, n. 4, p. 437-442, 2005. 36. TWOHY, C. W.; DURAN, A. P.; MUNSON, T. E. Endotoxin Contamination of Parenteral Drugs and Radiopharmaceuticals as determined by the Limulus Amebocyte Lysate Method. J. Parent. Sci. Tech., v. 38, n. 5, p. 190-201, 1984.