Protocolos LabDros

Organizado por: Gabriel da Luz Wallau, 2010.

Meio de Cultura Estoque para Drosophila - 1 kg de Farinha de milho grossa; - 200g de germe de trigo; - 1 xcara de acar; - 2 colheres de leite em p; - 1 colher de sal; - 800g de Farinha de milho mdia. Meio de Drosophila Especial - 9g de farinha - 0,5g de gar - meio pote de banana - 100ml de H2O - 0,26g de nipagim - diluir em lcool - diluir em gua - misturar tudo Meio de cultura de bactrias Para 100ml de meio - 1g de Peptona. - 1g de NaCl. - 0,5g de Extrato de levedura. - Completar at 100ml de H2O destilada

Acertar ph=7
*Para meio slido acrecentar gar correspondente da concentrao desejada (geralmente 1,5%). Autoclavar.

Crescer bactrias com plasmdeo 10,5ul de ampicilina (20mg/ml) para meio de 3ml 17,5ul de ampicilina (20mg/ml) para meio de 5ml 75ul de ampicilina (20mg/ml) para meio de 30ml Extrao de plasmdeo (lise alcalina)

Colocar bactrias (ex.: PBS) a crescer em meio de 30ml com ampicilina, overnight a 37C.

Soluo de ressuspeno (A): 5ml - 0,4ml de TRIS 1M ph=8 - 0,1ml de EDTA 0,5M - 4,5ml de H2O destilada Soluo de lise (B): 5ml - 1ml de NaOH 1M - 0,5ml de SDS 10% - 3,5ml de H2O destilada - Centrifugar (5min.) de meio j semeado em tubo falcon (vrias vezes), retirando o sobrenadante. - Ressuspender em 1ml de soluo (A). Vortex. - Acrescentar 1ml de soluo (B). Misturar com cuidado. - Acrescentar 1ml de Acetato de Potssio 5M. Misturar com cuidado. - Deixar (10 a 15 min.) no freezer. - Centrifugar (15min.). Retirar o sobrenadante para o tubo de vidro e descartar o tubo falcon. - Acrescentar 2 volumes de etanol gelado ou 1 volume de isopropanol. Misturar bem. - Overnight no freezer. - Centrifugar (20min.).

- Retirar o etanol virando o tubo. - Secar o plasmdeo na estufa (menos de 40oC). - Acrescentar 200ul de TE (varia conforme a quantidade de plasmdeo) esperar ressuspender. - Colocar 1ul de RNAse. Deixar no banho maria (30 a 60 min.) 37oC, passar para eppendorf. - Correr em gel de agarose 0,8% para purificao. Extrao de plasmdeo (lise alcalina) Mini-prep - Colocar bactrias (ex.: PBS) a crescer em meio de 3ml com ampicilina, overnight a 37C. Soluo de ressuspeno (A): 5ml - 0,4ml de TRIS 1M ph=8 - 0,1ml de EDTA 0,5M - 4,5ml de H2O destilada Soluo de lise (B): 5ml - 1ml de NaOH 1M - 0,5ml de SDS 10% - 3,5ml de H2O destilada - Centrifugar (1min.) de meio j semeado em um eppendorf (vrias vezes), retirando o sobrenadante. - Ressuspender em 200ul de soluo (A). Vortex. - Acrescentar 200ul de soluo (B). Misturar com cuidado. - Acrescentar 200ul de Acetato de Potssio 5M. Misturar com cuidado. - Deixar (10 a 15 min.) no freezer. - Centrifugar (15 min.). Retirar o sobrenadante para novo tubo. - Acrescenatr 2 volumes de etanol ou 1 volume de isopropanol. Misturar bem. - Overnight no freezer. - Centrifugar (10 min.) - Descartar o etanol virando o eppendorf. - Secar plasmdeo na estufa (menos de 40oC). - Acrescentar 30ul de TE (varia conforme a quantidade de plasmdeo) esperar ressuspender. - Colocar 1ul de RNAse. Deixar no banho maria (30 a 60 min.) 37oC. - Correr em gel de agarose 0,8% para purificao. Purificao de bandas com vidro

- Correr no gel o produto de PCR ou DNA genmico. - Cortar as bandas desejadas. - Coloca-se 300ul de NaI 6M + 2ul de TRIS 1M ph=8 no eppendorf com as bandas. - Deixar (15 min.) 60oC, mexer cuidadosamente. - Colocar 50ul de vidro, mexer durante 2 minutos. - Deixar (10 min.) na geladeira - Centrifugar (1 min.), descartar o lquido, com pipeta. - Acrescentar 150ul de etanol 70% no eppendorf. - Mexer, centrifugar mais (1 min.), descartar o lquido. - Acrescentar 150ul de etanol 70%. - Mexer, centrifugar mais (1min.), descartar o lquido. - Deixar secar na estufa, 40oC por 1:30h. - Ressuspender em 10 ou 15ul de H2O miliq (dependendo da intensidade da banda purificada). Deixar (15 min.) 60oC. - Centrifugar (3 min.). Retirar sobrenadante para eppendorf novo. - Aplicar certa quantidade no gel. Purificao de Plasmdeo com PEG - Certa quantidade de amostra e acrescenta-se 1 volume de PEG. - Deixar na geladeira por 30 min, mas pode-se deixar por 5 a 6 horas - Centrifugar (15 min.). - Descartar o sobrenadante. - Lavar com etanol 70%, duas vezes. Em cada vez centrifugar (1 min.) - Descartar o sobrenadante, deixar secar e ressuspender o pelet com H2O miliq. Purificao de Plasmdeo com Clorofrmio/PEG - Acrescentar 1 V de clorofrmio, agitar no vortex. - Centrifugar (10 min.), passar sobrenadante para eppendorf novo. - Acrescentar 10ul de Acetato de Amonia 7,5M, misturar bem. - Colocar 2 V de etanol absoluto, misturar. - Overnight no freezer. - Centrifugar (15 min.), secar na estufa. - Ressuspender com 30 ul de TE. - Colocar PEG (1 V) - Deixar ressuspender durante (20 min.) na bancada. - Centrifugar (20 min.). - Passar etanol 70% uma ou duas vezes (centrifugar 5 min.). - Ressuspender com 30 ul de H2O miliq.

Purificao de PCR com PEG - Certa quantidade de amostra e acrescenta-se 1 volume de PEG. - Deixar na geladeira overnight. - Centrifugar 30 min na centrfuga de placa. - Descartar cuidadosamente o sobrenadante com pipeta - Acrescentar 150ul de etanol 70%. - Centrifugar 15 min. - Descartar sobrenadante com pipeta, deixar secar e ressuspender em 8ul com H2O miliq. Purificao de plasmdeo com Fenol/Clorofrmio - Colocar 1 volume de fenol. Vortex. - Centrifugar (5 min.). - Retirar sobrenadante para tubo novo. - Colocar volume de fenol mais de clorofrmio. Vortex. - Centrifugar (5 min.). - Retirar sobrenadantepara tubo novo. - Colocar 1 volume de clorofrmio. Vortex. - Centrifugar (5 min.). - Retirar sobrenadante para tubo novo. - Acrescentar 10% de NaCl 5M ou AcK 5M. - Acrescentar 2 volumes de etanol 100% gelado. - Overnight no freezer. - Centrifugar (5 min.). - Descartar o etanol virando o eppendorf. - Secar os plasmdeos, no mximo (40oC) - Ressuspender em TE ou H2O miliq. Clivagem de DNA genmico com Eco R-1 - 10ul de DNA - 6ul de H2O - 2ul de Tampo React-3 - 2ul de Eco R-1 - Deixar overnight a 370C

Clivagem do Plasmdeo para fazer vetor

- 5ul de Plasmdeo. - 2ul de tampo (buffer D) da Eco R-5. - 2ul Eco R-5. - 11ul H2O miliq. - Deixar overnight 37oC. - Deixar (10 min.) no banho a 600C para inativar a enzima. Acrescentar T no plasmdeo - 20ul de Plasmdeo clivado. - 5ul de Buffer. - 0,2ul do T. - 3ul de MgCl2. - 2ul de Taq Polimerase. - 39,8ul de H2O miliq. - Deixar (3 h) 60oC. Reao de ligao para clonagem - 1ul de ligase T4. - 1ul de vetor. - 2ul de produto de PCR. - 1ul de tampo de ligao (buffer). - 5ul de H2O miliq. - Deixar na geladeira overnight. Transformao de bactrias Todos os procedimentos devem ser realizados na mesa de fluxo - Inocular 3ml de pr-cultura (XL1-Blue) em 30ml de meio, crescer a 37oC em agitao (1 2 h). - Centrifugar (5 min.) toda a cultura, descartar o sobrenadante. - Ressuspender as bactrias em 5ml de MgCl2 0,1M. Vortex. - Centrifugar (5 min.), descartar sobrenadante. - Ressuspender em 5ml de CaCl2 0,1M. Vortex. Deixar (30 min.) em banho com gelo 0oC. - Centrifugar (5 min.) e deixar um pouco de sobrenadante. Ressuspender no Vortex.

- Colocar 100ul em tubo estril com toda a ligao (se for clonagem) ou 1ul do plasmdeo a ser transformado. - Choque trmico: (20 min. 0oC), (2 min. 42oC), (5 min. 0oC). - Colocar 600ul de meio lquido novo (autoclavado) no eppendorf. - Incubar 37oC com agitao por (1 h). - Prepararas placas com 75ul de ampicilina e se for clonagem acrescentar tambm 30ul de X-Gal e 15 ul de IPTG. - Colocar 200ul da cultura do eppendorf na placa, espalhando bem. Incubar a 37oC. Se for clonagem pode-se fazer duas placas para cada ligao plaqueando todo o volume de bactrias. Extrao de cidos nuclicos de pequena amostra com Fenol
Digesto com protena K

- Mix de digesto: - 300ul de TNE 1X - 30ul de Tris-HCl pH 8 (1M) - 8ul de SDS 25% - 20ul de Proteinase K (20mg/ml) colocar depois em cada tubo. TNE 20X (500ml) - Tris 6,05g - NaCl 5,84g - EDTA 1,86g TE (pH 7,5) - 10 mM Tris, pH 7,5 - 0,1 mM EDTA Proteinase K - 20mg/ml em gua miliq - Incuba-se o material agitando de vez em quando, 37oC por pernoite ou 55oC por 3-4 horas; - Extrao orgnica: - adicionar um volume de Fenol:Clorofrmio:lcool Isoamlico 25:24:1 (360ul) (pegar a fase de baixo); - vortexar; - Centrifugar velocidade mxima por 10 min.;

- Retirar sobrenadante com ponteira cortada, passar para outro tubo e nesse tubo adicionar no mximo 2 volumes de etanol absoluto, misturar suavemente (720ul); - Centrifugar a velocidade mxima por 30 min. e descartar o sobrenadante; - Adicionar 500ul de etanol 70%; - Centrifugar a velocidade mxima por 10 min. e descartar o sobrenadante; - Secar; - Ressuspender em TE pH 7,5. Extrao de cidos nuclicos-Fenol/Clorofrmio Tampo de lise para extrao de c. Nuclicos: - 0,5ml de TRIS 1M - 1ml de EDTA 0,5M - 60ul de NaCl 5M - 3,44ml de H2O destilada - Colocar em um eppndorf de 1,5ml, Drosophila at a marca de 0,5ml. - Acrescentar 400ul de tampo de extrao p/ c. Nuclicos. - Homogeneizar bem. Lavar homogeneizador com H2O2 e depois com H2O destilada. - Acrescentar mais 200ul de tampo de lise. - Adicionar 60ul de SDS 10%. Misturar o SDS com a lise e colocar no banho maria por (45 min.), a uma temperatura entre 50oC e 60oC. - Colocar 300ul de fenol). Agitar (10 min.), cuidadosamente. - Centrifugar (10 min.). - Passar sobrenadante para novo eppendorf, desprezar o pellet. - Colocar 150ul de fenol, 150ul de clorofrmio. Agitar (10 min.), cuidadosamente. - Centrifugar (10 min.). Passar sobrenadante para novo eppendorf, desprezar o pellet. - Adicionar 300ul de clorofrmio. Agitar (10 min.), cuidadosamente. - Centrifugar (10 min.). Passar sobrenadante para novo eppendorf. - Colocar 2 volumes de etanol absoluto gelado, misturar suavemente , esperar (10 min.) ou overnight. - Centrifugar (1 min.), descartar o lcool, secar bem na estufa, no mximo (30 min.). - Colocar 100ul de TE. Extrao de c. Nuclicos com Coalho

- Utilizar 20 moscas (tamanho de D. simulans), homogeneizar em 200ul de tampo de lise (o mesmo tampo utilizado na extrao por Fenol/Clorofrmio). - Acrescentar mais 200ul de tampo de lise e 40ul de SDS 10%. - Deixar (45 min.) 60oC. Fazer 2ml de qualho: 0,5g de p de Coalho/ 2ml de H2O destilada. - Acrescentar 50ul de coalho, misturar. - Deixar (1 h) a 37oC, as vezes mexer. - Acrescentar 50ul de KAc 3,0 M. - Deixar (15 min.) no freezer. - Acrescentar 400ul de clorofrmio, misturar (10 min.). - Centrifugar (5 min.). - Passar sobrenadante para novo eppendorf. - Acrescentar 1 volume de isopropanol ou 2 volumes de estanol, misturar, aparecer fiapos. - Centrifugar (2 min.). - Retirar sobrenadante. - Ressuspender em 30ul de TE, deixar overnight na geladeira. - Colocar 1ul de RNAse e deixar a 37oC por (1 h). Extrao de c. Nuclicos com coalho/vidro Soluo de lise: - 100ul de TRIS (100mM ph=8) - 200ul de EDTA (100mM ph=8) - 12ul de NaCl (60mM) - 688ul H2O destilada - Homogeneizar 20 a 30 (tamanho de D. simulans) moscas em 400ul de tampo de lise. - Colocar 50ul de SDS 10%. - Deixar (1 h) em banho-maria 60oC. - Adicionar 50ul de coalho (0,5g de p de coalho/2ml de H2O) e manter no banho a 37C por 1h. - Adicionar 30ul de Acetato de Potssio 3M. Misturar levemente e colocar 15 minutos no freezer. - Adicionar 300ul de clorofrmio e misturar por 10 min. Centrifugar por 10 min. e remover o sobrenadante para um novo tubo. - Colocar 600ul de NaI 6M + 80ul de vidro. Misturar por 2 min. - Centrifugar por 1 min. e descartar o sobrenadante. - Passar 1 vez em etanol 70%. - Centrifugar (2 min.).

- Secar 50C (20-35 min.). - Ressuspender totalemente o vidro em H2O miliq, aps deixar 15 min. a 60C. - Centrifugar 1 min. e colocar sobrenadante em outro eppendorf. Extrao de c. Nucleicos com Acetato de Amnio - Macerar as moscas em 600ul de tampo de lise, mais 60ul de SDS 10%. Deixar (1 h) no banho-maria entre (50 e 60oC) - Acrescentar 100ul de coalho. Deixar a 37oC por (1 h). - Deixar no banho-maria a 55oC por mais (30 min.). - Colocar as amostras no freezer por mais (5 min.). - Acrescentar 400ul de Acetato de Amnio. - Agitar cuidadosamente (10 min.). - Centrifugar (10 min.). - Colocar o sobrenadante em eppendorf de 2ml. - Acrescentar 1 volume de isopropanol ou antes passar 1 volume de Clorofrmio, agitar, centrifugar e passar para novo eppendorf. - Centrifugar (2 min.). Desprezar o pellet. - Adicionar etanol 70%, misturar e deixar na geladeira por (15 min.). Centrifugar. - Repetir esse procedimento 5 vezes. - Secar o DNA, ressuspender e passar RNAse. Extrao de RNA com Trizol - Homogeneizar moscas em 1ml de Trizol (50-100mg tecido). - Deixar (5 min.) a T.A. - Colocar 200ul de clorofrmio. - Misturar virando o tubo (15 s). - Deixar (3 min.) a T.A. - Centrifugar (15 min.). - Retirar sobrenadante para novo eppendorf. - Colocar 500ul de isopropanol. - Deixar (10 min.) a T.A. - Centrifugar (10 min.). - Descartar sobrenadante. - Lavar o pelet de RNA com etanol 75%, colocando 1ml de etanol 75%. Vortex. - Centrifugar (5 min.). - Deixar secar (5 a 10 min.). - Ressuspender em H2O DEPC. - Inocular (10 min. a 55oC-60oC.

Isolamento de RNA mitocondrial - Congelar cerca de 10-20 moscas a 20oC, durante 20 min.; - Homogeneizar delicadamente em eppendorf, em 300ul de TES (no gelo); - Acrescentar mais 700ul de TES, misturar suavemente; - Centrifugar a 2500 rpm por 10 min.; - Transferir o sobrenadante para outro tubo e repetir a centrifugao (por mais 2-3 vezes, at ficar sem material particulado). - Centrifugar a 9000 rpm por 25 min.; - Jogar o sobrenadante fora; - Ressuspender o precipitado em 350ul de TES; - Adicionar 50ul de SDS e misturar delicadamente; - Incubar 15 min. a 65oC; - Adicionar 100ul de AcK 5M pH=5,0, e misturar delicadamente; - Incubar a -20C por 15 min.; - Centrifugar 5 min. a 9000 rpm; - Transferir o sobrenadante para um novo eppendorf; - Extrair com 1 volume de fenol:clorofrmio (250ul:250ul); - Centrifugar 5 min. a 9000 rpm, tirar a fase aquosa; - Tratar com 1 volume de clorofrmio (500ul); - Centrifugar 5 min. a 9000 rpm, tirar fase aquosa (de cima); - Precipitar com 2 volumes de etanol 100%, deixar o precipitado pelo menos 30 min. a -20C; - Centrifugar 10-20 min. a 12000 rpm, lavar o precipitado com etanol 70%, secar na estufa 50C; - Dissolver em 20-30ul de TE. Dever haver material suficiente para uma digesto, que aps a corrida do gel 0,8% deve permitir a visualizao das bandas diretam,ente, aps colorao com Brometo de Etdio; - Colocar 1ul de RNase, deixar em banho-maria 37C por 10-15 min.; - Migrar em gel de eletroforese, visualizar. Soluo de TRIS 1M PM: 121,11 Ph=8 - Para 200ml - 24,22g de TRIS - Completar com 150ml de H2O destilada - Acertar Ph=8 (com HCl)
Massa Molecular------1M X1 ------quantos molar quer X1 ------ 1000ml X ------- quantos ml quer

- Completar para 200ml - Autoclavar Soluo de EDTA 0,5 M PM: 372,24 Ph=8 - Para 200ml - 37,24g de EDTA - Colocar 100ml de H2O destilada - Acertar Ph=8 (com NaOH) - Autoclavar Proteinase K - 200mg de proteinase K; - Completar com H2O MQ autoclavada; Obs: estocar a -20C. Utilizar 50ug/ml na extrao de DNA genmico, incubando a 37-56C +/- 1h. Soluo de KCl 3M PM = 74,55 g) - 22,36 g de KCl - Completar para 100ml de H2O MQ autoclavada. - Autoclavar. Soluo de NaOH 10M PM:40 - Para 50ml - 20g de NaOH - Completar para 50ml com H2O Soluo de Glicose 1M (PM = 180 g) - 18g de glicose; - Completar para 100ml com H2O MQ autoclavada; - Filtrar atravs de um filtro de 0,22 microns. Soluo de HCl 10% - Para 50ml - 13,5ml de HCl(37%)

- Completar com H2O Clorofrmio : lcool Isoamil (24:1) - 48ml de clorofrmio; - 2ml de lcool isoamilico; Obs: o clorofrmio desnatura protenas e facilita a separao aquosa/orgnica. O lcool reduz a formao de espuma durante a extrao. lcool com Nipagim - Dissolver 1g de nipagim em 10ml de lcool. - Colocar no vidro do nipagin. - Completar de gua. Soluo de ampicilina 20mg/ml - 200mg de ampicilina - completar at 10ml com H2O destilada - *Filtrar em ambiente estril Para usar: C1 . V1 = C2 . V2 20.000 . V = 70 . volume do meio Soluo de NaCl 5M PM:58,44 - Para 200ml - 58,44g de NaCl - Comletar para 200ml com H2O destilada Autolavar Soluo de Wash Buffer - 400ul de NaCl; - 200ul Tris; - 100ul de EDTA; - Completar at 5ml com H2O destilada e at 10 ml com etanol absoluto. Soluo de TE - 1ml de TRIS (10mM)

- 100ul de EDTA 0,5M (0,5mM) - Completar para 100ml de H2O destilada - Autoclavar TAE 1X - 4,84g de TRIS - 2ml de EDTA 0,5M - 1,15ml de cido Actico Glacial - Completar para 1 L com H2O TEB 20X pH = 8,00 (para 1l) - 1,77 M de Tris-base - 216g de Tris-base - 0,025 M de EDTA - 9,3g de EDTA 50ml de EDTA 0,5M pH = 8,00 - 111,2g de cido brico - Completar volume apropriado com H2O MQ autoclavada; - Aproximar pH = 8,00 Obs: TEB recomendado para separao de DNA de baixo peso molecular. Brometo de Etdio - 1g de Brometo de Etdio - Completar para 100ml com H2O desticlavada; - Agitar at certificar-se que o corante est dissolvido, armazenar a 4C. Gel de Agarose 0,8% - 0,4g de agarose - 20ul de brometo de etdio (luvas) - 50ml de TAE 1X Soluo de Acetato de Potssio 3M PM: 98,14 - Para 100ml - 29,44g de Acetato de Potssio em 60ml de H2O

- 11,5ml de cido Actico Glacial - Completar para 100ml com H2O destilada Acetato de Potssio 8M - 7,85g para 10ml de soluo Acetato de Amnio 7,5M PM: 77,08 - 8,7g para 15ml de soluo Soluo de X-Gal (20mg/ml) - 40mg de X-Gal - 2ml de formamida Obs: Agitar a soluo de X-Gal em vortex, filtrando-a, posteriormente, em ambiente estril. Cobrir o tubo com alumnio para prevenir danificao por luz. Armazenar a -20C. IPTG (isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside) 200 mg/ml (pM = 238,3 g) - 0,4g de IPTG - 2ml de H2O MQ autoclavada; - Esterelizar por filtrao atravs de filtro de 0,22 microns. Dispensar em al Soluo de MgCl2 0,1M PM: 203,3 - Para 100ml - 2g de MgCl2 - Autoclavar

Soluo de CaCl2 0,1M PM: 147,01 - Para 100ml - 1,47g de CaCl2 - Autoclavar Soluo de PEG 13%, NaCl 1,6M - 1,3g de PEG *filtrar

- 0,94g de NaCl - Completar para 10ml de H2O destilada Soluo de PEG 20% - 20 g de PEG (polyethylene Glycol 8000); - 14,6 de NaCl; - 100ml de H2O (vol. final). Soluo de NaI 6M - Para 5ml - 4,5g de NaI *colocar 10ul de TRIS 1M Ph=8 - completar com H2O miliq Tampo fosfato 10X (para RNA) - Fazer 500ml de 100mM de Fosfato de Sdio dibsico e 500ml de Fosfato de Sdio monobsico. - Dissolver 7,1g de Fosfato de Sdio dibsico em 500ml de H2O. - Dissolver 6,9g de Fosfato de Sdio monobsico em 500ml de H2O. - Usando um medidor de Ph calibrado dissolva a soluo de Fosfato de Sdio monobsio no soluo de Fosfato de Sdio dibsico at que o Ph=7. Autoclavar e armazenar a T.A.

Southern Blot - Clivar o DNA (= 7ug). - Correr o Dna em gel de agarose 0,8% (novo, com TAE 1X novo), overnight, a aproximadamente 10v ( de 9v a 15v). - Despurinizar o gel em HCl 0,2N por (20 min.) sem agitao. HCl 0,2N: 3,8ml de HCl completar para 200ml de H2O. - Lavar com H2O destilada aps desprezar o HCl - Colocar soluo desnaturante, (45 min.) com agitao. Para 500ml: 10g de NaOH (0,5M) 43,83 g de NaCl (1,5M) - Descartar soluo e lavar com H2O. - Colocar soluo neutralizante, (30 min.) com agitao Para 500ml: 38,28g de TRIS 87,66g de NaCl

* Acertar ph=7 - Montar suporte de transferncia:

- Soluo de SSC 20X: 175,32g de NaCl 88,2g de Citrato de Sdio Colocar 800ml de H2O. * Ajustar ph=7 - Completar para 1 litro com H2O. *Autoclavar - Deixar transferindo overnight. - Marcar os slots - Retirar membrana do gel com pina, colocar sobre um papel filtro e secar na estufa a 80oC por (2 h). Hibridizao - Fazer soluo pr-hibridizao. 5ml de SSC 20X 1ml de Dextran Sulfato 25% 1ml de Blocking Agent 200ul de SDS 10% completar para 20ml com H2O - Aquecer a soluo a 60oC

- Colocar a membrana em um saco plstico com 10ml a 20ml da soluo de prhibridizao. - Selar o saco plstico e deixar em agitao a 60oC por no mnimo (1 h).
Preparao da Sonda

- Mtodo Random Prime: - Diluir o DNA (sonda) para uma concentrao de 25ng/ul em um volume no mnimo 20ul. - Desnaturar esse DNA fervendo (5 min.) e depois colocando no freezer por mais (5 min.) - Para a reao de marcao usa-se: 30ul de H2O 10ul de NTPs 5ul de primer 4ul do DNA denaturado 1ul de enzima * Pode-se fazer meia reao - Deixar no banho a 37oO por (1 h). - Desnaturar a sonda j marcada. - Fazer um pequeno furo no saco da membrana, acrescentar a sonda soluo de pr-hibridizao. Selar o saco novamente, retirando bolhas. - Deixar hibridizando overnight. Lavagem da Membrana - Retirar a membrana do plstico, colocando-a em um pote. - Aquecer a 60oC uam soluo de: 5ml de SSC 20X 1ml de SDS 10% completar com 100ml de H2O - Colocar a soluo com a membrana a 60oC, com agitao, por (15 min.). Aps retirar soluo. - Repetir o procedimento com uma soluo aquecida de: 2,5ml de SSC 1ml de SDS 10% completar para 100ml de H2O - Deixar (15 min.) 60oC, com agitao. - Retirar soluo. - Deixar por (1 h) a membrana com a soluo: 10ml de Blocking Agent 90ml de Buffer A

- Deixar (1 h) a temperatura ambiente, com agitao. - Soluo de Buffer A: para 500ml 6,05g de TRIS 8,76g de NaCl *Acertar ph=9,5, autoclavar. - Retirar essa soluo e colocar outra soluo: 150mg de albumina bovina 6ul de antifluresceina AP 30ml de Buffer A - Deixar (1 h) com esta soluo agitando a temperatura ambiente. - Ocupar o que sobrou do Buffer A para fazer uma soluo com Tween 20 para ficar 0,3%. para 300ml de Buffer A - 0,9ml de Tween 20. - Dar trs banhos com esta soluo, agitando (10 min.) a temperatura ambiente. - Desprezar a soluo. - Secar a membrana com uma folha de papel filtro. - Na sala escura, com pouca luz, espalhar bem 1ml do reagente detecton e esperar (3 min.). - Secar o excesso de reagente em papel filtro. - Colocar num saco plstico a membrana e selar. - Colocar a membrana no hipercassete e fixar com fita adesiva. *No esquecer de cortar ponta. - No escuro colocar o filme e fixar. - Tempo de exposio variado. - Para revelar: revelador-H2O-fixador - Deixar no revelador at aparecer as bandas. - Passar rapidamente na H2O. - Colocar no fixador por (5 a 10 min.). - Lavar bem o filme com H2O. Gel de Poliacrilamida -Lavar bem as placas de vidro e passar silicone lquido para dificultar a aderncia do gel nas placas. -Aps ajustar as placas com os bastes e selar as laterais com silicone. -Colocar o gel de poliacrilamida na placa e esperar a acrilamida polimerizar. -Aps colocar a quantidade de DNA e corante e colocar o marcador de peso molecular nas extremidades. -Colocar a correr com uma voltagem de 40v. -Aps correr o tempo necessrio fazer os seguintes procedimentos.

Revelao - Soluo de Etanol 10% + Ac. Actico 0,5% (200ml). - Aquecer at em torno de 60C; - Colocar no gel, durante 1 min; - Lavar 2x com gua destilada; - Soluo de AgNO3 0,2%; - Aquecer at em torno de 60C; - Deixar imerso 10 minutos; - Lavar 2x com gua destilada; - Soluo de revelao, NaOH 3% + 3ml/L de formaldeido 37%; - Aquecer at em torno de 60C; - Deixar revelando at a colorao desejada; - Lavar 2x com gua destilada; - Soluo de fixao, Ac. Actico 6%. Reagentes
Acrilamida 30%

-15g de Acrilamida. -0,4g de Bis-acrilamida. -gua destilada at completar 50 ml.

Gel de Poliacrilamida

-7ml de Acrilamida 30%. -30ul de TEMED -1 pitada de persulfato de amnio. -3ml de TAE 10x. -completar com H2O destilada para 30ml.
Nitrato de Prata

-Nitrato de Prata 0,2% - 0,4g de Nitrato em 200ml de gua. Protocolo para corar genitlia
- KOH 10% deixar overnight ou 4h a 60C;

- Lavar com gua destilada;

- Deixar overnight com corante a 37C; (Fuxina cida 5mg, 300ml de H2O, cido Clordrico 10% 10ml); - Passar no lcool 70% para tirar o excesso de corante; - Dissecar em glicerina. - Guardar moscas em etanol 70%. Teste de ligao do DNA ao vidro - Colocar em um eppendorf 5ul de DNA de alto peso molecular (DNA genmico) e de baixo peso molecular (Marcador caseiro); - Acrescentar em cada tubo 95ul de H2O; - Acrescentar 200ul de NaI + 40 ul de vidro a ser testado. Mexer durante 1 min; - Deixar 10 min. na geladeira; - Centrifigar 1 min. e descartar o sobrenadante; - Deixar secar o pelet 1:30 min. a temperaturas < 40oC; - Ressuspender em 10 ul; - Aplicar os 10ul das amostras purificadas mais 5ul das originais no purificadas no gel de agarose 0,8%. Referncias:
Oliveira, L.F.V., Wallau, G.L., Loreto, E.L.S. 2009. Isolation a high quality DNA: a protocol combining "rennet" and glass milk. Electronic Journal of Biotechnology. 12(2): 1-6. Sassi, A.K., Herdia, F., Loreto, E.L.S., Valente, V.L.S. 2005. Transposable element P and gypsy in natural populations of Drosophila willistoni. Genetics and Molecular Biology. 28: 734-739. Sanguinetti, C.J., Dias Neto, E., Simpson, A.J.G. 1994. Rapid silver staining and recovery of PCR products separated on polyacrylamide gels. Biotechniques. 17: 915-919.