Exame Bioqumica Analtica 2008/2009 1 Fase

1. Efectuaram-se duas centrifugaes, a 600g e a 1000g ao homogenato de figado. Seguidamente efectuou-se uma nova centrifugao com percoll. Explicar o procedimento. 1 fe!-se centrifugao diferencial, "ue separa compostos com tamanhos diferentes, a 600#, de forma a se o$ter um primeiro sedimento "ue cont%m c%lulas intactas, n&cleos e um so$renadante. ' so$renadante o$tido % novamente centrifugado a maior velocidade, 1000g, o$tendo-se no sedimento organitos de menores dimenses "ue na anterior, os mitocondrios. (lguns organitos de pe"uenas dimenses so arrastados pelos mitocondrios para o sedimento, sendo necess)rio separ)-los. *essupende-se o + pellet, efectuando-se uma centrifugao isopicnica, "ue separa consoante a densidade, com gradiente percoll, o$tendose os mitocondrios isolados numa &nica $anda. +. ,a separao de duas prote-nas ( e ., com p/06.1 e p/02.0, respectivamente, fe!-se uma cromatografia usando uma coluna 3E(ESephadex4 o tampo usado foi 5ris-67l 8p609: 0.01;. (p<s a lavagem da coluna aplicou-se um gradiente de 0-0.+; de ,a7l. Explicar o procedimento e prever a ordem de eluio. ' p6 usado % explicado pelo facto de as prote-nas se encontrarem mais est)veis a p6 alcalino. =tili!ou-se uma cromatografia de troca i<nica, permuta ani<nica, num gel 3E(E-Sephadex, com carga positiva. (o se utili!ar p6 alcalino as prote-nas vo ter carga negativa. ( prote-na ( tem carga glo$al mais negativa "ue a prote-na ., uma ve! "ue tem um p/ mais afastado do p6 do tampo utili!ado. 5ampo utili!ado foi o 5ris-67> por ser um tampo cati<nico 8em permuta ani<nica usa-se tampes cati<nicos, e vice-versa:. ?rote-nas ( e . ligam-se @ coluna, uma ve! "ue tem carga oposta @ da coluna. ,a lavagem da coluna so elu-das todas as prote-nas "ue no ficaram ligadas @ coluna. ( eluio das prote-nas ligadas @ coluna d)-se com $ase num gradiente de fora i<nica. Sendo a prote-na ( mais negativa, a . % elu-da em 1 lugar.

A. ( ;ucina % uma glicoproteina. Efectuou-se uma cromatografia para purificar a ;ucina, com gel lectina-Sephadex. ( lectina liga-se a l-pidos. '$tem-se

primeiramente um pico a +90nm. ( ;ucina % ento eluida "uando se Bunta ao tampo ,-acetilglucosamina. Explicar o procedimento. 7omatografia de troca i<nica, "ue tem por $ase relaes $ioespecificas entre ligandos e a macromolecula "ue pretendemos purificar. ' gl-cido da mucina liga-se @ lectina. ?assa-se um volume de tampo, o mesmo tampo com "ue se tinha e"uili$rado a coluna, sendo eluidas todas as prote-nas "ue no se ligaram @ lectina. '$tCm-se uma leitura a +90nm uma ve! "ue os amino)cidos arom)ticos das prote-nas o$tidas lCem-se a +90nm. (diciona-se tampo com ,-acetilglucosamina, "ue % um gl-cido, e "ue vai competir pelos ligandos, fa!endo com "ue a mucina seBa eluida. D. Separao de + compostos, acetofenona 8no ioni!a em grande extenso: e )cido $en!<ico 8pEa0 "ual"uer coisa:. 3o as condies da coluna 8*?19: e do tampo, e os tempos de reteno para A valores de p6 diferentes. Fase m<vel % 6+'e metanolG)cido ac%tico. (presentam os nomes de variados )cidos gordos. a. 7aracteri!ar a t%cnica, Bustificar a ordem de eluio e a alterao do *t do )cido $en!<ico, e Bustificar o facto de a fase m<vel ser )cida. $. 7omo diminuir o *t do )cido $en!<ico 8o acido $en!<ico % o pico D apresentado no cromatograma:H a:

( fase m<vel % acidificada para se retirar a carga dos )cidos gordos I supresso i<nica. 7romatografia de fase reversa, com fase estacionaria de 19 car$onos- apolar Fase m<vel % polar 'rdem de eluioJ sai primeiro o )cido gordo mais polar 8o "ue tiver mais duplas ligaes % o mais polar:

$: (lterar a fase m<velJ aumentando o metanol ou diminuir a )gua de forma a tornar a fase m<vel mais polar. 1. AK. a: $: Lustificar a resoluo elevada. 7omo determinar ;;. S3S-?(#E cuBo gel de separao era 1+K e o de concentrao

a: S3S-?(#E % uma electroforese em condies desnaturantes 8S3S I detergente ani<nico "ue vai Ma$rirN a proteina, e .-mercaptoetanol "ue redu! ligaes per-sulfureto:. ' S3S liga-se @ prote-na 8"uanto maior a prote-na, mais S3S se liga @ mesma: sendo "ue a ra!o cargaOmassa das prote-nas % a mesma. ' gel a 1+K % fortemente encru!ado, com poros de diPmetro redu!ido exercendo um efeito de crivo molecular. ' gel a AK tem poros largos8 como se a electroforese se desse em soluo livre: Elevada resoluo por"ue no gel a AK as prote-nas ficam em $andas pelo processo de isotacoforese, entrando em $andas no gel a 1+K.

$: '$serva-se a distPncia de migrao de uma amostra com ;; conhecido, aplicada no mesmo gel. percorrida. 7urva de cali$rao com log ;; em funo da distPncia

6. Electroforese $idimensional I electrofocagem na primeira dimenso e electroforese em gel poliacrilamida com gradiente de poro, na segunda4 Bustificar a elevada resoluo.

1 electroforese tem como principio a separao de prote-nas com $ase nas suas diferenas de p/. + electroforese separa as prote-nas com $ase nos seus tamanhos, uma ve! "ue o tamanho dos poros do gel no % uniforme. Elevada resoluo explicada pelo facto se de explorarem diferentes caracter-sticas das mol%culas nas duas electroforeses.

2. 3escrio de uma focagem isoel%ctrica com gradiente de p6 entre A e 10 8com imagem, as $andas esto concentradas entre p6 A e 6.1:, deu uma resoluo $aixa. ' "ue fa!er para melhorarH

=sar um menor gradiente de p6, entre A e 6,1, uma ve! "ue as prote-nas esto concentradas na mesma !ona. =ma das $andas na electroforese apresenta uma espessura elevada. Esta pode dividir-se me diversas $andas a"uando a alterao do gradiente de p6, sendo evidente a presena de um maior n&mero de prote-nas.

9. a: tem haver com a existCncias de n-veis vi$racionais e rotacionais, para al%m dos n-veis electronicos

$:Sistema comJ

($s+900 QtirosinaRx1100 G QtriptofanoR1000 ($s+900 QtirosinaRx+100 G QtriptofanoR+600