Stress oxidativo em leveduras : Avaliao de peroxidao lipdica pelo mtodo TBARS

ThioBarbituric Acid Reactive Substances (TBARS) so substancias naturais presentes em amostras biolgicas e incluem hidroperxidos lipdicos e aldedos que aumentam de concentrao em resposta ao stress oxidativo. Os valores do ensaio TBARS so normalmente reportados em equivalentes de malonaldedos (MDA), um composto resultante da decomposio de perxidos de acidos gordos polinsaturados. O ensaio TBARS um mtodo simples para quantificar este perxidos lipdicos, apesar de ser criticado pela sua reactividade com outros compostos para alm do MDA. Este ensaio baseado na reao do cido 2-tiobarbitrico com MDA a 25C. Uma molcula de MDA condensa com 2 molculas de TBA e origina um cromforo com mximo de absoro a 532 nm.

Leveduras sero sujeitas a condies de stress oxidativo e a peroxidao lipdica comparada pelo mtodo TBARS com condies controlo.

Material e reagentes 20 mM Na Fosfato pH 7.2 20 mM NaH2PO4.H2O: 0.276 g / 100 ml 20 mM Na2HPO4.2H2O: 0.356 g / 100 ml 100% TCA (cido tricloroactico) Soluo de TBA cido tricloroactico 100% -1.5 mL TBA (cido 2-tiobarbiturico) - 37.5 mg HCl 1M - 2.5 mL H2O at 10 mL 50 mM BHT (hidroxitolueno butilado): 5.51 mg (dissolvido em 500 l etanol) 0.1M EDTA Micropipetas Tubos eppendorf Vortex Microcentrfuga Prolas de zircnio Placa de aquecimento Espectrofotmetro

Mtodo 1. Crescer clulas de levedura em meio YPD a 26C at OD600 = 0.75 (fase exponencial). 2. Submeter as clulas s seguintes condies de stress: Amostra 1: 50 ml de cultura (controlo) Amostra 2: 50 ml de cultura + 26 l H2O2 (conc. final: 5 mM) 3. Incubar as clulas a 26C durante 30 min. NOTA: manter as amostras a 4C a partir deste ponto. 4. Centrifugar as clulas a 4000 rpm, 5 min. 5. Ressuspender o pellet em 1 ml 50 mM NaK Fosfato 0.1 mM EDTA pH 7.0 6. Centrifugar a 13000 rpm, 1 min, e rejeitar o sobrenadante.

Lise das clulas 1. Ressuspender o pellet em 250 l tampo 20 mM Na fosfato pH 7.2 e adicionar prolas de zircnio. Agitar num vortex 3 x 1 min. 2. Adicionar 28 l 100% TCA e agitar num vortex 2 x 1 min. 3. Centrifugar a 5000 rpm, 15 min. 4. Guardar o sobrenadante num tubo eppendorf. Avaliao de TBARS Este mtodo baseia-se na reaco de aldedos, como o malonaldedo (MDA), com o cido tiobarbitrico, formando um composto que absorve a 532 nm. 1. Prepare um branco, misturando num tubo eppendorf 250 l tampo Na fosfato pH 7.2 com 28 l 100% TCA. 2. Preparar os seguintes tubos:

Tubos Branco (l) Amostra 1 (l) Amostra 2 (l) 0.1M EDTA (l) TBA (l) 50 mM BHT (l)

0 100 100 792 8

1 100 100 792 8

2 100 100 792 8

3 100 792 8

3. Ferver durante 15 min. Arrefecer. 4. Ler a absorvncia relativa 532 nm (cuvete 1 ml).