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Disciplina de Bioqumica I Curso Prtico Depto. Gentica e Evoluo UFSCar

Profa. Dra. Maria Teresa Marques Novo Mansur/ Profa. Dra. Ana Paula Felicio Novello

PRTICA 1 : Estudo Qualitativo da Amilase Salivar Introduo: A digesto salivar se realiza atravs da ao da enzima amilase salivar, tambm chamada ptialina, que hidroliza o amido at a formao de acares de cadeia pequena como dissacardeos. Para a realizao da hidrlise do amido so necessrias certas condies adequadas, tais como pH e temperatura. Certos ons podem ainda ativar ou inibir a atividade enzimtica. Para se acompanhar a hidrlise enzimtica do amido pela amilase utiliza-se lugol (iodo/ iodeto de potssio), o qual reage com o amido, conferindo cor azul soluo. A colorao azul evidencia a presena do reagente, ainda no hidrolisado. Define-se como ponto acromtico o ponto em que os fragmentos da molcula do amido no formam mais o referido composto com o iodo.

1. Determinao do ponto acromtico Transfira para um bquer um pouco de saliva. Pipete 2 ml dessa saliva para uma proveta de 25 ml. Dilua para 20 ml com tampo fosfato (pH 6,8) (soluo 1:10). Homogenize bem a soluo, agitando gentilmente. Preparar previamente 12 tubos de ensaio contendo cada um 1 gota de soluo de lugol. Colocar 25 ml de soluo de amido 1% em bquer ou Erlenmeyer de 50 ml. Adicionar 1 ml da soluo de saliva 1:10, agitar e comear a marcar o tempo. Coletar imediatamente 0,5 ml dessa soluo (tempo~ zero) e transferir para um dos tubos de ensaio contendo a soluo de lugol. Agitar. A cada minuto de incubao repetir a retirada da alquota e adicionar a cada um dos tubos com lugol. Retirar as alquotas durante 10 minutos e comparar cada teste com um tubo-controle contendo 0,5 ml de gua e 1 gota de lugol (ponto acromtico). Retirar uma alquota aps 15 minutos e, se o ponto acromtico no tiver sido atingido, aps 30 minutos. Compare o seu resultado com o de outros

grupos para ter uma estimativa da variabilidade da atividade entre amostras de diferentes indivduos.

2. Efeito de ons cobre sobre a atividade da amilase salivar Repetir o teste anterior, adicionando 0,1 ml de soluo de sulfato de cobre 5% soluo de amido, antes da adio da saliva. Comparar os resultados com o teste anterior, realizado na ausncia do sulfato de cobre (a amostra de saliva deve ser da mesma pessoa do teste 1).

3. Efeito de ons cloreto sobre a atividade da amilase salivar reagentes saliva 1:10 amido 1% NaCl 4% gua destilada Tubo 1 4 ml 1 ml 1 ml Tubo 2 1 ml 4 ml 1 ml Tubo 3 1 ml 4 ml 1 ml -

Agite bem as solues, inicie a contagem do tempo e retire imediatamente 1 ml de cada tubo, adicionando a 1 gota de lugol em tubos de ensaio separados (tempo~zero). Incube os tubos 1, 2 e 3 temperatura ambiente e repita a reao com lugol aps 5 e 10 minutos do comeo da atividade enzimtica.

4. Efeito da temperatura 4.1. Desnaturao enzimtica reagentes/ procedimento saliva NaCl 4% gua destilada Aquecimento a 100oC (5 min) Tubo 1 0,5 ml 2 ml no Tubo 2 1 ml 0,5 ml 1 ml sim Tubo 3 1 ml 0,5 ml 1 ml no

Aps aquecimento apenas do tubo 2, adicionar 2 ml de amido 1% a todos os tubos, agitar e incubar a temperatura ambiente. Aps 15 minutos adicionar 1 gota de lugol a cada tubo e agitar. Observar o resultado.

4.2. Temperatura tima de atividade

reagentes saliva 1:10 NaCl 4% amido 1% temperatura de incubao (oC) gua destilada

Tubo 1 0,5 ml 2 ml ambiente

Tubo 2 1 ml 0,5 ml 2 ml 0o

Tubo 3 1 ml 0,5 ml 2 ml ambiente

Tubo 4 1 ml 0,5 ml 2 ml 37 o

Tubo 5 1 ml 0,5 ml 2 ml 60 o

1 ml

Agite os tubos e incube imediamente nas diferentes temperaturas, por 10 minutos. Aps esse tempo de incubao, adicione 1 gota de lugol a cada tubo. Observar e explicar os resultados.