1 PLANEJAMENTO DE EXPERIMENTOS E ANLISE DE RESULTADOS

Conceitos bsicos

Wagner C. Valenti Universidade Estadual Paulista Centro de Aqicultura Dept. Biologia Aplicada, FCAV I. Planejamento de Experimentos Fator: qualquer varivel, cujo efeito deseja-se testar. Ex. densidade de estocagem, teor de protenas em rao, cor de tanque, modo de alimentao. Nveis do fator: cada um dos valores que o fator assume no experimento. Exemplo: Fator: Densidade de estocagem; nveis: 10, 20, 40, 80 ind./m2 (ou 20, 30, 40, 50 ind./m2) Fator: teor de testosterona na dieta; nveis: 1%, 2% e 4% (ou 1,5%, 2,0% e 2,5%) Fator: Cor do Tanque; nveis: amarelo, vermelho, preto e verde Fator: Modo de alimentao; nveis: a lano e em bandejas Geralmente, quando no se conhece nada sobre os efeitos de um fator, iniciam-se os estudos com os nveis dos fatores definidos em progresso geomtrica. A seguir, testa-se um intervalo menor, definido com base nos resultados do experimento anterior, escolhidos em escala aritmtica. Mas tudo depende do sistema estudado. Fator quantitativo: quando os seus nveis so valores numricos e podem ser ordenados seqencialmente. Ex. densidade de estocagem, teor de testosterona na dieta, teor de protenas na dieta. Fator qualitativo: quando os seus nveis so atributos; no podem ser ordenados. Ex. cor de tanque, modo de alimentao. Tratamento: nos experimentos em que se testa um nico fator, cada tratamento corresponde a cada nvel do fator. Nos experimentos em que se testa mais de um fator ao

2 mesmo tempo (ex. efeito da amnia e pH em conjunto), cada tratamento corresponde combinao entre os nveis dos fatores considerados. Ex: Fator 1: pH; nveis: 7 e 8 Fator 2: amnia; nveis: 2 e 4 mg/L Tratamento 1: pH = 7 e amnia = 2 mg/L Tratamento 2: pH = 8 e amnia = 2 mg/L Tratamento 3: pH = 7 e amnia = 4 mg/L Tratamento 4: pH = 8 e amnia = 4 mg/L Esses experimentos so chamados em esquema fatorial. No exemplo acima, temos um experimento em esquema fatorial (2x2), indicando que so dois fatores, com 2 nveis cada um. Se tivssemos mais um fator e o terceiro fator tivesse 4 nveis, a notao seria (2x2x4). Tratamento controle (ou testemunha): quando o objetivo contrastar os tratamentos contra um deles apenas, este chamado controle. O controle negativo quando h ausncia do fator testado (nvel zero) e o controle positivo quando usa-se um dos nveis do fator como controle (geralmente um valor ou manejo tradicionalmente usado na prtica ex. cultivo tradicional contra despescas seletivas) Variveis de avaliao: variveis que sero medidas nas unidades experimentais (vide abaixo) para avaliar o efeito dos tratamentos. Podem ser: quantitativas, quando puderem ser ordenadas em uma seqncia numrica (ex. ganho de peso, sobrevivncia, produo de PL, taxa de respirao) qualitativas, quando ferem atributos (ex. estdio de maturao gonadal, morfotipos, sexo). Unidade experimental: cada um dos elementos que recebe o efeito dos tratamentos, no qual sero determinados os valores das variveis de avaliao. Ex: cada viveiro usado em um experimento (ou o conjunto de animais contidos nele), cada tanque (ou o conjunto de

3 animais contidos nele), cada bquer contendo larvas ou pode ser ainda cada animal, conforme o tipo de experimento. O conjunto de unidades experimentais deve ser o mais homogneo possvel, isto , todas as unidades experimentais devem ser iguais. Caso contrrio, deve-se dividi-las em blocos homogneos de unidades experimentais. Unidade amostral: cada uma das menores unidades mensuradas. Ex. para a varivel peso mdio, obtida em um viveiro de cultivo de camares (usado como unidade experimental), a unidade amostral cada um dos camares pesados (se eles forem pesados individualmente). Por outro lado, para as variveis sobrevivncia e produtividade, a unidade amostral o prprio viveiro, coincidindo com a unidade experimental. Variveis controladas: so aquelas que interferem nas variveis de avaliao e por isso so mantidas constantes. Ex. temperatura, salinidade, fotoperodo em um experimento de larvicultura. Taxa de arraoamento em um experimento em viveiros externos. Variveis monitoradas (ou medidas): so aquelas que interferem nas variveis de avaliao, mas no se consegue controlar; por isso so medidas para caracterizar as condies em que o experimento foi realizado. Ex. temperatura e fotoperodo em um experimento realizado em viveiros externos. Observe que o oxignio dissolvido, pH, transparncia podem ser variveis simplesmente monitoradas ou podem ser controladas, se houver um mecanismo efetivo de correo para um valor adequado a partir das medidas tomadas. Varivel fixa: aquela cujos valores so fixados pelo pesquisador na realizao de um experimento. Essa varivel dita sem erro. Ex. os nveis de um fator. Varivel aleatria: aquela que medida; apresenta um erro devido aos aparelhos de medida e ao acaso. Ex. todas as variveis de avaliao.

4 Observe que, quando coletamos animais em um viveiro e determinamos o peso e o comprimento, ambas variveis so aleatrias, no existindo a nenhuma varivel fixa. Mas se coletamos indivduos de viveiros estocados com diferentes densidades e medimos o peso, temos uma varivel fixa (densidade de estocagem) e uma varivel aleatria (peso). A um nico valor de uma varivel fixa, associam-se diversos valores da varivel aleatria, um para cada rplica de cada tratamento. Rplica: cada uma das unidades experimentais que recebe o mesmo tratamento. As rplicas so necessrias porque os resultados obtidos no so homogneos devido variabilidade individual dos organismos (gentica) e ao efeito de outros fatores que no esto sendo controlados. Cada rplica deve receber o efeito do respectivo tratamento de forma independente. Pseudorplica: quando as rplicas no so independentes ou no h rplicas de tratamentos. Nesse caso, cada unidade no pode ser tratada como rplica; na verdade elas no so unidades experimentais, mas apenas unidades amostrais. Ex. em um experimento para avaliar o efeito da temperatura, monta-se seis tanques pequenos em um tanque grande mantido a 20 C por termostatos e aquecedores internos e mais seis em outro mantido a 25 C tambm por termostatos e aquecedores idnticos aos anteriores. Cada um dos tanques pequenos uma peseudorplica. Observe que no h rplica de tratamento porque as seis pseudorplicas esto sendo mantidas pelo mesmo sistema de aquecimento. Caso ocorra um problema no sistema de um dos tanques grandes, ir afetar todas as unidades de um tratamento e no ir afetar as do outro. Os valores de cada pseudorplica devem ser juntados para compor uma nica mdia que ser usada na anlise dos dados como um dado nico (como feito com o peso dos camares contidos em cada viveiro, na hora de avaliar o efeito dos tratamentos). Parcela (trial ou plot): cada uma das unidades experimentais que recebe um tratamento. Corresponde ao nmero de tratamentos multiplicado pelo nmero de rplicas. Cada rplica corresponde a uma unidade experimental e a uma parcela.

Delineamento Experimental H dois tipos bsicos de delineamentos experimentais, dos quais derivam muitos dos demais: Delineamento Inteiramente Casualisado (DIC) (completely randomized experimental design): quando todas as unidades experimentais so homogneas, os tratamentos so atribudos a cada uma por sorteio. Portanto, todas unidades experimentais tm a mesma probabilidade de receber um determinado tratamento. Delineamento em Blocos Casualisados (DBC) (randomized block experimental design): quando as Unidades Experimentais apresentam heterogeneidades, ou seja, quando o pesquisador no dispe de nmero de unidades experimentais homogneas para compor o total de parcelas, deve-se agrupar as Unidades Experimentais em grupos homogneos (Blocos), contendo nmero de unidades experimentais igual ao nmero de tratamentos. Aplica-se uma rplica de cada tratamento em cada bloco, de modo que todos os blocos recebam todos os tratamentos. Dentro de cada bloco, todas as unidades experimentais esto submetidas s mesmas condies, exceto pelo tratamento. Alm disso, todas tm a mesma probabilidade de receber cada tratamento (por isso os blocos so casualizados). O nmero de blocos igual ao nmero de rplicas e o nmero de unidades experimentais dentro de cada bloco igual ao nmero de tratamentos testados. Exemplos: Quando o conjunto de animais no possurem a mesma idade pode-se estabelecer blocos homogneos de idade. Quando a posio dos tanques no laboratrio pode receber luz ambiente de forma diferente, pode-se estabelecer blocos de posio (ex. quatro encostados em cada parede). Quando no temos todas as larvas ou PL para montar todas as parcelas ao mesmo tempo, podemos iniciar os testes em pocas diferentes, estabelecendo os blocos

6 homogneos de tempo. Portanto, cada bloco corresponde ao conjunto de rplicas iniciadas ao mesmo tempo, que contm todos os tratamentos. No delineamento em blocos temos reduo dos graus de liberdade do resduo (erro) o que torna o teste estatstico menos sensvel. Exemplo de um experimento cujo objetivo avaliar o efeito da intensificao: Fator: Densidade de estocagem Nveis: 10, 20, 40 e 80 ind/m2 (tratamentos). um fator quantitativo porque se pode ordenar cada nvel numericamente, um a seguir do outro. Delineamento experimental: Se todos os viveiros forem iguais e povoados ao mesmo tempo: DIC com 4 tratamentos e 3 repeties. Se houver grupos de viveiros diferentes e/ou povoamento feito em pocas diferentes: DBC com 4 tratamentos e 3 repeties. Variveis de Avaliao: Peso mdio (g), Produo (kg/ha), Produtividade (kg/ha/ano) e Sobrevivncia (%). Unidades Experimentais e Parcelas: cada um dos viveiros. Unidades amostrais: cada camaro para a varivel peso mdio e cada viveiros para as demais. Rplicas: cada viveiro que compem cada tratamento. Se 3 viveiros foram povoados com a mesma densidade, o tratamento tem 3 rplicas. Variveis controladas: taxa de arraoamento e taxa de renovao de gua. Variveis monitoradas: transparncia, oxignio dissolvido na gua, pH, teor de amnia e de nitrito. II. Anlise de Resultados Objetivos da realizao de um experimento e da anlise estatstica

7 O Objetivo de um experimento avaliar o efeito dos Nveis do Fator estudado sobre cada Varivel de Avaliao. O Objetivo de Anlise Estatstica avaliar se as diferenas encontradas so devidas ao acaso ou realmente ao efeito dos fatores. A anlise estatstica apenas mais uma ferramenta para o pesquisador considerar em sua anlise. Ela NO decide pelo pesquisador! Escolha do Teste Estatstico Variveis de avaliao qualitativas: Quando as variveis de avaliao forem qualitativas, os dados so apresentados na forma de freqncias (ex. nmero de machos e de fmeas, nmero de indivduos em cada estgio de maturao). Nestes casos, deve-se preferir o uso de testes de freqncias. Geralmente, elabora-se uma tabela de contingncia e aplica-se o teste G, Qui-quadrado ou Teste Exato de Fisher. No so testadas as mdias, mas as freqncias absolutas. Ex. Determinar se existe estratificao com relao a sexo em uma populao de lagartos entre a mata ciliar e a mata atlntica. 1. Realiza-se uma amostragem nos dois ambientes e separam-se os animais por sexos. Ex. coletou-se 87 machos e 9 fmeas na mata ciliar e 112 machos e 18 fmeas na mata atlntica. 2. Constri-se uma tabela de contingncia como esta abaixo Machos Fmeas Total M. Ciliar 87 a 9 c 96 n3 M. Atlntica 112 b 18 d 130 n4 Total 199 n1 27 n2 226 N

3. Calcula-se o valor do 2 pela frmula abaixo: (ad bc ) 2 N n1 n2 n3 n4

2 =

Os graus de liberdade correspondem ao nmero de linhas menos 1, vezes o nmero de colunas menos 1 (g.l. = (nolin. -1)(nocol.-1)). No exemplo temos:

8 (87.18 112.9) 2 .226 = 1,0494 199 27 96 130

2 =
g.l. = (2-1)(2-1)=1;

2c = 3,841 para = 0,05 e 1 g.l.(obtido na tabela)

como 2o < 2c as amostras so homogneas, ou seja o sex-ratio no varia entre as localidades. Em outras palavras: no h preferncia por mata ciliar ou mata atlntica por machos ou fmeas. Obs1: Se a freqncia em uma das clulas da tabela for inferior a 5, o resultado do teste deve ser usado com cautela. Obs2: freqentemente calculam-se as mdias das freqncias em todas as rplicas. Nesse caso, a varivel se torna contnua. Ento, aplicam-se os mesmo testes usados para as variveis quantitativas, que sero descritas a seguir. Variveis de avaliao quantitativas: Para as variveis quantitativas, o primeiro passo avaliar a distribuio de freqncia da varivel de avaliao com base nos dados obtidos. Pode-se aplicar o teste de ShapiroWilk ou Kolmogorov-Smirnov para avaliar se os dados desviam significativamente da distribuio normal. Caso o teste apresente um resultado significativo isto , os dados apresentam distribuio diferente da distribuio normal, utilizam-se testes no paramtricos. Caso os dados no desviem significativamente da distribuio normal, testa-se a igualdade das varincias (homocedasticidade) dos dados obtidos para cada tratamento pelo teste de Brown-Forsythe, Bartlet ou outro. Caso o teste apresente um resultado no significativo, isto , no foi demonstrado que as varincias so diferentes, utilizam-se testes paramtricos. Caso contrrio, utilizam-se testes no paramtricos. Dados que no desviam significativamente da distribuio normal so apresentados na forma de mdia e desvio padro. Dados que no seguem a distribuio normal so apresentados na forma de mediana e percentis (quartis, interquartis etc). Experimentos com um fator:

9 Para comparar apenas dois nveis de um fator, utiliza-se o teste t de Student (paramtrico) ou o teste de Mann-Whitney (no paramtrico). Se houver trs ou mais nveis do fator, utiliza-se a Anlise de Varincia (ANOVA) pelo Teste F com uma classificao (one-way ANOVA ou one-factor ANOVA) (paramtrico) ou ANOVA pelo teste de Kruskal-Wallis (no paramtrico) para delineamentos inteiramente casualizados (DIC). Para Delineamentos em Blocos Casualizados (DBC), utiliza-se ANOVA pelo Teste F em Blocos (two-way ANOVA, ou two-factor ANOVA) (paramtrico) ou ANOVA pelo teste de Teste de Friedman (no paramtrico). Obs. Se os nveis do fator foram fixados pelo pesquisador, isto , temos uma varivel fixa (geralmente ocorre em experimentos), usa-se ANOVA modelo fixo. Caso sejam variveis medidas pelo pesquisador, isto , so variveis aleatrias (geralmente ocorre em estudos de campo, quando se obtm amostras da natureza, sem montar um experimento), usa-se ANOVA modelo aleatrio. Experimentos com dois fatores: Quando temos dois fatores para delineamentos inteiramente casualizados, usamos ANOVA com duas classificaes (two-way ANOVA ou two-factor ANOVA). Para delineamentos em blocos casualizados com dois fatores ou no caso de 3 ou mais fatores em DIC, usamos ANOVA com 3 ou mais classificaes. Nos casos dos experimentos em esquema fatorial (2 ou mais fatores), com replicas para cada tratamento, testa-se a interao entre os fatores, que mostra se o efeito dos fatores independente ou os efeitos esto associados. Isto equivalente ao teste de independncia nas anlises de freqncias. Se os dois fatores forem fixos, usa-se o modelo fixo de ANOVA, se um for fixo e outro aleatrio usa-se o modelo misto e se ambos forem aleatrios usa-se o modelo aleatrio. Obs. Os testes paramtricos tem um poder maior (so mais sensveis), isto , detectam diferenas que os no paramtricos no detectam. Por isso devem ser preferidos quando as premissas so satisfeitas (distribuio normal e homocedasticidade). Como eles so robustos, isto , muitas vezes fornecem resultados confiveis mesmo quando os dados

10 no atendem as premissas, freqentemente so usados para dados no normais ou heterocedsticos. Outra premissa que no ser discutida aqui a aditividade. Muitas vezes, transformaes de variveis podem ser aplicadas para torn-las com distribuio normal e/ou homocedsticas. As mais comuns so: log x, ln x, x, arcsen x. As propores sempre seguem uma distribuio binomial, mas pode-se normalizar essas variveis aplicando-se a transformao arcsen x, antes de aplicar a anlise. Qualquer que seja a transformao, os dados so apresentados na forma original, ou seja, os dados transformados so usados apenas para realizar a anlise estatstica. Interpretao do resultado do teste estatstico Os testes estatsticos fornecem resultados do clculo de variveis estatsticas (valores de t, F, 2, G etc.). Estes esto associados a uma probabilidade, que o que importa para o pesquisador. A probabilidade que o teste estatstico fornece (o valor de P) indica a chance de obterse aquele valor da estatstica (ex. valor de F) se as mdias forem diferentes, ou seja, se houver efeito dos nveis do fator (tratamentos) estudado sobre a varivel de avaliao analisada. Se P for pequeno (ex. P<0,05), indica que as mdias testadas so diferentes e, portanto, dizemos que existe diferena significativa. Se P for grande (ex. P>0,05), no podemos dizer que as mdias so diferentes e dizemos que elas no diferem estatisticamente, mas NO podemos afirmar que so iguais. Simplesmente o teste estatstico usado no indicou que as mdias so diferentes. Isto porque os testes de mdias somente consideram o erro tipo I (vide abaixo). No confunda significncia estatstica com significncia biolgica. Mdias que apresentam diferena estatstica altamente significativa podem no revelar nenhuma diferena biolgica importante. Pense, por exemplo, se obtivermos o peso mdio dos

11 peixes em um viveiro 0,01 g maior do que o de outro, em amostras de 1000 indivduos (g.l. = 999) com baixa variabilidade; esse resultado pode ser altamente significativo para os testes estatsticos, mas para o cultivo da espcie no significa nada. Por outro lado, uma taxa de reproduo 1% maior em uma populao com gerao de uma semana no seria detectada como significativa na anlise estatstica, mas faria uma diferena enorme em um ano (54 geraes). Quem decide o que relevante ou no o pesquisador. A estatstica uma ferramenta apenas para evidenciar melhor o que deve ser demonstrado. Nvel de significncia ou : a probabilidade que assumimos ser pequena o suficiente para considerar o resultado do teste significativo. Geralmente considera-se 5%. Podem-se usar as seguintes notaes: = 5%, = 0,05, P<0,05 ou *. Erros em testes de comparaes de mdias: Erro tipo I (ou erro ): atribuir uma diferena quando ela no existe Erro tipo II (ou erro ): atribuir uma igualdade quando ela no existe

Os testes estatsticos normalmente usados consideram o erro tipo I, mas no consideram o erro tipo II. Por isso, no podemos dizer que as mdias so iguais quando o resultado do teste no d significativo, pois no sabemos qual a probabilidade de erro dessa afirmao. Testes post-hoc (testes de contrastes, testes de comparaes mltiplas) Quando a diferena entre os tratamentos testados for significativa e o Fator analisado for quantitativo, fazemos a anlise de regresso para determinar uma equao matemtica que expresse a variao da varivel de avaliao (Ex: produo, peso mdio, sobrevivncia) em funo da variao do fator estudado (ex. densidade de estocagem). Esta equao pode ser uma reta, mas geralmente no linear; o uso indiscriminado das equaes lineares leva a muitos erros. Mas, se quisermos saber quais mdias diferem entre si (isto geralmente no correto para variveis quantitativas, mas muito usado), fazemos um teste post hoc. Neste caso, ao apresentarmos os resultados, colocamos letras

12 aps as mdias para indicar quais mdias diferem entre si. Mdias seguidas por letras diferentes diferem estatisticamente ao nvel da probabilidade considerada. Para fatores qualitativos, no se faz regresso, mas pode-se fazer o teste post hoc e apresentar as mdias seguidas por letras ou contrastar os tratamentos com o controle apenas. A escolha do que fazer depende da pergunta que queremos responder com o experimento. Os principais testes de contrastes usados so o teste de Tukey (para nmero igual de rplicas), Student-Newman-Keuls (tambm chamado SNK ou Newman-Keuls), Scheff (para nmero diferente de rplicas), Dunnett (para comparaes com o controle), Bonferroni, Fisher-LSD e Duncan. Os trs primeiros so muito conservadores, ou seja, s indicam que h diferena significativa quando as estas diferenas forem grandes e/ou a variabilidade for pequena. Isto , a diferena mnima significativa (DMS) maior. Devem ser usados quando o coeficiente de variao (CV) for menor que 15%. Quando este for maior que 30% usam-se os testes de Fisher-LSD ou Duncan. Para a escolha dos testes post hoc deve-se considerar: O delineamento experimental As caractersticas dos dados (paramtricos ou no-paramtricos) O coeficiente de variao O tipo de erro que seria pior cometer: erro tipo I ou erro tipo II O nmero de tratamentos testados

Os testes SNK e Duncan podem ser usados aps analises de varincia no paramtrica (one way ou two way), mas o clculo feito com o grupo de rankings ao invs do grupo de mdias. Todos os testes de contrastes podem ser aplicados somente aps obter-se ANOVA (paramtrica ou no paramtrica) significativa.

13 Leitura recomendada Morris, T.R. 2002. Experimental design and analysis in animal science. Oxon, CABI Publishing, 208p. Ruxton, G.D. and Colegrave, N. 2003. Experimental design for the life sciences. Oxford, Oxford University Press, 114p. Scheiner, S.M. and Gurevitch, J. (ed.) 2001. Design and analysis of ecological experiments. 2nd ed., Oxford, Oxford University Press, 415p. Sokal, R. R. and Rohlf, F. J. 1995. Biometry. 3nd. ed., New York, W.H. Freeman and Company, 887p.