Reviso da Literatura

Sistema colinrgico: revisitando receptores, regulao e a relao com a doena de Alzheimer, esquizofrenia, epilepsia e tabagismo
Colinergic system: revisiting receptors, regulation and the relationship with Alzheimer disease, schizophrenia, epilepsy and smoking
ANa L. M. VENtURa1, PaULa A. ABREU1,2, RODRIGO C. C. FREItaS1, PLNIO C. SatHLER2, NatLIa LOUREIRO2, HELENa C. CaStRO2
Laboratrio de Neuroqumica da Universidade Federal Fluminense (UFF), Niteri, RJ. Laboratrio de Neuroqumica e Laboratrio de Antibiticos, Bioqumica e Modelagem Molecular (LABioMol) dos Programas de Ps-graduao em Neurocincias (EGB), e de Patologia (HUAP) da UFF, Niteri, RJ.
1 2

Recebido: 5/9/2007 Aceito: 13/5/2009

Resumo
Objetivo: Revisar a estrutura e o funcionamento do sistema colinrgico central ressaltando seu papel na fisiologia e na fisiopatologia das doenas de Alzheimer e Parkinson, esquizofrenia, epilepsia e tabagismo. Mtodo: Foi realizada uma pesquisa bibliogrfica no MedLine, LILACS, PubMed e ISI, e na Biblioteca da Fundao Oswaldo Cruz, RJ, selecionando-se o perodo de 1914 a 2009, utilizando os descritores: receptors, cholinergic, Alzheimer disease, schizophrenia, epilepsy e smoking, alm de referncias cruzadas dos artigos selecionados e anlise adicional de referncias na literatura especfica do tema. Resultados: Efeitos importantes da ativao de receptores colinrgicos nicotnicos e muscarnicos sobre o desenvolvimento do sistema nervoso central (SNC) tm sido descritos. A dessensibilizao e a internalizao dos receptores acoplados protena G mediadas pela ativao de protenas cinases tm sido descritas em proliferao, diferenciao e morte celular, alm de sndromes neuropsiquitricas. Concluso: As informaes produzidas a partir de estudos do sistema de neurotransmisso colinrgica podem auxiliar no desenvolvimento de medicamentos mais especficos para o tratamento da doena de Alzheimer, esquizofrenia, epilepsia e tabagismo. Ventura ALM, et al. / Rev Psiq Cln. 2010;37(2):66-72 Palavras-chave: Receptores colinrgicos, doena de Alzheimer, esquizofrenia, epilepsia, tabagismo.

Abstract
Objective: To review articles regarding important topics about cholinergic system and its ionotropic and G-protein coupled receptors as well as their regulation, also enlightening its importance in central nervous system (CNS) development and in several neuropsychiatric conditions such as Alzheimer disease, schizophrenia, epilepsy and smoking. Method: Bibliographical research was completed through MedLine, LILACS, PubMed, ISI and the Fundao Oswaldo Cruz Library, RJ, specifically for 1914 to 2009, using the descritors: receptors, cholinergic, Alzheimer disease, schizophrenia, epilepsy and smoking, in addition to the cross-reference of the articles selected and further analyses of bibliographical references on the theme. Results: Currently literature describes important effects of nicotinic and muscarinic receptors activation on development of central nervous system (CNS). The protein G coupled receptors dessensibilization and internalization mediated by kinases have been described in proliferation, differentiation and cell death, and also in neurologic disorders. Discussion: The importance of the cholinergic system and its relationship with pathologies such as Alzheimer disease, schizophrenia, epilepsy is evident. The data produced so far may help on planning medicaments more specific for these pathologies treatment. Ventura ALM, et al. / Rev Psiq Cln. 2010;37(2):66-72 Keywords: Receptors, cholinergic, Alzheimer disease, schizophrenia, epilepsy, smoking.

Introduo
A acetilcolina (Ach) um mediador qumico de sinapses no sistema nervoso central (SNC), no sistema nervoso perifrico e tambm na juno neuromuscular1. A Ach, seus receptores e o aparato enzimtico responsvel por sua sntese e degradao constituem o sistema de neurotransmisso colinrgica. O conhecimento desse sistema, principalmente das vias de sinalizao intracelular que se iniciam pela ativao dos receptores colinrgicos, tem sido utilizado no desenvolvimento de novos tratamentos para sndromes neurolgicas e psiquitricas. Nessas sndromes, observa-se uma disfuno do sistema de neurotransmisso colinrgica, como transtornos do humor e alguns tipos de esquizofrenia. O aumento de receptores colinrgicos na doena de Parkinson e a reduo destes no processo de envelhecimento do SNC, bem como na morte sbita infantil, tambm j foram descritos na literatura mdica.

A relao entre o sistema colinrgico e algumas doenas como a de Parkinson e a esquizofrenia ressalta a importncia do bom funcionamento desse sistema. Neste artigo, pretende-se rever o sistema colinrgico, seus receptores e sua regulao, bem como a participao de neurotransmissores e enzimas importantes no seu funcionamento. Foi includa nesta reviso a relao entre o sistema colinrgico e alguns quadros patolgicos importantes, como as doenas de Parkinson e de Alzheimer, a esquizofrenia, a epilepsia e o tabagismo.

Sntese, captao e liberao da acetilcolina

A Colina-O-Acetil-Transferase (ChAT) a enzima responsvel pela sntese da Ach a partir de acetil-coenzima A e colina. A glicerofosforilcolina, a fosforilcolina e a fosfatidilcolina geram a colina que utilizada como substrato e transportada para o SNC atravs da circulao sangunea. Assim, as fontes de colina para a sntese de

Endereo para correspondncia: Ana L. M. Ventura/Helena C. Castro. Rua Outeiro So Joo Batista. Universidade Federal Fluminense. Departamento de Neurobiologia, IB/CEG 24001-970 Niteri, RJ. Telefone: (21) 26292294/Fax: (21) 27195934. E-mails: almv@vm.uff.br e hcastrorangel@yahoo.com.br

Ventura ALM, et al. / Rev Psiq Cln. 2010;37(2):66-72

75

Ach provm da circulao, alm da sua recaptao aps a liberao e degradao desse neurotransmissor. Uma vez sintetizada, parte da Ach transportada e armazenada em vesculas sinpticas. Esse processo realizado por um transportador vesicular de Ach (VAChT), capaz de elevar em at 100 vezes sua concentrao no interior dessas vesculas. Aps ser liberada inteiramente por exocitose, a Ach interage especificamente com os receptores colinrgicos presentes nas membranas pr- e pssinpticas2,3. A ao da acetilcolina cessa quando hidrolisada em acetato e colina pela enzima acetilcolinesterase (AChE), presente na fenda sinptica. Atualmente existem descritos dois tipos de colinesterases que incluem: a) enzimas com alta afinidade para a Ach ligadas membrana neuronal e presentes em todas as sinapses colinrgicas; b) enzimas com alta afinidade para a butirilcolina, tambm chamadas de butiril-acetil-colinesterases (BchE) presentes em todos os tecidos (Figura 1).

Figura 1. Sntese, liberao, degradao e recaptao da acetilcolina na fenda sinptica. Transportador vesicular de acetilcolina (), transportador de colina () e receptor de acetilcolina (R).

A AChE a enzima de maior eficincia cataltica conhecida na atualidade e pode apresentar diferentes isoformas, que podem ser classificadas como globulares ou assimtricas, dependendo da sua conformao espacial. Todas essas formas apresentam uma alta taxa de hidrlise enzimtica, de aproximadamente 5.000 molculas de Ach/s4.

Receptores colinrgicos
Em 1914, Dale5 classificou as aes da Ach em muscarnicas e nicotnicas. Essa classificao foi baseada nos subtipos de receptores colinrgicos capazes de se ligar nicotina e muscarina, respectivamente, e que respondem ativao colinrgica com alta afinidade5.

receptores neuronais so constitudos por uma estequiometria geral de 23. Entretanto, 7, 8 e 9 podem formar homo-oligmeros constitudos por um nico tipo de subunidade. Em mamferos, 42 e o pentmero homomrico 7 tm propriedades diferentes. O 7, que liga com alta afinidade a -bungarotoxina (-BTX), uma neurotoxina de veneno de serpente, tem uma dessensibilizao rpida e reversvel e sua ativao promove um aumento da permeabilidade celular ao clcio8. J a principal caracterstica do 42 possuir alta afinidade por nicotina. Os RCNs so amplamente expressos no SNC. Os receptores 3 e 2 esto presentes no crtex, no tlamo, no hipocampo e no cerebelo. J o 4 expresso apenas no crtex e no cerebelo, enquanto o 7 expresso no crtex, no hipocampo e no tlamo. A estrutura das subunidades dos RCNs composta por: a) um domnio hidroflico na regio N-terminal, posicionado na poro extracelular e que apresenta o stio de glicosilao envolvido na ligao do agonista, bem como na regulao da dessensibilizao e permeabilidade inica; b) quatro segmentos hidrofbicos (19-27 aminocidos) formando os domnios transmembrana9 (Figura 2); c) um pequeno domnio hidroflico altamente varivel; d) um domnio C-terminal hidrofbico de aproximadamente 20 aminocidos10. e) alas intracelulares compreendidas entre os segmentos transmembranas possuem stios de fosforilao envolvidos no processo de dessensibilizao. Muitas drogas induzem a dessensibilizao indiretamente, aumentando os nveis de clcio intracelular que levam fosforilao por protenas cinases sensveis ao clcio. Os stios de ligao aos agonistas parecem estar localizados na regio de interface entre as subunidades, enquanto os stios para ligantes alostricos no competitivos localizam-se diretamente nas subunidades. Os RCNs localizados no crebro distribuem-se nas regies pr-, ps-, peri- e extrassinpticas, podendo modular a liberao de neurotransmissores e, consequentemente, a atividade sinptica neuronal. Os RCNs tm importncia em diversos processos, como o aprendizado e a memria, o desenvolvimento neuronal e participa do sistema de recompensa11. Essa versatilidade funcional se correlaciona com as diferentes estruturas que esses receptores possuem nas diversas reas do sistema nervoso. Como exemplos, podem-se citar receptores com subunidades 354 que regulam a transmisso ganglionar e receptores com a subunidade 4 que regulam parcialmente a liberao de dopamina e de glutamato. J receptores localizados na regio estriatal que possuem a subunidade 3 alteram a atividade motora por modular a liberao de dopamina, enquanto receptores com a subunidade 2 controlam a liberao de GABA e a resposta de neurnios dopaminrgicos no mesencfalo. Uma disfuno do gene que sintetiza a subunidade 2 responsvel pela atrofia do crtex e perda de neurnios, o que sugere que os RCNs estejam envolvidos em processos de sobrevivncia de neurnios, alm da fisiologia e manuteno dos circuitos sinpticos neuronais12.
A B

Receptores colinrgicos nicotnicos

Os receptores colinrgicos nicotnicos (RCN) pertencem famlia de receptores ionotrpicos que, quando ativados, adquirem a conformao de canal aberto permevel aos ons Na+ e K+6. Quando comparada transmisso sinptica induzida por receptores muscarnicos, nota-se que os RCNs medeiam uma transmisso excitatria rpida. Esses receptores so constitudos por cinco subunidades proteicas e esto distribudos em vrios tecidos, incluindo o crebro e o tecido muscular (Figura 2). Os RCNs presentes nos msculos so heteropentmeros constitu dos por subunidades , , , e (Figura 2), enquanto os receptores do crebro so formados por vrias subunidades 2-10 e 2-47. Estes

Figura 2. Receptor colinrgico nicotnico A Subunidades , , e . B Domnios presentes em cada subunidade: N-terminal hidroflico (1), quatro segmentos hidrofbicos transmembrana (2), domnio hidroflico varivel (3), C-terminal hidrofbico (4) e alas intracelulares formando stios de fosforilao (5).

76

Ventura ALM, et al. / Rev Psiq Cln. 2010;37(2):66-72

Os RCNs regulam a liberao e a ativao de neurotransmissores nas regies pr- e ps-sinpticas, respectivamente, podendo controlar a eficcia da transmisso sinptica. A atuao dos RCNs nos processos de memria e aprendizado indica sua participao na fisiopatologia e nos processos inflamatrios caractersticos da doena de Alzheimer13 e o uso simultneo de antagonistas nicotnicos e de receptores glutamatrgicos do tipo N-metil-D-aspartato (NMDA) tem atenuado ataques epilpticos induzidos em ratos e camundongos, o que sugere uma ntima relao entre os sistemas de neurotransmisso colinrgico e de NMDA na atividade excitatria do SNC14. O comprometimento da atividade cooperativa entre RCN e receptores dopaminrgicos na regio mesoestriatal pode estar envolvido em algumas disfunes neurolgicas que predispem pacientes doena de Parkinson15.

Receptores colinrgicos muscarnicos

Os receptores colinrgicos muscarnicos (RCMs) tambm so amplamente distribudos por diversos sistemas biolgicos, onde participam de vrias funes vitais3. A ativao desses receptores no sistema nervoso perifrico tem aes que incluem a reduo da frequncia e fora da contrao cardaca, o relaxamento de vasos sanguneos perifricos e a constrio das vias respiratrias (brnquios e bronquolos). No SNC, esto envolvidos no controle da funo extrapiramidal, vestibular, em funes cognitivas como memria, aprendizado e ateno, em respostas emocionais, na modulao do estresse, no sono e na viglia. O conhecimento das funes dos RCMs e de seus subtipos avanou consideravelmente aps a clonagem de seus cinco genes distintos (M1-M5) em clulas de mamferos16. Enquanto a expresso heterloga de RCMs em diferentes linhagens celulares favoreceu a descoberta das vias de sinalizao intracelular envolvidas, os anticorpos especficos permitiram a localizao tecidual e celular dos subtipos de RCMs em diferentes organismos. A identificao dos cinco genes que codificam os RCMs permitiu ainda a localizao dos stios de expresso de RNAm desses receptores em diferentes tecidos. A utilizao de agentes farmacolgicos seletivos para RCMs tem contribudo para o entendimento da funo e regulao desses receptores. Riker e Wescoe17 foram os primeiros a demonstrar a existncia de diferentes subtipos de RCMs, ao evidenciarem as propriedades cardiosseletivas da galamina, um antagonista muscarnico17. Em 1976, Barlow et al.18 demonstraram diferenas significativas nas propriedades farmacolgicas de RCMs entricos e atriais de cobaias, enquanto estudos sobre a seletividade da ligao de drogas a RCMs e suas diferenas funcionais no organismo contribuam para sua comprovao in vivo18. Entre os cinco subtipos de RCMs clonados (M1, M2, M3, M4, M5), apenas o subtipo M5 ainda no foi totalmente caracterizado no nvel farmacolgico e funcional. Todos os RCMs pertencem superfamlia de receptores acoplados protena G e estruturalmente so protenas de membrana contendo sete domnios transmembranares (Figura 3). Stios de ligao especficos para Ach, agonistas e antagonistas muscarnicos esto presentes na regio N-terminal e nas alas extracelulares. A presena de um ou mais stios de glicosilao no N-terminal, como nos receptores M2, refora a evidncia da localizao extracelular dessa poro da molcula19. Na regio intracelular, os RCMs conservam a regio C-terminal, alm de trs alas intracelulares (i1, i2 e i3)19. A diferena funcional na ativao dos diferentes subtipos de RCMs reside principalmente na constituio da ala i3 desses receptores (Figura 3). A i3 a regio dos receptores muscarnicos que interage com a protena G e apresenta variao na sequncia de aminocidos entre os RCMs. J as alas i1 e i2 so bastante conservadas em todos os subtipos. Os 18 primeiros aminocidos presentes na regio i3 dos receptores M2 e M4 possuem um alto grau de homologia enquanto, nos receptores M1, M3 e M5, essa regio idntica. Com base nesse padro de homologia, os RCMs foram divididos em dois grupos: a) receptores M1/M3/M5 e b) receptores M2/M420.

Figura 3. Receptor colinrgico muscarnico mostrando os sete domnios transmembrana e a ala de ligao protena G. Em zoom, parte da sequn cia de aminocidos dessa ala importante para a ligao protena G, revelando os aminocidos homlogos entre as classes de receptores M1, M3 e M5 e entre M2 e M4, marcados em cinza-claro. A variao da sequncia de aminocidos na ala i3 nos dois grupos de receptores muscarnicos provavelmente determina o acoplamento distinto protena G, justificando os diferentes mecanismos de regulao da resposta celular. Os receptores muscarnicos M1, M3 e M5, quando ativados por agonistas colinrgicos, acoplam-se preferencialmente com a protena Gq/11, induzem a ativao da fosfolipase C, que promove a hidrlise de fosfoinositdeos presentes na membrana e a produo de diacilglicerol e inositol trifosfato (segundos mensageiros)21. De forma diferenciada, os receptores muscarnicos M2 e M4, quando ativados, acoplam-se preferencialmente protena G inibitria, Gi/o, que inibe a atividade da adenilciclase e reduz os nveis intracelulares de AMP cclico22.

Os subtipos de receptores colinrgicos muscarnicos

Os RCMs apresentam caractersticas funcionais e de localizao que os diferenciam significativamente: Receptores M1: no SNC, constituem cerca de 50% dos RCMs presentes no hipocampo e foram localizados, por anlises de hibridizao in situ, na regio do giro denteado, no bulbo olfatrio, nas amgdalas e no crtex piriforme23. Recentemente, foi demonstrado que so estimulados por carbacol, um agonista colinrgico, e ativam as cinases reguladas por sinais extracelulares (ERKs) em fatias de hipocampo de camundongos. Isso foi confirmado pelo pr-tratamento com pirenzepina, um antagonista colinrgico, que aboliu a ativao das ERKs nessa regio do sistema nervoso. Estudos semelhantes demonstraram a deficincia na ativao das ERKs 1 e 2 em neurnios corticais de camundongos knockout para receptores M1. O inositol-1,4,5-trifosfato(IP3) uma molcula formada pela ao da fosfolipase C sobre fosfolipdios de membrana, atuando, portanto, como um segundo mensageiro. A induo da produo de IP3 por carbacol se mostrou 60% menor nos neurnios corticais dos camundongos knockout, quando comparada com neurnios de camundongos normais, sugerindo que a ativao das ERKs 1 e 2 induzida por carbacol mediada por receptores M1 acoplados ativao da fosfolipase C24. Receptores M2: no SNC, foram localizados principalmente em neurnios estriatais, no tegumento mesopontino e no ncleo motor do nervo craniano. A localizao da imunorreatividade para esse receptor semelhante ao padro de imunorreatividade para neurnios colinrgicos no SNC, o que aponta esse subtipo de receptor como um autorreceptor nesse tecido25.

Ventura ALM, et al. / Rev Psiq Cln. 2010;37(2):66-72

77

Estudos sobre a ao dos receptores M2 na fisiologia do corao mostram a ativao da xido ntrico sintase (eNOS) em micitos em vrias espcies. Entretanto, necessria a translocao dos receptores M2 e da eNOS para compartimentos subcelulares especializados, chamados cavolas, para viabilizar esse processo. A produo de xido ntrico induzida pelos receptores M2 pode ser um dos fatores que contribui para a resposta ionotrpica negativa geralmente observada aps estimulao colinrgica do tecido cardaco. A ativao de receptores M2 reduz a fora de contrao e tambm a frequncia de batimentos cardacos em cobaias, o que est associado inibio de canais de Ca2+ voltagem dependente e ativao de canais retificadores de K+ atravs da estimulao da Gi/o22. Wang et al.26 mostraram a relao entre a ativao de receptores M2 e a regulao de canais inicos de clcio e de cloreto26. A estimulao de receptores M2 transfectados transitoriamente em ocitos de Xenopus promoveu a abertura de canais de Cl- dependentes de voltagem, um efeito dependente da ativao da PI-3-cinase, demonstrando uma nova via de sinalizao intracelular iniciada por receptores M2. Essa via pode ser alternativa ao tradicional acoplamento desse subtipo de receptor via Gi/o. Receptores M3: segundo anlises de imunocitoqumica, hibridizao in situ e autorradiografia, esto presentes em vrias regies cerebrais que incluem o ncleo estriado, hipocampo, ncleo talmico anterior, colculo superior, ncleo pontiforme, regio lmbica cortical e camadas superficiais do neocrtex23. Os dados sugerem que esses receptores medeiam vrios processos colinrgicos no crebro que incluem a formao de memria, aprendizado, o controle da funo motora e o comportamento social. Os receptores M3 expressos transitoriamente em clulas CHO, uma linhagem celular produzida a partir do ovrio de hamster chins, tambm esto envolvidos na ativao de protenas cinases ativadas por mitgenos (MAPKs), uma vez que agonistas como oxotremorine-M e pilocarpina mimetizam a ativao dessa enzima induzida por acetilcolina. Esse efeito bloqueado por inibidores de protena cinase-dependente de clcio (PKC) e mimetizado por agonistas seletivos para receptores M1 e M5, sugerindo que nessas clulas a via de sinalizao intracelular para ativar as MAPKs integra a ativao dos subtipos de receptores muscarnicos M1, M3 e M5, bem como sua consequente mobilizao de IP3 e da PKC27. Receptores M4: so abundantes em neurnios estriatais de ratos, mas tambm esto presentes no hipocampo de roedores. Compem importantes vias de sinalizao inibitria ou estimulatria para a formao da memria, juntamente com receptores M1 e M223. De forma interessante, o RNAm para os receptores M4 foi localizado no ncleo caudado, putmen e nas camadas plexiformes do bulbo olfatrio. Kimura e Baughman28 demonstraram que receptores M4 modulam negativamente potenciais ps-sinpticos excitatrios em neurnios corticais de ratos, uma vez que antagonistas especficos de receptores M4 bloqueiam a inibio da acetilcolina sobre esses potenciais28. Eles ainda observaram que receptores M1 modulam negativamente os potenciais ps-sinpticos inibitrios desses neurnios. Dessa forma, a separao das aes da acetilcolina no crtex cerebral, atravs da discriminao de seus subtipos de receptores, favorece a interveno farmacolgica seletiva em alguns distrbios neurolgicos que envolvem a neurotransmisso colinrgica. Receptores M5: so os menos caracterizados quando comparados com os demais subtipos. A sua localizao no SNC determinada principalmente pela distribuio do seu RNAm. Algumas evidncias demonstram a existncia de expresso endgena de receptores M5 em clulas do melanoma humano A2058. Essas clulas so um modelo de estudo em potencial para a sinalizao intracelular iniciada pelos receptores M5, visto que sua estimulao produz tanto a liberao de cido araquidnico quanto a inibio do acmulo de AMP-cclico (AMPc) induzido por forscolina, um ativador de adenilciclase. A linhagem de clulas da leucemia eosinoflica (EoL-1) outro sistema celular que pode ser utilizado para o estudo dos receptores M5 endgenos. Nessas clulas, a expresso de RNAm para receptores M5 e M3 aumentada na presena de interferon, o que necessrio para a diferenciao das clulas EoL-1 em macrfagos maturos29.

Regulao de receptores acoplados protena G

Atualmente, os trs mecanismos de regulao da resposta celular induzida por ativao de receptores acoplados protena G so: i) a dessensibilizao, ii) a internalizao ou sequestro de receptores, e iii) a diminuio do nmero de receptores ou downregulation30.

Dessensibilizao
A dessensibilizao est diretamente relacionada com a diminuio na gerao de segundos mensageiros induzida pela ativao do receptor pelo agonista e tem como pr-requisitos: i) ativao prolongada do receptor por seu agonista, ii) fosforilao do receptor por protenas cinases dependentes de receptores acoplados protena G (GRKs) ou dependentes de segundos mensageiros como a PKA ou PKC e iii) ligao ao receptor de uma classe de protenas citoslicas, as arrestinas31. Na dessensibilizao, a diminuio da capacidade responsiva do receptor ocupado pelo agonista pode ocorrer afetando (dessensibilizao heterloga fosforilao dos receptores pelas protenas cinases dependentes de segundos mensageiros) ou no (dessensibilizao homloga ativao de GRKs) outros receptores no estimulados e presentes na mesma clula32.

Internalizao e reciclagem
O processo de internalizao ou sequestro de receptores acoplados protena G mais um nvel de regulao da atividade desses receptores quando estimulados pelo agonista. Estudos utilizando o receptor 2-adrenrgico como modelo tm demonstrado que a exposio ao agonista promove a translocao desses receptores da superfcie celular para compartimentos intracelulares30. A internalizao de receptores no s um mecanismo para a dessensibilizao, mas tambm para sua ressensibilizao desses receptores30. A recuperao da atividade de receptores se d principalmente por um processo de reciclagem dos receptores previamente internalizados, que parece ser constitutivo na maioria das clulas. Nessa reciclagem, os receptores fosforilados pelas GRKs e internalizados em vesculas intracelulares so defosforilados por fosfatases, que tm sua ao favorecida pela diminuio do pH das vesculas. Os receptores so ento posteriormente reinseridos na membrana, onde se tornam aptos para um novo ciclo de regulao30. A internalizao de receptores acoplados protena G influi diretamente na distribuio celular e subcelular desses receptores. Essa distribuio pode ser determinada por quatro vias de trfego intracelular. Geralmente, os receptores recm-sintetizados provenientes do complexo de Golgi so direcionados para a superfcie celular. Entretanto, alm de compor um estoque de reserva intracelular, os receptores presentes nos endossomas podem ser reciclados para a membrana plasmtica ou seguir para a fuso com lisossomas, onde sero degradados. Nas clulas no estimuladas por agonistas, esse trfego intracelular de receptores se apresenta relativamente lento, sendo drasticamente acelerado na presena de agonistas. A literatura descreve duas vias de internalizao de receptores acoplados protena G mediada por: a) clatrina e b) cavolas. A via mediada por clatrina tem sido a mais estudada, sendo comprovada experimentalmente como responsvel pela internalizao de vrios receptores, incluindo os receptores 2-adrenrgicos, muscarnicos e de endotelina A33. Goodman et al.34 observaram que a ligao da arrestina ao receptor fosforilado promove o recrutamento e a ligao da protena clatrina a esse complexo (Figura 4), que se polimeriza, promovendo o recobrimento da membrana e a formao de vesculas intracelulares contendo complexos proteicos que incluem o receptor, a arrestina e protenas cinases34. Recentemente, foi demonstrada que a arrestina pode promover o recrutamento de enzimas tirosina-cinases da famlia das Src e, consequentemente, induzir a formao do complexo receptor acoplado protena G-tirosina-cinase Src. A ativao da tirosina cinase Src essencial para a ativao de protenas cinases ativadas por mitgenos (MAPKs). A internalizao de receptores acoplados protena G induzida por seus agonistas especficos via

78
Acetilcolina Receptor muscarnico

Ventura ALM, et al. / Rev Psiq Cln. 2010;37(2):66-72

Figura 4. Regulao do receptor muscarnico acoplado protena G, ressaltando os mecanismos de dessensibilizao (1), internalizao via clatrina (2), ressensibilizao (3) e internalizao via cavolas (4). clatrina aparentemente regula a resposta celular diante do estmulo do agonista, promovendo uma segunda onda de sinalizao celular envolvendo a ativao das MAPKs. Recentemente, tem sido observada a correlao funcional entre a internalizao e a transduo de sinal induzida por diversos receptores de neurotransmissores, incluindo aqueles acoplados protena G, em pequenas invaginaes vesiculares (50-100 nm) da membrana plasmtica, denominadas cavolas (Figura 4). Essas estruturas funcionam como subcompartimentos da membrana celular especializados no trfego de protenas e em mecanismos de transduo de sinal mediados por receptores.

Downregulation
Enquanto a dessensibilizao refere-se diminuio da atividade dos receptores sem alterao do seu nmero total, a downregulation implica a diminuio de receptores por meio da reduo da sntese, da internalizao com degradao em lisossomos ou degradao no lisossmica de receptores35. Diferentes mecanismos podem induzir downregulation, incluindo a modulao da expresso gnica. Experimentos revelam que o nmero de receptores presentes em uma clula pode ser regulado por meio do nvel de expresso gnica, bem como o de biossntese e de degradao destes. possvel observar ainda a diminuio dos receptores M2 e M4 presente nos dendritos como tambm a diminuio de receptores M2 aderidos membrana, aps uma estimulao neuronal colinrgica crnica, indicando que esses receptores foram downregulados. A diminuio do RNAm de receptores M2 no ncleo basal de Meynart e em neurnios estriatais de camundongo cujos nveis de ACh so cronicamente elevados explica parcialmente a perda dos receptores M4 dos dendritos35. A downregulation pode resultar em um aumento da prote lise de protenas G acopladas a receptores. Para os receptores 2-adrenrgicos, acredita-se que a protelise o mecanismo de downregulation predominante35.

Doenas relacionadas ao sistema colinrgico

Doena de Alzheimer: a relao entre o sistema colinrgico e a demncia do tipo Alzheimer tem sido explorada desde os anos 1980. Essa uma doena neurodegenerativa de instalao insidiosa e progressiva. Modificaes neuroqumicas primrias no sistema colinrgico tm sido observadas em crebros de doentes de Alzheimer, sugerindo uma disfuno colinrgica envolvida nas alteraes de memria, aprendizagem, ateno e outros processos cognitivos comuns afeta-

dos nesses pacientes36. Alteraes tanto na quantidade de receptores muscarnicos em diversas regies cerebrais quanto na sinalizao intracelular induzida por esses receptores, como a presena de altas concentraes de uma protena denominada inibidor endgeno de baixo peso molecular (IEBP), j foram descritas. O IEBP proporciona um antagonismo endgeno aos receptores colinrgicos muscarnicos nesses pacientes que parece se relacionar s manifestaes clnicas observadas nessa neuropatia degenerativa. O tratamento da doena de Alzheimer requer intervenes farmacolgicas visando sua fisiopatologia especfica e este inclui o uso de agentes farmacolgicos que melhoram os sintomas especficos (como iluses e distrbios do sono) e intervenes comportamentais que possam melhorar os sintomas e as atividades dirias do paciente. Os inibidores da AChE (tacrina e donepezil) que permitem um aumento nos nveis cerebrais de acetilcolina37 e recentemente um antagonista no competitivo de receptor de NMDA (memantina), o qual est indicado para as formas moderadas a graves da doena, so os nicos frmacos atualmente aprovados pelo FDA (U.S. Food and Drug Administration) para o tratamento da doena de Alzheimer. Estudos demonstram que a tacrina eficaz no apenas em melhorar a cognio, mas tambm os distrbios neuropsiquitricos dos pacientes como apatia e ansiedade. Por ser hepatotxica, necessita-se de realizao de provas de funo heptica e ajustes da dose. O donepezil apresenta menos efeitos colaterais e no exige monitorizao bioqumica para disfuno heptica38. Os efeitos colaterais desses medicamentos incluem nuseas, vmitos, diarreia, bradicardia e tontura relacionados com a dose. As contraindicaes ao tratamento com inibidores da colinesterase incluem hepatopatia, alcoolismo, doena ulcerosa pptica, doena pulmonar obstrutiva crnica e bradicardia. Tais agentes podem estabilizar o estado do paciente por um perodo de meses. Uma depresso leve a moderada comum nos estgios iniciais da doena e pode responder medicao antidepressiva, como os inibidores seletivos da recaptao da serotonina (ISRS) e antidepressivos tricclicos com baixos efeitos colaterais anticolinrgicos (desipramina e nortriptilina). As convulses generalizadas devem ser tratadas com anticonvulsivantes apropriados, como fenitona ou carbamazepina, enquanto a agitao pode ser tratada com fenotiazinas (como tioridazina), haloperidol, risperidona e benzodiazepnicos (como lorazepam). O haloperidol em baixas doses, a trazona, a buspirona, o propranolol e a olanzapina podem ser os mais teis como tambm os que apresentam menos efeitos colaterais38. As intervenes comportamentais so essenciais no tratamento dos pacientes com doena de Alzheimer. O controle do ambiente, com o propsito de manter a casa do paciente segura e facilitar a locomoo interna, pode ajud-lo. Epilepsia: a epilepsia no lobo frontal resultado de uma mutao da serina 248 por uma fenilalanina na subunidade 4 do domnio transmembrana do receptor nicotnico, o que leva a uma reduo da permeabilidade ao clcio, reduo na abertura do canal e rpida dessensibilizao39. A concentrao de agonista capaz de induzir a dessensibilizao desses receptores mutantes 3 mil vezes mais baixa. Nos pacientes com epilepsia, a rpida dessensibilizao de RCN 7 aumenta enormemente. A mutao da leucina 250 pela threonina em receptores 7 conhecidos por reduzir a dessensibilizao do canal aumenta a sensibilidade apreenso induzida por nicotina em ratos, o que sugere um papel importante da dessensibilizao do RCN 7 nos modelos de epilepsia. A carbamazepina ou a fenitona so atualmente os frmacos de escolha inicial para o tratamento das convulses parciais14, incluindo as que apresentam generalizao secundria. O uso da fenitona em longo prazo associa-se com efeitos estticos indesejveis como hirsutismo, feies grosseiras e hipertrofia gengival. A carbamazepina pode causar leucopenia, anemia aplsica ou hepatotoxicidade. O cido valproico uma alternativa eficaz para alguns pacientes com convulses parciais, especialmente com generalizao secundria e raramente causa supresso reversvel da medula ssea e hepatotoxicidade. A lobectomia temporal ainda tem sido um tratamento de escolha para os casos resistentes a frmacos.

Ventura ALM, et al. / Rev Psiq Cln. 2010;37(2):66-72

79

Tabagismo: a nicotina presente no tabaco um agonista seletivo de RCN e, assim como outras drogas capazes de causar dependncia, est diretamente envolvida na liberao de dopamina na regio mesolmbica. A tolerncia nicotina observada em fumantes, bem como os sintomas de abstinncia, ocorre por dessensibilizao e upregulation dos RCNs aps a exposio crnica. A nicotina chega s sinapses neurais atravs da barreira hematoenceflica, alcanando concentraes de 50-600 nM, que muito menor do que as concentraes fisiolgicas de ACh necessrias para gerar um potencial de ao (1 mM). Entretanto, a nicotina persiste por no ser degradada pela AChE e essa exposio prolongada pode promover dessensibilizao aps ativao transiente40. O uso crnico da nicotina pode resultar em um aumento do nmero de receptores associado a uma desativao funcional, o que se sugere ser o mecanismo responsvel pelos efeitos de dependncia nicotina40. Trs medicamentos so aprovados pela Food and Drug Administration para o tratamento do tabagismo: a nicotina, a bupropiona e a vareniclina41. Alm desses, a nortriptilina e clonidina mostraram-se mais eficientes do que placebo em ensaios clnicos controlados. H cinco produtos para reposio de nicotina: goma de mascar, pastilhas e comprimidos, sistemas adesivos transdrmicos, inalador e spray. Os efeitos da goma de mascar so basicamente locais e incluem fadiga mandibular, irritao da boca e da garganta, desconforto gstrico e soluos. Os sistemas transdrmicos so aplicados pela manh e removidos na manh seguinte ou ao deitar-se, dependendo do produto. O spray nasal de nicotina pode causar irritao local do nariz, o que comumente provoca sensao de queimao, espirros e lacrimejamento no incio do tratamento, mas sobrevm tolerncia a esses efeitos em um a dois dias. O inalador fornece nicotina garganta e s vias areas superiores, de onde absorvida da mesma forma como na goma de mascar, sendo comercializado como um dispositivo de plstico em forma de cigarro, sendo usado sem restrio. A bupropiona, tambm comercializada como antidepressivo, pode ser associada ao uso do adesivo de nicotina. Os antidepressivos so mais eficazes naqueles com antecedentes de sintomas de depresso41. No entanto, apesar de evidncias mostrarem a eficcia desses medicamentos, a maioria dos pacientes no adere totalmente ao tratamento e, portanto, novas opes teraputicas so necessrias. O tartrato de vareniclina uma nova droga produzida a partir de um alcaloide natural da planta Cytisus laburnum, a cistisina. Com efeito de agonista parcial dos receptores nicotnicos neuronais 42, a vareniclina foi desenvolvida especialmente para o tratamento do tabagismo. Esse composto se liga com elevada afinidade e seletividade aos nAChR 42, onde atua como agonista parcial, possuindo tanto atividade de agonista, com eficcia intrnseca inferior da nicotina, como atividade antagonista na presena da nicotina42. Estudos eletrofisiolgicos e neuroqumicos demonstraram que a vareniclina, quando se liga aos receptores nicotnicos neuronais 42 da acetilcolina, estimula a atividade mediada por estes, mas a um nvel significativamente inferior ao da nicotina, uma vez que esta compete por um mesmo stio de ligao no receptor nAChR 42, para o qual a vareniclina tem a maior afinidade. Assim, a vareniclina pode efetivamente bloquear a capacidade da nicotina de ativar completamente os receptores 42 e o sistema mesolmbico dopaminrgico43. A eficcia da vareniclina na cessao tabgica resulta da atividade agonista parcial desta sobre os receptores nicotnicos 42, nos quais a sua ligao produz um efeito suficiente para aliviar os sintomas de abstinncia e dependncia (atividade agonista) e simultaneamente resulta na reduo dos efeitos compensatrios e de reforo do tabaco, pela preveno da ligao da nicotina aos receptores 42 (atividade antagonista)43. Essa droga absorvida bem via oral, atingindo concentraes plasmticas em 2 a 4 horas. Sua vida mdia de 20 a 30 horas, sendo eliminada 80% na urina aps a metabolizao. Esquizofrenia: O envolvimento dos RCNs na esquizofrenia foi sugerido devido grande proporo de esquizofrnicos fumantes (90%), em comparao com os 30% de fumantes na populao geral9. Altos nveis de anticorpos anti-RCN foram encontrados em pacientes com esquizofrenia, o que poderia contribuir para a reduo no nme-

ro de receptores observado. O uso de nicotina nesses pacientes pode ser uma tentativa de compensar a reduo na neurotransmisso em RCN e pode auxiliar os pacientes a compensar o dficit cognitivo e os distrbios de ateno. O defeito est relacionado ao polimorfismo no cromossomo 15, que lcus para a subunidade 7. Alm disso, observada uma reduo da subunidade 7 no crtex frontal nesses pacientes, o que refora sua importncia na esquizofrenia. Apesar do envolvimento de receptores colinrgicos nessa doena, os antipsicticos so considerados a base do tratamento agudo e de manuteno da esquizofrenia. O bloqueio do receptor dopaminrgico do sistema lmbico e dos ncleos da base parece ser um elemento fundamental, uma vez que as potncias clnicas dos antipsicticos tradicionais, como o haloperidol e a clorpromazina, acompanham suas afinidades pelo receptor D2 de dopamina e, mesmo os agentes mais novos, os chamados atpicos, em funo do menor espectro de efeitos colaterais, exercem algum grau de bloqueio no receptor D2. Contudo, a eficcia clnica dos neurolpticos atpicos pode envolver o bloqueio dos receptores dopaminrgicos D1, D3 e D4, a atividade 1 e 2-noradrenrgica e/ou a alterao da relao entre a atividade dos receptores 5HT2 e D244. A farmacoterapia inicial da psicose deve comear com a administrao de agentes antipsicticos atpicos, tais como a clozapina, a risperidona, a olanzapina ou a quetiapina45. Contudo, o antipsictico atpico padro a clozapina, um dibenzodiazepnico de potncia maior em bloquear o receptor 5HT2 em relao ao D2, e uma afinidade muito mais alta pelo receptor D4 do que pelo D246. A principal desvantagem desse medicamento o risco de discrasia sangunea, o que requer monitorizao regular com hemograma completo. A clozapina aumenta a atividade do gene precoce-imediato c-fos no crtex pr-frontal, a regio neuroanatmica que tem a concentrao mais alta de receptores D4, sendo uma rea que se acredita mediar as funes executivas especficas que so proeminentemente prejudicadas na esquizofrenia. Esses agentes so mais eficazes no tratamento dos sintomas psicticos negativos da esquizofrenia, como apatia e anergia, e na melhora da funo cognitiva45, alm de ser mais efetivos para o tratamento de pacientes refratrios. Os antipsicticos podem causar uma ampla gama de efeitos colaterais, incluindo letargia, ganho ponderal, hipotenso postural, priso de ventre, boca seca, aumento de secreo de prolactina, prolongamento do intervalo QTc no eletrocardiograma e discinesia tardia. O fator limitante mais frequente da posologia dos agentes antipsicticos o aparecimento de efeitos colaterais extrapiramidais, como distonia, acatisia e parkinsonismo. O tratamento farmacolgico da esquizofrenia insuficiente, sendo necessrio um modelo de tratamento envolvendo uma equipe multidisciplinar.

Consideraes finais
A importncia do sistema de neurotransmisso colinrgica tem sido significativamente evidenciada, visto sua relao com algumas doenas do SNC. As alteraes neuropsiquitricas que envolvem disfunes desse sistema podem ser observadas em quadros patolgicos atualmente de considervel incidncia, como doena de Alzheimer. Neste trabalho, procurou-se ressaltar o entendimento desse sistema para permitir um tratamento mais especfico para doenas de sintomatologias to diversas, sendo ainda necessrias mais informaes que orientem a gerao de medicamentos mais especficos para o tratamento dessas patologias.

Referncias
1. Bruneau EG, Akaaboune M. Running to stand still: ionotropic receptor dynamics at central and peripheral synapses. Mol Neurobiol. 2006;34(2):137-51. 2. Fujii T, Takada-Takatori Y, Kawashima K. Basic and clinical aspects of non-neuronal acetylcholine: expression of an independent, non-neuronal cholinergic system in lymphocytes and its clinical significance in immunotherapy. J Pharmacol Sci. 2008;106(2):186-92. 3. Taylor P, Brown JH. Nicotinic receptors. In: Siegel GJ, Agranoff BW, Albers RW, editors. Basic neurochemistry: molecular, cellular, and medical aspects (Philadelphia): Raven Press; 1994. p. 248-54.

80

Ventura ALM, et al. / Rev Psiq Cln. 2010;37(2):66-72 26. Wang YX, Dhulipala PD, Li L, Benovic JL, Kotlikoff MI. Coupling of M2 muscarinic receptors to membrane ion channels via phosphoinositide 3-kinase gamma and atypical protein kinase C. J Biol Chem. 1999;274(20):13859-64. 27. Wotta DR, Wattenberg EV, Langason RB, El-Fakahany EE. M1, M3 and M5 muscarinic receptors stimulate mitogen-activated protein kinase. Pharmacology. 1998;56(4):175-86. 28. Kimura F, Baughman RW. Distinct muscarinic receptor subtypes suppress excitatory and inhibitory synaptic responses in cortical neurons. J Neurophysiol. 1997;77(2):709-16. 29. Mita Y, Dobashi, K, Suzuki K, Mori M, Nakazawa T. Induction of muscarinic receptor subtypes in monocytic/macrophagic cells differentiated from eol-1 cells. Eur J Pharmacol. 1996;297(1-2):121-7. 30. Krupnick JG, Benovic JL. The role of receptor kinases and arrestins in G protein-coupled receptor regulation. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 1998;38:289-319. 31. Scarselli M, Donaldson JG. Constitutive internalization of G proteincoupled receptors and G proteins via clathrin-independent endocytosis. J Biol Chem. 2009;284(6):3577-85. 32. Chuang TT, Iacovelli L, Sallese M, De Blasi A. G protein-coupled receptors: heterologous regulation of homologous desensitization and its implications. Trends Pharmacol Sci. 1996;17(11):416-21. 33. Reinera C, Nathanson NM. The internalization of the M2 and M4 muscarinic acetylcholine receptors involves distinct subsets of small G-proteins. Life Sci. 2008;82(13-14):718-27. 34. Goodman OB, Krupnick JG, Gurevich VV, Benovic JL, Keen JH. Arrestin/ clathrin interaction. Localization of the arrestin binding locus to the clathrin terminal domain. J Biol Chem. 1997;272(23):15017-22. 35. Bernard V, Dcossas M, Liste I, Bloch B. Intraneuronal trafficking of G-protein-coupled receptors in vivo. Trends Neurosci. 2006;29(3):140-7. 36. Cummings JL, Back C. The cholinergic hypothesis of neuropsychiatric symptons in alzheimer disease. Am J Geriatr Psychiatry. 1998;6:64-78. 37. Weinreb O, Mandel S, Bar-Am O, Yogev-Falach M, Avramovich-Tirosh Y, Amit T, et al. Multifunctional neuroprotective derivatives of rasagiline as anti-Alzheimers disease drugs. Neurotherapeutics. 2009;6(1):163-74. 38. Clark CM, Karlawish JHT. Alzheimer disease: current concepts and emerging diagnostic and therapeutic strategies. Ann Intern Med. 2003;138(5):400-10. 39. Puttfarcken PS, Jacobs I, Faltynek CR. Characterization of nicotinic acetylcholine receptor-mediated [(3)H]-dopamine release from rat cortex and striatum. Neuropharmacology. 2000;39(13):2673-80. 40. Dani JA, Biasi MD. Cellular mechanisms of nicotine addiction. Pharmacol Biochem Behav. 2001;70(4):439-46. 41. Fiore MC. US public health service clinical practice guideline: treating tobacco use and dependence. Respir Care. 2000;45(10):1200-62. 42. Wang C, Xiao D, Chan KP, Pothirat C, Garza D, Davies S. Varenicline for smoking cessation: a placebo-controlled, randomized study. Respirology. 2009;14(3):384-92. 43. Oncken C, Gonzales D, Nides M, Rennard S, Watsky E, Billing CB, et al. Efficacy and safety of the novel selective nicotinic acetylcholine receptor partial agonist, varenicline, for smoking cessation. Arch Intern Med. 2006;166(15):1571-77. 44. Bymaster FP, Hemrick-Luecke SK, Perry KW, Fuller RW. Neurochemical evidence for antagonism by olanzapine of dopamine, serotonin, alpha 1-adrenergic and muscarinic receptors in vivo in rats. Psychopharmacology. 1996;124(1-2):87-94. 45. Tandon R, Milner K, Jibson MD. Antipsychotics from theory to practice: integrating clinical and basic data. J Clin Psychiatry. 1999;60:21-8. 46. Tiihonen J, Wahlbeck K, Kiviniemi V. The efficacy of lamotrigine in clozapine-resistant schizophrenia: a systematic review and meta-analysis. Schizophr Res. 2009;109(1-3):10-4.

4. Js AS, Franciscato C, Sonego F, Figueir M, Thiesen FV, Garcia SC, et al. Sensitivity of young rats to nicotine exposure: Physiological and biochemical parameters. Ecotoxicol Environ Saf. 2009;72(1):242-7. 5. Dale HH. The action of certain esters and ethers of choline, and their relation to muscarine. J Pharmacol Exp Ther. 1914;6:147-90. 6. Cox BC, Marritt AM, Perry DC, Kellar KJ. Transport of multiple nicotinic acetylcholine receptors in the rat optic nerve: high densities of receptors containing 6 and 3 subunits. J Neurochem. 2008;105(5):1924-38. 7. Millar NS, Gotti C. Diversity of vertebrate nicotinic acetylcholine receptors. Neuropharmacology. 2009;56(1):237-46. 8. Albuquerque EX, Pereira EF, Castro NG, Alkondon M, Reinhardt S, Schroder H, et al. Nicotinic receptor function in the mammalian central nervous system. Ann NY Acad Sci. 1995;757:48-72. 9. Wang H, Sun X. Desensitized nicotinic receptors in brain. Brain Res Brain Res Rev. 2005;48(3):420-37. 10. Pacheco MA, Pastoor TE, Wecker L. Phosphorylation of the alpha4 subunit of human alpha4beta2 nicotinic receptors: role of cAMP-dependent protein kinase (PKA) and protein kinase C (PKC). Brain Res Mol Brain Res. 2003;114(1):65-72. 11. Gopalakrishnan M, Molinari EJ, Sullivan JP. Regulation of human alpha4beta2 neuronal nicotinic acetylcholine receptors by cholinergic channel ligands and second messenger pathways. Mol Pharmacol. 1997;52(3):524-34. 12. Quick MW, Lester RA. Desensitization of neuronal nicotinic receptors, J Neurobiol. 2002;53(4):457-78. 13. Albuquerque EX, Pereira EF, Alkondon M, Rogers SW. Mammalian nicotinic acetylcholine receptors: from structure to function. Physiol Rev. 2009;89(1):73-120. 14. Lscher W, Klotz U, Zimprich F, Schmidt D. The clinical impact of pharmacogenetics on the treatment of epilepsy. Epilepsia. 2009;50(1):1-23. 15. Zhou C, Wen ZX, Wang ZP, Guo X, Shi DM, Zuo HC, et al. Green fluorescent protein-labeled mapping of neural stem cells migrating towards damaged areas in the adult central nervous system. Cell Biol Int. 2003;27(11):943-5. 16. Langmead CJ, Watsona J, Reavilla C. Muscarinic acetylcholine receptors as CNS drug targets. Pharmacol Ther. 2008;117(2):232-43. 17. Riker WF, Wescoe WC. The pharmacology of flaxedil with observations on certain analogs. Ann Ny Acad Sci. 1951;54:373-94. 18. Barlow RB, Berry KJ, Glenton PAM, Nikolau NM, Soh KSA. A comparison of affinity constants for muscarine-sensitive acetylcholine receptors in guinea-pig atrial pacemaker cells at 29 degrees C and in ileum at 29 degrees C and 37 degrees C. Br J Pharmacol. 1976;58(4):613-20. 19. Van Koppen CJ, Nathanson NM. The cysteine residue in the carboxylterminal domain of the M2 muscarinic acetylcholine receptor is not required for receptor-mediated inhibition of adenylate cyclase. J Neurochem. 1991;57(6):1873-7. 20. Wess J. Molecular basis of muscarinic acetylcholine receptor function. Trends Pharmacol Sci. 1993;14(8):308-13. 21. Sandiford S, Slepak V. G5-RGS7 selectively inhibits muscarinic M3 receptor signaling via the interaction between the third intracellular loop of the receptor and the DEP domain of RGS7. Biochemistry. 2009;48(10):2282-9. 22. Caulfield MP. Muscarinic receptors-characterization, coupling and function. Pharmacol Ther. 1993;58(3):319-79. 23. Levey AI, Edmunds SM, Heilman CJ, Desmond TJ, Frey KA. Localization of muscarinic M3 receptor protein and M3 receptor binding in rat brain. Neuroscience. 1994;63(1):207-21. 24. Hamilton E, Nathanson NM. The M1 receptor is required for muscarinic activation of mitogen-activated protein (MAP) kinase in murine cerebral cortical neurons. J Biol Chem. 2001;276(19):15850-3. 25. Levey AI, Kitt CA, Simonds WF, Price DL, Brann MR. Identification and localization of muscarinic acetylcholine receptor proteins in brain with subtype-specific antibodies. J Neurosci. 1991;11(10):3218-26.