CAROLINA CRUZ MURTA DE CASTRO

ESTUDO EXPERIMENTAL DA RESPOSTA IMUNE CELULAR DE BOVINOS VACINADOS COM O PEPTDEO SINTTICO SBbo23290 NO CONTROLE DA BABESIOSE POR Babesia bovis (Babes, 1888)

Tese apresentada Universidade Federal de Viosa, como parte das exigncias do Programa de Ps-Graduao em Medicina Veterinria para a obteno do ttulo de Magister Scientiae.

VIOSA MINAS GERAIS - BRASIL 2005

CAROLINA CRUZ MURTA DE CASTRO

ESTUDO EXPERIMENTAL DA RESPOSTA IMUNE CELULAR DE BOVINOS VACINADOS COM O PEPTDEO SINTTICO SBbo23290 NO CONTROLE DA BABESIOSE POR Babesia bovis (Babes, 1888)

Tese apresentada Universidade Federal de Viosa, como parte das exigncias do Programa de Ps-Graduao em Medicina Veterinria para a obteno do ttulo de Magister Scientiae.

APROVADA:

________________________ Prof Marlene I. Vargas Vilria (Conselheira) ________________________ Prof Lygia M Friche Passos

________________________ Prof. Srgio Oliveira de Paula

_________________________ Prof. Carlos Luiz Massard

_________________________ Prof. Joaqun Hernn Patarroyo Salcedo (Orientador)

 Deus, pela vida, por tudo que consegui at hoje, por todas as oportunidades e pela famlia maravilhosa que tenho.

Aos meus pais Antnio Eustquio e Maria Helena - as razes da minha vida - pelo amor, carinho e incansvel esforo e dedicao. Venci mais este obstculo graas a vocs.

Aos meus irmos Carla e Breno, pelo amor, apoio e amizade. Obrigada por existirem e por fazerem parte da minha vida. Amo vocs!

Ao Fabrcio, pelo amor, carinho, ateno e ajuda nos momentos em que mais precisei. Obrigada por tudo!

o Prof. Dr. Alair Assis, cujo incentivo e ajuda foram indispensveis para que eu chegasse at aqui.

AGRADECIMENTOS

Deus, por me ajudar a ultrapassar mais esse obstculo, por me iluminar e estar sempre presente em minha vida, principalmente nos momentos mais difceis. Obrigada por tudo que tenho.

Aos meus pais e irmos, cuja convivncia foi essencial para minha formao como pessoa. Obrigada pelo amor, esforo, dedicao e suporte financeiro, sem os quais no seria possvel realizar este sonho. Dedico essa vitria a vocs.

Ao Fabrcio, pelo amor, incentivo, ajuda, e pelo ombro amigo sempre que precisei. Obrigada por ser to presente em minha vida! Te amo!

Cida, Osvaldo, Fabiana e Flvia, por serem minha famlia aqui em Viosa. Obrigada por todo o carinho e ajuda durante este tempo. Adoro vocs! Ao Prof. Dr. Alair Assis, meu padrinho de mestrado, por ter acreditado em mim e por ter me ajudado a chegar at aqui.

Ao Prof. Dr. Joaqun Hernn Patarroyo Salcedo e Prof Marlene Isabel Vargas Viloria, pela orientao, pela confiana e valiosa colaborao; pelo carinho e amizade durante todo esse tempo de convvio.

Ao Mrcio Mendes, pela ajuda, indispensvel acessoria tcnica, e principalmente pela amizade. Obrigada por tudo!

 Universidade Federal de Viosa, ao Departamento de Veterinria e ao Instituto de Biotecnologia Aplicada Agropecuria BIOAGRO, pelo acolhimento e suporte estrutural essenciais para a realizao do meu mestrado.

Universidade Metropolitana de Santos, pela minha formao acadmica.

Universidade Federal de Minas Gerais e Universidade Federal de Ouro Preto pelo suporte estrutural essencial para a realizao deste trabalho.

Aos Professores Luis Carlos Crocco Afonso e Mcio Flvio Barbosa Ribeiro, pela colaborao e valiosas sugestes.

A todos que me ajudaram em BH e Ouro Preto: Simone, Daniella, Camila, Lvio; Eduardo, Roberta, Leonardo, Djalma, Tiago, Jamile, Elisngela, Wagner e Miriam. Muito obrigada!

Ao Jos Carlos e ao Cauzinho, pela colaborao e pelos cuidados com os animais utilizados neste experimento.

s amigas Ana Paula, Fabiana, Carla e Bruna, pelo carinho e amizade, pelo ombro amigo, pela convivncia agradvel e pela ajuda indispensvel durante todo esse perodo de alegrias e dificuldades. Muito obrigada! Ao Carlos, por me socorrer sempre que eu precisei. Obrigada pelos quitutes, pela convivncia e pelo sorriso sempre amigo. Aos amigos do Laboratrio de Biologia e Controle de Hematozorios LBCH: Larissa, Sidimar, Policarpo, Irma, Mariurea, Ana Paula Adry, Liza, Ana Carolina, Flvia, Breno, Ferdinan, Priscilla, Rmulo, Javier, Diogo e Luana. Obrigada pelos momentos de alegria e amizade.

 minha amiga Claudinha pela orientao nos momentos de dificuldades e pelo convvio sempre agradvel.

Rose, pelo sorriso sempre amigo, e pela incansvel ajuda e disposio no decorrer desses anos. Muito obrigada!

A todos os funcionrios do Departamento de Veterinria da UFV que colaboraram de alguma forma para a concluso deste projeto de tese.

A todos da Clnica de Grandes Animais, pela ajuda indispensvel neste experimento. Obrigada!

A todos que contriburam para a realizao deste trabalho direta ou indiretamente, meu muito obrigada.

BIOGRAFIA

CAROLINA CRUZ MURTA DE CASTRO, filha de Antnio Eustquio Murta de Castro e Maria Helena da Cruz Murta de Castro, nascida em 07 de setembro de 1979, na cidade de Cataguases Minas Gerais Brasil. Cursou o primeiro grau na Escola Municipal de Primeiro Grau Baro do Rio Branco, em Santos SP, at o ano de 1993. Em 1994, iniciou o segundo grau no Colgio Santista. Deu continuidade aos seus estudos no Colgio Jean Piaget de 1995 a 1996, na cidade de Santos SP. Ingressou no Curso de Medicina Veterinria da Universidade Metropolitana de Santos em 1997, concluindo sua graduao no ano de 2001. Foi estudante especial de Ps-Graduao da Universidade Federal de Viosa de fevereiro a junho de 2003. Iniciou o Curso de Mestrado em Medicina Veterinria na Universidade Federal de Viosa em agosto de 2003.

NDICE

LISTA DE ABREVIATURAS LISTA DE FIGURAS LISTA DE TABELAS RESUMO ABSTRACT 1. INTRODUO 2. OBJETIVOS 2.1 Objetivo geral 2.2 Objetivos especficos 3. REVISO DE LITERATURA 3.1 Babesiose bovina 3.2 Biologia da Babesia bovis 3.3 Patofisiologia da Babesia bovis 3.4 Mecanismo de imunidade Babesia bovis 3.4.1 Clulas natural killer e macrfagos 3.4.2 Clulas T 3.4.3 Clulas B 3.4.4 Resposta dos tecidos linfides 3.4.5 Recirculao de linfcitos 3.5 Mtodos de controle da babesiose 3.5.1 Premunio 3.5.2 Vacinao 3.5.3 Controle com Exoantgenos 3.5.4 Protenas Associadas s Roptrias 3.5.5 Peptdeos Sintticos 4. MATERIAIS E MTODOS 4.1 Local de realizao do experimento 4.2 Animais 4.3 Peptdeo Sinttico 4.4 Esquema de inoculao 4.5 Infeco (Desafio) 4.6 Imunofenotipagem de Linfcitos Perifricos Bovinos (PBL) 4.7 Histologia de linfonodos bovinos 4.8 Hematoxilina & Eosina 4.9 Verde Metil Pironina 4.10 Pesquisa de antgenos de B. bovis em linfonodos bovinos atravs da tcnica de Peroxidase anti-peroxidase (PAP) 4.11 Analse estatstica

ix x xii xiii xv 1 4 4 4 5 5 7 9 11 12 13 18 19 22 24 25 26 27 28 29 31 31 31 32 32 33 33 36 37 37 38 39

5. RESULTADOS E DISCUSSO 5.1 Avaliao histopatolgica de linfonodos bovinos 5.2 Avaliao imunohistoqumica de linfonodos bovinos 5.3 Imunofenotipagem de linfcitos T CD4, CD8 e WC1 e B CD21 5.3.1 Linfcitos perifricos T CD4+ 5.3.2 Linfcitos perifricos T CD8+ 5.3.3 Linfcitos perifricos B CD21+ 5.3.4 Linfcitos perifricos T WC1+ 5.3.5 Linfcitos T totais 5.3.6 Clulas no T no B (NTNB) 5.3.7 Relao entre linfcitos T CD4+ e CD8+ 5.3.8 Relao entre linfcitos T e B 6. CONCLUSES 7. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

40 40 46 49 49 52 56 59 62 63 65 67 71 72

LISTA DE ABREVIATURAS

APC

Clulas Apresentadoras de Antgeno

BIOAGRO CD
CF CGs DNA DVT EDTA FITC g Ig IL INFiNOS

Instituto de Biotecnologia Aplicada Agropecuria Grupo de diferenciao antignico

Citometria de Fluxo Centros Germinais cido desoxirribonuclico Departamento de Veterinria cido Etileno Diamino Tetractico Isotiocianato de Fluorescena gravidade Imunoglobulina Interleucina Interferon Gamma Enzima xido Ntrico Sintase Induzida

LBCHV Laboratrio de Biologia e Controle de Hematozorios e Vetores

MAP MHC NK mL NO NTNB PAP PBL PBMC PBS q.s.p. RAP RNA SBbo23290 SFB Tc CD4+ T Th 1 Peptdeo Mltiplo Antignico Complexo de Histocompatibilidade Principal Clulas exterminadoras naturais Microlitros xido Ntrico No T no B Peroxidase anti-peroxidase Leuccito Perifrico Bovino Clulas Mononucleares Perifricas Bovinas Phosphate Buffer Solution quantidade suficiente para Protenas Associadas s Roptrias cido ribonuclico Sinthetic Babesia bovis 23290 Soro Fetal Bovino Clulas T CD4+ citotxicas Linfcito T gamma delta Resposta imune tipo 1

Th2 TNFUFOP UFV UI WC1

Resposta imune tipo 2 Fator de Necrose Tumoral Alfa Universidade Federal de Ouro Preto Universidade Federal de Viosa Unidades Internacionais Workshop Cluster 1

LISTA DE FIGURAS

Figura 1:

Linfonodos bovinos dos grupos controle, saponina e imunizados com o peptdeo sinttico SBbo23290. A: Animal controle aos cinco dias aps a primeira inoculao, colorao H&E, 20X. B: Animal controle aos cinco dias aps primeira inoculao, colorao Verde Metil Pironina, 20X. C: Animal do grupo saponina aos cinco dias aps a primeira imunizao com formao de CG, colorao H&E, 20X. D: Animal do grupo peptdeo aos cinco dias aps a primeira imunizao com maior formao de CGs em relao aos demais grupos, colorao H&E, 10X. Linfonodos bovinos dos grupos controle, saponina e imunizados com o peptdeo sinttico SBbo23290. A: Animal do grupo saponina aos quatro dias aps a segunda inoculao, colorao Verde Metil Pironina, 10X. B: Animal do grupo peptdeo aos cinco dias aps a primeira inoculao Verde Metil Pironina, 10X. C: Animal do grupo peptdeo aos quatro dias aps a segunda inoculao, colorao Verde Metil Pironina, 10X. D: Animal do grupo peptdeo aos cinco dias aps a primeira inoculao, colorao Verde Metil Pironina, 40X. Resultado do teste Peroxidase anti-peroxidase para deteco de antgenos. Linfonodo pr-escapular. Observa-se clula dendrtica folicular (seta) contendo peptdeo sinttico SBbo23290 e apresentando a linfcitos aos trs dias aps a terceira inoculao, PAP, 100X. Representao grfica da Imunofenotipagem dos linfcitos T CD4+, CD8+, WC1+, e B CD21+ Porcentagem de linfcitos T CD4+ Porcentagem de linfcitos T CD8+

43

Figura 2:

44

Figura 3:

48

Figura 4:

50

Figura 5: Figura 6:

51 53

Figura 7: Figura 8: Figura 9:

Porcentagem de linfcitos B CD21+ Porcentagem de linfcitos T WC1+ Porcentagem de linfcitos T totais

57 60 62 64 66 68

Figura 10: Porcentagem de clulas NTNB Figura 11: Relao entre os linfcitos T CD4+ e CD8+ Figura 12: Relao entre os linfcitos T e B

LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Tabela 2: Tabela 3: Tabela 4: Tabela 5: Tabela 6: Tabela 7: Tabela 8: Tabela 9: Tabela 10: Tabela 11: Tabela 12: Tabela 13:

Esquema de inoculao Dias referentes s coletas de PBL Anticorpos monoclonais utilizados Dias referentes s coletas de linfonodos Mdias das porcentagens de linfcitos T CD4+ Mdias das porcentagens de linfcitos T CD8+ Mdias das porcentagens de linfcitos B CD21+ Mdias das porcentagens de linfcitos T WC1+ Mdias das porcentagens dos linfcitos T totais Mdias das porcentagens de clulas NTNB Relao entre as mdias das porcentagens de linfcitos T CD4+ e T CD8+ Relao entre as mdias das porcentagens de linfcitos T e B Impacto diferencial entre as coletas de PBL

33 34 35 37 52 56 58 61 63 65 67 69 70

RESUMO

CASTRO, Carolina Cruz Murta de, M.S., Universidade Federal de Viosa, novembro de 2005. Estudo experimental da resposta imune celular de bovinos vacinados com o peptdeo sinttico sbbo23290 no controle da babesiose por Babesia bovis (Babes, 1888). Orientador: Joaquin Hernn Patarroyo Salcedo. Conselheiros: Marlene Isabel Vargas Vilria e Jackson Victor de Arajo. Bovinos da raa holandesa entre 3-4 meses de idade receberam quatro imunizaes subcutneas com o peptdeo sinttico SBbo23290 anti-Babesia bovis mais saponina, e foram desafiados com amostra virulenta de B. bovis, sendo avaliados quanto ao desenvolvimento da resposta imune celular. Para isso, foi determinado o perfil de linfcitos circulantes (CD4+, CD8+, CD21+ e WC1+) por citometria de fluxo e seguimento dos eventos microscpicos ocorridos em linfonodos atravs de tcnicas diferenciais (Hematoxilina & Eosina e Verde Metil Pironina) e de imunohistoqumica (Peroxidase anti-peroxidase). Os estudos histolgicos mostraram reatividade evidente de centros germinativos a partir do quinto dia aps a primeira imunizao. A hiperplasia dos cordes medulares foi mais evidente aos trs dias aps a terceira imunizao. O antgeno SBbo23290 foi detectado em clulas SBbo23290 positivas durante todo o experimento, concomitantemente s alteraes histolgicas em rgos linfides. Quando foi determinada a composio fenotpica dos linfcitos de sangue perifrico circulantes, observou-se no grupo peptdeo um aumento progressivo de linfcitos WC1+ at os sete dias aps a segunda coleta, que decaiu ligeiramente aps a

terceira inoculao, aumentando novamente aps o desafio com a amostra virulenta de B. bovis, o que no aconteceu com os demais grupos experimentais, havendo diferena estatstica entre os grupos. Os linfcitos CD4 + e CD21+ decresceram aps a primeira inoculao, aumentando aps a segunda inoculao, e decaindo nas demais coletas, havendo diferena estatstica entre os grupos. A porcentagem de linfcitos T totais no grupo peptdeo foi superior aos demais grupos durante quase todo o experimento, sendo que a maior porcentagem foi obtida aps a segunda coleta, no havendo diferena estatstica entre os grupos nas diferentes coletas. Sendo assim, pode-se concluir que o peptdeo sinttico induz de maneira eficaz uma resposta imunolgica antgenoespecfica, na qual encontram-se envolvidos mecanismos celulares e humorais.

ABSTRACT

CASTRO, Carolina Cruz Murta de, M.S., Universidade Federal de Viosa, November, 2005. Experimental study of cellular immune response of bovines immunizated with synthetic peptide sbbo23290 to the control of babesia boviss (babes, 1888) babesiosis. Advisor: Joaqun Hernn Patarroyo Salcedo. Committee members: Marlene Isabel Vargas Vilria and Jackson Victor de Arajo.

Tree-four month old bovines of the Holstein Freesan breed received four underskin immunization of the synthetic peptideo 23290 anti-Babesia bovis plus saponina. They were challenged with an virulent sample of B. bovis and they were evaluated considering the development of the cellular immune answer through identification of CD4+, CD8+, CD21+, and WC1+ T lymphocytes by flow citometry and microscopic evaluation of lymph nodes using the techniques H&E and Pironin Methil Green, such as PAP. The lymphonodes analysis demonstrated germinal centers reactivity at the 5th day after the first immunization. Medullars cords hyperplasia was more evident three days after the third immunization. SBbo32290 antigen was detected in SBbo23290 positive cells during whole experiment, and simultaneous to the histology alterations in lymphonodes. Evaluating phenotypic composition of the peripheral blood lymphocytes, a progressive increase of WC1+ lymphocytes was detected, which decreased after third immunization, and an increment was observed again after the challenge. It was not observed in the another experimental groups. The CD4+ and CD21+ lymphocytes decreased after

first immunization, increased after the second immunization, and decreased again in the following immunizations; the variation was statistically significant between the groups. The variation in total number of lymphocytes wasnt statistically significant, although an increment of this cells was observed in the peptide group almost whole experiment, comparing with the another groups. We can conclude that the syntetic peptideo induct an effective immunological specific-antigen answer, in with cellular and humoral mechanisms were involved.

1 - INTRODUO

No Brasil, existem aproximadamente 160 milhes de bovinos, dos quais 80% esto expostos ao parasitismo pelo carrapato comum dos bovinos, o Boophilus microplus, e s doenas por ele transmitidas. A Babesia bovis, transmitida pelo carrapato Boophilus microplus, um parasita apicomplexo dos bovinos transmitido por carrapatos, e junto com a Babesia divergens e a Babesia bigemina, responsvel pelas maiores perdas na indstria dos bovinos em todo o mundo (FASILA, 2004), pois uma vez com babesiose, os bovinos sofrem uma grave anemia hemoltica, gerando perdas na produtividade e morte dos animais (BOMFIM et.al., 2004). A babesiose uma doena causada pela infeco intra-eritrocitria de protozorios do gnero Babesia (CARLTON E MCGAVIN, 1998), sendo considerada uma das doenas mais importantes que afeta o gado em regies tropicais e subtropicais do mundo (LEVY et. al., 1982), alm disso, vem ganhando crescente interesse como uma zoonose emergente em humanos (HOMER et. al., 2000). No Brasil, a babesiose foi relatada em bovinos pela primeira vez por Fajardo em 1901 (SILVA, 1981). Aproximadamente 300 milhes de cabeas de gado nas regies tropical e subtropical do mundo esto sob o risco de infeco com Babesia bovis e B. bigemina, (WRIGHT, 1991).

A babesiose bovina, especialmente a que causada pela B. bovis, continua sendo a de maior importncia patolgica e econmica no mercado agropecurio do Brasil. Na Amrica Latina, a babesiose causa prejuzos de mais de US$ 1.365 milhes por ano (MONTENEGRO-JAMES, 1992). Casos clnicos de babesiose ocorrem quando, por diversas razes, a barreira da estabilidade enzotica quebrada (ZINTL et. al., 2005). Existe uma grande variedade de sinais clnicos da babesiose, que se deve a variaes na patogenicidade dos microorganismos e na susceptibilidade dos animais (CARLTON E MCGAVIN, 1998). De acordo com BROWN E PALMER (1999), os bovinos acometidos por Babesia bovis podem desenvolver uma babesiose severa, que ocorre quando eritrcitos parasitados so seqestrados dos capilares do crebro e pulmes, resultando numa baixa parasitemia perifrica, babesiose cerebral e Sndrome Respiratria associada a uma infiltrao massiva de neutrfilos dentro dos capilares dos pulmes, permeabilidade e edema vascular. O controle da babesiose bovina pode ser realizado tanto pelo combate direto ou imunidade protetora contra seu vetor, o carrapato Boophilus microplus, como atravs da estimulao imunolgica contra o hematozorio. No entanto, as limitaes da quimioterapia tm levado ao estudo vacinal e melhorado o entendimento da resposta imune a Babesia spp (ZINTL et. al., 2005). A vacinao constitui um mtodo de imunizao ativa com o intuito de estimular os mecanismos de defesa de um hospedeiro, de forma a proteger o animal de futuras infeces ou de manifestaes clnicas, alm de ativar clulas de memrias. A imunidade contra a Babesia spp requer no apenas a resposta imune inata, mas tambm a adaptativa. Esta tem sido induzida aps a inoculao com antgenos, atenuados, ou sintticos, assim como por sobrenadantes de cultura do parasito que contem antgenos solveis. Devido s limitaes das vacinas que empregam parasitos vivos, novas fontes de imungenos tm sido pesquisadas e as vacinas constitudas por parasitos mortos, as

confeccionadas a partir de extratos de parasitos ou sobrenadante de cultura, e as vacinas sintticas e recombinantes tm sido consideradas as mais promissoras (BITTAR, 2002). As protenas produzidas em organelas do complexo apical tm grande importncia no processo de invaso do parasita na clula hospedeira (BROWN et al., 1996). Sabendo disso, foram realizados diversos estudos que puderam comprovar que a famlia multignica que codifica protenas de 58-60kDa, denominadas RAP, que esto associadas tanto superfcie dos merozotos quanto s roptrias do complexo apical de B. bovis e B. bigemina, tm capacidade de estimular a resposta imune adaptativa dos tipos humoral e celular. Tendo em vista a importncia da protena RAP-1, o Laboratrio de Biologia e Controle de Hematozorios (LBCH) da Universidade Federal de Viosa, associado ao FIDIC Fundacin Instituto de Imunologia de Colombia desenharam e sintetizaram peptdeos sintticos baseados na estrutura ntegra dessa protena (PATARROYO et al., 1999). A utilizao de vacinas se destaca como uma tecnologia promissora alternativa ao mtodo de controle tradicional, premunio, devido ao fato de apresentar memria imunolgica, eficincia e segurana.

2. OBJETIVOS

2.1. Objetivo geral

Avaliar e mensurar a resposta imune celular e a proteo conferida "ex vivo" a bovinos (Bos taurus taurus) pela "vacinao" com o imungeno sinttico SBbo23290 e desafio com cepa virulenta de B. bovis.

2.2. Objetivos especficos

Avaliar a dinmica das alteraes microscpicas dos folculos linfides e centros germinais de linfonodos perifricos dos animais imunizados e desafiados; Analisar a resposta ao SBbo23290 em PBL do sangue de animais submetidos imunizao e ao desafio; Identificar cronologicamente o desenvolvimento da resposta imune em linfonodos de bovinos imunizados com o peptdeo SBbo23290 e desafiados com cepa patognica; Identificar a presena de antgeno em linfonodos de animais imunizados e desafiados.

3 - REVISO DE LITERATURA

3.1 Babesiose bovina

As infeces por parasitas do gnero Babesia provavelmente tm complicado a vida dos humanos desde a antiguidade, primeiramente atravs das infeces dos animais domsticos, mas s recentemente, na metade deste sculo, essas infeces se tornaram uma ameaa documentada sade humana, adquirindo o ttulo de uma zoonose emergente (HOMER et. al., 2000). De acordo com o referido autor, a praga do gado egpcio descrita como Grievous Murrain, pode ter sido a Febre da gua Vermelha dos Bovinos (causada pela Babesia bovis) e pode ter includo a hematria como sinal prevalente. A babesiose bovina causada por vrias espcies de Babesia, entretanto, no Brasil os bovinos so acometidos por duas espcies: B. bovis (BABES, 1888), que causa maiores prejuzos no Brasil devido severidade da doena (FREITAS, 2001), e B. bigemina (SMITH & KILBORNE, 1893), sendo que ambas, em condies naturais, so transmitidas pelo carrapato Boophilus microplus (CANESTRINI, 1887). A distribuio de todas as espcies diferentes de Babesia se d de acordo com a distribuio geogrfica dos carrapatos, que so os vetores que a transmitem (GAFFAR, 2004).

Segundo BUSHELL et al. (1991), a babesiose tem ampla distribuio geogrfica, que corresponde rea de existncia do seu vetor biolgico carrapato, Boophilus microplus, a qual se estende entre as latitudes 32 Sul e 40 Norte da linha do Equador, constituindo um problema para os pases tropicais e subtropicais como o Brasil. No Brasil, a babesiose foi descrita primeira vez por Fajardo em 1901 (SILVA, 1981). Das duas espcies B. bovis e B. bigemina, a B. bovis considerada a mais virulenta (ZAUGG, 1993). A dinmica da infeco por Babesia spp dependente de fatores como populao de carrapatos infestantes, capacidade de transmisso do carrapato, susceptibilidade dos bovinos, a qual varia com a raa, idade, sexo, estado fisiolgico e imunitrio (SOARES et. al., 2000; SOUZA et al., 2000). A babesiose considerada um dos maiores impedimentos de uma produo eficiente em criaes nos pases menos desenvolvidos, que esto localizados principalmente em regies tropicais e subtropicais (RAMREZ-CRUZ et.al., 1997; ALARCN et.al., 2003), visto que nessas regies o programa de controle do carrapato aparentemente impossvel de ser mantido devido a alguns fatores climticos e geogrficos. A Babesia bovis, de acordo com McCOSKER (1981), causa perdas econmicas devido aos efeitos diretos da doena, como mortalidade dos animais, queda da produo dos animais doentes, e gastos com medicamentos para tratamentos, e aos efeitos indiretos, como elevados custos de medidas profilticas e de controle da doena, e dificuldade de expanso de bacias leiteiras de alta produtividade devido restrio ao fluxo de animais provenientes de reas instveis. A patogenicidade varivel de acordo com a cepa de Babesia bovis, mais na maioria dos casos, apresenta uma alta mortalidade nos animais no tratados (GAFFAR, 2004). Em trabalho realizado por BOMFIM et.al. (2004), foi observado que bezerros gerados por fmeas que passaram pela doena clnica durante a gestao, nasceram mais leves, confirmando a influncia da infeco por Babesia sp. em vacas prenhes sobre o peso dos bezerros ao nascer. No Brasil, os prejuzos totais na produtividade da bovinocultura, causados direta e indiretamente pelo Boophilus microplus, foram calculados na cifra de dois bilhes de

dlares anuais sendo quinhentos milhes devido s doenas transmitidas por estes (MADRUGA, 2003).

3.2 Biologia da Babesia bovis

A Babesia bovis classificada taxonomicamente no Filo Apicomplexa, Classe Aconoidasida, (LEVINE,1973). Embora sejam capazes de infectar uma ampla variedade de vertebrados, os parasitas do gnero Babesia requerem um vertebrado competente e um hospedeiro invertebrado para manter o ciclo transmissor (HOMER et. al., 2000). A babesiose acomete mamferos domsticos e silvestres; sabe-se que atualmente existem aproximadamente 73 espcies animais como possveis hospedeiros (BARREIRA et.al., 2004). Em 2000, HOMER afirmou existir mais de 100 espcies de Babesia identificadas. Segundo GAFFAR (2004), aps testes de invaso in vitro, foi observado que merozotos da Babesia bovis so capazes de invadir e se desenvolver em clulas vermelhas de mltiplas espcies, em contraste com a especificidade de hospedeiros observada na natureza. No hospedeiro vertebrado, aps serem inoculados pelo vetor no momento da alimentao, os esporozotos entram na corrente sangnea e penetram nas hemcias, desenvolvendo-se rapidamente, originando os trofozotos que evoluem para merozotos. A sada do merozoto rompe a clula infectada, embora possa permanecer intacta. Um ciclo de diviso de B. bovis de aproximadamente 8 horas; esse um processo contnuo que depende fundamentalmente das condies imunolgicas do hospedeiro (MAHONEY, 1975; RISTIC, 1988; MEHLHORN & SCHEIN, 1984). A invaso das hemcias pelo parasita um processo ativo que envolve organelas do complexo apical como roptrias, grnulos densos e micronemas, alm de corpos esfricos, conide e anel polar (SAM-YELLOWE, 1996). Ordem Piroplasmida, Famlia Babesiidae e Gnero Babesia

A fase sexuada do ciclo se d quando o carrapato ao se alimentar, ingere os eritrcitos infectados com merozotos, os quais iro se desenvolver no intestino do vetor. A partir do intestino do carrapato, via hemolinfa, estas formas sexuadas gametas podem invadir os ovrios, Tubos de Malpighi, e clulas musculares, onde iro evoluir para zigoto. No ovrio, os ocitos infectados so responsveis pela transmisso vertical da Babesia. Depois da postura, o zigoto infectado d origem a um cineto mvel (uninucleado) que ir se multiplicar assexuadamente no ncleo do ovo e as clulas-filhas invadem o epitlio intestinal em desenvolvimento da larva, produzindo esporocinetos, que iro invadir as glndulas salivares, transformando-se em esporozitos (RISTIC, 1988). A transmisso da forma infectante (esporozoto) ocorre at trs dias aps a fixao do carrapato no hospedeiro. No caso da B. bovis, a transmisso ocorre apenas na fase larval (MAHONEY, 1975). Tais larvas se tornam negativas para B. bovis aps a transmisso, e a maior fonte de reinfeco pode ocorrer no final do perodo de ingurgitamento da fmea adulta (KESSLER et al., 2000). A transmisso em bovinos pode ser adquirida via transplacentria (raramente) (NEW et al., 1997) ou iatrogenicamente, atravs de fmites contaminados (ZAUGG, 1993). Em estudo realizado por OLIVEIRA-SEQUEIRA et.al. (2005), com o intuito de avaliar a freqncia da infeco de fmeas ingurgitadas e ovos de Boophilus microplus com Babesia bovis e B. bigemina, foi observado que a maioria das fmeas ingurgitadas 60,8% no mostraram estar infectadas com Babesia spp., sendo que a freqncia de infeco com B. bovis foi de 15,9%, e de B. bigemina foi de 17,6%. Em relao porcentagem de ovos infectados, os autores supracitados observaram que as fmeas ingurgitadas infectadas com B. bovis produziram 47,3% de ovos infectados, enquanto as fmeas infectadas com B. bigemina produziram 76,6% de ovos infectados. Segundo KJEMTRUP & CONRAD (2000), a co-infeco da babesiose com outros agentes transmitidos por carrapatos tm confundido o entendimento dessas doenas. YOSHINARI et.al. (2003) demonstraram a existncia de co-infeco entre o agente etiolgico da denominada Doena de Lyme like e a Babesia bovis na populao brasileira.

3.3 - Patofisiologia da Babesiose

A patogenia da babesiose, caracterizada por um envolvimento cerebral, tem sido comparada com a do Plasmodium falciparum em humanos. Essa descoberta permitiu inmeros avanos no estudo da imunidade contra Babesia bovis, bem como dos mecanismos de proteo mesma (NEVILS et. al., 2000). Clinicamente, na babesiose causada pela B. bovis os hospedeiros apresentam febre (40-42C), depresso, ictercia, anorexia, taquicardia, taquipnia, anemia, hemoglobinemia, hemoglobinria menos frequente (WRIGHT, 1981; ZINTL et. al., 2005), sialorria, depresso, distrbios neurolgicos e tremores mimetizando, muitas vezes, os sintomas de outras enfermidades, como a raiva dos bovinos, e intoxicaes por plantas causadoras de doenas neurolgicas (SOARES et. al., 2000). Tambm foram reportados sinais como caquexia, e Sndrome do choque hipotensivo, acarretando um alto ndice de mortalidade entre animais susceptveis (FREITAS, 2001). A anemia causada pela destruio intravascular de eritrcitos, pela liberao de merozotos aps a reproduo intra-eritrocitria das babesias. Ademais, a fragilidade osmtica de toda a populao eritrocitria aumenta terminalmente de tal modo que ocorre macia lise, ainda que a parasitemia possa ser inferior a 1% (WRIGHT, 1981). FRANSSEN et.al. (2003), avaliando a caracterizao da invaso eritrocitria pela Babesia bovis, notaram que a invaso ocorre rapidamente (0,91% de parasitemia aos 15 minutos ps infeco), atingindo um pico de 2,20% aps 60 minutos. A morte pode ser causada por uma sndrome similar ao choque, associado liberao de substncias vasoativas e anxia anmica. Entretanto, a mortalidade extremamente varivel, dependendo da espcie de Babesia envolvida, da susceptibilidade do hospedeiro, dos fatores de manejo e de tenso ambiental (ZAUGG, 1993). Leses macro e microscpicas, causada por B. bovis, foram reportadas por PATARROYO et.al. (1982), tais como membranas mucosas plidas e ictricas, tecidos subcutneos levemente amarelados, rgos abdominais como os rins, congestos e com hemorragia subcapsular; vescula urinria com urina vermelho escura e petquias na

mucosa. Os pulmes tambm se mostraram congestos, levemente edemaciados com algumas reas hemorrgicas. O endocrdio se mostrou com petquias e hemorragias. No crebro, foi observada uma distenso de moderada a marcada dos capilares por eritrcitos, bem como uma dilatao dos espaos perivasculares. O fgado mostrou uma evidente degenerao das clulas parenquimatosas, e os canalculos biliares distendidos com bile. No bao, foi verificada congesto e uma hiperplasia marcada das fibras reticulares; os centros germinais contendo poucas clulas; um grande nmero de macrfagos continha hemossiderina e congesto de capilares principalmente do crebro, rins e corao. Em outros pases tambm se evidenciou congesto do bao, encfalo, pulmes e msculos esquelticos, demonstrando tambm a presena de ictercia, hemoglobinria, hemorragias sub-epicrdicas e sub-endocrdicas; os rins se mostraram tumefeitos; a vescula biliar estava distendida e com bile espessa; no crebro havia congesto da substncia cinzenta de todo o encfalo CARLTON & MCGAVIN (1998). Uma caracterstica clnica da babesiose a chamada babesiose cerebral, caracterizada por entupimento da microvasculatura cerebral com eritrcitos infectados e reaes inflamatrias associadas (GAFFAR, 2004). Segundo ZAUGG (1993), a babesiose cerebral caracterizada por hiperexcitabilidade, convulses, opisttono, coma e morte, sendo os sintomas neurolgicos, causados pela anxia cerebral resultante da anemia grave e/ou bloqueio dos capilares cerebrais pelos eritrcitos. O dano causado pelo bloqueio dos capilares pode levar a uma condio conhecida como babesiose cerebral (VALEIRN ,1998). Trabalhos realizados por CAETANO (2001), mostram que a adeso resulta da interao entre antgenos de B. bovis na superfcie dos eritrcitos e receptores endoteliais complementares. Variaes na composio de aminocidos e estrutura dos antgenos podem alterar a afinidade de ligaes com receptores expressos nas clulas endoteliais. Assim, mesmo que amostras diferentes de B. bovis sejam capazes de produzir a sensibilizao de hemcias com antgenos, apenas haver adeso se estes antgenos apresentarem afinidade pelos receptores endoteliais. HERNNDEZ (2002) demonstrou que o aumento da adeso de eritrcitos provenientes de animais inoculados com uma

amostra patognica de B. bovis (BbovUFV 7 passagem) devido maior expresso de molculas de adeso na superfcie das clulas endoteliais. importante relatar que NEVILS et.al. (2000), ao observarem que clones que cresceram vagarosamente in vitro se mostraram menos virulentos, puderam comprovar que existem subpopulaes de Babesia bovis que apresentam graus variveis de virulncia.

3.4 Mecanismos de Imunidade dos bovinos contra a Babesia bovis

A imunidade contra Babesia spp envolve os dois tipos de resposta imune, a inata e a adaptativa (BROWN & PALMER, 1999). As clulas do sistema imune inato so responsveis por controlar a taxa de crescimento do parasita e em parte da parasitemia (HOMER et. al., 2000). A imunidade inata, de acordo com GOFF et. al. (2001), pode ser suficiente na preveno da doena severa em bezerros, em contraste com os animais adultos que foram sucumbidos ao mesmo desafio com B. bovis. Segundo BROWN (2001), os eventos que ocorrem a partir do momento em que o parasito invade o hospedeiro vertebrado e entra em contato com a imunidade inata que determinaro a magnitude da resposta imune especfica. Os hospedeiros mamferos a desenvolvem aps um episdio de infeco natural, ou posterior a uma imunizao profiltica (HOMER et al., 2000). Ambos fatores, humoral e celular esto envolvidos na imunidade contra babesiose; o componente humoral do sistema imune atualmente considerado de importncia limitada na proteo contra infeces por parasitas do gnero Babesia, visto que estes podem subverter a resposta imune humoral e manipul-la para sua vantagem (HOMER et. al., 2000).

3.4.1 Clulas NK e Macrfagos

AHMED (2002), afirma que existe uma crescente evidncia de que a imunidade protetora aos carrapatos e s doenas transmitidas por eles depende da mobilizao de ambas, imunidade inata e adaptativa. Moncitos e macrfagos exercem um papel central nas respostas imunes como clulas apresentadoras de antgeno, clulas imuno-regulatrias e efetoras (GOFF et. al., 2002). Alguns linfcitos sangneos no demonstram propriedades nem de clulas T nem de clulas B (NTNB), constituindo uma terceira populao distinta de linfcitos, encontrada em pequeno nmero no sangue e se distribuem largamente por todos os rgos linfides, so as chamadas clulas natural killer (NK), ou exterminadoras naturais, que originam a partir das mesmas clulas precursoras que as clulas T, mas no sofrem o processamento tmico (TYZARD, 1998). Uma caracterstica definida dos macrfagos e clulas NK que eles so capazes de produzir mediadores solveis em resposta a uma variedade de estmulos infecciosos inespecficos (HOMER et. al., 2000). De acordo com JAMES (1988), especificamente clulas NK e macrfagos, esto envolvidas na atividade anti-babesias, pois na ausncia destas, observa-se um aumento da parasitemia em curto perodo de tempo, sugerindo que os fatores imunes inatos podem estar envolvidos na destruio dos parasitas antecipadamente produo de anticorpos. Na ausncia de macrfagos e clulas NK, uma alta parasitemia se desenvolve em um curto perodo de tempo (HOMER et. al., 2000). De acordo com BITTAR (2002) os macrfagos e outras clulas como as NK e neutrfilos, produzem xido ntrico e citocinas pr-inflamatrias, que auxiliam no controle da parasitemia e na recuperao do animal na fase aguda da doena. A produo de xido ntrico (NO) em macrfagos de bovinos, estimulados in vitro com antgenos de membrana de Babesia bovis e com sobrenadante de cultura de clulas Th antgeno-especficas contendo IFN- e TNF- endgenos, parecem sugerir que o aumento da expresso da enzima xido ntrico sintetase induzida (iNOS) em macrfagos pode ser indicativo do potencial babesicida do NO (STICH et al., 1998). De acordo com GOFF

et.al. (2001), o xido ntrico tem sido conhecido por seu poder babesicida in vitro, porm sua efetividade in vivo tem sido questionada devido sua habilidade de diminuir a regulao da resposta imune do tipo I.
Todavia, a superproduo de NO, tambm, pode estar associada a mecanismos patognicos da infeco, incluindo a babesiose cerebral, j que vrias disfunes orgnicas, observadas durante a evoluo da malria e da babesiose, podem ser mediadas pela produo exacerbada de citocinas pr-inflamatrias (GRAU et al., 1989).

No entanto, GOFF et. al. (2001) obtiveram resultados consistentes com a hiptese de que o xido ntrico exerce um papel no controle da infeco por B. bovis em bezerros jovens no primeiro contato com o parasita, durante uma resposta imune inata no bao.

3.4.2 Clulas T

As clulas T so os linfcitos predominantes no sangue (at 80% dos linfcitos do sangue perifrico), que deixam o sangue por duas vias; as clulas T que no se encontraram com o antgeno anteriormente (clulas virgens) se conjugam com vnulas especializadas localizadas no paracrtex dos linfonodos (vnulas endoteliais altas), e as clulas T de memria deixam a corrente sangnea atravs dos vasos sangneos convencionais nos tecidos e so depois transportadas para os linfonodos atravs da linfa aferente (TYZARD, 1998). As clulas T exercem um papel crucial orquestrando as defesas do hospedeiro contra patgenos intra e extra-celulares (FLYNN et. al., 1998). De acordo com HOMER et. al. (2000), as clulas T so crticas na resistncia babesiose, e os mecanismos mediados por clulas T ocorrem no estgio de resoluo, sendo que as clulas T tambm tm sido implicadas na proteo contra espcies letais de Babesia. As clulas T CD4+ desempenham uma variedade de funes auxiliares, necessrias para montar uma eficiente resposta imune adaptativa (APPAY, 2004). Visto que a Babesia bovis um parasita intra-eritrocitrio obrigatrio, as clulas T CD4+ representam a ligao entre os dois tipos de resposta, inata e adaptativa, uma vez que o

eritrcito no possui Complexo Maior de Histocompatibilidade - MHC (BROWN & PALMER, 1999). As clulas bovinas positivas para CD4 usualmente representam entre 15 e 35% das clulas mononucleares do sangue perifrico, dependendo da idade dos animais, enquanto no timo, CD4 expresso em 60-80% dos timcitos, sendo que uma grande populao dessas clulas (75-88% delas) tambm expressam CD8 (BENSAID & HADAM, 1991). A morte intra-eritrocitria nos estgios de resoluo requerem linfcitos T, especificamente a subpopulao de clulas CD4+ produtoras de IFN- (HOMER et. al., 2000). No entanto, importante salientar que apesar das clulas T CD4 serem consideradas unicamente auxiliares, novos subtipos e novas funes tm sido relacionadas s clulas T CD4+. Foi reportado por APPAY (2004) a existncia de linfcitos T CD4+ citotxicos, que so clulas Tc CD4+ (clulas T citotxicas CD4+) altamente diferenciadas que j tiveram contato com antgeno, levadas a esse estgio atravs de uma ativao, no entanto, ainda no existe evidncia que sugira que essas clulas Tc CD4+ so derivadas das clulas T CD8+ ou pertencem a alguma famlia de clulas semelhantes a NK ou clulas T regulatrias. Muitos estudos tm reportado a presena de clulas TcCD4+ detectadas diretamente do sangue perifrico, in vivo, em diversas patologias humanas. Indivduos saudveis mostraram possuir poucas dessas clulas (no mais de 2% de toda a populao de clulas T CD4+), no entanto, essas clulas corresponderam a mais de 50% das clulas T CD4+ em alguns portadores do vrus HIV, podendo claramente exibir potencial citotxico. Pode-se dizer que a resposta imune resultante da infeco por Babesia conseqncia de um somatrio de fatores e que o controle do padro de resposta dos linfcitos T CD4+ representa um ponto central no desenvolvimento de uma imunidade protetora (BITTAR, 2002). As clulas T CD4+ produzem IL-2, que tambm essencial para a expanso clonal das clulas T CD8+ (AHMED, 2002). Segundo COX (1997) e BROWN et al. (1998),

existem evidncias de que muitas infeces so controladas por mecanismos humorais e celulares, sendo que a imunorregulao das infeces difere em relao aos tipos celulares envolvidos, s citocinas e mediadores secretados, bem como os seus efeitos supressores ou indutores sobre respostas imunes do tipo Th1 e Th2. As clulas Th apresentam um papel duplo; suprem as citocinas necessrias para a maturao de istipos de imunoglobulinas de alta afinidade, e produo e ativao de macrfagos (BROWN & PALMER, 1999). Existem dois subgrupos distintos de clulas Th, que so diferenciados pelas citocinas que secretam: as clulas Th1, que secretam caracteristicamente interleucina 2 (IL2), interferon (IFN- ), e a linfotoxina fator de necrose tumoral (TNF) dentro de

poucas horas aps o estmulo por um antgeno, e as clulas Th2, que secretam IL-4, IL-5, IL-10 e IL-13 vrios dias aps a exposio a um antgeno (TYZARD, 1998). Como suposto por ZINTL et. al. (2005), animais adultos e jovens responderiam com uma resposta imune Th1 infeco primria com Babesia bovis, caracterizada pela produo de IL-12, bem como estimulao de citocinas pr-inflamatrias no bao. A composio final da resposta das clulas Th ao antgeno, pode determinar se as respostas inflamatrias e auto-imunes sero favorveis ou no (MURPHY & REINER, 2002). GOFF et. al. (2001), aps inocular eritrcitos infectados com B. bovis em bovinos jovens constatou que a resposta imune inata protetora de bezerros frente babesiose possui atributos tipo I, com uma induo precoce de IL-12 esplnica e a expresso de RNAm IFN- seguido por um perodo curto de expresso de xido ntrico sintetase induzvel (iNOS). Na metade dos anos 80, caracterizaram-se clulas T humanas e murinas contendo TCR (receptor de clulas T) composto de heterodmeros / , que levou a um grande interesse no papel das clulas T nas respostas imunes (POLLOCK & WELSH, 2002).

Cerca de 1 a 3% dos linfcitos do sangue perifrico nos humanos e nos camundongos e at 60% nos ruminantes possuem TCRs que consistem em cadeias e ; essas clulas em humanos e nos camundongos possuem uma diversidade limitada, no

entanto, nos ruminantes essas clulas constituem uma alta proporo da populao de clulas T e so capazes de se conjugar com uma larga variedade de antgenos, sugerindo que possuam uma importncia funcional maior (TYZARD, 1998). De acordo com FIKRI et.al. (2000), em bovinos, as clulas T constituem uma

populao proeminente das clulas mononucleares perifricas bovinas (PBMC), atingindo mais de 20 30% em bovinos jovens. ROGERS et.al. (2005) constataram que embora as clulas T WC1.1+ tenham sido as clulas predominantemente expressas em bezerros WC1.2+

jovens, devido ao declnio precoce e rpido deste tipo celular, as clulas T

demonstraram uma quantidade semelhante de 1 a 2 anos de idade, indicando que tambm possuem papel importante em animais adultos. Os bovinos possuem subpopulaes de clulas T que diferem no fentipo

celular e podem ter diferentes distribuies teciduais, e um dos antgenos de diferenciao mais estudados das clulas T bovinas uma molcula de superfcie de 215 kDa na

denominada Workshop Cluster 1 (WC1), que expressa na maioria das clulas T

circulao perifrica (POLLOCK & WELSH, 2002). WC1 uma glicoprotena transmembrnica, membro da famlia do Receptor Scavenger Rico em Cistena (SRCR), sendo unicamente expressa nas clulas T . Uma grande proporo, freqentemente a maioria das clulas T do sangue perifrico em animais jovens expressam WC1, tendo

sido identificada somente em ruminantes e sunos (ROGERS et.al., 2005). Duas populaes de clulas T tm sido identificadas no sangue perifrico WC1-/CD2+, uma ampla proporo de clulas

bovino; uma delas descrita como WC1+/CD2-/CD4-/CD8-, e a outra WC1-/CD2+/CD8+, sendo que quando comparamos clulas T T WC1+/CD2- so encontradas no sangue perifrico, enquanto existe uma ampla WC1-/CD2+ no bao (VESOSKY et.al., 2003). possurem duas populaes distintas, existem tambm trs

proporo de clulas T

Alm das clulas T

isoformas de WC1, referidas como WC1.1, WC1.2 e WC1.3, que so expressas em clulas T , sendo que WC1.1 e WC1.2 so expressas na maioria das populaes de clulas T , enquanto WC1.3 expressa em uma pequena subpopulao de clulas T caracterstica de WC1.1. com

Anlises da distribuio tecidual de duas populaes de clulas T

por

citometria de fluxo revelaram que a populao WC1+ estava presente em altas concentraes no sangue perifrico (30-60% em animais jovens) e baixas nos rgos linfides secundrios (5-10%) e que a populao WC1- foi baixa no sangue perifrico (35%) e alta no bao, glndula mamria, e epitlio mucoso do intestino (20-60%) (PARK et. al., 2000). Estudos tm mostrado que as clulas T so ativadas e proliferam atravs da

exposio a organismos patognicos e parasitas. A atividade reguladora e efetora das subpopulaes das clulas T , de acordo com as pesquisas realizadas por PARK et. al.

(2000), so moduladas atravs de mecanismos diretos e indiretos: reconhecimento de antgeno atravs dos TCRs; e ativao atravs das citocinas produzidas pelas clulas apresentadoras de antgenos e citocinas crossregulatory produzidas por clulas T Nos ruminantes, segundo TYZARD (1998), as clulas T e .

respondem

predominantemente na reao linfoctica mista, sugerindo que possam reconhecer antgenos estranhos do MHC e que tambm possam ser citotxicas. Alm disso, essas clulas tambm podem ser exigidas para proporcionar uma resposta imune precoce mediada por clulas nos animais cujas Igs falhem em atravessar a placenta. As clulas T possuem diversas funes, dentre elas a capacidade de secretar

citocinas tanto do tipo 1 quanto do tipo 2, a capacidade citoltica, o efeito regulador sobre o sistema imune (HOWARD et al., 1999), a capacidade de reconhecerem antgenos proticos (WELSH et al., 2002), apresentarem antgenos s clulas T CD4+ e induzirem a sua proliferao (COLLINS et al., 1998) e de participarem na maturao das clulas dendrticas (LESLIE et al., 2002). Estudos de infeco por Mycobacterium bovis em bovinos exauridos de clulas T WC1+ atravs de anticorpo monoclonal sugeriram que a presena dessas clulas est WC1+ como uma ligao entre a imunidade

associada com o desenvolvimento de uma resposta imune adquirida com polarizao Th1, com isso, acredita-se no papel das clulas T

inata e adquirida, o que fundamental para uma resposta imune apropriada (POLLOCK & WELSH, 2002).

Quanto localizao, em estudos realizados por PARK et.al. (2000), foi observado que as clulas WC1- estavam abundantes na polpa vermelha do bao, enquanto as clulas WC1+ estavam predominantemente presentes na regio periarteriolar e zona marginal; enquanto no linfonodo, ambas populaes de clulas estavam localizadas nos seios subcapsulares da regio cortical e medular. Neste mesmo trabalho, notou-se que as clulas WC1+ estavam muito distribudas no timo, em pouco nmero no crtex, e em maior concentrao na regio medular, em grupos prximos aos corpsculos de Hassall. Quanto idade, enquanto o decrscimo na porcentagem no sangue no primeiro ano de vida foi notado ser decrescente para clulas T WC1.2+ (ROGERS et.al., 2005). WC1.1+, o mesmo no aconteceu com as clulas

3.4.3 Clulas B

A proteo contra a infeco aguda de Babesia envolve macrfagos ativados (BROWN & PALMER,1999), neutrfilos, clulas NK (COURT et al., 2001), entre outros, no entanto, o controle da parasitemia durante a persistncia da infeco ou aps a infeco por Babesia envolve tambm anticorpos (BROWN & PALMER, 1999). As clulas B atuam como clulas efetoras primariamente, atravs da expanso clonal antgeno-especfica e diferenciao celular (MCHEYZER-WILLIAMS, 2003). FLYNN et. al. (1998) sugerem que as clulas B antgeno-ativadas promovem um mecanismo de diferenciao das clulas Th e seu recrutamento para folculos B, onde o centro germinal se desenvolve. Respostas de clulas B reguladas por clulas Th fazem uso das clulas B foliculares como precursoras e dependem de padres qualitativamente diferentes da formao da sinapse imune para regular o destino das clulas B (MCHEYZERWILLIAMS, 2003). Clulas B antgeno-especficas possivelmente continuam a chegar no linfonodo por alguns dias aps a imunizao, e provavelmente fazem uma interao cognata com as clulas T ativadas no linfonodo drenante do stio de imunizao (TOELLNER et. al, 1998).

Aps a re-exposio mesma protena antignica, clulas B de memria so estimuladas para se diferenciar rapidamente em clulas plasmticas que secretam anticorpos de alta afinidade, com mudana de istipo como clulas efetoras de longo prazo na imunidade adaptativa (MCHEYZER-WILLIAMS, 2003). Ainda, estes autores afirmam que clulas B de memria, geralmente expressam istipo mudado e Igs de membrana maturadas por afinidade, e requer regulao da memria cognata de clulas Th para sua resposta a um antgeno j conhecido (MCHEYZER-WILLIAMS, 2003).

3.4.4 Resposta em Tecidos Linfides

O sistema linfide muito mais do que um acmulo de rgos linfides como bao, timo, medula ssea, tecido linfide associado ao intestino, e linfonodos; nos organismos vivos, existe uma troca dinmica e uma reorganizao das subpopulaes de linfcitos entre esses rgos linfides, e at mesmo na maioria dos tecidos (HAY & ANDRADE, 1998). A resistncia inata B. bovis parece depender de uma resposta precoce tipo I que amplamente limitada aos rgos linfides, particularmente o bao. O bao um grande rgo linfide que possui clulas T, B, NK e macrfagos (HOMER et. al., 2000), e seu papel central no controle da babesiose bovina em animais jovens suportado pelo fato conhecido de que bezerros esplenectomizados so to susceptveis quanto bovinos adultos infectados pela primeira vez por Babesia (ZINTL et. al., 2005). Os linfonodos so os rgos aonde a resposta imune inata conduz a uma imunidade adquirida; onde alguns dos patgenos mais devastadores evadem a resposta imune, e linfcitos auto-reativos encontram pela primeira vez antgenos prprios tecidoespecficos e so tolerados ou ativados. Os principais papis dos linfonodos dependem da migrao coordenada de seus constituintes celulares; os linfonodos possuem diversas funes importantes no sistema imune: recrutar grande nmero de linfcitos virgens do sangue; coletar antgenos e clulas dendrticas dos tecidos perifricos; suprir o ambiente

para tolerncia antgeno-especfica ou promover respostas efetoras primrias e secundrias; modular as caractersticas orientadoras das clulas T de memria, levando-as aos tecidos que contm os antgenos cognatos; e promover o look out para as clulas centrais de memria (VON ANDRIAN & MEMPEL, 2003). Nos linfonodos estimulados por um antgeno, algumas das clulas dentro desses ndulos se expandem para formar estruturas caractersticas, conhecidas como centros germinais (CGs), onde as clulas B sofrem o processo de mutao somtica, e onde ocorre a mudana de classe imunoglobulnica e a formao de clulas de memria (TYZARD, 1998). A importncia da formao do CG nas respostas a antgenos proticos descrita por LANE et al. (1994) ao demonstrar que camundongos carentes de CGs foram incapazes de produzir anticorpos de alta afinidade, ou segundo MATSUMOTO et al. (1996), embora produzam IgGs precisa-se de doses imunognicas altas para gerar tal afinidade. De fato, as nicas estruturas capacitadas para conferir a especificidade necessria para uma resposta imune bem sucedida so os CGs, uma vez que neles os genes variveis Ig nas clulas B sofrem hipermutao somtica e troca de isotipos ao se diferenciarem em centroblastos, que convertem-se em centrcitos no proliferativos (LIU et al.,1992) que expressam Igs de membrana que ficam expostas aos complexos imunes nas FDC. Duas regies principais podem ser distinguidas histologicamente nos linfonodos o crtex e a medula, sendo o crtex dividido em paracrtex (rea das clulas T), e a rea mais superficial das clulas B, que consiste de folculos primrios e (aps desafio antignico), centros germinais. Os folculos das clulas B so os principais stios das respostas humorais, enquanto a paracrtex o stio onde os linfcitos circulantes entram nos linfonodos, e onde as clulas T interagem com as clulas dendrticas. A medula um labirinto de seios drenantes que so separados pelos cordes medulares, que contm muitas clulas plasmticas e alguns macrfagos e clulas T de memria (VON ANDRIAN & MEMPEL, 2003). A diferenciao de clulas B reguladas por linfcitos T comea com a ativao e migrao de clulas dendrticas s zonas T dos linfonodos que drenam as reas do tecido exposto ao antgeno protico. A captao do antgeno, processamento e sua apresentao

dentro do contexto MHC II, permitem a interao da clula dendrtica ativada e a clula T auxiliar no marcada e o posterior incio de uma sinapse imune, a qual gera a expanso de clones antgeno-especficos tanto de clulas T quanto B (GULBRANSON-JUDGE & MACLENNEN, 1996). As clulas T so ativadas pela apresentao do antgeno apropriado, e subseqentemente influenciam a proliferao, a troca de istipo, a sobrevivncia, e/ou a mutao somtica das clulas B do centro germinal pelo contato e/ou produo de citocinas. No entanto, os requerimentos das clulas T para a formao do centro germinal so diferentes para a troca de istipos e para secreo de Igs (SECORD et. al., 1996). As interaes clulas B e T, desencadeiam uma reao no centro germinal, ocorrendo hipermutao somtica, seleo antgeno-especfica, preservando as clulas plasmticas de alta afinidade com longevidade e clulas B de memria como clulas precursoras sensibilizadas por um antgeno j conhecido (MCHEYZER-WILLIAMS, 2003). Ainda, de acordo com SECORD et. al. (1996), a interao entre clulas T e B antgeno-especficas ativadas progride com a proliferao de clulas B; algumas se diferenciam prematuramente em plasmcitos nas zonas parafoliculares, com a conseqente produo de anticorpos de vida curta no diversificados somaticamente, enquanto outras, junto com as clulas T CD4+ so induzidas a migrarem aos folculos linfides primrios, estimulando a formao de centros germinais (CGs) antgeno-especficos altamente reativos. Segundo VON ANDRIAN & MEMPEL (2003), as clulas T so inicialmente ativadas na rea de clulas T, especialmente no paracrtex superficial, enquanto as clulas B antgeno-especficas so dispersas atravs dos folculos de clulas B. Depois, as clulas T CD4+ se localizam ao redor dos folculos, onde vo auxiliar as clulas B antgenoespecficas promovendo a formao de centros germinais. Essas respostas T-dependentes induzem uma diferenciao de clulas plasmticas de vida curta e o desenvolvimento do centro germinal com clulas plasmticas maduras de vida longa e clulas B (MCHEYZER-WILLIAMS, 2003). A formao dos CGs freqentemente caracterizada pela estratificao de subpopulaes linfocticas em regies proliferativas e no proliferativas bem conhecidas

como zonas escura e clara respectivamente (MACLENNAN, 1994; CAMACHO et al., 1998). Em bovinos essa formao tem sido claramente observada e o tempo de aparecimento dos mesmos parece depender do imungeno utilizado (FREITAS, 2000; RESENDE 2003).

3.4.5 Recirculao de linfcitos

A integrao e o controle das respostas imunes sistmicas dependem do trfego regulado dos linfcitos (BUTCHER & PICKER, 1996). A migrao dos linfcitos do sangue para dentro dos tecidos perifricos e linfides determinada por eventos complexos e combinados, envolvendo mltiplas molculas que, juntas regulam o acesso tecidual de subtipos especializados de linfcitos (DEBES et.al., 2005). A recirculao contnua dos linfcitos entre o sangue, tecidos e linfa essencial para a coordenao e disseminao das respostas imunes. O sangue contm pools distintos de linfcitos que diferem na sua competncia de recirculao (YOUNG et.al., 1997). O processo de recirculao dispersa o repertrio imunolgico, direciona os subtipos de linfcitos para os microambientes especializados que controlam sua diferenciao e regulam sua sobrevivncia, alm de direcionar clulas imunes efetoras aos stios de invaso antignica ou microbiana (BUTCHER & PICKER, 1996). A sada dos linfcitos dos tecidos e a migrao via linfa aferente dentro dos linfonodos drenantes um mecanismo de migrao homeosttica crtico para clulas T de memria e efetoras (DEBES et.al., 2005). Um pool de clulas de memria originadas do sangue tem a capacidade de entrar em mltiplos tecidos, ambos linfides e no linfides, e essa entrada diferentemente regulada (KLONOWSKI et.al., 2004). DEBES et.al (2005) demonstraram que a sada dos linfcitos dos tecidos pela linfa um processo seletivo e ativo, e que o receptor de quimiocina CCR7 a chave desse processo.

A expresso de alguns receptores de adeso de superfcie celular nas clulas linfticas est correlacionada com a sua presena na linfa drenante especfica do tecido, sugerindo que eles podem ser pools fenotipicamente definidos de linfcitos que preferencialmente migram atravs dos tecidos distintos, sendo que os PBLs representam todos esses pools (YOUNG et.al., 1997). O pool de linfcitos que recirculam ativamente pelo organismo tem sido estimado ser dez vezes maior do que o pool sangneo; mesmo assim, essas clulas ativamente recirculantes representam somente 10% do nmero total de linfcitos. A maioria dos linfcitos dentro do timo incapaz de recircular, ou seja, talvez a massa tmica no seja includa no total, alm do que, o pool de linfcitos recirculantes no pode ser considerado homogneo, visto que composto de mltiplas populaes com comportamentos diferentes. A caracterstica fenotpica dos subtipos de linfcitos no sangue similar ao do bao e diferente dos linfonodos, linfa ps-nodal e pr-nodal (HAY & ANDRADE, 1998). Os experimentos de KLONOWSKI et.al. (2004) demonstraram que um pool de clulas de memria originadas do sangue foram capazes de entrar na maioria dos tecidos no linfides e que essas clulas migratrias foram funcionalmente ativas, sugerindo um mecanismo capaz de conferir rapidamente uma ampla proteo frente a uma infeco secundria. No entanto, apesar deste experimento ter sido capaz de demonstrar a capacidade migratria das clulas T de memria, ele no foi capaz de demonstrar o movimento das clulas T CD8 de memria ao longo dos tecidos. Segundo HAY & ANDRADE (1998), tem sido demonstrado que as clulas derivadas das linfas possuem diferentes capacidades migratrias em relao aos linfcitos derivados do sangue, e que um desafio antignico de um nico linfonodo pode primeiramente reduzir a produo de linfcitos e ento, aumentar marcadamente o recrutamento do sangue e subseqentemente a produo dentro da linfa eferente.

3.5. Mtodos de controle da babesiose

Considerando-se as peculiaridades da babesiose, incluindo sua caracterstica aguda, na maioria das vezes, intensos esforos tm sido feitos para desenvolver mtodos ou produtos capazes de control-la (ALARCN et.al., 2003). RAMREZ-CRUZ et.al. (1997) afirmam que no existe um procedimento que por si mesmo constitua um controle real da babesiose no mundo, visto que h diferentes aspectos que determinam e condicionam a presena da enfermidade. A reduo da transmisso da babesiose na atualidade favorecida pelo controle dos carrapatos que realizado de maneira estratgica por meio de aplicao de drogas acaricidas em determinados perodos do ano, baseados em dados de levantamento epidemiolgico, estas medidas reduzem os nveis populacionais dos carrapatos (NARI, 1990). Esforos significativos tm sido investidos no desenvolvimento de vacinas para bovinos e outros animais, de qualquer forma, devem eventualmente se mostrar utilizveis para o desenvolvimento de uma vacina humana (HOMER et. al., 2000). A imunizao, sob o ponto de vista de RAMREZ-CRUZ et.al. (1997), parece ser o procedimento que oferece as melhores perspectivas, pois este mtodo de preveno e controle considerado uma das alternativas primordiais para resolver o complexo problema da babesiose bovina.
preciso salientar que embora as vacinas sejam desenvolvidas para proteger os animais contra um amplo nmero de patgenos importantes, freqentemente elas so apenas parcialmente efetivas, seja pela sua ineficincia em gerar uma resposta imune celular (ELLIS, 2004), seja pela possibilidade de transmitir doenas.

DE VOS & BOCK (2000), estudando a eficincia de vacinas contra babesioses, cita que uma vacina ideal deve apresentar as seguintes caractersticas: prevenir a doena, proteger contra as diferentes cepas, induzir imunidade de longa durao, ser livre de antgenos contaminantes, conservar a potncia durante o armazenamento e transporte, de fcil administrao.

3.5.1. Premunio

A premunio consiste na inoculao de sangue de um animal portador (doador) em um animal susceptvel (receptor), esta teve origem no incio do sculo XX, na Austrlia, por C. J. Pound (CALLOW et al., 1997); apesar de ser o mtodo mais antigo, atualmente, esta prtica continua sendo amplamente utilizada no controle da babesiose em plantis de bovinos leiteiros no Brasil. PATARROYO (1979) destaca as limitaes desse mtodo j que o inoculo desconhecido tanto qualitativa como quantitativamente. A necessidade de medicao dos animais que apresentam a doena na forma aguda interrompe o mecanismo de desenvolvimento da imunidade, necessitando-se, por isso, de repetidas inoculaes. Como o volume de sangue inoculado relativamente grande (em geral 5 mL), ocorrer a sensibilizao do receptor para grupos sangneos, o que poder conduzir doena de incompatibilidade de sangue entre o bezerro e a vaca. DIMMOCK & BELL (1970), afirmam que isto ocorre devido formao de anticorpos polireativos contra as hemcias. Outra desvantagem a necessidade de suporte veterinrio mesmo aps a fase de premunio (SOUZA et al, 2000). Pois, os doadores podem ser portadores de outras doenas infecciosas como brucelose, tuberculose, leucose, diarria bovina a vrus (BVD), rinotraqueite infecciosa bovina (IBR), lngua azul, erlichiose, tripanossomose, etc., as quais podem ser disseminadas por este mtodo. Aliados a isto, esto o alto custo do processo e a dificuldade de imunizar grande nmero de animais simultaneamente.

3.5.2. Vacinao

A primeira vacina contra B. bovis desenvolvida por pesquisadores australianos; trata-se de uma vacina viva atenuada, que a princpio foi utilizada em reas endmicas do

pas e posteriormante exportada (CALLOW & MELLORS, 1966; CALLOW et.al.,1979). Entretanto, por causa da variabilidade antignica destes parasitos no tem sido possvel obter, at o momento, uma vacina efetiva e economicamente vivel (WRIGHT et al., 1992; BROWN et al., 1995; PALMER & McELWAIN, 1995; PATARROYO et al., 1995b). Apesar de efetiva, a vacina apresenta algumas desvantagens no que diz respeito ao curto perodo de validade (5-7 dias a 5C), a transmisso de agentes infecciosos como o da leucose bovina, e a proteo parcial dos animais vacinados (BOCK et al , 1992). A presena de reaes ps-vacinais intensas, e a necessidade de tratamento teraputico levaram investigao de atenuao de cepas de Babesia capazes de manter a sua imunogenicidade, atravs de passagens rpidas em bezerros esplenectomizados e radiao, a fim de no ser patognicos aos hospedeiros (RAMREZ-CRUZ et al., 1997). No entanto, pode-se dizer que as vacinas vivas atenuadas apresentam desvantagens, como dificuldades de estocagem, risco de transmisso de outras infeces, proteo parcial dos animais vacinados, isoeritrlise fetal, competio antignica devido utilizao de amostras vivas, alm do risco de inocular enzimas e outras protenas oriundas do animal do qual a amostra foi multiplicada. Considerando-se que o intuito de desenvolver uma vacina contra B. bovis evitar a morte e diminuir gastos com tratamento de animais e com funcionrios para monitorar os animais aps a vacinao, ento, as vacinas vivas atenuadas oferecem desvantagens que no justificam sua utilizao. Na atualidade ainda no h vacinas inativadas no mercado, apesar das tentativas que tm sido realizadas. A imunogenecidade de parasitas mortos provenientes de eritrcitos infectados com B. bovis foi primeiramente abordada por MAHONEY & WRIGHT (1976), no entanto, os animais vacinados mostraram proteo parcial quando desafiados com organismos heterlogos; desenvolvendo a infeco, apenas de forma subclnica.

3.5.3. Controle com exoantgenos

O desenvolvimento e aprimoramento de tcnicas que propiciaram a manuteno in vitro de B. bovis geraram um grande interesse no cultivo deste parasita, como fonte de vacinas babesiais a partir de antgenos presentes no sobrenadante de cultura (LEVY & RISTIC, 1980). Exoantgenos presentes em sobrenadante de cultivo de amostra atenuada de B. bovis foram capazes de induzir uma resposta imune protetora contra amostras virulentas heterlogas quando desafiados, indicando que a vacina com antgenos solveis de B. bovis so capazes de elicitar tanto a resposta imune humoral quanto a celular (PATARROYO et al., 1995a). BROWN et al. (1995), bem como TUO et al. (1999), realizaram pesquisas com o intuito de indentificar protenas de B. bovis que fossem imunognicas e pudessem ser utilizadas na produo de vacinas formadas por subunidades proticas.

3.5.4. Protena Associada s Roptrias (RAP)

Com o passar dos anos, notou-se a importncia de se identificar eptopos universais de clulas T que so reconhecidos por indivduos com mltiplos hapltipos do MHC para promover a melhor proteo possvel a nvel populacional (NORIMINE et.al., 2002). Em 1995, foi observado em estudos realizados por PALMER & MCELWAIN, que anticorpos monoclonais contra merozotos ntegros ou organelas do complexo apical (tais como as roptrias, os micronemas, os corpos esfricos e os grnulos densos) permitiam a identificao de protenas requeridas para a sobrevivncia do parasita. A famlia multignica que codifica protenas de 58-60 kDa, denominadas RAP, que esto associadas tanto superfcie dos merozitos quanto s roptrias do complexo apical de B. bovis e B. bigemina, demonstram capacidade de estimular a resposta imune adaptativa tanto do tipo humoral quanto celular. As protenas produzidas em organelas do

complexo apical tm grande importncia no processo de invaso do parasita na clula hospedeira (BROWN et al., 1996). A protena associada roptria-1 (RAP-1) famlia gene homlogo inclui: Babesia bovis, B. caballi, B. canis, B. divergens e a B. ovis (SKUCE et al., 1996). Segundo WRIGHT et al. (1992), a protena RAP-1 responsvel pelo estabelecimento do parasitismo intra-eritrocitrio e conservada em vrios isolados de espcies geograficamente diferentes, alm de apresentar eptopos altamente imunognicas para linfcitos B e clulas T-CD4+ (PALMER et al., 1991; SUAREZ et al., 1991). Embora alguns estudos mostrem que os eptopos para clulas B mais antignicos da protena RAP-1, normalmente no so conservados entre espcies diferentes e que seqncias altamente conservadas so pouco imunognicas (SUAREZ et al., 1993), BROWN et al. (1996) demonstraram no apenas que a protena RAP-1 de B. bovis altamente imunognica, como tambm que os eptopos para clulas Th so conservados entre isolados geograficamente diferentes de B. bovis. A significncia imunolgica de RAP-1 indicada pela inibio do desenvolvimento in vitro de Babesia utilizando anticorpo monoclonal especfico contra RAP-1 e a habilidade deste em imunizar contra alteraes do parasitismo no gado (FIGUEROA & BUENING, 1991; McELWAIN et al., 1991). Ento, uma vacina contra B. bovis constituda de subunidades proticas deve conter epitopos T e B reativos, no sujeitos a variao antignica, devendo ser reconhecidos por uma grande variedade de molculas MHC-II, o que coloca a protena RAP-1 como forte candidata para produo de vacina (BROWN & PALMER, 1999). A resposta imune de bovinos imunizados com roptrias purificadas de Babesia bigemina foi observada por MACHADO et.al. (2004), que constataram que as clulas B estavam em nmero maior na regio medular dos linfonodos das vacas imunizadas.

3.5.5. Peptdeos sintticos

Os peptdeos sintticos so seqncias de aminocidos construdas e derivadas de uma ou vrias protenas. O grande interesse na utilizao de peptdeos sintticos na produo de vacinas decorre da capacidade de simulao dos stios antignicos ou dos receptores proticos, da qual provm a seqncia aminoacdica do peptdeo (PATARROYO & GUZMAN, 2004).

Ao contrrio das vacinas tradicionais, as peptdicas apresentam grandes vantagens, tais como: alto grau de pureza e completa segurana quanto caracterizao qumica e a ausncia de contaminantes, reprodutibilidade na produo, fim da manipulao de cultivo celular em biorreatores, alta estabilidade e baixo custo da produo em escala, permite, tambm, a manipulao da resposta imunolgica, pois os imungenos sintticos podem ser desenhados de tal forma que estimulem uma resposta imune apropriada (NEURATH & KENT, 1986), bem como ausncia de mecanismos supressores, alrgicos e/ou, autoimunes (PATARROYO et al., 1995b). Portanto, o uso de peptdeos sintticos como vacinas teriam a vantagem de ser mais um produto qumico que biolgico (PATARROYO & GUZMAN, 2004). Atualmente h um interesse crescente pelo uso de peptdeos sintticos no campo da medicina preventiva, diagnstico e controle, assim como na teraputica tem sido alavancada com diferentes comprovaes e a aprovao de outros frmacos pela FDA. Assim, existem peptdeos em fase de teste clnico com adjuvante para imunizao contra o P. falciparum, o B. microplus, o S. mansoni, entre outros para o diagnstico de malria, doena de Chagas, leishmanioses, fascioloses, hidatidoses e cistercercoses, sendo o mais recente avano a liberao do FuzeonTM para o controle da AIDS (PATARROYO & GONZLEZ, 2004); isto, tambm, se da devido ao fato dos peptdeos poderem ser sintetizados e serem muito estveis temperatura ambiente, a utilizao destes pode melhorar a padronizao e reprodutibilidade dos diferentes testes para sorodiagnstico (PATARROYO et.al., 1999b). Os resultados obtidos por FREITAS (2001) em experimento com clulas ex vivo permitiram constatar que a resposta ao peptdeo hbrido 23.290 foi caracterizada pelas maiores taxas de produo de IFN- , TNF- e IL-12 por PBMC, sendo ento o peptdeo que apresentou maior imunogenicidade e reconhecimento celular em relao aos outros peptdeos testados. A interveno vacinal com o peptdeo sinttico SBbo23290 derivado de RAP-1 de B. bovis, reduz a taxa de mortalidade de animais imunizados aps o desafio com amostra patognica, bem como a eficcia desta vacinao estar associada ao desenvolvimento

precoce da habilidade de desenvolver uma resposta antgeno especfica envolvendo clulas B e linfcitos TCD4+ (BITTAR, 2002). De acordo com pesquisas realizadas no LBCHV/BIOAGRO, utilizando peptdeos sintticos, concluiu-se que quando bem desenhados e convenientemente testados, tais peptdeos comportam-se como uma protena nativa, portanto, este trabalho tem como intuito realizar estudos sobre os mecanismos envolvidos na resposta imunolgica ao imunogno sinttico SBbo23290.

4. MATERIAL E MTODOS

4.1. Local de realizao do experimento

O experimento foi realizado no Laboratrio de Biologia e Controle de Hematozorios e Vetores (LBCHV) do Departamento de Veterinria (DVT), localizado no Instituto de Biotecnologia Aplicada Agropecuria (BIOAGRO) e no Isolamento contra Artrpodes e Vetores de Hematozorios para Bovinos, localizado no Departamento de Veterinria (DVT) da Universidade Federal de Viosa (UFV), Viosa - MG.

4.2. Animais

Foram utilizados nos ensaios de imunizao, 12 bovinos Bos taurus taurus da raa holandesa, machos, com idade entre 4-5 meses; os quais foram identificados sorolgica e hematologicamente como negativos para hemoparasitas. Os bovinos foram confinados no isolamento a prova de artrpodes e vetores de hematozorios. Durante a realizao da pesquisa, os mesmos receberam diariamente rao balanceada com 17% de protena e Capim Napier picado proveniente de rea livre de carrapato, duas vezes por dia, alm de suplemento mineral. Durante todas as fases, os bovinos receberam gua vontade.

4.3. Peptdeo sinttico

A protena RAP possui P.M. de 64,97 kDa e composta de 565 aa. Esta foi sintetizada em 31 peptdeos diferentes, alguns com "overlap" entre uma seqncia e outra. Os peptdeos foram catalogados no livro de seqncias de 5.067 at 5.097. Aps o mapeamento de eptopos B e T de todos os peptdeos, utilizando experimentos "in vitro" e "ex vivo", realizou-se a hibridizao dos peptdeos SBbo5084 (eptopo B) e do SBbo5081 (eptopo T) com adio de cisteina no N- e C- terminal, originando o peptdeo sinttico SBbo23290 (PATARROYO et al., 1999a), sendo o SBbo23290 o peptdeo mais imunognico de acordo com os estudos de FREITAS (2001). Este peptdeo foi desenvolvido e produzido pelo LBCHV/BIOAGRO/DVT/ UFV, em parceria com a Fundacin Instituto de Imunologia de Colmbia (FIDIC). O peptdeo sinttico SBbo23290 foi sintetizado de acordo com a metodologia descrita por MERRIFIELD (1963).

4.4. Esquema de imunizao

Os 12 animais utilizados no experimento foram agrupados, atravs de sorteio, em dois grupos de quatro animais e um de trs, mantidos em iguais condies ambientais. Esses animais foram inoculados por via subcutnea (sc) de acordo com a tabela 1.

Como mg/animal/dose.

adjuvante,

utilizou-se

saponina

(Saponine )

na

dose

de

1,5

Tabela 1 Esquema de Imunizao

N.o grupo 01 (Peptdeo)

N.o animais 04

Inoculao (n.odoses/via) 4x/sc

Intervalo 30 d

Produto 2 mg SBbo 23.290 2 mL H2O destilada 1,5 mg saponina 1,5 mg saponina 2 mL H2O destilada 2 mL H2O destilada

02 (Saponina) 03 (Controle)

04 04

4x/sc 4x/sc

30 d 30 d

4.5. Infeco Desafio

Uma amostra virulenta de Bbo UFV1, stima passagem, mantida sob criopreservao em nitrognio lquido no LBCH/BIOAGRO, foi descongelada para o experimento. Aps o descongelamento, a amostra foi inoculada em um bezerro para reativao da mesma. Quando a parasitemia alcanou 1,4% coletou-se o sangue total para ser usado como inculo nos animais do experimento. Os animais dos grupos 1, 2 e 3 receberam 1,0 mL de sangue contendo aproximadamente 1,2x106 hemcias infectadas por mL, como inoculo de desafio por via endovenosa. O desafio foi realizado 60 dias aps a ltima imunizao.

4.6. Imunofenotipagem dos linfcitos do sangue perifrico (PBL)

Foram realizadas cinco coletas de sangue completo vcuo, com anticoagulante EDTA nos dias 7, 7, 37, 65 e 172, conforme descrito na tabela 2. Os leuccitos foram isolados por centrifugao (300g, por 15 minutos a 18 C) e criopreservados (40% de albumina srica bovina a 20%, 60% de soluo crioprotetora FARMOTERPICA, 10 % da soluo final de dimethilsulfoxido (DMSO) e 2UI de heparina sdica por mL) em nitrognio lquido. Os marcadores de diferenciao de linfcitos foram analisados por citometria de fluxo. Os anticorpos utilizados, especficos para antgenos de superfcie celular bovina CD21, CD4, CD8 e o antgeno de superfcie WC1 das clulas T , ambos utilizados em citometria de fluxo e produzidos pela Serotec descritos no tabela 3, foram previamente padronizados utilizando-se sangue total bovino e amostras congeladas de PBL bovino. A titulao especfica para cada anticorpo foi determinada por citometria de fluxo, empregando-se quantidades especficas (1,5; 0,75; 0,37 e 0,50 diludo em 15 L de PBS. L) para cada anticorpo

Tabela 2 - Dias referentes s coletas de PBL

Coleta C1 C2 C3 C4 C5

Dias -7 7 37 65 172

Dias correspondentes 7 dias antes da 1 inoculao 7 dias aps a 1 inoculao 7 dias aps a 2 inoculao 5 dias aps a 3 inoculao 15 dias aps o desafio

O criotubo de PBL com volume de 350

L foi retirado do freezer e colocado

diretamente no banho-maria a 37 C. Aps ser descongelado, o sangue foi transferido para um tubo Falcon de 15 mL fundo em V, sendo ento adicionado 5 mL de meio RPMI incompleto. O sangue foi centrifugado a 300g por 10 minutos, a 4C. Aps descartar cuidadosamente o sobrenadante e ressuspender o sedimento, retirou-se 30 L (correspondendo a aproximadamente 2x106 clulas por mL) de PBL que foram colocados em tubos Falcon de 5 mL (n352052) contendo 15 L dos anticorpos monoclonais

especficos. Depois de homogeneizar, o tubo Falcon contendo o PBL e os anticorpos foram incubados por 30 minutos temperatura ambiente e ao abrigo da luz. Aps a incubao, foram adicionados 2 mL de soluo de lise (FACSTM Lysing Solution, na diluio 1:10) sob agitao. Os leuccitos totais, aps incubao de 10 minutos, foram centrifugados a 300g por 10 minutos, a 18 C. O PBL foi lavado duas vezes da seguinte maneira: o sobrenadante foi descartado, adicionou-se 1 mL de PBS, o tubo foi homogeneizado com o auxlio de um Vrtex e centrifugou-se a 300g por 10 minutos a 18C. Depois de descartar o sobrenadante, foram adicionados 200 L de soluo fixadora (paraformaldedo 1% em tampo cacodilato de sdio 10g/L, pH 7,2) e analisados no citmetro de fluxo FACScan BENCTON DICKINSON.

Tabela 3: Anticorpos Monoclonais utilizados

Nome
Mabs CC8 Mabs CC63 Mabs CC21 Mabs CC101

Especificidade

Istipo

Diluio
Anti-CD4 conjugado com FITC Anti-CD8 conjugado com FITC Anti-CD21 conjugado com FITC Anti-WC1 conjugado com FITC 1:240 1:120 1:200 1:10 Camundongo IgG2a Camundongo IgG2a Camundongo IgG1 Camundongo IgG2a

A identificao das populaes celulares de interesse, bem como a determinao do valor percentual de populaes e subpopulaes celulares, foram realizadas utilizandose o programa Cell-Quest. A cada etapa do experimento, foi analisado inicialmente o controle de clulas (controle negativo), importante na padronizao da qualidade do perfil celular. Para a anlise da expresso dos antgenos de superfcie linfocitria, o primeiro passo consistiu na identificao da populao de linfcitos. Para isso, foram utilizados grficos de distribuio pontual nos quais a populao de interesse ocupa uma regio caracterstica aps ajustes de ganhos de seu tamanho (FSC) e granulosidade (SSC). Aps a seleo da regio de interesse (R1) o percentual de subpopulaes celulares dentro da populao selecionada foi obtido em grficos bidimensionais de distribuio pontual com coordenadas de fluorescncia 1 (FL1) versus fluorescncia 2 (FL2). Este grfico tipo dot-plot permite identificar o percentual de clulas fluorescentes para um determinado fentipo de marcao, quantificado atravs da estatstica de quadrantes includa no programa. O corte foi posicionado considerando-se a populao celular positiva para os marcadores CD4, CD8, CD21 e WC1, o que permitiu obter o percentual equivalente populao de linfcitos reativos dentro da populao de leuccitos totais. Tambm foram avaliados alguns marcadores que se expressam de forma constitutiva na superfcie celular. Para isto foi utilizada a estratgia de anlise por meio de Canal Mdio de Fluorescncia (CMF), que representa a intensidade total de luz emitida pela excitao do fluorocromo indiretamente ligado superfcie celular. Esta estratgia objetiva ampliar a sensibilidade na deteco das possveis variaes na expresso durante as diferentes fases do experimento. A intensidade de fluorescncia foi avaliada atravs de histogramas unidimensionais para os marcadores CD4+, CD8+, CD21+ e WC1+.

4.7. Histologia dos linfonodos bovinos

Linfonodos pr-escapulares foram cirurgicamente removidos nos dias 1, 5, 34, 63 e 160 (tabela 4). Os fragmentos de linfonodos seccionados foram fixados durante 4 horas em paraformaldedo a 4% (pH 7,2), e desidratados por 24 horas em solues alcolicas crescentes (70%, 80%, 90% e 100% I e II), e posteriormente os fragmentos foram diafanizados em xilol e includos em Paraplast Plus (Sigma ) (PROPHET et al.,

1992). Os linfonodos foram coletados do mesmo lado que a imunizao. Realizaram-se cortes histolgicos seriados de 5 m de espessura em micrtomo de rotao SPENCER American Optical Company, os quais foram corados segundo as tcnicas de Hematoxilina & Eosina e Verde Metil Pironina. As lminas foram analisadas com auxlio de microscpio ptico binocular ECLIPSE E6001.

Tabela 4 Dias referentes s coletas de linfonodos bovinos

Coleta C1 C2 C3 C4 C5

Dias -1 5 34 63 160

Dias correspondentes 1 dias antes da 1 inoculao 5 dias aps a 1 inoculao 4 dias aps a 2 inoculao 3 dias aps a 3 inoculao 3 dias aps o desafio

4.8. Hematoxilina & Eosina

Os cortes foram desparafinados em xilol por 5 minutos, sendo hidratados em solues alcolicas decrescentes (100% por trs minutos; 90%, 80% e 70% por um minuto cada), e lavados em gua comum por trs minutos. Ento, os cortes foram corados em Hematoxilina por um minuto e meio, lavados em gua comum por cinco minutos, e corados com Eosina por trs minutos e lavados em gua comum novamente por cinco

minutos. Posteriormente, os cortes foram desidratados em solues alcolicas crescentes por dois minutos cada, desparafinados em xilol por cinco minutos, e montados entre lmina e lamnula com Entellan.

4.9. Verde Metil Pironina

Os cortes foram desparafinados em xilol por cinco minutos, lavados em gua destilada por quinze minutos, e corados com Verde Metil Pironina por seis minutos. Ento os cortes foram lavados duas vezes em butanol por cinco minutos cada, desparafinados em xilol por cinco minutos e montados entre lmina e lamnula com Entellan.

4.10. Pesquisa de antgenos de Babesia bovis em linfonodos bovinos atravs da tcnica de Peroxidase-anti-Peroxidase PAP (PROPHET et al. 1992)

Os cortes histolgicos foram desparafinados em xilol, duas passagens de 30 minutos cada, sendo hidratados em solues alcolicas decrescentes (100% I e II, 90%, 80% e 70%) trocando-se de soluo a cada 5 minutos. A peroxidase endgena foi

bloqueada com perxido de hidrognio metanlico 3% durante 30 minutos a temperatura ambiente. Aps lavagem em PBS pH 7,4 (1,48g de fosfato de sdio dibsico anidro, 0,43g de fosfato de sdio monobsico anidro, 7,2g de cloreto de sdio e gua deionizada q.s.p. 1000ml), foi feita a digesto enzimtica dos cortes utilizando-se tripsina 1mg/ml em PBS pH 7,4 durante 15 minutos a 37C. Os cortes foram lavados duas vezes, durante 5 minutos cada, com PBS pH 7,4. Em seguida, cobriram-se os cortes com soro normal de cabra diludo 1:10 em PBS pH 7,4 e incubaram-se em cmara mida durante 45 minutos a temperatura ambiente. Aps a incubao, enxugou-se o excesso de soro e sem deixar secar os cortes colocou-se anticorpo primrio especfico (IgG de coelho anti-Babesia bovis), produzido pelo LBCH,

Microscpio ptico Eclipse E600 Nikon Japan

diludo 1:20 em PBS pH 7,4; os cortes foram incubados durante 18 horas em cmara mida a 4C. Posteriormente, os cortes foram lavados trs vezes com PBS pH 7,4 durante cinco minutos cada e em seguida cobertos com o anticorpo secundrio (IgG de cabra anti-IgG de coelho), produzidos pelo LBCH, diludo 1:10 em PBS 7,4. Aps incubao em cmara mida, durante 45 minutos a 37C, os cortes foram lavados trs vezes, 5 minutos cada, com PBS pH 7,4 e posteriormente cobertos com o complexo PAP produzido em coelho (SIGMA ), diludo 1:200 de acordo com especificao do fabricante, e imediatamente incubados em cmara mida, durante 45 minutos a 37C. Lavaram-se os cortes novamente em PBS pH 7,4 durante 10 minutos e imediatamente foram colocados em soluo reveladora recm preparada [25mg de diaminobenzidina (DAB), 200 l de H2O2 30 volumes em 100ml de PBS pH 7,4] durante 5 minutos. Finalmente, lavaram-se os cortes durante 5 minutos em PBS pH 7,4 e contra corou-se com Hematoxilina de Harris 1:10 em PBS pH 7,4 durante 20 segundos, sendo em seguida desidratados em lcool, diafanizados em xilol e montados com Entellan entre lmina e lamnula.

4.11. Anlise Estatstica

A anlise estatstica dos resultados foi feita por intermdio da anlise de varincia (ANOVA), seguido do Teste de Tukey, nvel de 5% de probabilidade. Os clculos estatsticos foram realizados com o apoio instrumental do software Graph Pad Prisma verso 4.03.

5. RESULTADOS E DISCUSSO

5.1. Avaliao histopatolgica de linfonodos pr-escapulares bovinos

O exame microscpico dos linfonodos dos animais inoculados com o peptdeo SBbo23290, corados com Hematoxilina & Eosina (H&E) demonstrou que a partir dos cinco dias aps a primeira inoculao foi possvel constatar reatividade de centros germinais - CGs (Figura 1C e D) e de reas paracorticais, diferente dos do grupo controle (Figura 1A e B). Igualmente constatou-se que algumas regies interfoliculares estavam levemente hiperplsicas. Quatro dias aps a segunda inoculao a formao de CGs se mostrou mais evidente, igualmente os cordes medulares estavam nitidamente hiperplsicos (Figura 2B).

Esse resultado pode ser explicado pelo fato de que quando se usam antgenos Tdependentes, a resposta de clulas T aps um segundo desafio geralmente mais rpida e efetiva em relao ao desafio antignico inicial, como conseqncia do aumento no nmero de clulas antgeno-especficas e de memria que respondem mais eficazmente do que as clulas virgens durante as repostas primrias, concordando com o constatado por FREITAS (2001), quando trabalhou com uma amostra atenuada de Babesia bovis; GONZLEZ (2003) e SALES JNIOR (2003) ao trabalharem com o peptdeo sinttico SBm7462; e BOUSSO & KOURILSKY (1999) utilizando tetrmeros. Alm disso, a maior reatividade dos CGs, bem como a hiperplasia de cordes medulares e de reas Tdependentes observada neste trabalho quatro dias aps a segunda imunizao, trs dias aps a terceira inoculao, e trs dias aps o desafio com amostra virulenta de B. bovis comprova-se que a resposta imune secundria mais rpida e efetiva em relao primria, isto devido memria imunolgica. Visto que foi possvel constatar uma reatividade dos linfonodos caracterizada pela formao de CGs e hiperplasia das reas paracorticais, pode-se dizer que o imungeno sinttico SBbo23290 utilizado neste estudo induziu uma resposta imune adaptativa do tipo T-dependente, concordando com o que foi referido por LIU et al. (1992). Assim, as particularidades histolgicas dos CGs tambm descritas por vrios autores em rgos linfides perifricos de bovinos (FREITAS, 2001; SAKAMOTO & CABRERA, 2003; RESENDE, 2003; GONZLEZ, 2003) so caractersticas de resposta a antgenos Tdependentes. Estes achados tambm tm sido descritos por vrios autores em rgos linfides perifricos de humanos (CAMACHO et al., 1998) e camundongos (SALES JNIOR, 2003) tais como: bao, linfonodos (REARDON & PIERCE, 1981), tonsilas (CAMACHO et al., 1998) e Placas de Payer (GULBRANSON-JUDGE et.al., 1997). Alm disso, quando os cortes histolgicos foram corados com Verde Metil Pironina foi possvel observar que aos cinco dias aps a primeira inoculao (Figura 2 B e D) haviam clulas intensamente coradas de vermelho principalmente nos cordes medulares, enquanto nos seios medulares havia predominncia de clulas coradas de azul em quantidade elevada, sendo possvel notar a presena de clulas dendrticas e plasmcitos, sendo estes achados mais notveis aps cada inoculao (Figura 2C). Corroborando os resultados de FREITAS (2001) e RESENDE (2003), na regio cortical

notou-se a presena de clulas fortemente coradas de vermelho e de azul, porm em menor quantidade. A zona escura dos CGs apresentava clulas fortemente coradas de vermelho, enquanto na zona clara havia uma ntida predominncia de clulas coradas de azul. FREITAS (2001) e RESENDE (2003) constataram que durante a primeira semana as clulas formadoras de anticorpos localizadas nas reas extrafoliculares produziam anticorpos de baixa afinidade, clulas estas caracterizadas como plasmcitos quando coradas pelo Verde Metil Pironina, o que tambm foi descrito por SMITH et al. (1997), ZHENG et al. (1996) e TARLINTON (1998). Nesta tcnica de colorao, o RNA corado de vermelho e somente as clulas que esto em diviso so coradas, como o caso dos linfcitos B; e o DNA corado de verde ou azul acinzentado. Os achados acima descritos corroboram os resultados do presente trabalho, visto que foi possvel constatar a presena de grande quantidade de clulas com caractersticas de plasmcitos aos quatro dias aps a segunda imunizao, aos trs dias aps a terceira inoculao, e aos trs dias aps o desafio. Nas regies interfoliculares foi possvel observar clulas dendrticas, ao redor das quais agrupavam-se clulas cujo citoplasma corou-se intensamente de vermelho com Verde Metil Pironina, semelhantes quelas que se encontram nos cordes medulares.

Figura 1 Linfonodos bovinos dos grupos controle, saponina e imunizados com o peptdeo sinttico SBbo23290. A: Animal controle aos cinco dias aps a primeira inoculao, colorao H&E, 20X. B: Animal controle aos cinco dias aps a primeira inoculao, colorao Verde Metil Pironina, 20X. C: Animal do grupo saponina aos cinco dias aps a primeira imunizao com formao de CG, colorao H&E, 20X. D: Animal do grupo

peptdeo aos cinco dias aps a primeira imunizao com maior formao CGs em relao aos demais grupos, colorao H&E, 10X.

Figura 2 Linfonodos de bovinos dos grupos controle, saponina e imunizados com o peptdeo SBbo23290. A: Animal do grupo saponina aos quatro dias aps a segunda inoculao, colorao Verde Metil Pironina, 10X. B: Animal do grupo peptdeo aos cinco dias aps a primeira inoculao Verde Metil Pironina, 10X. C: Animal do grupo peptdeo

aos quatro dias aps a segunda inoculao, colorao Verde Metil Pironina, 10X. D: Animal do grupo peptdeo aos cinco dias aps a primeira inoculao, colorao Verde Metil Pironina, 40X.

Ento, esses achados sugerem que o imungeno sinttico SBbo23290 foi capaz de provocar uma resposta imune com produo de clulas de memria, j que segundo MORRISON et al. (1986) as duas principais funes dos CGs so a produo de clulas de memria e a regulao do nvel e durao da resposta de anticorpos, fato este comprovado por JARDIM (2005) quando avaliou o mesmo imungeno sinttico em bovinos, visto que a autora observou aumento dos nveis de IgG aps a segunda e a terceira inoculaes. A cintica de formao dos CGs que foi observada nos linfonodos semelhante ao que foi descrito por outros autores, quando utilizaram antgenos T-dependentes, uma vez que na resposta imune primria eles aparecem ao redor do quarto dia ps-imunizao (JACOB et al., 1991; GULBRANSON-JUDGE et al., 1997; HAN et al., 1997; KENNETH et al., 1997; FREITAS, 2001; GONZLEZ, 2003 ; SALES JNIOR, 2003). Assim, os resultados obtidos por GONZLEZ (2004) e SALES JNIOR (2003) ao imunizar bovinos e camundongos respectivamente, com o peptdeo sinttico SBm7462 anti-carrapato Boophilus microplus, e de RESENDE (2003), que utilizou uma amostra de Anaplasma marginale, so semelhantes aos obtidos com o peptdeo sinttico SBbo23290 utilizado neste trabalho j que aps a primeira imunizao, houve pouca reatividade de CGs, as reas paracorticais e algumas regies interfoliculares encontravam-se hiperplsicas, constatando-se uma ligeira hiperplasia de cordes medulares, sendo essas caractersticas mais evidentes e intensas aps cada inoculao imungenos. Entretanto, alguns antgenos T-independentes, tais como lipopolissacardios ligados a haptenos e alguns surfactantes, entre outros, podem induzir formao de CGs ou reaes semelhantes a CGs (KELSOE, 1995). No entanto, visto que nenhuma das substncias supracitadas estava presente no imungeno ou no veculo utilizados, pode-se com os referidos

afirmar que a resposta imune T-dependente foi induzida pelo peptdeo sinttico SBbo23290. No grupo controle observaram-se alguns folculos secundrios, porm sem reatividade e em menor nmero que os observados nos animais imunizados, com presena de poucas clulas linfocticas. No houve hiperplasia de reas interfoliculares, paracorticais e nem de cordes medulares. Em trabalhos experimentais com Babesia bovis e Anaplasma marginale, FREITAS (2001) e RESENDE (2003) respectivamente, tambm observaram reatividade de CGs nos linfonodos dos animais no inoculados, fato este atribudo, como no presente trabalho, a respostas inespecficas. Os resultados do grupo saponina foram semelhantes aos resultados do grupo peptdeo, porm com menos reatividade de CGs e menos hiperplasia dos cordes medulares. Essa diferena de responsividade foi mais evidente aps a segunda e terceira coleta.

5.2. Avaliao imunohistoqumica de linfonodos pr-escapulares bovinos inoculados atravs do mtodo Peroxidase anti-peroxidase (PAP)

Ao examinar os cortes histolgicos submetidos ao teste imunohistoqumico Peroxidase anti-peroxidase (PAP), foi possvel observar que aos cinco dias aps a primeira inoculao houve resposta positiva nas clulas dendrticas dos CGs. FREITAS (2001), ao avaliar os fragmentos de linfonodos de animais imunizados com uma cepa atenuada de Babesia bovis, detectou reatividade fracamente positiva em clulas dendrticas dos CGs aos doze dias ps-inoculao em clulas dendrticas foliculares, indicando a presena do antgeno. Aos quatro dias aps a segunda imunizao observou-se clulas PAP fortemente positivas nos cordes medulares, o que corrobora os achados de GONZLEZ (2004), que observou o mesmo fato aos cinco dias aps a segunda inoculao, e de FREITAS (2001), que constatou a reatividade fortemente positiva aos trs dias aps a reinoculao. As clulas PAP positivas encontravam-se dispersas na regio paracortical, cordes medulares

e nos CGs, sendo que as clulas marcadas foram claramente distinguveis das clulas no marcadas. Algumas das clulas PAP positivas apresentavam-se com abundante citoplasma e prolongaes evidentes semelhana de clulas dendrticas, enquanto outras apresentavam citoplasma escasso semelhante a clulas linfocticas. Aos trs dias aps a terceira inoculao (Figura 3) e aos trs dias aps o desafio, observou-se um nmero maior de clulas PAP positivas. Ento, pode-se dizer que a memria gerada pelo imungeno SBbo23290 estaria associada aos eventos observados pela tcnica de PAP; esta suposio se fundamenta na marcada presena de clulas PAP positivas verificadas neste experimento aps cada imunizao. Entretanto, de acordo com GONZLEZ (2004), a intensidade e a velocidade da resposta ao antgeno detectada pelo PAP na segunda imunizao, tambm pode ser resultado do reconhecimento antignico por clulas B antgeno-especficas geradas na resposta imune primria, ou ao seqestro de imunoglobulinas ligadas a antgenos dentro das redes de clulas dendrticas. Por outro lado, a intensidade e a velocidade da resposta ao antgeno, detectada pela tcnica de PAP na re-inoculao, tambm pode ser devido ao processo de maturao das clulas dendrticas ocorrido entre a primeira e segunda inoculao, o que seguramente foi devido a endocitose do peptdeo. Segundo GRAY et al. (1996), a reposio contnua do antgeno pelas clulas que se visualizam como PAP positivas estaria envolvida na gerao de clulas B de memria a partir de clulas ativadas logo aps a seleo de mutantes somticos com alta afinidade dentro dos CGs. A presena de grande quantidade de clulas dendrticas nos linfonodos pode ser devido via de inoculao visto que, geralmente, quando um antgeno injetado atravs da via subcutnea, as clulas dendrticas so as mais provveis carreadoras, processadoras e apresentadoras do antgeno (HOWARD et al., 1999). No presente trabalho foi observada a presena de um tipo celular diferente, que no clulas dendrticas, possivelmente envolvido na apresentao antignica, j que a existncia de clulas PAP positivas no caracterizadas morfologicamente como dendrticas, poderiam ser linfcitos T WC1 ou B capacitados na apresentao antignica.

O fato anterior poderia corroborar o trabalho desenvolvido por COLLINS et al. (1998), no qual foi demonstrado que as clulas T WC1 so capazes de apresentar antgenos

proticos s clulas CD4+ e induzir a sua proliferao. Poderamos dizer ainda, que o peptdeo sinttico se comporta como um verdadeiro antgeno/imungeno protico.

Figura 3- Resultado do teste Peroxidase anti-peroxidase para deteco de antgenos. Linfonodo pr-escapular. Observa-se clula dendrtica (seta) contendo peptdeo sinttico SBbo23290 (colorao amarronzada) e apresentando a linfcitos aos trs dias aps a terceira inoculao, PAP, 100X.

5.3. Imunofenotipagem dos linfcitos T CD4+, CD8+, CD21+ e WC1+ em sangue perifrico

5.3.1. Linfcitos perifricos T CD4+

Tem sido demonstrado que a distribuio perifrica de linfcitos T CD4+ depende da idade do animal, sendo que em condies fisiolgicas, pode variar de 15-30% das clulas de sangue perifrico em animais adultos. importante salientar que os linfcitos CD4+ migram mais eficientemente do que os CD8+ ou linfcitos B (DEBES et.al., 2005). A porcentagem de linfcitos T CD4+ sete dias aps a primeira inoculao nos animais do grupo peptdeo, saponina e controle (figura 5) foi de 14,91 ( 12,07), 15,41 ( 8,40) e 11,56 ( 4,14) respectivamente, no havendo diferena estatstica entre os grupos. O grupo controle obteve diferena estatstica entre as coletas dos dias sete antes e sete aps a primeira imunizao (p<0,05). Houve um aumento significativo da porcentagem de linfcitos T CD4+ sete dias aps a segunda imunizao, como pode ser observado na tabela 5, as mdias foram de 21,04 ( 1,97), 19,78 ( 5,77) e 21,94 ( 3,23) nos grupos peptdeo, saponina e controle, respectivamente. No houve diferena estatstica entre os grupos. Os resultados do presente trabalho corroboram os achados de GONZLEZ (2004), ao avaliar a resposta de bezerros imunizados com o peptdeo sinttico anti-carrapato Boophilus microplus SBm7462, visto que a referida autora notou que a partir do quinto dia aps a segunda imunizao, as clulas T CD4+ mostraram um sutil aumento, com mdia de 22,35 ( 4,48), provavelmente devido memria imunolgica. O trabalho anteriormente descrito mostrou que o grupo controle obteve mdias superiores em relao aos grupos imunizados durante todo o experimento, fato este no

observado no presente estudo. Apesar da referida autora tambm ter trabalhado com peptdeo sinttico, pode ser que o carrapato B. microplus induza um perfil de resposta imunolgica diferente do perfil induzido contra o parasita B. bovis. BITTAR (2002),

Granulosidade

R1

FL 2

Tamanho

FL 1

CD4 +

CD8+ +

Figura 4: Representao grfica da Imunofenotipagem dos linfcitos bovinos. Perfil dos leuccitos perifricos bovinos obtidos de PBL (A); Controle de clulas (B); populao marcada com anticorpos especficos para linfcitos T CD4+ (C), CD8+ (D), WC1+ (F) e B CD21+ (E). FL 1 fluorescncia 1 e FL 2 fluorescncia 2.

tambm estudando a resposta imune frente B. bovis utilizando peptdeo sinttico, observou que no houve diferena estatstica entre os grupos durante a imunizao corroborando o resultado do presente trabalho.

25,00

Mdia da % de LT CD4+

20,00 15,00 10,00 5,00 0,00 Dia -7 Dia 7 Dia 37 Dia 65 Dia 172

Controle Peptdeo Saponina

Figura 5 Porcentagem de Linfcitos T CD4+

Aos cinco dias aps a terceira inoculao, notou-se uma ligeira queda nas porcentagens de LT CD4+, visto que os animais do grupo peptdeo apresentaram 16,55 ( 4,90), o grupo saponina 14,80 ( 5,78), e o grupo controle apresentou uma mdia de 15,30 ( 4,75). Tambm foi possvel observar uma diminuio na mdia das porcentagens de LT CD4+ cinco dias aps o desafio com a amostra virulenta de B. bovis: o grupo peptdeo apresentou 13,08 ( 2,76), o grupo saponina 11,36 ( 1,42) e 13,48 ( 2,94) no grupo controle. Estes resultados diferem dos obtidos por GONZLEZ (2004), visto que aos trs dias aps a terceira inoculao, foi observada uma mdia de 22,33 ( 2,94) nos grupos imunizados, e 28,42 ( 3,37) no grupo controle, valores estes, muito prximos aos

obtidos aps a segunda imunizao e aps o desafio. No trabalho de BITTAR (2002), no qual foi testado o peptdeo sinttico anti-Babesia bovis SBbo23290, observou-se que a porcentagem de linfcitos T CD4+ no sangue perifrico dos bovinos pertencentes aos grupos experimentais variou de 26,22 a 29,04 (x = 27,73 de 27,77 a 29,14 (x = 28,62 1,42) na primeira imunizao,

0,73) na segunda imunizao e de 28,23 a 28,62 (x = 28,48

0,21) na terceira imunizao, no havendo diferena estatstica da porcentagem de linfcitos T CD4+ entre os grupos durante as intervenes. Apesar da porcentagem de linfcitos T CD4+ terem sido inferiores em relao aos trabalhos supracitados, pode-se dizer que o peptdeo SBbo23290 foi capaz de induzir uma resposta imune efetiva, visto que embora a porcentagem de linfcitos T CD4+ tenha sido relativamente baixa, a porcentagem de linfcitos T resposta imunolgica. WC1+ e B CD21+ foram altas, indicando um outro perfil de

Tabela 5- Mdia da Porcentagem de linfcitos T CD4+

Dia -7

Dia 7
14,91 ( 12,07) 15,41 ( 8,40) 11,56 ( 4,14)

Dia 37
21,04 ( 1,97) 19,78 ( 5,77) 21,94 ( 3,23)

Dia 65
16,55 ( 4,90) 14,80 ( 5,78) 15,30 ( 4,75)

Dia 172
13,08 ( 2,76) 11,36 ( 1,42) 13,48 ( 2,94)

Grupo
Peptdeo Saponina Controle
20,62 ( 5,53) 22,34 ( 2,07) 23,78 ( 5,91)

5.3.2. Linfcitos perifricos T CD8+

As clulas T CD8+ se encontram relacionadas com respostas a parasitas intracelulares, vrus ou antgenos citoslicos que induzem a expresso de molculas MHC da classe I. Suas propriedades tm sido estudadas quanto sua citotoxicidade e como clulas efetoras (CERWENKA et al., 1999), mais do que como indutoras de uma resposta.

Alm disso, foi demonstrado que a proteo que este tipo celular pode oferecer a esses antgenos est diretamente relacionada com a sua capacidade de migrao e efetividade citoltica aos locais ativos de infeco. A porcentagem dos linfcitos T CD8+ foi inferior em relao aos outros linfcitos e, em geral, foi decrescente no decorrer das imunizaes nos animais do grupo peptdeo e saponina (figura 6), exceto aps o desafio em que houve um ligeiro aumento, enquanto no grupo dos animais controle houve um aumento gradativo no decorrer das trs inoculaes e um decrscimo aps o desafio, como pode ser observado no tabela 6. Sete dias aps a primeira imunizao, a mdia foi de 13,89 ( 10,47) e 12,31 ( 1,07) nos animais imunizados (grupos peptdeo e saponina respectivamente), e de 8,02 ( 2,05) no grupo controle (tabela 6). Os grupos peptdeo e controle apresentaram diferena estatstica entre as coletas, sendo o grupo peptdeo entre o dia sete antes da primeira imunizao e cinco aps a terceira imunizao (p<0,05), e o grupo controle entre o dia sete antes da primeira imunizao e todas as outras coletas (p<0,01). O grupo peptdeo mostrou maiores porcentagens durante todo o experimento em relao aos demais grupos. Nos fentipos CD8+, GONZLEZ (2004) no evidenciou diferena de porcentagens entre perodos e entre animais imunizados e controles. Nestes as mdias apresentadas alcanaram 16,22% nos animais imunizados com o peptdeo anti-carrapato Boophilus microplus e de 17,88% no grupo controle. J BITTAR (2002), notou que a percentagem de linfcitos T CD8+ no grupo peptdeo foi discretamente mais elevada que no grupo saponina e grupo controle por todo o perodo de imunizao, porm no houve diferena estatstica.

25

Mdia da % de LT CD8+

20 15 10 5 0 Dia -7 Dia 7 Dia 37 Dia 65 Dia 172

Controle Peptdeo Saponina

Figura 6 Porcentagem de Linfcitos T CD8+ No trabalho de BITTAR (2002) tambm foi possvel notar que a porcentagem de LT CD8+ foi inferior de LT CD4+, variando de 18,24 ( 3,69) a 22,78 ( 9,46) na primeira imunizao, de 18,34 ( 22,44) a 22,44 ( 10,24) na segunda imunizao, e de 16,84 ( 1,85) a 23,58 ( 13,45) na terceira imunizao. O grupo peptdeo obteve mdias superiores aos outros dois grupos, no havendo diferena significativa entre eles, o que corrobora com os resultados do presente trabalho. Os trabalhos de FIKRI et.al. (2000) mostraram que nas PBMC, WC1+, e clulas T CD4+ e CD8+ representaram 42%, 21% e 14% respectivamente, ou seja, esperado que a porcentagem de linfcitos T CD8+ sejam inferiores aos demais, o que corrobora os achados do presente estudo. As clulas T CD8 virgens migram atravs do sangue, tecidos linfides secundrios (linfonodos, bao, placas de Peyer), e retornam ao sangue via linfa eferente at que a clula T encontre um antgeno apresentado pelas clulas dendrticas nos tecidos linfides secundrios; a clula T se torna ento um linfcito T citotxico, o qual possui um padro de trfego modificado semelhante s clulas efetoras, sendo distribudos aos mltiplos tecidos no-linfides, enquanto nos tecidos tercirios, as clulas T citotxicas podem entrar em contato com clulas-alvo expressando antgeno, dessa forma mediando a eliminao do tecido infectado pelo patgeno. Aps o pico proliferativo da resposta, uma fase de

contrao apopttica ocorre em todos os stios, permanecendo uma pequena populao de clulas de memria antgeno-especficas em todos os tecidos (KLONOWSKI et.al., 2004). A distribuio fenotpica dos subtipos de linfcitos no a mesma no sangue, linfa aferente e eferente, e experimentos tm demonstrado que os linfcitos variam nas suas propriedades migratrias (HAY & ANDRADE, 1998). Esse mecanismo de recirculao talvez possa explicar a baixa porcentagem deste tipo celular no sangue perifrico, visto que assim que as clulas T CD8 forem capazes de entrar na circulao, tambm sero capazes de entrar em rgos como pulmo, fgado, medula ssea, e tecidos linfides com a mesma eficincia (KLONOWSKI et.al., 2004). O autor supra-citado afirma tambm que parece possvel que os atributos funcionais das clulas de memria sejam modificados como resultado da migrao do sangue para tecidos no linfides, devido s interaes que ocorrem durante o extravasamento e/ou como resultado dos fatores ambientais tecido-especficos. Linfcitos originados da linfa migram atravs do mecanismo de recirculao linftica, sendo que mais de 1/3 de todos os linfcitos perifricos sangneos (PBLs) foram excludos do circuito linftico e migraram para o bao. Anlises fenotpicas mostraram que a maioria dos PBLs no circulantes eram clulas B (YOUNG et.al., 1997). O fato acima descrito pode explicar as baixas porcentagens de linfcitos T CD8+, visto que foram observados em cortes histolgicos uma grande quantidade de linfcitos T CD8 nos linfonodos durante as coletas experimentais, sugerindo que este tipo celular estivesse presente nos rgos linfides em quantidade muito superior em relao ao pool sanguneo. Outro fato que tambm deve ser levado em considerao a amostra utilizada no presente trabalho, pois de acordo com HAY & ANDRADE (1998), o sangue uma conveniente amostra, porm ainda questiona-se a sua validade ao determinar o status imunolgico de um indivduo baseado na caracterizao de uma amostra de linfcitos originados do sangue, pois as mudanas mais sbitas da difuso de linfcitos associados ao exerccio, sono, e perturbaes endcrinas representam desafios experimentais adicionais. Segundo o referido autor, se os linfcitos no sangue no refletirem adequadamente o resto do sistema imune, eles podem afetar a interpretao dos experimentos envolvendo amostras de sangue, visto que a recirculao de linfcitos um processo complexo que envolve um amplo nmero de clulas que se movem entre uma variedade de pools.

Ainda, visto que nem todos os linfcitos no sangue possuem uma probabilidade igual de migrao, muitas estimativas prvias da taxa e do grau da recirculao de linfcitos fora do sangue e dentro dos tecidos so provavelmente subestimadas, alm do que, dada a importncia das mensuraes do sangue perifrico no contexto clnico, todo cuidado necessrio ao interpretar a contagem de PBL como uma janela no sistema imune, especialmente nas condies em que mudanas nas propores de PBL no so necessariamente refletidas nos tecidos linfides perifricos (YOUNG et.al., 1997). Pode-se dizer que o peptdeo SBbo23290 desenvolve uma resposta antgeno especfica envolvendo clulas B, linfcitos T CD4+ e linfcitos T WC1+. importante lembrar que os linfcitos T CD4+ e WC1+ tambm podem apresentar papel citotxico, sendo um possvel motivo para a queda da porcentagem dos linfcitos T CD8+.

Tabela 6 - Mdia da Porcentagem de linfcitos T CD8+

Dia -7

Dia 7
13,89 ( 10,47) 12,31 ( 1,07) 8,02 ( 2,05)

Dia 37
10,33 ( 1,43) 10,06 ( 2,63) 8,20 ( 2,16)

Dia 65
8,56 ( 0,85) 8,42 ( 1,71) 8,40 ( 2,05)

Dia 172
9,55 ( 1,64) 9, 51 ( 1,75) 8,28 ( 1,69)

Grupo
Peptdeo Saponina Controle
20,61 ( 3,97) 14,04 ( 4,76) 21,30 ( 4,47)

5.3.3. Linfcitos perifricos B CD21+

A populao de LB CD21+ foi predominante neste estudo, como se pode observar na tabela 7. Aos sete dias aps a primeira imunizao foi possvel observar um grande nmero de LB CD21+ (figura 7), com mdias que variaram de 13,37 ( 6,16) no grupo controle, e 20,56 ( 6,46) no grupo peptdeo. Houve um aumento considervel na porcentagem de LB CD21+ sete dias aps a segunda imunizao, sendo que o grupo

peptdeo apresentou mdia de 28,28 ( 5,35), o grupo saponina 27,71 ( 8,63) e o grupo controle 28,50 ( 2,07). Houve diferena estatstica entre as coletas em todos os grupos experimentais, sendo o grupo peptdeo entre a coleta aps a segunda imunizao e aps o desafio (p<0,01); o grupo saponina entre os sete dias aps a primeira imunizao e aps o desafio (p<0,05) e aps a segunda imunizao e aps o desafio (p<0,01); e o grupo controle entre o dia zero e ps-desafio (p<0,05), entre os sete dias aps a primeira e a segunda imunizao (p<0,05), e entre os sete dias aps a segunda imunizao e aps o desafio (p<0,01). JARDIM (2005) em conjunto com o presente trabalho observou que a produo de IgG foi superior no grupo peptdeo em relao aos demais grupos durante todo o experimento, havendo diferena estatisticamente significativa entre o grupo imunizado com o peptdeo sinttico SBbo23290 e os outros grupos experimentais, no havendo diferena entre o grupo saponina e controle. Sendo assim, foi possvel notar que a cintica de resposta ao peptdeo SBbo23290 demonstrada no estudo supracitado apresentou uma curva clssica de resposta de IgG, mostrando uma resposta intensa alcanando a produo mxima entre a 2a e a 3a semana aps cada inoculao e declinando em seguida. Alm disso, a referida autora concluiu que o peptdeo sinttico SBbo23290 induziu elevados nveis de IgG e seus istipos IgG1 e IgG2, ambos apresentaram diferena estatisticamente significativa quando comparados aos grupos controles, e a resposta imune humoral foi caracterizada pela predominncia de anticorpos antgeno-especficos da classe IgG1. Os fatos anteriores corroboram os achados do presente trabalho, se levarmos em conta a cintica da formao dos centros germinais e a produo de clulas T e B.

30

Mdia da % de LB CD21+

25 20 15 10 5 0 Dia -7 Dia 7 Dia 37 Dia 65 Dia 172

Controle Peptdeo Saponina

Figura 7 Porcentagem de Linfcitos B CD21+

Em relao aos linfcitos B CD21+, GONZLEZ (2004) encontrou porcentagens maiores no grupo controle do que nos animais imunizados, sendo o grupo controle com porcentagens de linfcitos B CD21+ inferiores a 24,28% enquanto os imunizados obtiveram porcentagens de at 39,51%, o que em parte difere do presente trabalho, visto que no dia 7 o grupo controle apresentou mdia inferior aos demais grupos experimentais, e nos dias 37, 65 e 172, a mdia do grupo controle se manteve semelhante mdia do grupo peptdeo, e muito prxima do grupo saponina. Neste estudo tambm foi constatado um aumento gradual na porcentagem de clulas dos animais imunizados aps a primeira imunizao. A queda da porcentagem dos linfcitos B CD21+ neste trabalho coincide com o aumento da populao de clulas T WC1+, indicando que este tipo celular pode ter

sido mais atuante neste perodo do experimento em relao aos linfcitos B. No trabalho de BITTAR (2002), notou-se que os linfcitos B CD21+ dos animais do grupo peptdeo possuam as menores porcentagens de linfcitos B CD21+ quando comparados ao grupo saponina e grupo controle. A porcentagem de linfcitos B CD21+ do grupo peptdeo, no perodo das imunizaes, variou de 14,71 a 17,30 (x = 15,23 no grupo saponina foi de 14,47 a 16,03 (x = 15,03 20,39 a 17,59 (x = 19,51 1,86),

8,86) e no grupo controle variou de

1,66), o que difere dos resultados do presente trabalho, pois a

porcentagem de LB CD21+ do grupo peptdeo no foi inferior aos demais grupos em

nenhuma das cinco coletas. Alm disso, a referida autora obteve menores porcentagens de LB CD21+ do que de LT CD4+ e CD8+, visto que as mdias de LB CD21+ variaram de 14,46 ( 4,88) a 20,39 ( 10,11) na primeira imunizao, de 13,67 ( 8,30) a 20,53 ( 8,53) na segunda, e de 16,02 ( 5,07) a 17,59 ( 8,64) na terceira, enquanto neste trabalho, em geral, as mdias de LB CD21+ foram maiores do que as de LT CD4+ e LT CD8+. Neste trabalho os linfcitos B CD21+ no variaram significativamente em nenhum dos grupos experimentais durante todo o perodo analisado. Tabela 7 - Mdia da Porcentagem de linfcitos B CD21+

Dia -7

Dia 7
20,56 ( 6,46) 20,55 ( 1,45) 13,37 ( 6,16)

Dia 37
28,38 ( 5,35) 27,71 ( 8,63) 28,50 ( 2,07)

Dia 65
17,37 ( 2,94) 16,56 ( 3,20) 17,07 ( 2,12)

Dia 172
9,24 ( 5,47) 8,18 ( 1,92) 9,85 ( 3,92)

Grupo
Peptdeo Saponina Controle
19,77 ( 7,24) 19,50 ( 1,83) 23,86 ( 6,43)

5.3.4. Linfcitos perifricos T WC1+

A anlise dos linfcitos T WC1+ demonstrou que a mdia das porcentagens desses linfcitos aumentou desde a pr-imunizao at a segunda imunizao (figura 8), e se manteve constante at depois do desafio. Na pr-imunizao, as mdias variaram de 14,25 ( 3,53) a 16,32 ( 4,53), na primeira imunizao variou de 17,48 ( 1,36) a 21,08 ( 2,37), e na segunda imunizao, variou de 17,36 ( 0,67) a 23,19 ( 2,62). Aps a terceira imunizao e aps o desafio com a cepa virulenta de B. bovis, as mdias se mantiveram semelhantes, como mostra a tabela 8. Entre as coletas, houve diferena estatstica nos grupos peptdeo e saponina; no grupo peptdeo, ocorreu entre o dia zero e aps a segunda imunizao (p<0,05), e no grupo saponina, entre o dia zero e aps a terceira imunizao. Visto que o clone utilizado CD2-, CD4- e CD8-, pode-se afirmar que o tipo de clula avaliada foi clula T T WC1+. Foi possvel notar que o aumento da populao de clulas

WC1+ coincidiu com a queda de outros tipos celulares.

No trabalho de YOUNG et.al. (1997), foi observado que a maioria dos PBLs marcados que migraram dentro da linfa foram as clulas T , sugerindo que este subtipo

pode ser particularmente eficiente durante a recirculao de linfcitos, fato este, que pode explicar a porcentagem superior deste subtipo no presente trabalho. Ainda, em ruminantes, as clulas T compreendem a populao de principal proporo nas clulas

mononucleares perifricas bovinas, de acordo com KENNEDY et.al. (2002). Em estudo realizado por VALDEZ et.al. (2002), observou-se que bezerros timectomizados tratados com anticorpo monoclonal anti-CD4 foram capazes de controlar uma anaplasmose aguda induzida, em contraste com a predio de que uma depresso significativa de linfcitos T CD4+ entre os grupos tratados pudesse anular a resistncia uma infeco aguda, o que sugere um possvel papel para os linfcitos T anaplasmose aguda. A ativao seletiva das clulas WC1.1+, quando propicia a secreo de IFNdurante a vacinao, pode promover maneiras de estimular consistentemente respostas imunes tipo 1 e pode ser especialmente til no desenvolvimento de vacinas para patgenos intra-celulares bacterianos, protozorios e vrus, podendo permitir maneiras de direcionar respostas imunes adaptativas mesmo quando vacinas de subunidade so utilizadas (ROGERS et.al., 2005). Animais WC1+-deprimidos exibiram decrscimo da resposta proliferativa de linfcitos antgeno-especficos, aumento da produo de IL-4 antgenoespecfica, e falta de IgG2 especfica, sugerindo que clulas T WC1+ TCR+ contribuem no controle da

direta ou indiretamente, para polarizao Th1 da resposta imune na tuberculose bovina, sendo essa hiptese baseada no decrscimo da produo inata de IFN- (KENNEDY et.al., 2002).

25

Mdia da % de LT WC1+

20 15 10 5 0 Dia -7 Dia 7 Dia 37 Dia 65 Dia 172

Controle Peptdeo Saponina

Figura 8 Porcentagem de Linfcitos T WC1+

GONZLEZ (2003), ao imunizar bovinos com o peptdeo sinttico SBm7462, notou que os linfcitos T WC1+ mostraram variaes no decorrer do perodo, visto que a populao aumentou cinco dias aps a segunda imunizao e diminuiu nos dias subseqentes se comparados com as porcentagens da pr-imunizao, fato no observado no presente estudo, talvez devido diferena no perfil de resposta entre os dois peptdeos. Em trabalho com o parasita intracelular Theileria parva, foi observado que as clulas T bovinas so ativadas pelo parasita e lisam as clulas infectadas atravs do

reconhecimento induzido pelo parasita ou pelos antgenos derivados do parasita de maneira MHC irrestrita (DAUBENBERGER et.al., 1999), o que tambm pode explicar a porcentagem superior deste tipo celular em relao aos outros observado no presente estudo, visto que a B. bovis tambm um parasita intracelular. Foi observado por KENNEDY et.al. (2002) que a depresso das clulas T WC1+ resultou em diferenas evidentes da resposta imune durante o curso da infeco por M. bovis; evidenciou-se tambm que as clulas T WC1+ exercem um papel no WC1+ so ativadas aps

direcionamento da resposta celular inicial ao parasita, acompanhando a infeco do hospedeiro natural. A principal observao foi que as clulas T a infeco com o aumento das clulas CD4+, e que a depresso imediatamente resultou em

uma menor produo de IFN- , uma diminuio da resposta proliferativa tardia, aumento de IL-4, e nveis reduzidos de IgG2, o que corrobora os resultados de JARDIM (2005), em estudo conjunto com o presente trabalho, visto que foi observada uma queda de IgG2 e aumento dos nveis de IgG1. Tudo isso sugere que a produo precoce de IFN- pelas clulas T WC1+, possivelmente como parte da resposta imune inata, promove a ativao

de linfcitos e influencia a polarizao de citocinas, contribuindo para a produo de citocinas pr-inflamatrias, podendo ser parte do processo que resulta na polarizao Th1 com resposta de anticorpo IgG2. Uma outra possibilidade que as clulas T WC1+ podem influenciar a produo inata de IFN- atravs de uma segunda populao, como as clulas NK.

Tabela 8- Mdia da Porcentagem de linfcitos T WC1+

Dia -7

Dia 7
18,27 ( 4,04) 17,48 ( 1,36) 21,08 ( 2,37)

Dia 37
23,19 ( 2,62) 17,36 ( 0,67) 17,71 ( 4,02)

Dia 65
18,61 ( 1,31) 22,55 ( 2,24) 19,62 ( 2,67)

Dia 172
21,35 ( 1,34) 18,62 ( 2,30) 18,92 ( 5,18)

Grupo
Peptdeo Saponina Controle
16,27 ( 2,41) 14,25 ( 3,53) 16,32 ( 4,53)

5.3.5. Imunofenotipagem dos linfcitos T totais

O percentual dos linfcitos T totais no grupo peptdeo foi maior por quase todo o experimento exceto aos 5 dias aps a terceira inoculao, visto que o grupo saponina foi discretamente maior do que os demais. Como pode ser observado no tabela 9, houve um aumento de linfcitos T totais 7 dias aps a segunda inoculao, principalmente no grupo peptdeo, havendo um decrscimo desta populao 5 dias aps a terceira inoculao, e 15

dias aps o desafio, no entanto, o grupo peptdeo apresentou um acrscimo quase insignificante aps o desafio (figura 9). No houve diferena estatstica entre os grupos. No trabalho de BITTAR (2002), as porcentagens de clulas T totais nos grupos experimentais no variou durante o perodo, sendo as mdias do grupo peptdeo, saponina e controle, de 51,37 (0,58); 46,29 (0,92) e 47,52 (0,77) respectivamente. Pode-se observar que os animais pertencentes ao grupo peptdeo possuam porcentagens de linfcitos T totais maior do que o grupo controle e saponina, corroborando os resultados obtidos no presente trabalho.

70

% de linfcitos T totais

60 50 40 30 20 10 0 Dia -7 Dia 7 Dia 37 Dia 65 Dia 172 Controle Peptdeo Saponina

Figura 9 Porcentagem de Linfcitos T totais

No entanto, no trabalho de GONZLEZ (2003), notou-se que os animais imunizados apresentaram porcentagem de linfcitos T totais ligeiramente menores que o grupo controle, diferindo do presente trabalho. Observou-se ainda, que o percentual de clulas T totais nos grupos experimentais no variou significativamente durante todo o perodo nos animais imunizados, e nos animais controle os valores oscilaram em mdia de 54,01 a 60,31% e 58,67 a 63,70% nos animais imunizados e controle, respectivamente. Apesar da referida autora tambm ter trabalhado com peptdeo sinttico, pode-se sugerir

que os dois peptdeos sintticos em questo (SBm7462 e Sbbo23290) induzam perfis diferentes de resposta imune.

Tabela 9- Mdia da Porcentagem de linfcitos T totais

Dia -7

Dia 7
47,07 ( 26,23) 45,20 ( 9,03) 40,66 ( 6,19)

Dia 37
54,56 ( 2,89) 47,20 ( 8,63) 47,85 ( 7,07)

Dia 65
43,72 ( 3,80) 45,77 ( 8,86) 43,32 ( 6,33)

Dia 172
43,98 ( 3,16) 39,49 ( 5,24) 40,68 ( 8,14)

Grupo
Peptdeo Saponina Controle
57,50 ( 5,44) 50,63 ( 3,93) 61,40 ( 11,76)

5.3.6. Imunofenotipagem de clulas NTNB

Em relao porcentagem das clulas NTNB, houve maior porcentagem destas clulas sete dias aps a primeira inoculao e quinze dias aps o desafio (Figura 10). Nenhum dos grupos se manteve constantemente com nveis maiores de clulas NTNB em relao aos demais durante o experimento. A maior porcentagem destas clulas foi observada aps o desafio, sendo que o grupo saponina obteve 52,33 ( 11,85), o grupo controle 49,47 ( 14,69) e o grupo peptdeo 46,78 ( 10,12), o que pode ser observado na tabela 10.

60 50

% de clulas NTNB

40 Peptdeo 30 20 10 0
Dia -7 Dia 7 Dia 37 Dia 65 Dia 172

Saponina Controle

Figura 10 Porcentagem de Clulas NTNB

De acordo com os resultados obtidos por BITTAR (2002), o grupo saponina apresentou porcentagem maior do que os demais grupos durante todo o experimento, o que, em parte corrobora os achados do presente estudo, j que o grupo saponina se manteve com nveis semelhantes ou superiores. Aps a primeira imunizao, a autora observou porcentagens de 38,25 ( 7,64) no grupo saponina, (34,57 13,33) no grupo

peptdeo e (32,97 9,47) no grupo controle. Essa mdia superior do grupo saponina em relao aos demais grupos permaneceu por todo o perodo de imunizao. Aps a terceira imunizao o grupo peptdeo apresentou uma diminuio da percentagem das clulas NTNB (30,90 14,33) enquanto o grupo controle apresentou uma elevao no percentual celular (34,54 9,85). As variaes do percentual celular durante as imunizaes e entre os grupos no foram estatisticamente significativas. A cintica das clulas NTNB no presente trabalho pode ser explicada levando-se em considerao o aumento de outros tipos celulares em circulao, como algumas populaes de clulas T e clulas B. importante salientar que no trabalho de BITTAR (2002) foi observada uma porcentagem superior observada no presente estudo porque neste a populao WC1 foi includa como parte da

populao total de linfcitos T, refletindo consequentemente na porcentagem das clulas consideradas NTNB. GONZLEZ (2003) em seu trabalho com B. microplus, notou que houve uma queda de porcentagens de clulas NTNB nos animais imunizados aps a primeira imunizao e mantendo-se relativamente igual at a ltima amostragem, sendo que essa diferena foi mais evidente no dia 35, diferente dos resultados obtidos no presente trabalho. Segundo a autora, estes resultados se devem ao aumento de outros tipos celulares em circulao como as clulas CD21+ e algumas outras subpopulaes de linfcitos T nos animais imunizados. Os animais controle apresentaram porcentagens superiores em relao aos animais imunizados durante todo o experimento. As porcentagens nos grupos imunizados variaram entre 5,57 ( 4,44) cinco dias aps a segunda imunizao e 7,48 ( 6,46) aos dez dias aps a terceira imunizao.

Tabela 10- Mdia da Porcentagem de clulas NTNB

Dia -7

Dia 7
32,37 ( 11,86) 34,25 ( 9,98) 45,97 ( 11,12)

Dia 37
17,06 ( 10,48) 25,09 ( 8,46) 23,65 ( 7,96)

Dia 65
38,91 ( 9,97) 37,67 ( 12,36) 39,61 ( 10,75)

Dia 172
46,78 ( 10,12) 52,33 ( 11,85) 49,47 ( 14,69)

Grupo
Peptdeo Saponina Controle
22,73 ( 7,56) 29,87 ( 9,47) 14,74 ( 7,63)

5.3.7. Relao entre os linfcitos T CD4+ e CD8+

Conforme o esperado, a subpopulao de clulas T CD8+ circulantes de bovinos imunizados avaliada em relao subpopulao de clulas T CD4+ foi menor durante todo o perodo. O grupo peptdeo obteve as menores relaes T CD4+/CD8+ no incio do experimento (no dia zero e aps a primeira imunizao), apresentando a maior mdia

somente aps a terceira imunizao (figura 11). O grupo saponina s apresentou mdia superior em relao aos demais grupos no dia zero, enquanto o grupo controle obteve as maiores mdias aps a primeira e a segunda imunizao, e aps o desafio, como mostra o tabela 11. A relao T CD4+/CD8+ diferiu estatisticamente somente no grupo peptdeo, entre o dia zero e aps a segunda imunizao (p<0,05) e entre as coletas aps a primeira e a segunda imunizao (p<0,05). Em mdia, as propores CD4:CD8 dos animais experimentais foram semelhantes s observadas por outros autores (GONZLEZ, 2003; BITTAR, 2002; TUO, 1999; POLLOCK et. al.2001), exceto aps a segunda inoculao, quando as porcentagens foram superiores aos trabalhos citados. No trabalho realizado por BITTAR (2002), o grupo peptdeo apresentou a menor relao T CD4+/CD8+ desde a primeira imunizao, corroborando os achados do presente trabalho. O grupo saponina (1,61 0,08) apresentou durante maior parte do experimento 0,07) e grupo controle (1,49 0,13),

mdias superiores ao grupo peptdeo (x = 1,36

diferente do presente estudo, visto que o grupo controle apresentou mdias superiores na maior parte do experimento. A relao T CD4+/CD8+ no diferiu estatisticamente entre os grupos (p > 0,05).

Relao de linfcitos T CD4/CD8

3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 Dia -7 Dia 7 Dia 37 Dia 65 Dia 172 Peptdeo Saponina Controle

Figura 11 Relao entre os linfcitos T CD4 e CD8

Tem-se evidenciado relaes CD4/CD8 iguais ou maiores s descritas neste trabalho em animais aps infeco experimental com Micobacterium bovis, (POLLOCK et al., 2001; RHODES et al., 2000; VANDEN BUSH & ROSENBUSCH, 2003), isto pode de alguma maneira sugerir que o SBbo23290 induz uma resposta no sistema imune com efeitos evidentes sobre a expanso da populao CD4+ mais do que a CD8+. De fato, a populao CD4+ considerada a populao mais envolvida nas respostas imunes adquiridas na maioria de antgenos proticos (RHODES et al., 2000), pois a expanso celular inicial em respostas ao reconhecimento antignico principalmente, mediada por uma via de crescimento autcrino gerada a partir das clulas CD4+.

Tabela 11- Mdia da Relao entre os linfcitos T CD4+ e CD8+

Dia -7

Dia 7
1,07 ( 0,31) 1,25 ( 0,78) 1,44 ( 0,31)

Dia 37
2,04 ( 0,19) 1,96 ( 0,19) 2,67 ( 0,50)

Dia 65
1,93 ( 0,64) 1,76 ( 0,44) 1,82 ( 0,59)

Dia 172
1,37 ( 0,29) 1,19 ( 0,15) 1,63 ( 0,49)

Grupo
Peptdeo Saponina Controle
1,00 ( 0,41) 1,59 ( 0,56) 1,12 ( 0,32)

5.3.8. Relao entre os linfcitos T e B

A mdia da relao T/B se manteve muito semelhante entre os grupos durante o experimento (figura 12). As menores mdias foram obtidas aps a segunda imunizao, variando de 1,70 ( 0,94) a 1,92 ( 0,33) (grupos saponina e peptdeo respectivamente), e as maiores mdias foram observadas aps o desafio: 4,13 ( 1,90) no grupo controle, 4,76 ( 2,63) no grupo peptdeo e 4,83 ( 2,09) no grupo saponina (tabela 12). Somente os grupos peptdeo e saponina apresentaram diferena estatstica entre as coletas, sendo essa diferena notada entre as coletas aps a primeira e a segunda imunizao (p<0,05), e entre

a coleta aps a segunda imunizao e aps o desafio (p<0,05 para o grupo saponina, e p<0,01 para o grupo peptdeo). A mdia da relao T/B foi maior no grupo peptdeo durante as duas primeiras imunizaes no trabalho de BITTAR (2002), porm na terceira imunizao essa relao diminuiu, mas no significativamente. Os grupos controle e saponina permaneceram com mdias inferiores s do grupo imunizado durante todo o processo de imunizao, o que difere dos achados do presente estudo.

Relao dos Linfcitos T/B

7 6 5 4 3 2 1 0 Dia -7 Dia 7 Dia 37 Dia 65 Dia 172 Peptdeo Saponina Controle

Figura 12 Relao entre os linfcitos T e B

Foi evidenciada por GONZLEZ (2003) uma discreta diminuio da relao T/B nos animais imunizados ao longo do experimento e uma notvel diferena quando comparada com os animais controle, o que difere do presente trabalho. Alm disso, a mdia da relao T/B foi menor desde o comeo do experimento nos animais imunizados do que nos controles, no havendo nenhuma variabilidade durante todo o perodo, o que indica que houve um movimento diferente nas populaes T/B somente nos animais imunizados, o que no aconteceu no presente trabalho, visto que a relao T/B se manteve muito semelhante entre os grupos experimentais durante quase todo o experimento. No entanto o presente trabalho corrobora os resultados de GONZLEZ (2003) e BITTAR (2002) no que diz respeito estatstica, visto que em ambos estudos foi observado que no houve diferena estatstica significativa entre os grupos durante os experimentos. Pode-se

dizer que a resposta frente ao peptdeo SBbo23290 induz uma resposta caracterizada pela produo superior de linfcitos T em relao aos linfcitos B, resposta essa, que se manteve constante entre os grupos.

Tabela 12- Mdia da Relao entre os linfcitos T e B

Dia -7

Dia 7
2,29 ( 0,78) 2,20 ( 0,41) 3,04 ( 2,20)

Dia 37
1,92 ( 0,33) 1,70 ( 0,94) 1,68 ( 0,24)

Dia 65
2,52 ( 0,69) 2,76 ( 0,41) 2,54 ( 0,28)

Dia 172
4,76 ( 2,63) 4,83 ( 2,09) 4,13 ( 1,90)

Grupo
Peptdeo Saponina Controle
2,91 ( 0,79) 2,60 ( 0,36) 2,57 ( 0,41)

Encontra-se disposto na tabela 13 um resumo com todos os resultados obtidos atravs da tcnica de imunofenotipagem.

Tabela 13- Impacto diferencial entre as coletas de PBL

GRUPO Peptdeo

Dia -7 Dia 7
CD4: CD8: CD21: WC1: T/B: CD4/CD8: T tot.: NTNB: CD4: CD8: CD21: WC1: T/B: CD4/CD8: T tot.: NTNB: CD4: CD8: CD21: WC1: T/B: CD4/CD8: T tot.: NTNB:

Dia 37
CD4: CD8: CD21: WC1: T/B: CD4/CD8: T tot.: NTNB: CD4: CD8: CD21: WC1: T/B: CD4/CD8: T tot.: NTNB: CD4: CD8: CD21: WC1: T/B: CD4/CD8: T tot.: NTNB:

Dia 65
CD4: CD8: CD21: WC1: T/B: CD4/CD8: T tot.: NTNB: CD4: CD8: CD21: WC1: T/B: CD4/CD8: T tot.: NTNB: CD4: CD8: CD21: WC1: T/B: CD4/CD8: T tot.: NTNB:

Dia 172
CD4: CD8: CD21: WC1: T/B: CD4/CD8: T tot.: NTNB: CD4: CD8: CD21: WC1: T/B: CD4/CD8: T tot.: NTNB: CD4: CD8: CD21: WC1: T/B: CD4/CD8: T tot.: NTNB:

Saponina

Controle

6. CONCLUSES

- O peptdeo sinttico SBbo23290 utilizando saponina como adjuvante foi eficaz, estimulando a resposta imune dos bovinos imunizados e submetidos ao desafio com a amostra virulenta de Babesia bovis. - Os animais imunizados com o peptdeo SBbo23290 desenvolveram uma resposta imune que promoveu mudanas nas populaes circulantes de linfcitos T CD4 e T e B CD21. - A resposta imune induzida pelo SBbo23290 nos tecidos linfides demonstrou formao tpica de estruturas que conferiram especificidade e memria aps as inoculaes. - Foi demonstrado atravs da imunohistoqumica que o peptdeo em questo eficientemente apresentado pelas clulas apresentadoras de antgeno (APCs) s clulas T CD4+, induzindo uma resposta T-dependente e de memria.

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