Alexandre Schuler

CROMATOGRAFIA
A G LQ AG S SE EA AL QU UI ID DO O
(det et or es ,aqui s i o de dados ,val i dao e aval i ao es t at s t i ca)

Volume 3

Oi t ava Edi o

2004

Professor Adjunto 4 Departamento de Engenharia Qumica Universidade Federal de Pernambuco

Alexandre Schuler

CROMATOGRAFIA
A G LQ AG S SE EA AL QU UI ID DO O
(det et or es ,aqui s i o de dados ,val i dao e aval i ao es t at s t i ca)

Volume 3

Oi t ava Edi o

2004

Alexandre Schuler - Cromatografia SUMRIO 1 - Introduo, 1 1.1. Histrico, 1 1.2. Classificao, 1 2 - Tipos de Processos Cromatogrficos, 3 2.1. Cromatografia de adsoro, 3 2.2. Cromatografia de partio, 4 2.3. Distribuio em contracorrente, 6 2.4. Cromatografia em fase lquida, 7 2.5. Fatores que influem na separao, 8 2.6. Cromatografia em fase gasosa, 12 3 - Tratamento terico da Cromatografia, 16 3.1. A equao de Van Deemter, 16 3.2. Fase estacionria, 16 3.3. Suporte, 17 3.4. Coluna, 18 3.5. Fase mvel, 18 4 - O Cromatgrafo, 20 4.1. O Cromatgrafo a Gs, 20 4.2. O Cromatgrafo a Lquido, 23 4.3. Detetores, 24 5 - Anlise Qualitativa, 32 6 - Anlise Quantitativa, 33 6.1. Introduo, 33 6.2. Medio de rea, 33 6.3. Mtodos de clculo, 35 6.4. Seleo do melhor mtodo de clculo, 40 7. Otimizao do processo analtico, 41 7.1. Parmetros analticos, 41 7.2. Projetando um mtodo analtico, 43

Alexandre Schuler - Cromatografia 7.3. Validao de um mtodo analtico, 45 8. Tcnicas adicionais de identificao, 52 8.1 Tempo de reteno e reteno relativa, 52 8.2. ndice de reteno, 52 8.3. Equivalncia entre fases estacionrias, 53 Bibliografia, 54 Apndice 1 (Tnel do Tempo), 55 Apndice 2 (Caractersticas Bsicas dos Detetores), 59 A2.1. Sensibilidade, 59 A2.2. Nvel de rudo, 59 A2.3. Limite de Deteco, 59 A2.4. Faixa de Linearidade Dinmica, 60 Apndice 3 (Tcnicas de introduo da amostra), 61 Apndice 4 (Sistemas de aquisio de dados), 63 Apndice 5 (O desenvolvimento cromatogrfico), 64 Apndice 6 (Outros detetores utilizados em Cromatografia), 66 Apndice 7 (Estatstica), 70

Alexandre Schuler - Cromatografia APNDICE 1 Tnel do Tempo

A inteno deste texto apresentar uma seqncia cronolgica dos fatos mais importantes que marcaram o desenvolvimento da tcnica cromatogrfica, at os tempos atuais. Mais do que apresentar uma lista exaustiva, pretende-se to somente dar ao leitor uma compreenso geral da histria da Cromatografia. Reza a lenda que um pesquisador, trabalhando em seu laboratrio com uma soluo contendo uma mistura de corantes, acidentalmente molhou sua vestimenta. Para sua surpresa, no lugar de uma mancha mais ou menos circular e de cor uniforme (igual da soluo), surgiram crculos concntricos, cada um com uma cor diferente das demais, como na figura abaixo. De algum modo esse fato teria ficado registrado, tendo servido de sugesto para Tswett (ver adiante) resolver seu problema analtico. Isso teria acontecido no sculo XIX. Em 19 de maio de 1872 nasceu em Asti, uma pequena cidade localizada no norte da Itlia, filho de Simon Tswett (russo) e Marie Dorroza (italiana), Mikhal Semenovitch Tsvet. Registrado como de nacionalidade russa, Mikhail Tswett (grafia mais usual na literatura) mudou-se em 1875 com o pai (a me falecera pouco aps o seu nascimento) para Lausanne e depois Genebra (Sua), onde passou toda a sua infncia e juventude, graduando-se em 1893 em botnica pela Universidade de Genebra, doutorando-se em 1896 na mesma universidade. Nesse mesmo ano mudouse para a Rssia, como professor de botnica em escolas privadas na cidade de So Petersburgo (Leningrado) e em 1901 mudou-se para Varsvia (Polnia), sendo contratado pela Universidade de Varsvia, onde trabalhou at 1915. Com a invaso alem, durante a 1a Guerra Mundial, Tswett fugiu para a Rssia, refugiando-se em Moscou. Em 1917 tornou-se professor de botnica e Diretor do Jardim Botnico da Universidade de Jourjeff, em Dorpat (Tartu). No incio de fevereiro os alemes ocuparam Jourjeff e fecharam a Universidade. Mais uma vez Tswett se mudou, dessa vez para Voronej, aonde veio a falecer, debilitado pela tuberculose, no dia 26 de junho de 1919, com 47 anos de idade. Em 1900, Tswett descobrira a razo da cor verde das plantas, isolando as clorofilas A e B, xantofilas e carotenides amarelos, entre outros pigmentos, em uma coluna de adsoro contendo carbonato de clcio. ter de petrleo foi empregado como fase mvel neste trabalho. Este primeiro trabalho (de uma srie de mais de cinqenta) foi publicado em 1903, no volume 14 da revista cientfica Proc. Warsaw Soc. Nat. Sci., Biol. Sec. Sua obra maior foi um livro, publicado (em russo) em 1906, intitulado "Os cromfilos no mundo animal e vegetal", Mikhail Tswett no qual ele descreve com detalhes seu mtodo de separao de pigmentos. de Tswett a seguinte definio: "Cromatografia um mtodo em que os componentes de uma mistura so separados numa coluna de adsorvente num sistema em fluxo". Ele deu tcnica o nome de Cromatografia, combinando as palavras gregas Khromatos (cores) e Graphos

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(descrever). Ele acreditava que o processo de separao, de algum modo, tinha algo a ver com a cor da substncia. Segundo suas prprias palavras, "como raios de luz no espectro, os diferentes componentes de uma mistura de pigmentos, obedecendo a alguma lei, se separam numa coluna de carbonato de clcio e podem assim ser qualitativamente e quantitativamente determinados. Eu chamo tal preparao um cromatograma, e o mtodo correspondente o mtodo cromatogrfico". Mais tarde, antevendo toda a potencialidade de sua inveno, afirmou: "... bastante evidente que o fenmeno de adsoro descrito no se restringe aos pigmentos vegetais, mas devemos aceitar que todos os tipos de compostos qumicos, coloridos ou incolores, esto sujeitos s mesmas leis". Aps sua morte, ningum de imediato empregou a Cromatografia em suas pesquisas. Um detalhe interessante que o nome tswett, em russo, significa cor. Algum chegou a sugerir, como uma homenagem pstuma a Tswett, que o nome da tcnica fosse tswettografia. Linha do Tempo: 1931 Khun e Lederer repetiram o trabalho de Tswett com clorofilas, xantofilas e carotenos, rompendo o silncio de 22 anos. Logo em seguida, Brockmann, Karrer, Winterstein e Zechmeister trouxeram suas contribuies. 1938 Reichstein realiza a primeira anlise de uma substncia incolor. Para visualizar as zonas ocupadas por substncias incolores empregam-se reativos prprios, designados como reveladores (Figura A1.1).

Figura A1.1 Cromatografia em Camada Delgada (diferentes formas de revelar). 1940 Wilson, Devault, Weiss, Glckauf, Martin e Synge1 deram incio aos estudos tericos da Cromatografia.

Archer John Porter Martin (19102002) e Richard Laurence Millington Synge (1914-1994).

Alexandre Schuler - Cromatografia 1941 Martin e Synge introduziram a cromatografia de partio (com slica gel).

1943 Lyman C. Craig desenvolve um aparelho para extrao lquido-lquido, que pode ser considerado um precursor do cromatgrafo e cujo funcionamento, descrito adiante, auxilia no entendimento do processo cromatogrfico. 1944 Consden, Gordon e Martin inventaram a cromatografia em papel. 1947 Boyd, Marinsky, Spedding, Tompkins e outros realizaram pesquisas que conduziriam mais tarde produo industrial de terras raras por cromatografia de troca inica. 1948 Lederer e Linstead aplicaram a cromatografia em papel a compostos inorgnicos. 1951 Kirchner introduziu a cromatografia em camada delgada. 1952 Martin e Synge desenvolvem a cromatografia a gs. 1956 Sober e Peterson prepararam as primeiras celuloses para troca inica e Lathe e Ruthvan trabalharam com peneiras moleculares (naturais e modificadas) para medidas de peso molecular. 1964 Moore desenvolveu a cromatografia por permeao em gel. O aparelho de Craig Lyman C. Craig (1906-19740), pesquisador da Universidade de Rockefeller (New York, USA), desenvolveu um equipamento, denominado Aparato de Craig, que promove a separao de misturas de substncias atravs da tcnica de extrao lquido-lquido, conforme descrito na pgina 6. Esse equipamento (Figura A1.2) foi bastante utilizado em separaes (inclusive preparativas), antes do advento dos modernos cromatgrafos. Craig inventou tambm um equipamento ainda bastante empregado em laboratrios, o evaporador rotatrio, tambm conhecido como rotavapor.

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Figura A1.2 Aparato de Craig.

Alexandre Schuler - Cromatografia APNDICE 2 Caractersticas bsicas dos detetores 1. Sensibilidade

A sensibilidade de um detetor medida pela sua Resposta, que a magnitude do sinal recebido pelo Sistema de Aquisio de Dados (Registrador potenciomtrico, Integrador ou Software), sob a forma de rea do pico. Assim, quanto maior for a rea do pico de uma mesma amostra, maior ser a sensibilidade do detetor empregado. 2. Nvel de rudo O rudo uma caracterstica indesejvel dos detetores, ou melhor, de qualquer dispositivo eletrnico. No caso do cromatgrafo, o rudo devido a um conjunto de fatores, tais como: - impurezas dos componentes eletrnicos - interferncias na rede eltrica - defeitos em circuitos eletrnicos - contaminao no septo da coluna - vazamento de fase mvel - mau contato em cabos e conectores - sangramento da coluna - contaminao na vlvula de amostragem - contaminao no detetor - contaminao na coluna

Essas causas podem ser removidas, exceto a primeira, que depende no s da qualidade do produto, mas tambm de suas caractersticas prprias. Assim, existe um nvel mnimo de rudo que no pode ser removido. Evidentemente, um pico com altura igual do rudo no poder ser reconhecido como tal. O rudo faz com que a linha de base no seja uma reta perfeita, mas algo parecido com o traado mostrado na Fig. A2.1.

Fig. A2.1. Linha de base com rudo. 3. Limite de Deteco Limite de Deteco (LD), ou Quantidade Mnima Detectvel (QMD), como o prprio nome o diz, a massa mnima injetvel que produza um pico que possa ser identificado como tal. Por definio, LD uma massa cujo pico tenha uma altura igual ao dobro da altura mdia do rudo (hr, Fig. A2.1).

Alexandre Schuler - Cromatografia 4. Faixa de Linearidade Dinmica

Entende-se por Faixa de Linearidade Dinmica (FLD) o intervalo compreendido entre a Quantidade Mnima Detectvel (QMD) e a massa mxima injetvel cuja Resposta ainda seja linear. A Fig. A2.2 ilustra a situao. A linha vermelha compreende a regio linear. Alguns detetores, possuem uma faixa ampla (DIC), enquanto outros apresentam linearidade numa faixa bem mais estreita (DCE). Alguns operam com massas altas (DCT, DIR), enquanto outros s apresentam linearidade a altas diluies (DCE, DUV). Para se determinar a FLD de um detetor, em relao a um determinado composto, necessrio preparar solues dentro do intervalo de interesse e montar um grfico equivalente ao apresentado na Fig. A2.2. Em seguida, o analista deve calcular o coeficiente de correlao (r; Apndice 6) para todos os pontos e depois recalcular o coeficiente de correlao aps retirar, sucessivamente, os pontos n, (n-1), (n-2), etc, at que o valor de r permanea estvel e prximo da unidade. No tendo havido erro grosseiro na preparao das solues, nas injees, nem nas medies de reas, deve-se encontrar um valor de r maior ou igual a 0,999.

Figura A2.2 Faixa de Linearidade Dinmica.

Alexandre Schuler - Cromatografia APNDICE 3 Tcnicas de introduo da amostra

Tradicionalmente a amostra (slido em soluo, lquido ou gs) introduzida com auxlio de uma microseringa (Figura A3.1). Em Cromatografia a Gs (CFG), exceto com colunas capilares ou megabore (ver abaixo), recomenda-se injetar de 3 a 5 microlitros (L), sendo que o erro de medio inversamente proporcional ao volume.

Figura A3.1 Microseringa para amostras lquidas em CFG Em se tratando de amostras gasosas, existem duas outras tcnicas: seringa especial para gases (seringas gas-tight, que previnem contaminao ou diluio da amostra com ar), que utilizada quando a amostra no est pressurizada e a vlvula injetora de sete vias (Figura A3.2). Em Cromatografia a Lquido (HPLC), a amostra (lquido ou slido em soluo) introduzida com auxlio de uma seringa numa vlvula equivalente vlvula da Figura A3.2, sendo do tipo rotativa e resistente alta presso empregada neste tipo de equipamento. Ambas as vlvulas encarregam-se de medir o volume injetado, que varia de umas poucas dezenas de microlitros (HPLC) a 1 2 mL (CFG). No caso de colunas capilares (ou megabore), o volume mximo injetvel muito pequeno para ser medido por uma microlitros (0,01 a 1 L). Alm disso, o dimetro das mesmas to pequeno ( 0,53 mm) que a injeo no pode ser feita diretamente na coluna, como acontece com as colunas de maior dimetro (CFG). Nesses casos, necessrio um injetor especial, onde a amostra, uma vez vaporizada, dissolvida na fase mvel e esta soluo sofre uma diviso (divisor pneumtico), de modo que 1/100 ou uma frao ainda menor realmente enviada para a coluna, enquanto que o restante descartado.

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Figura A3.2.a Vlvula de injeo de amostra gasosa (posio carga)

Figura A3.2.b Vlvula de injeo de amostra gasosa (posio injeo)

Alexandre Schuler - Cromatografia APNDICE 4 Sistemas de aquisio de dados

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Mesmo na atualidade ainda so empregados registradores para a aquisio dos dados cromatogrficos. Qualquer que seja o detetor empregado (CFG ou HPLC), o sinal gerado pelo mesmo uma tenso (corrente contnua). Trabalhando-se com registrador, obtm-se um grfico (cromatograma), com auxlio do qual so medidos os tempos de reteno e as reas dos diferentes picos. O tempo gasto nesse trabalho muito grande e o erro s vezes bastante expressivo (5 a 10 %). O integrador eletromecnico realizou uma verdadeira revoluo na Cromatografia, particularmente em laboratrios de Controle de Qualidade, acelerando e aumentando bastante a preciso do trabalho analtico (erro da ordem de 0,5 %). Com o desenvolvimento da eletrnica, alguns registradores passaram a ser comercializados com um integrador eletrnico cujo registro grfico era igual ao do integrador eletromecnico, de modo que no houve diminuio visvel no erro de integrao, pois a leitura continuava sendo analgica. Mas logo em seguida surgiram os verdadeiros integradores eletrnicos. Os primeiros limitavam-se a imprimir a rea medida. Os clculos eram ainda realizados pelo analista, embora com uma preciso na integrao (medida da rea) da ordem de 0,001 %. A Segunda gerao de integradores veio complementar o trabalho. Aps a integrao, o equipamento, utilizando o mtodo de clculo previamente selecionado pelo analista, realizava a operao final, chegando a imprimir a concentrao na unidade desejada. Esses equipamentos denominam-se integradores-processadores. Alguns, mais sofisticados, imprimem o cromatograma, em tempo real, utilizando os recursos de correo vertical e correo tangencial e inclusive realizando clculos ps-anlise (geralmente em BASIC), alm de automatizar o acionamento de vlvulas. Na realidade esses integradores de ltima gerao so computadores dedicados. Seu alto custo, aliado a uma curta vida tecnolgica, decretou o fim desses equipamentos. Na atualidade, os laboratrios de cromatografia esto substituindo os integradores por softwares bastante completos e sofisticados, que com auxlio de um microcomputador tipo PC e de uma interface, realizam o trabalho do integrador com a mesma eficincia, a um preo bem menor, alm de poderem monitorar at quatro cromatgrafos de um modo totalmente independente.

Alexandre Schuler - Cromatografia APNDICE 5 O desenvolvimento cromatogrfico

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As Figuras 1.1 (p. 1) e 2.1 (p. 3) mostram, respectivamente, a distribuio das partculas slidas (fase estacionria slida ou suporte, no caso da fase estacionria lquida) dentro de uma coluna empacotada e o processo de separao a nvel molecular (pictoricamente). Na Seo 2.2 (p. 4) dado um pequeno tratamento matemtico ao processo de separao por partio, quando ento h referncia a etapas ou pontos de equilbrio. Entre as pginas 7 e 8 oferecida uma pequena discusso a respeito do que acontece numa coluna de cromatografia clssica (fase estacionria slida), quando se faz referncia a uma coluna desenvolvida. No final da Seo 2.6, ao discutir as Figuras 2.15 (p. 14) e 2.16 (p. 15), feita referncia ao nmero de pratos tericos (n), como medida da eficincia (capacidade de separao) de uma coluna cromatogrfica. Finalmente, no Captulo 3 (p. 16), apresentada a equao de van Deemter e seus diversos parmetros so discutidos. O processo de separao cromatogrfica pode ser analisado, por analogia, como uma destilao fracionada. No projeto de uma coluna de destilao contnua, o engenheiro qumico calcula em que pontos devem ser colocadas bandejas (pratos) para a retirada de fraes de diferentes pontos de ebulio. Numa destilao em batelada no existem essas bandejas, mas evidentemente o clculo o mesmo. Como no existem pontos de remoo ao longo da coluna, tudo sai pelo topo da mesma, na ordem crescente do ponto de ebulio. O mesmo acontece com a cromatografia. A diferena que outros fatores tambm interferem no processo, tornando-o mais complexo, porm tambm mais completo, mais eficiente. Assim, enquanto uma coluna de destilao contm cerca de 40-60 bandejas, uma coluna de cromatografia possui algumas centenas ou mesmo milhares de bandejas (pratos tericos). Cada componente da amostra, com diferente coeficiente de partio (ou de adsoro), movimenta-se ao longo da coluna, transportado pela fase mvel, com uma velocidade mdia diferente: quanto maior for sua afinidade com a fase estacionria (ou menor com a fase mvel), maior ser o coeficiente e portanto maior ser seu tempo de residncia (tempo de reteno) na coluna, ou seja, menor ser sua velocidade mdia. O material eludo comporta-se como um pisto mvel, com concentrao mxima nas proximidades da parte central e distribuio de concentrao quase gaussiana. medida que o tempo passa, a largura do pisto aumenta (por efeito da difuso), de modo que se o tempo de eluio for muito grande, os picos coalescem e a separao ser incompleta (ver Figura 2.10, vazo V1, na pgina 11). Por outro lado, se o tempo for muito curto, (vazo V4 da Figura 2.10), pode ser insuficiente para permitir separao completa. Esse raciocnio levou elaborao da equao abaixo, para o clculo da eficincia de uma coluna cromatogrfica (Fig. 2.16, p. 15): n = (4Dr/L)2 Pictoricamente, uma mistura de trs componentes apresentaria o comportamento mostrado na Figura A5.1 e a distribuio de concentrao (ou de massa) de cada

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componente mostrada na Figura A5.2. Observe-se que a Figura A5.2 no um cromatograma. A substncia que sai primeiro da coluna a primeira a atingir o detetor. Do mesmo modo, a primeira poro de cada componente a atingir o detetor a da extremidade direita (na Figura). O cromatograma, por outro lado, traado da esquerda para a direita (neste livro). Assim, enquanto a Figura A5.2 mostra uma cauda frontal, o cromatograma correspondente mostraria uma cauda no ramo negativo (descendente) do pico de cada componente.

Figura A5.1 Desenvolvimento cromatogrfico de uma mistura.

Figura A5.2 Distribuio de massa.

Alexandre Schuler - Cromatografia APNDICE 6 Outros detetores empregados em Cromatografia 1. Detetor de Nitrognio e Fsforo (DNP)

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O DNP um detetor utilizado em cromatografia a gs e foi projetado especificamente para a deteco de compostos nitrogenados (N) e fosforados (P) ao nvel de traos (concentraes da ordem de ppb). Tambm conhecido como detetor termoinico, o DNP utiliza uma eletrnica (e o prprio hardware) equivalente ao DIC, inclusive com os mesmos gases (Nitrognio como fase mvel e Hidrognio e Ar Sinttico como gases da chama). O polarizador contm uma pastilha alcalina e a razo de fluxos dos trs gases (que diferente para compostos nitrogenados ou fosforados) insuficiente para produzir chama, mas o potencial eltrico estabelecido no local gera um estado de plasma, que aumenta de 14-105 a sensibilidade do detetor frente a esses compostos, relativamente a outros compostos. Devido a essas caractersticas, o DNP dito seletivo para compostos nitrogenados e fosforados, unicamente para solues extremamente diludas, sendo portanto ideal para a deteco de traos de pesticidas organo-nitrogenados e organo-fosforados. 2. Detetor Fotomtrico de Chama (DFC) O DFC basicamente um detetor de ionizao de chama, no que diz respeito ao hardware. Entretanto, a deteco baseia-se na absoro da radiao emitida pelo enxofre (e tambm pelo fsforo e ainda outros elementos) na regio visvel do espectro eletromagntico. Trata-se portanto de um espectrofotmetro, obedecendo assim Lei de Beer. A radiao emitida pela chama atravessa um filtro, o qual seleciona o comprimento de onda desejado (394 nm para o enxofre e 526 nm para o fsforo). Para compostos contendo um desses elementos, sua sensibilidade da mesma ordem de grandeza do DNP, sendo portanto indicado para a deteco de traos (ppb) de pesticidas fosforados e sulfurados. 3. Detetor de ons At os anos 70 a Cromatografia Instrumental apenas no era empregada na anlise de ons (ctions e nions). Posteriormente foi observado que o bombeamento em paralelo de um reagente complexante poderia transformar o on em um derivado (na sada da coluna), colorido, o qual seria detectado num espectrofotmetro (ex.: detetor UV-VIS). A separao cromatogrfica de ons, no discutida neste livro, ocorre numa coluna contendo uma resina trocadora de ons apropriada, tratando-se portanto de uma tcnica bastante antiga, mais largamente empregada na purificao de guas (deionizao). O equipamento , em ltima anlise, um HPLC tpico.

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Para evitar o trabalho de derivao, foi desenvolvido um detetor especfico, o detetor de ons, que , em ltima anlise, um condutivmetro. Consta de um par de eletrodos contidos numa clula termostatizada. Aplica-se um campo eltrico entre os eletrodos. O efluente da coluna passa pela clula, variando a resistncia R entre os eletrodos, de acordo com a Lei de Ohm. A condutncia (L) inversamente proporcional resistncia e medida em Ohm-1. Essa unidade atualmente denomina-se Siemens (smbolo S). Quando a distncia entre os eletrodos de 1 cm, tem-se: k = L/A onde k a condutncia especfica e A a rea do eletrodo. Por outro lado, a condutncia equivalente (Ce) relacionada com a condutncia especfica como: Ce = 1000 k/c onde c a concentrao do on em equivalente-grama/L. 4. Detetor de Fluorescncia O Detetor de Fluorescncia, utilizado em HPLC, equivalente a um Detetor de Ultravioleta. A nica diferena consiste na localizao (ortogonal e no linear) em relao ao caminho tico. Desse modo, captada apenas a radiao proveniente do processo de fluorescncia, caracterstico de certas classes de compostos. Assim, substncias que no fluorescem podem existir na amostra sem interferir na deteco. Uma importante aplicao a anlise de aminocidos em materiais biolgicos (ex.: teste do pezinho). Neste exemplo, os aminocidos so transformados em derivados fluorescentes com o reagente AQC (carbamato de aminoquinolil-N-hidroxisuccinimidila). Nove aminocidos podem ser analisados em aproximadamente dez minutos, em gradiente ternrio, com limite de deteco menor que 10 mg/L. 5. Detetor Eletroqumico O Detetor Eletroqumico, tambm utilizado em HPLC, basicamente uma clula eletroqumica. O analito oriundo da coluna, ao passar pela clula, oxidado (ou reduzido) pelo potencial aplicado, gerando uma corrente eltrica que proporcional sua concentrao. Existem dois tipos de detetores: a) Detetor coulomtrico: a amostra passa atravs da clula. Desse modo, todo o material oxidado (ou reduzido); b) Detetor amperomtrico: a amostra passa pela superfcie do eletrodo. Assim, apenas cerca de 1% a 5% do material realmente oxidado (ou reduzido).

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Desenvolvido para detectar traos (ppb a ppt) de ons, este detetor exige alta pureza de solventes e reagentes. A gua, por exemplo, deve ser deionizada, purificada em sistema Milli-Q ou equivalente e filtrada em filtros com 0,2 m (membrana de nylon 66) e sua resistividade deve ser ao menos 18,2 Mohm.cm. O fabricante inclusive aconselha que ao sair do sistema Milli-Q a gua passe em coluna com fase mvel C18 para extrao. 6. Detetor por Espalhamento da Luz com Evaporao Surgiu recentemente no mercado um detetor para HPLC que se apresenta como o detetor ideal. Este detetor, denominado Evaporative Light Scattering Detector (ELSD), emprega o fenmeno de espalhamento (ou disperso) da luz, tambm conhecido como Efeito Tyndall. Embora conhecido desde 1966, quando foi descrito por pesquisadores da Union Carbide australiana, apenas em anos recentes comeou a ser comercializado. A grande vantagem do ELSD sua universalidade (como o DIR) aliada a uma alta sensibilidade (como o DUV), alm de apresentar resposta proporcional massa, no requerendo portanto a preparao de soluo padro para calibrao, ou seja, no exige calibrao. Os Cromatogramas abaixo ilustram bem a importncia desse detetor.

Cromatograma A6.1 Anlise de cidos graxos com: a) Detetor UV (215 nm) e b) ELSD.

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O detetor de ndice de Refrao, embora universal, apresenta baixa sensitividade e no pode trabalhar com gradiente de polaridade. O detetor de Ultravioleta, embora apresente um Limite de Deteco muito mais baixo, somente detecta substncias que absorvam luz ultravioleta. Observe-se que no Cromatograma A6.1.a aparece um pico bastante proeminente de uma impureza presente em baixssima concentrao na amostra. Devido sua alta absortividade molar, a rea do pico bastante grande e alm disso acarreta um problema de resoluo entre si e o pico do componente 2. No cromatograma A6.1.b, obtido com um ELSD, esse problema desaparece totalmente, alm de obter-se um sinal mais alto para o componente 3, de baixa absortividade molar. A literatura j apresenta um grande nmero de mtodos analticos empregando um ELSD. Pode-se acrescentar que muitas vezes, principalmente devido baixa sensitividade do DIR, necessrio realizar-se uma derivao na amostra para que a mesma torne-se detectvel por um DUV ou um detetor de fluorescncia, como por exemplo, no caso de aminocidos. A derivao sempre um transtorno, por representar um trabalho a mais e uma fonte de erro a mais. No ELSD (Figura A6.1.) o efluente da coluna sofre trs processos, nessa ordem: a) nebulizao, por um gs inerte, b) evaporao da fase mvel em uma cmara aquecida e c) deteco da luz espalhada pelas partculas remanescentes. Por esta descrio torna-se bvia a talvez nica restrio do ELSD: s detecta substncias de mais alto ponto de ebulio que a fase mvel. A referncia 13 traz um review sobre ELSD, com 26 trabalhos cientficos cobrindo o perodo de 1966 a 1998.

Figura A6.1 Diagrama esquemtico de um ELSD

Alexandre Schuler - Cromatografia APNDICE 7 Estatstica 1. Erro estatstico

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Todo trabalho experimental dotado de erro. Trata-se aqui de dois tipos de erro: a) erro estatstico e b) erro sistemtico. O erro estatstico possui caractersticas aleatrias. Pode ser avaliado e minimizado, mas nunca anulado. Apresenta um comportamento gaussiano, isto , em um certo nmero de repeties, os valores que mais se afastam da mdia (aritmtica) ocorrem com menor freqncia e erros positivos e negativos de mesma grandeza ocorrem com igual freqncia. O erro sistemtico, por outro lado, um erro determinado, possui sinal ( positivo ou negativo). Em Cromatografia, o erro sistemtico corrigido automaticamente pelo prprio mtodo de clculo (Seo 6.3; p. 35). 2. Avaliao do erro estatstico Uma das maneiras de se medir o grau de disperso de um conjunto de resultados analticos (repeties) o desvio padro (s), o qual pode ser calculado com auxlio da equao s = [ (xi - x )2/(n 1)]1/2 (eq. 22) onde xi um resultado qualquer, x a mdia aritmtica e n o nmero de repeties. Esse parmetro denominado primeira estimativa do desvio padro, j que o verdadeiro desvio padro s pode ser calculado quando n tende para infinito. Entretanto, s s pode ser empregado quando n maior que 10. Como normalmente n muito pequeno (3 a 5 determinao em paralelo), emprega-se em seu lugar a segunda estimativa do desvio padro (sR): sR = Kn R (eq. 23)

onde R a amplitude, ou seja, a diferena entre o valor (resultado analtico) maior e o valor menor. O valor de Kn obtido da Tabela A7.1. 3. Avaliao da exatido Na realidade, erro de exatido o erro sistemtico, que seria corrigido pelo prprio mtodo analtico, conforme afirmado acima. Entretanto, o analista pode cometer erros operacionais que resultem em erro sistemtico (ex.: uso de solventes contendo impurezas que interfiram na identificao). O erro sistemtico pode ser avaliado com auxlio do teste t (de Student), que compara a concentrao real de uma soluo padro, preparada com todo critrio

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(por exemplo, preparada por um Laboratrio de Referncia) com a concentrao do padro empregado na calibrao do equipamento. A equao seguinte aplicada, com auxlio da Tabela A7.2: Tabela A7.1 - Valores de Kn para clculo de sR. n Kn 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0,8862 0,5908 0,4857 0,4299 0,3946 0,3698 0,3512 0,3367 0,3249

t=

X n s

(eq.24)

onde X a mdia aritmtica das n determinaes, a concentrao real, s calculado de acordo com a eq. 22 (p. 66) e t comparado com o valor tabelado (Tabela A7.2). Se o valor de tcalc for menor ou igual ao de ttab na coluna P = 95%, para o correspondente valor de n-1, o Laboratrio em avaliao est correto. Tabela A7.2 - Valores de t para aplicao do teste t. P (%) 95 12,706 4,303 3,182 2,776 2,571 2,447 2,365 2,306 2,262 2,228

n-1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

90 6,314 2,920 2,353 2,132 2,015 1,943 1,895 1,860 1,833 1,812

99 63,657 9,925 5,841 4,608 4,032 3,707 3,499 3,355 3,250 3,169

4. Avaliao da reprodutibilidade O objetivo comparar a preciso de um Laboratrio, de um analista, de um equipamento ou de um mtodo (ou um determinado procedimento) com outro. Aplica-se o teste F, que compara a disperso de um conjunto de dados com a de outro. Se as diferenas em preciso forem estatisticamente significativas, o valor de Fcalc ser maior que o valor de Ftab (Tabela A7.3). Para uso da eq. 25, o maior desvio padro colocado no numerador, de modo a ter-se um valor de F maior que 1.

Alexandre Schuler - Cromatografia

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F=

s2 A s2 B

(eq. 25)

Tabela A7.3 - Valores de F para aplicao do teste F (n -1) de B 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 (n - 1) PARA O MTODO A 3 4 5 6 7 8 216 225 230 234 237 239 19,2 19,2 19,3 19,3 19,4 19,4 9,9 9,1 9,0 8,9 8,8 8,8 6,6 6,4 6,3 6,2 6,1 6,1 5,4 5,2 5,1 5,0 4,9 4,8 4,8 4,5 4,4 4,3 4,2 4,2 4,4 4,1 4,0 3,9 3,6 3,7 4,1 3,8 3,7 3,6 3,5 3,4 3,9 3,6 3,5 3,4 3,3 3,2 3,7 3,5 3,3 3,2 3,1 3,1

1 161 18,5 10,1 7,7 6,6 6,0 5,6 5,3 5,1 5,0

2 200 19 8,6 6,9 5,8 5,1 4,7 4,5 4,3 4,1

9 241 19,4 8,8 6,0 4,8 4,1 3,6 3,3 3,1 3,0

10 242 19,4 8,8 6,0 4,8 4,1 3,6 3,3 3,1 3,0

5. Nmero ideal de repeties O nmero ideal de repeties (em paralelo) calculado com aplicao das eq. 26 e 27:

 =

t.s

(eq. 26)

L = 100/

(eq. 27)

Os dados so organizados no Quadro abaixo (os valores so exemplo fictcio), para facilitar a interpretao. Na ltima coluna indicada a diferena entre o valor de L atual e o da linha anterior. No momento em que a diferena (vale dizer, a diminuio na disperso dos valores, ou ainda o aumento na preciso) fica desprezvel, a critrio do analista, este adota o nmero anterior como sendo o nmero ideal de repeties. n 2 3 4 5 6 0,260 0,072 0,046 0,036 0,030 amostra A: = 1% L Dif. 26,0 7,2 18,8 4,6 2,6 3,6 1,0 3,0 0,6

Alexandre Schuler - Cromatografia 6. Expresso do resultado final

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Para explicitar o grau de confiabilidade em uma anlise, necessrio indicar os limites de confiana. Na prtica, comum definir os limites a partir da amplitude. Assim, um resultado Re representado como:

Re = X + R/2
Na realidade, caso o mtodo tenha sido submetido a uma avaliao estatstica completa, emprega-se a relao:

Re = X + t. Kn.
7. Clculo do coeficiente de correlao (r)

R n

Na Seo 10.4 (p. 56) foi solicitado o clculo do coeficiente de correlao. Este clculo realizado com uso da eq. 28: (eq. 28)

Para ordenar os clculos, faz-se uso do quadro abaixo, onde x e y so, respectivamente, concentrao e rea do pico. Ponto no 1 2 ... ... ... n Totais x x1 x2 ... ... ... xn x y y1 y2 ... ... ... yn y x.y x1.y1 x2.y2 ... ... ... xn.yn x.y x2 x12 x22 ... ... ... xn2 x2 y2 y12 y22 ... ... ... yn2 y2