C

i
r
c
u
l
a
r
T

c
n
i
c
a
63
ISSN 1517-1965

Adequao da Metodologia Kjeldahl para
determinao de Nitrognio Total e
Protena Bruta

A quantidade de produtos qumicos que liberado no meio ambiente como emisses
de rotina de laboratrios enorme e apresenta um grande risco sade da
sociedade. No entanto, as vantagens que esses produtos podem trazer para a
indstria qumica moderna e as pesquisas cientficas de um modo geral so
indiscutveis. Nesse contexto, uma poltica que venha a ter como objetivo evitar a
gerao de resduos na fonte, com a aplicao de tecnologias que utilizem menores
quantidades de matria-prima e recursos naturais em geral, imprescindvel
(Alberguini, 2005). Aes de programas de gerenciamento de resduos devem estar
norteadas para a minimizao ou mesmo eliminao de alguns resduos produzidos
nos laboratrios. Uma das estratgias recomendadas para se adequar a esta nova
realidade substituir ou diminuir a quantidade de reagentes, ou ainda, modificar
procedimentos (Simeone, 2005).
Com o objetivo de diminuir a quantidade de resduos gerados e, conseqentemente,
custos este trabalho prope uma adequao do mtodo de Kjeldahl a partir da
reduo na quantidade de cada reagente utilizado durante o processo para a
determinao do nitrognio total. Foram realizados ensaios com amostras de trs
espcies de forrageiras da regio do Pantanal (Andropogon bicornis, Reimarochloa
sp. e Luziola subintegra) e uma amostra padro de referncia do Programa
Colaborativo Interlaboratorial coordenado pela Embrapa Meio Ambiente. Anlises
estatsticas foram realizadas para averiguar a preciso da nova metodologia proposta.
Princpio
A determinao do nitrognio total (NT) proposta por Kjeldahl em 1883, ainda
muito usada por ser uma tcnica confivel, com rotinas bem estabelecidas e ao
longo do tempo permaneceu praticamente a mesma com poucas modificaes
(Vogel, 1992). Esta tcnica possibilita a determinao indireta de protenas em vrias
amostras biolgicas, assim como o nitrognio em plantas para a avaliao do estado
nutricional (Yasuhara e Nokihara, 2001; Nogueira e Souza, 2005).
O mtodo baseado na decomposio da matria orgnica atravs da digesto da
amostra a 400
o
C com cido sulfrico concentrado, em presena de sulfato de cobre
como catalisador que acelera a oxidao da matria orgnica. O nitrognio presente
na soluo cida resultante determinado por destilao por arraste de vapor,
seguida de titulao com cido diludo (Nogueira e Souza, 2005).
As reaes qumicas que se passam durante o processo da determinao dos
compostos nitrogenados podem ser assim resumidas (Silva, 1990):

Digesto
Durante a digesto (Figura 1A) ocorrem as seguintes reaes:
M a t ria O rg n ic a

H
2
S O
4
S O
2
+

C O
2
+ H
2
O +

R N H
2
R N H
2 H
2
O
H
2
S O
4

+ R O H + N H
3
R C
O
N H
2
+ H
2
O

[H
+
]
R C
O
O H
N H
3
+
N H
3
2 H
2
S O
4
+
(N H
4
)
2
S O
4

Corumb, MS
Maio, 2006
Autores
Fbio Galvani
Qumico, Dr. em Cincias e
Engenharia de Materiais
Embrapa Pantanal
CP 109, Corumb, MS.
CEP 79320-900.
fgalvani@cpap.embrapa.br
Eliney Gaertner
Bilogo
Embrapa Pantanal
CP 109, Corumb, MS.
CEP 79320-900.
eliney@cpap.embrapa.br
Adequao da Metodologia Kjeldahl para determinao de Nitrognio Total e Protena Bruta

2

Figura 1. (A) Digesto de uma amostra para a determinao de nitrognio total. (B) Mudana de colorao da
soluo durante o processo da digesto.

O carbono contido na matria orgnica oxidado e o dixido de carbono (CO2) se desprende. Durante o
processo da digesto a soluo passa de uma colorao escura (preto) para um verde claro (Figura 1B).
Alm dos agrupamentos proticos, existe o nitrognio sob a forma de amina, amida e nitrila, que
transformado em amnia (NH3) a qual reage com o H2SO4, formando o sulfato de amnio ((NH4)2SO4) conforme
mostrado nas reaes durante a digesto, e esse ao esfriar forma cristais.

Destilao
Aps a digesto inicia-se o processo de destilao (Figura 2A) que pode ser feita por aquecimento direto ou por
arraste de vapor. O sulfato de amnio tratado com hidrxido de sdio (NaOH), em excesso, ocorrendo a
liberao de amnia, conforme as reaes:

(NH
4
)
2
SO
4
NaOH 2

2 NH
4
OH Na
2
SO
4
NH
4
OH

NH
3
H
2
O


Ao se adicionar o hidrxido de sdio, deve-se utilizar algumas gotas de soluo indicadora, no destilador, para
garantir um ligeiro excesso de base. A amnia que desprende na reao coletada num frasco contendo cido
brico (H3BO3) com o indicador, previamente adaptado ao conjunto da destilao.
Considera-se terminado o processo, quando toda a amnia j se desprendeu. A soluo contendo cido brico
com o indicador que no incio apresentava colorao rsea adquire a cor azulada (Figura 2B) medida que vai
se formando o borato de amnio (NH4H2BO3), conforme a reao:
H3BO3 + NH3 NH4H2BO3


Figura 2.(A) Processo de destilao.(B) Formao do borato de amnio.
A B
A
B
Adequao da Metodologia Kjeldahl para determinao de Nitrognio Total e Protena Bruta

3

Titulao
A ltima etapa do processo corresponde a titulao (Figura 3A). O borato de amnio titulado com uma
soluo padro de cido clordrico (HCl) de ttulo conhecido at a viragem do indicador (Figura 3B), conforme a
reao:
NH4H2BO3 + HCl H3BO3 + NH4CL


Figura 3. (A) Titulao para a determinao da dosagem de nitrognio. (B) Viragem na titulao para a
determinao da dosagem de nitrognio total.

O nitrognio total (NT) determinado pela seguinte equao:
NT = (Va Vb) x F x 0,1 x 0,014 x 100
P1
Onde:
NT teor de nitrognio total na amostra, em percentagem;
Va volume da soluo de cido clordrico gasto na titulao da amostra, em mililitros;
Vb volume da soluo de cido clordrico gasto na titulao do branco, em mililitros;
F fator de correo para o cido clordrico 0,01 mol/L;
P1 massa da amostra (em gramas).
Na determinao da protena bruta, multiplica-se o valor do nitrognio total encontrado pelo mtodo de Kjeldahl
por um fator que converte o nitrognio em protena. Convencionalmente, em amostras de alimentos para
animais: plantas forrageiras, raes concentradas, entre outros materiais, a protena bruta (PB) expressa pelo
fator 6,25, considerando que a maioria das protenas contm nas suas molculas aproximadamente 16% de
nitrognio. A expresso abaixo utilizada para determinar a protena bruta:

PB = NT x FN
Onde:

PB teor de protena bruta na amostra, em percentagem;
FN 6,25.

Expressa-se o resultado corrigido, tendo-se como base de correo a matria seca a 105
o
C.
Deve se fazer testes em branco com o objetivo de eliminar a interferncia e contaminao dos reagentes.

A
B
Adequao da Metodologia Kjeldahl para determinao de Nitrognio Total e Protena Bruta

4
Parte Experimental
Materiais e Equipamentos
Bloco digestor;
Capela para exausto de gases;
Destilador de nitrognio;
Bureta automtica;
Agitador magntico;
Erlenmeyer de 50 mL;
Balana analtica - preciso ( 0,0001g);
Tubo de ensaio com borda reforada (25x250 mm);
Frascos dosadores de reagente;
Esptula;
Papel impermevel.

Reagentes e Solues
cido sulfrico (H2SO4 d=1,84), p.a., concentrado;
Hidrxido de sdio (NaOH) a 40% (m/v);
Sulfato de sdio (Na2SO4);
Sulfato de cobre pentaidratado (CuSO4.5H2O);
cido clordrico (HCl) 0,01 mol/L;
Soluo alcolica de verde de bromocresol, a 0,1% (m/v);
Soluo alcolica de vermelho de metila a 0,1% (m/v);
Soluo alcolica de vermelho de metila a 0,04% (m/v);
Soluo de cido brico, a 2% (m/v).

Mistura Catalisadora
Pesar 1000 g de sulfato de sdio anidro, pesar 50 g de sulfato de cobre pentaidratado. Em um recipiente
misturar os reagentes e em seguida acondicionar em frasco com tampa. Segundo a metodologia descrita no
Manual de Laboratrios: Solo, gua, Nutrio Animal e Alimentos (Nogueira e Souza, 2005), 2,5 g de selnio
em p so adicionados na mistura catalisadora. Neste trabalho optou-se por no usar o selnio como
catalisador com o intuito de minimizar a gerao de resduos durante o processo.

Soluo receptora indicadora
Misturar 1000 mL de soluo de cido brico a 2%, 6 mL de soluo alcolica de vermelho de metila a 0,1% e
15 mL de soluo alcolica de verde de bromocresol.

Procedimento
Foram realizadas cinco baterias de testes com 30 amostras por bateria. As amostras analisadas foram de trs
espcies de forrageiras (Andropogon bicornis, Reimarochloa sp. e Luziola subintegra), que geralmente
apresentam nveis diferenciados da concentrao de nitrognio total e protena bruta, alm de uma amostra
padro de referncia (Volumoso AR4) do Programa Colaborativo Interlaboratorial (PCI) ano 7 de 2004
coordenado pela Embrapa Meio Ambiente.
A determinao do nitrognio total e protena bruta foram realizadas pelo processo de digesto Kjeldahl
conforme metodologia atual adotada pela Embrapa e descrita no Manual de Laboratrios: Solo, gua, Nutrio
Animal e Alimentos (Nogueira e Souza, 2005), porm a quantidade de amostra e de cada reagente utilizado
para o estudo da adequao da metodologia foram reduzidos conforme apresentado na Tabela 1. Determinou-
se a matria seca de cada amostra a 105
o
C para fazer a correo e expressar os resultados de protena bruta.

Adequao da Metodologia Kjeldahl para determinao de Nitrognio Total e Protena Bruta

5
Tabela 1. Quantidade de amostra e reagentes utilizados nos processos para a determinao do nitrognio total
segundo: MA metodologia atual (Nogueira e Souza, 2005) e MP - mtodo proposto neste estudo.

Componente MA MP
Amostra 0,1-0,2 g 0,03-0,04 g
Mistura catalisadora 2 g 0,4-0,45 g
cido sulfrico concentrado 5 mL 0,65 mL
gua destilada (aps a digesto) 20 mL 2 mL
Soluo receptadora indicadora 10 mL 1,25 mL
Hidrxido de sdio a 40% 15 mL 6,20 mL
cido clordrico 0,1mol/L 0,01 mol/L
Aps a obteno dos resultados pelas duas metodologias, foi realizada uma anlise estatstica para averiguar a
preciso da metodologia proposta, comparando-se os dados de protena bruta da amostra de referncia
(Volumoso AR4) fornecidos pelo PCI com os obtidos pela metodologia proposta. Realizou-se tambm um
levantamento da descrio estatstica dos resultados de nitrognio total e protena bruta das demais amostras.

Resultados e Discusses

Na Tabela 2 encontram-se os resultados de matria seca das amostras estudadas que serviro como base para
o clculo corrigido dos valores de protena bruta.
Tabela 2. Matria seca a 105
o
C das amostras estudadas.

Amostra Matria Seca (%)
Volumoso AR4 93,32
Andropogon bicornis 92,22
Reimarochloa sp. 92,57
Luziola subintegra 91,57

Na Tabela 3 encontram-se os resultados de nitrognio total e protena bruta das amostras analisadas. Os
valores de protena bruta esto corrigidos com base nos resultados de matria seca a 105
o
C de cada material.

Adequao da Metodologia Kjeldahl para determinao de Nitrognio Total e Protena Bruta

6
Tabela 3. Resultados de nitrognio total e protena bruta das amostras estudadas.
Volumoso
AR4 (MA)
Volumoso
AR4 (MP)
Andropogon
bicornis
Reimarochloa sp. Luziola
subintegra
Nmero
da amostra
NT
(%)
PB
(%)
NT
(%)
PB
(%)
NT
(%)
PB
(%)
NT
(%)
PB
(%)
NT
(%)
PB
(%)
1 1,32 8,84 1,42 9,54 0,35 2,35 1,11 7,47 1,76 12,03
2 1,32 8,84 1,42 9,54 0,34 2,33 1,10 7,43 1,78 12,12
3 1,38 9,29 1,42 9,52 0,32 2,15 1,11 7,47 1,81 12,35
4 1,33 8,90 1,45 9,70 0,37 2,51 1,12 7,53 1,78 12,13
5 1,37 9,17 1,43 9,60 0,37 2,49 1,12 7,54 1,72 11,72
6 1,39 9,32 1,39 9,29 0,36 2,44 1,13 7,62 1,74 11,91
7 1,37 9,19 1,42 9,50 0,37 2,48 1,11 7,47 1,74 11,91
8 1,33 8,87 1,41 9,46 0,33 2,26 1,07 7,24 1,77 12,09
9 1,34 8,95 1,41 9,42 0,37 2,51 1,11 7,48 1,78 12,15
10 1,37 9,16 1,44 9,67 0,37 2,53 1,10 7,42 1,73 11,81
11 1,33 8,88 1,41 9,45 0,36 2,46 1,11 7,50 1,81 12,37
12 1,33 8,91 1,39 9,32 0,36 2,46 1,11 7,49 1,86 12,72
13 1,34 8,96 1,44 9,66 0,36 2,45 1,10 7,46 1,86 12,69
14 1,35 9,06 1,42 9,49 0,36 2,47 1,10 7,46 1,90 12,99
15 1,32 8,87 1,39 9,33 0,35 2,36 1,13 7,63 1,90 12,96
16 1,38 9,25 1,44 9,66 0,36 2,45 1,11 7,47 1,88 12,80
17 1,34 8,96 1,45 9,74 0,36 2,45 1,10 7,46 1,86 12,72
18 1,33 8,93 1,39 9,31 0,37 2,48 1,13 7,66 1,93 13,17
19 1,32 8,83 1,38 9,63 0,35 2,39 1,15 7,77 1,87 12,75
20 1,44 9,68 0,35 2,35 1,14 7,70 1,84 12,57
21 1,45 9,72 1,37 9,18 0,35 2,39 1,06 7,18 1,74 11,89
22 1,36 9,12 1,41 9,45 0,37 2,50 1,09 7,28 1,81 12,38
23 1,35 9,01 1,36 9,14 0,35 2,38 1,05 7,11 1,82 12,44
24 1,36 9,14 1,45 9,71 0,36 2,46 1,13 7,66 1,85 12,64
25 1,37 9,17 1,41 9,41 0,36 2,44 1,05 7,07 1,84 12,58
26 1,28 8,58 1,42 9,49 0,34 2,33 1,08 7,30 1,82 12,39
27 1,30 8,71 1,40 9,38 0,41 2,75 1,06 7,17 1,88 12,85
28 1,34 8,95 1,46 9,75 0,33 2,27 1,08 7,29 1,80 12,27
29 1,33 8,90 1,43 9,56 0,36 2,45 1,07 7,24 1,83 12,50
30 1,31 8,76 1,44 9,63 0,34 2,33 1,06 7,18 1,83 12,44
* No determinado, pois se perdeu a amostra durante a anlise.

A preciso de uma metodologia representa a disperso de resultados entre ensaios independentes, repetidos de
uma mesma amostra, amostras semelhantes ou padres, sob condies definidas. A preciso avaliada pelo
desvio padro (s) e/ou coeficiente de variao (CV) das medidas obtidas, que utiliza um nmero significativo de
medies, normalmente maior que 20 (Ribani, 2004), onde o coeficiente de variao no deve ultrapassar 15%
(Valentini, 2002).
Comparando-se os dados estatsticos de protena bruta da amostra de referncia (Volumoso AR4) com os
obtidos pela metodologia atual empregada pela Embrapa e a metodologia proposta (Tabela 4) pode-se avaliar a
preciso da nova metodologia. Tanto o desvio padro quanto o coeficiente de variao, determinados pela
metodologia em estudo so menores que os fornecidos pela metodologia atual da Embrapa e pelo PCI.
Portanto as alteraes nas quantidades dos reagentes proposta pela metodologia em estudo no influenciaram
significativamente nos resultados de protena bruta e apresentaram preciso compatvel com a metodologia
atualmente utilizada.
Adequao da Metodologia Kjeldahl para determinao de Nitrognio Total e Protena Bruta

7

Tabela 4. Anlise estatstica de protena bruta (PB) para amostras de referncia do volumoso AR4 do Programa
Colaborativo Interlaboratorial (PCI) ano 7 de 2004, amostras submetidas a metodologia atual (MA) empregada
na Embrapa e amostras submetidas a metodologia proposta (MP).

Parmetro PCI ano 7 de 2004 MA MP
Mdia (M) 9,54 9,01 9,51
Desvio padro (s) 0,65 0,23 0,17
Coeficiente de variao (CV %) 6,86 2,51 1,72
Nmero de determinaes (N) 183 29 30

Foram realizados testes com diferentes espcies forrageiras (Andropogon bicornis, Reimarochloa sp. e Luziola
subintegra) utilizando a metodologia proposta. Estas espcies geralmente apresentam nveis diferenciados da
concentrao de nitrognio total e protena bruta. As avaliaes estatsticas para os resultados de nitrognio
total e protena bruta encontram-se nas Tabelas 5 e 6 respectivamente.


Tabela 5. Anlise estatstica para o nitrognio total das espcies: Andropogon bicornis, Reimarochloa sp. e
Luziola subintegra determinadas com a metodologia proposta.

Nitrognio Total Andropogon
bicornis
Reimarochloa sp. Luziola subintegra
Mdia (M) 0,360 1,100 1,820
Erro padro 0,003 0,005 0,010
Desvio padro (s) 0,017 0,027 0,056
Varincia da amostra 0,0003 0,0007 0,0031
Intervalo 0,090 0,100 0,210
Mnimo 0,320 1,050 1,720
Mximo 0,410 1,150 1,930
Coeficiente de variao (CV %) 4,680 2,490 3,070
Nmero de determinaes (N) 30 30 30







Adequao da Metodologia Kjeldahl para determinao de Nitrognio Total e Protena Bruta

8

Tabela 6. Anlise estatstica para a protena bruta das espcies: Andropogon bicornis, Reimarochloa sp. e
Luzioloa subintegra determinadas com a metodologia proposta.

Protena Bruta Andropogon bicornis Reimarochloa sp. Luziola subintegra
Mdia (M) 2,42 7,43 12,41
Erro padro 0,02 0,03 0,07
Desvio padro (s) 0,11 0,18 0,38
Varincia da amostra 0,01 0,03 0,14
Intervalo 0,60 0,70 1,45
Mnimo 2,15 7,07 11,72
Mximo 2,75 7,77 13,17
Coeficiente de variao (CV %) 4,40 2,46 3,06
Nmero de determinaes (N) 30 30 30

Os parmetros estatsticos de nitrognio total e protena bruta das espcies forrageiras indicaram um baixo
grau de disperso dos resultados e auxiliaram na confirmao da preciso da metodologia proposta.

Concluses
A nova metodologia proposta possibilitou atingir os objetivos especficos do trabalho: diminuir a quantidade de
resduos gerados, o consumo de reagentes e os custos para a determinao de nitrognio total e protena bruta
pelo mtodo Kjeldhal. Alm disso, foi verificado que as alteraes nas quantidades dos reagentes proposta
neste mtodo no influenciaram significativamente nos resultados e na preciso do mesmo.
Diante destes resultados, esta metodologia passou a ser adotada como anlise padro pela Embrapa Pantanal
para a determinao de nitrognio total e protena bruta de tecidos, produtos e subprodutos de origem animal e
vegetal.

Agradecimentos
s pesquisadoras Dra. Sandra Aparecida Santos e Dra. Sandra Mara Arajo Crispim por permitirem utilizar as
espcies forrageiras de seus respectivos projetos de pesquisa neste estudo. equipe de apoio tcnico:
Reynaldo Sidney Brando Pereira e Rosilene Gutierrez pelo auxlio no registro das fotografias e Miguel Ageu de
Faria Gonalves pelo auxlio no registro das fotos e na realizao das anlises.

Referncias Bibliogrficas
ALBERGUINI, L. B. A. Gerenciamento e tratamento de resduos qumicos. In: Encontro Nacional sobre
Metodologias de Laboratrios da Embrapa, 10. So Carlos, 2005. Resumos...So Carlos: Embrapa Pecuria
Sudeste, 2005.
NOGUEIRA, A. R. A.; SOUZA, G. B. Manual de Laboratrios: Solo, gua, Nutrio Vegetal, Nutrio Animal e
Alimentos. So Carlos: Embrapa Pecuria Sudeste, 2005. 313p.
RIBANI, M. Validao em mtodos cromatogrficos e eletroforticos. Qumica Nova, v. 27, n. 5, p. 771-780,
2004.
SILVA, D. J. Anlise de alimentos (mtodos qumicos e biolgicos). 2 ed. Viosa: UFV, 1990. 165p.
Adequao da Metodologia Kjeldahl para determinao de Nitrognio Total e Protena Bruta

9
Circular
Tcnica, 63
Ministrio da Agricultura,
Pecuria e Abastecimento
Exemplares desta edio podem ser adquiridos na:
Embrapa Pantanal
Endereo: Rua 21 de Setembro, 1880
Caixa Postal 109
CEP 79320-900 Corumb, MS
Fone: 67-32332430
Fax: 67-32331011
Email: sac@cpap.embrapa.br
1 edio
1 impresso (2006): formato digital
Comit de
Publicaes
Presidente
ecretrio-Executivo
Membros
Supervisor editorial
Reviso de texto
Tratamento das ilustraes
Editorao eletrnica
:
:
:
:
:
:
:

Thierry Ribeiro Tomich
S S ana Maria Salis
Debora Fernandes Calheiros
Marcal Henrique Amici Jorge
Jorge Antnio Ferreira de Lara
Regina Clia Rachel dos Santos
Suzana Maria Salis
Mirane dos Santos Costa
Regina Clia R. Santos
Regina Clia R. Santos
uz
Expediente
SIMEONE, M. L. Implementao de um programa de gerenciamento de resduos em laboratrios. In: MET
Encontro Nacional sobre Metodologias de Laboratrios da Embrapa, 10. So Carlos, 2005. ResumosSo
Carlos: Embrapa Pecuria Sudeste, 2005.
YASUHARA, T.; NOKIHARA, K. High-throughput analysis of total nitrogen content that replaces the classic
Kjeldahl method. Journal of agricultural and food chemistry, v. 49, p. 4581-4583, 2001.
VALENTINI, S. A. Atributos da validao da metodologia analtica do Captopril num programa de garantia de
qualidade. 75p. 2002. Dissertao (Mestrado) - Programa de Ps-Graduao em Engenharia de Produo,
Universidade Federal de Santa Catarina, 2002. Disponvel em:
<http://teses.eps.ufsc.br/defesa/pdf/8241.pdf> .Acesso em: 22 fev. 2006.
VOGEL, A. I. Anlise Qumica Quantitativa. Traduo: Horcio Macedo. 5 ed. Rio de Janeiro: Guanabara
Koogan S. A., 1992. 712p.