Quim. Nova, Vol. 30, No.

3, 740-744, 2007

Assuntos Gerais

TERMINOLOGIA PARA AS TCNICAS ANALTICAS DE ELETROMIGRAO EM CAPILARES# Jos Alberto Fracassi da Silva* Instituto de Qumica, Universidade Estadual de Campinas, CP 6154, 13083-970 Campinas SP, Brasil Wendell Karlos Tomazelli Coltro e Emanuel Carrilho Instituto de Qumica de So Carlos, Universidade de So Paulo, CP 780, 13560-970 So Carlos SP, Brasil Marina Franco Maggi Tavares Instituto de Qumica, Universidade de So Paulo, CP 26077, 05513-970 So Paulo SP, Brasil Recebido em 4/7/06; publicado na web em 19/1/07

This is a contribution that presents a translation of the work Terminology for Analytical Capillary Electromigration Techniques by Riekkola and collaborators (Pure Appl. Chem., Vol. 76, No. 2, 443-451, 2004) from IUPAC for the Portuguese Language. Additional terms that had not been defined in native Portuguese were included for the benefit of the local community. Additional notes were also included to clarify some important concepts and to highlight the differences between techniques.

INTRODUO Tcnicas que empregam eletromigrao em capilares tm se tornado populares e crescido em importncia na qumica analtica, especialmente no campo da bioanlise. Parte dos termos empregados pode ser encontrada em um artigo sobre a terminologia de eletroforese em qumica clnica1, mas em muitos casos estes no podem ser aplicados a tcnicas capilares e no levam completamente em conta as definies sugeridas pela IUPAC2. Em 1994, Knox publicou um artigo sobre a terminologia a ser empregada em tcnicas de eletrosseparao3, embora este no esteja em concordncia com a nomenclatura da IUPAC para cromatografia4. O presente artigo discute e define os termos relevantes utilizados na prtica laboratorial, incluindo os nomes das vrias tcnicas baseadas nos princpios da eletromigrao. Deve ser notado que diversas aplicaes prticas podem se situar em casos limites, no que diz respeito ao nome de uma destas tcnicas em particular. As separaes efetuadas com tcnicas de eletromigrao em capilar utilizam capilares de dimetro interno reduzido e empregam campos eltricos elevados, sendo baseadas em diferentes princpios de separao que, em alguns casos, podem se sobrepor. Estas incluem as tcnicas eletroforticas capilares e as tcnicas cromatogrficas capilares que utilizam campo eltrico para bombeamento dos fluidos. Tcnicas de eletromigrao em capilares tm se mostrado altamente eficientes na separao de ons pequenos, tanto orgnicos como inorgnicos, frmacos, explosivos, corantes, polmeros, protenas e peptdeos, DNA e RNA, clulas, partculas, etc.5-10. A presena do fluxo eletrosmtico (EOF, electroosmotic flow) pode contribuir para a separao, mesmo quando no necessria (por ex., em focalizao isoeltrica), ou pode ser completamente indesejvel. O EOF tem sua origem na atuao de um campo eltrico sobre as espcies carregadas na regio difusa da dupla camada eltrica, formada devido carga da parede interna do capilar. Como exemplo, para um capilar de slica fundida em contato com uma
# Artigo traduzido de Terminology for analytical capillary electromigration techniques, publicado em Pure Appl. Chem. 2004, 76, 443, por M. L. Riekkola, J. A. Jnsson e R. M. Smith. Publicao aprovada pelo Comit Brasileiro para Assuntos de Qumica junto IUPAC. * e-mail: fracassi@iqm.unicamp.br

soluo com valor de pH acima de 2, os grupos silanol da superfcie apresentam-se desprotonados e proporcionam carga negativa parede. Para contrabalancear as cargas da parede h, na regio prxima parede, o excesso de cargas positivas, provenientes dos ctions da soluo. A aplicao do campo eltrico ao longo do capilar causa a movimentao dos ons positivamente carregados, presentes na camada difusa, no sentido do ctodo. Para distncias maiores que a definida pelo plano de cisalhamento, no qual a velocidade eletrosmtica zero, encontra-se que esta velocidade aumenta rapidamente, at que para distncias maiores que a espessura da camada difusa (comprimento de Debye) assume um valor constante. Para experimentos de eletromigrao em capilares, a espessura da camada difusa muito menor que o raio do capilar, de modo que o perfil de velocidade radial aparece como linear. Como conseqncia, o EOF permite altas eficincias nas separaes, em comparao s tcnicas que empregam presso para bombeamento dos fluidos, cujo perfil de velocidade radial parablico. Algumas das vantagens destas tcnicas de eletromigrao incluem eficincias de separao extremamente altas, tempo de anlise relativamente curto, pequenas quantidades de amostra e baixo custo de anlise. Alm disso, instrumentos comerciais automatizados permitem operao confivel em anlises de rotina. Tipicamente so utilizados capilares com dimetro interno de 20-100 m e comprimento de 20-100 cm. Na separao de molculas pequenas, capilares de slica fundida sem recobrimento da superfcie interna so comumente empregados. Para prevenir a adsoro de analitos ou componentes da matriz e para eliminar ou controlar o EOF, o recobrimento ou a modificao qumica dos grupos silanol presentes na superfcie pode ser necessria. Recobrimentos neutros e carregados tm sido usados com sucesso em grande variedade de aplicaes. A injeo da amostra no capilar pode ser feita hidrodinamicamente, atravs da criao de um gradiente de presso entre os reservatrios da amostra e do eletrlito de corrida, enquanto as extremidades do capilar esto mergulhadas nestes reservatrios. Utilizando a injeo eletrocintica, um determinado valor de potencial aplicado entre os reservatrios da amostra e eletrlito durante um intervalo de tempo definido, enquanto a extremidade apropriada do capilar inserida no reservatrio da amostra, ao passo que a outra extremidade colocada no reservatrio do eletrlito de corrida.

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Idealmente, efeitos de disperso da zona durante a separao so devidos apenas difuso longitudinal. Entretanto, eletrodisperso (causada pelas diferenas de condutividade entre as zonas do eletrlito e da amostra), bem como os gradientes de temperatura no interior do capilar podem causar efeitos adicionais de alargamento das bandas. O tipo de tcnica de introduo de amostra, volume injetado em excesso, tipo de matriz e fenmeno de adsoro na parede do capilar podem vir a ser fontes adicionais de alargamento das bandas. O controle da temperatura do capilar de separao, a escolha apropriada do tampo de corrida, as tcnicas de tratamento da superfcie do capilar, o tipo de amostra e o modo como injetada podem ser cruciais para o sucesso de uma separao particular. Aditivos, como solventes orgnicos, ciclodextrinas ou polmeros, podem ser usados para controlar a migrao e o formato dos picos dos solutos. Ciclodextrinas podem tambm ser utilizadas como parte do recobrimento da parede do capilar, em gis rgidos e em fases dispersas micelares. Capilares preenchidos com gis contendo ligaes cruzadas, como por ex. a poliacrilamida, podem ser utilizados como meio na separao baseada no tamanho de biomolculas de alta massa molar. A incorporao de diferentes seletores quirais ao tampo ou eletrlito de corrida tem sido utilizada com sucesso na separao de compostos quirais de baixa massa molar. Polmeros lineares emaranhados so freqentemente utilizados na separao de biomolculas. Em eletrocromatografia capilar11,12, as separaes so efetuadas em colunas capilares contendo recheio particulado, como em cromatografia lquida de alta eficincia, ou material monoltico. Capilares sem recheio e contendo apenas a parede recoberta, como os capilares utilizados em cromatografia gasosa capilar, tambm tm sido empregados. No futuro, microcanais contidos em estruturas baseadas em microdispositivos tendero a ser utilizados com maior freqncia em tcnicas de eletromigrao capilar, aps maiores desenvolvimentos no campo da nanotecnologia. H disponvel em Lngua Portuguesa alguns artigos de reviso que envolvem fundamentos das tcnicas eletroforticas de separao13-16 e aspectos relacionados17-19. TCNICAS DE ELETROMIGRAO EM CAPILARES Eletroforese Capilar (CE, capillary electrophoresis) a tcnica de separao efetuada em capilares e baseada somente nas diferenas entre as mobilidades de espcies carregadas (analitos), em eletrlitos que podem ser aquosos ou orgnicos. Estes podem conter aditivos, como ciclodextrinas, complexantes ou ligantes, que interagem com os analitos e alteram suas mobilidades eletroforticas. Notas: 1. Esta tcnica tambm conhecida por eletroforese capilar de zona (CZE, capillary zone electrophoresis) ou em soluo livre (FSCE, free solution capillary electrophoresis). 2. O uso do termo eletroforese capilar (CE) como um termo coletivo para todas as tcnicas de eletromigrao no recomendado, pois muitas destas tcnicas envolvem outros mecanismos de separao que no o descrito acima. 3. Alguns autores tm se referido utilizao de ciclodextrinas carregadas no eletrlito como cromatografia eletrocintica. Eletroforese Capilar de Afinidade (CAE, capillary affinity electrophoresis) uma tcnica eletrofortica de separao em capilares na qual substncias capazes de interagir especificamente (muitas vezes bio-especifica-

mente) com os analitos so adicionadas ao eletrlito de corrida. Nota: A mesma tcnica conhecida por ACE (affinity capillary electrophoresis). Eletroforese Capilar de Peneiramento (CSE, capillary sieving electrophoresis) Tcnica de separao eletrofortica em capilar contendo um meio peneirador (por ex., rede de polmeros lineares emaranhados) no eletrlito de corrida. A separao baseada nas diferenas de forma e tamanho entre os analitos carregados. Eletroforese Capilar em Gel (CGE, capillary gel electrophoresis) Caso especial de eletroforese capilar de peneiramento, no qual o capilar preenchido com gel contendo ligaes cruzadas. Focalizao Isoeltrica Capilar (CIEF, capillary isoelectric focusing) Tcnica eletrofortica para separao de analitos anfteros de acordo com seu ponto isoeltrico, atravs da aplicao de um campo eltrico ao longo de um gradiente de pH gerado no capilar. Isotacoforese Capilar (CITP, capillary isotachophoresis) Tcnica de separao eletrofortica efetuada em um sistema descontnuo de eletrlitos, no qual os analitos migram de acordo com suas mobilidades eletroforticas, formando uma cadeia de zonas adjacentes que se movem com igual velocidade entre duas solues, os eletrlitos lder e terminador. As condies que devem ser satisfeitas para que os analitos migrem em zonas adjacentes so que as mobilidades dos ons do eletrlito lder e terminador sejam maior e menor, respectivamente, que as mobilidades dos ons na amostra. Cromatografia Eletrocintica (EKC, electrokinetic chromatography) Tcnica de separao baseada na combinao de eletroforese e interaes dos analitos com aditivos (por ex., tensoativos), de modo a formar uma fase dispersa que se mova com velocidade diferente do analito. De maneira a promover a separao, os analitos ou a fase dispersa devem possuir carga. Notas: 1. Esta definio no totalmente compatvel com a definio de cromatografia. 2. A mesma tcnica tambm conhecida por cromatografia capilar eletrocintica (ECC, electrokinetic capillary chromatography). Cromatografia Eletrocintica Micelar (MEKC, micellar electrokinetic chromatography) Caso especial da cromatografia eletrocintica, em que a fase dispersa no capilar micelar. Nota: A mesma tcnica conhecida por cromatografia capilar eletrocintica micelar (MECC, micellar electrokinetic capillary chromatography). Cromatografia Eletrocintica em Microemulso (MEEKC, microemulsion electrokinetic chromatography) Caso especial da cromatografia eletrocintica, no qual uma microemulso empregada como fase dispersa.

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Nota: A mesma tcnica tambm chamada de cromatografia capilar eletrocintica em microemulso (MEECC, microemulsion electrokinetic capillary chromatography). Potencial Eletrocintico, Eletrocromatografia Capilar (CEC, capillary electrochromatography) Caso especial da cromatografia lquida capilar, no qual a movimentao da fase mvel atravs de um capilar preenchido ou recoberto com a fase estacionria promovida pelo fluxo eletrosmtico (que pode ser assistido por presso). O tempo de reteno determinado pela combinao da migrao eletrofortica e da reteno cromatogrfica. TERMOS RELACIONADOS S TCNICAS DE ELETROMIGRAO EM CAPILARES Eletrosmose o movimento de um lquido atravs de uma membrana (ou capilar) como conseqncia da aplicao de um campo eltrico. Nota: A velocidade linear do fluxo dividida pelo campo eltrico aplicado chamada de mobilidade eletrosmtica (u ou eo). Fluxo Eletrosmtico em Volume o fluxo em volume dividido pelo campo eltrico aplicado sobre o plug total ou capilar. Corrigido da ref. 2. Tempo de Migrao Eletrosmtico, teo o tempo requerido para que o lquido percorra o comprimento efetivo do capilar, Lef, devido eletrosmose. Este tempo comumente medido como o tempo de migrao de um marcador neutro, conhecido como marcador do fluxo eletrosmtico e cuja mobilidade assumida desprezvel com relao ao analito. Velocidade Eletrosmtica, eo Veja eletrosmose2. Nota: Em tcnicas de eletromigrao capilar, esta velocidade positiva, por conveno, no sentido da extremidade de injeo de amostra para a extremidade de deteco do capilar, caso contrrio ela assume valor negativo. A velocidade eletrosmtica pode ser calculada como eo = Lef / teo, o comprimento efetivo do capilar dividido pelo tempo de migrao eletrosmtico. Campo Eltrico, E a fora que atua sobre uma partcula carregada dividida pela sua carga eltrica. Nota: Em tcnicas de eletromigrao capilar, esta tomada como a componente axial do campo, que a diferena de potencial aplicada nas extremidades do capilar dividida pelo comprimento total do capilar, Ltot. Existe tambm um campo eltrico radial proveniente da dupla camada eltrica formada nas proximidades da parede do capilar, que est envolvida no fenmeno da eletrosmose. O comprimento total do capilar tipicamente maior que o comprimento efetivo, Lef. Veja tambm tempo de migrao. Mobilidade Eletrosmtica, u ou eo Velocidade eletrosmtica dividida pelo campo eltrico.

(1)

o potencial no plano de cisalhamento que se encontra na camada difusa e est associado ao fenmeno da eletrosmose. negativo quando os vetores de campo eltrico (E) e velocidade do fluxo (eo) esto na mesma direo e sentido. No clculo do potencial eletrocintico a partir dos fenmenos eletrocinticos, assume-se que o plano de cisalhamento divide a camada difusa em duas regies distintas: uma imvel e outra mvel. Como no esto disponveis dados confiveis a respeito da permitividade e viscosidade na regio da dupla camada eltrica prxima interface, o clculo do potencial eletrocintico est sujeito a crticas. Torna-se, portanto, essencial indicar em todos os casos quais equaes foram utilizadas para clculo do . Entretanto, para as mesmas suposies sobre permitividade e viscosidade, todos os fenmenos eletrocinticos devem fornecer o mesmo valor para o potencial eletrocintico2. Notas: 1. Se as condies referidas acima forem seguidas, o potencial eletrocintico pode ser relacionado mobilidade do fluxo eletrosmtico, eo, pela Equao de Smoluchowski: (2) onde r a permitividade da soluo (usualmente tomada como a permitividade do solvente puro), 0 a permitividade do vcuo e a viscosidade dinmica da soluo, na qual se assume que a razo entre a permitividade e a viscosidade independente do campo eltrico na dupla camada eltrica. 2. O potencial eletrocintico tambm conhecido por potencial zeta. Tempo de Migrao, tm o tempo requerido para que o analito percorra o caminho efetivo do capilar, Lef, que a distncia entre os pontos de injeo e deteco. Taxa de Migrao (em eletroforese), a distncia de migrao dividida pelo tempo, s vezes chamada de velocidade de migrao. O smbolo tambm usado para velocidade2. Velocidade Eletrofortica, ep a velocidade que um analito carregado adquire sob ao de um campo eltrico, em relao ao eletrlito de corrida. Tambm chamada de taxa de migrao (em eletroforese). Mobilidade Eletrofortica, ou ep a taxa de migrao observada (em eletroforese), , ou a velocidade eletrofortica, ep, dividida pela magnitude do campo eltrico aplicado, E, em um dado meio. Notas: 1. Mobilidades podem ser expressas com sinal negativo, pois a migrao de solutos ou partculas pode ocorrer no sentido contrrio quele do campo eltrico (que tomado como referncia). 2. Em um meio de suporte slido, apenas valores aparentes podem ser determinados. (Modificado da ref. 2). 3. A mobilidade eletrofortica de um on dada por:

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(3) (8) Nesta equao, f o coeficiente de atrito, z o nmero de cargas elementares do on e e a carga elementar. O coeficiente de atrito aumenta com o tamanho do on e com a viscosidade do eletrlito suporte. Para ons esfricos rgidos, de raio r, movendose em um meio de viscosidade , o coeficiente de atrito pode ser estimado utilizando-se a Lei de Stokes: (4) Coeficientes de atrito para partculas de outros formatos, como elipsides, podem ser estimados utilizando-se equaes mais complexas. Mobilidade Eletrofortica Efetiva, ef LISTA DE ACRNIMOS A mobilidade eletrofortica efetiva de um analito dada pela somatria das mobilidades eletroforticas (j) de todas as n espcies relacionadas entre si por equilbrios qumicos, multiplicadas pela distribuio destas espcies (j): ACE CAE CE CEC CGE CIEF CITP CZE CSE EKC MECC MEECC MEEKC MEKC Eletroforese Capilar de Afinidade Eletroforese Capilar de Afinidade Eletroforese Capilar Eletrocromatografia Capilar Eletroforese Capilar em Gel Focalizao Isoeltrica Capilar Isotacoforese Capilar Eletroforese Capilar de Zona Eletroforese Capilar de Peneiramento Cromatografia Eletrocintica Cromatografia Capilar Eletrocintica Micelar Cromatografia Capilar Eletrocintica em Microemulso Cromatografia Eletrocintica em Microemulso Cromatografia Eletrocintica Micelar

2. kMEKC no deve ser confundido com o fator de reteno k (em cromatografia de coluna). Entretanto, anlogo razo de distribuio de massas (em cromatografia). RAZO DE DISTRIBUIO DE MASSAS (EM CROMATOGRAFIA ELETROCINTICA EM MICROEMULSO), kMEEKC Definido de forma anloga razo de distribuio de massas em MEKC, kMEKC, substituindo-se os termos para as micelas pelos termos correspondentes para a microemulso.

(5) Velocidade Total do Analito (em eletroforese capilar), tot a soma da velocidade eletrofortica, ep, com a velocidade eletrosmtica, eo. (6) Esta quantidade pode ser medida experimentalmente dividindo-se o comprimento efetivo do capilar pelo tempo de migrao (Lef / tm). Notas: 1. Dependendo dos sinais e magnitudes relativas destas velocidades, a velocidade total de um analito pode possuir o mesmo sentido da velocidade eletrosmtica ou o sentido contrrio. 2. A velocidade total a velocidade do on medida como o seu deslocamento em relao parede do capilar dividida pelo tempo. 3. O termo velocidade aparente tambm denomina a velocidade total do analito. Tempo de Migrao das Micelas, tmc determinado experimentalmente pelo tempo de migrao de um composto que completamente retido na fase micelar. RAZO DE DISTRIBUIO DE MASSAS (EM CROMATOGRAFIA ELETROCINTICA MICELAR), kMEKC definida como: (7) onde nmc e naq so os nmeros de moles de analito nas fases micelar e aquosa, respectivamente, K a constante de distribuio e Vmc e Vaq so os volumes correspondentes das fases. Notas: 1. Para o caso de analitos eletricamente neutros, kMEKC pode ser diretamente calculado a partir dos tempos de migrao:

SMBOLOS e E f K kMEEKC kMEKC Lef Ltot naq nmc r teo tm tmc Vaq Vmc z r 0 ef eo ep eo Carga elementar Campo eltrico Coeficiente de atrito Constante de distribuio Razo de distribuio de massas em MEEKC Razo de distribuio de massas em MEKC Comprimento efetivo do capilar Comprimento total do capilar Nmero de moles de analito na fase aquosa Nmero de moles de analito na fase micelar Raio de Stokes Tempo de migrao eletrosmtica Tempo de migrao do analito Tempo de migrao das micelas Volume da fase aquosa Volume da fase micelar Nmero de cargas elementares Permitividade da soluo Permitividade do vcuo Potencial eletrocintico (ou zeta) Viscosidade dinmica Mobilidade eletrofortica Mobilidade efetiva Mobilidade eletrosmtica Mobilidade eletrofortica Taxa de migrao Velocidade eletrosmtica

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ep tot u

Velocidade eletrofortica Velocidade total do analito Mobilidade eletrosmtica

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