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doenas infecciosas
Jorge L M Sampaio
Panorama atual
As possibilidades e oportunidades so inmeras
Novas tecnologias com custo elevado
Presso dos pagadores para reduo dos custos em
sade
Reduo da atuao humana com automao da
extrao, amplificao e interfaceamento com sistema
de apoio deciso
Nvel de automao depende do nmero de exames
consolidao de laboratrios de anlises clnicas
O grande desafio reduzir custos mantendo ou
aumentando a qualidade do resultado
Perguntas
Quais as doenas (excetuando as virais) nas
quais os mtodos moleculares so essenciais?
Que tipos de alvos devem ser
prioritariamente selecionados e quais as
principais estratgias?
Quais as principais metodologias aplicveis ao
laboratrio clnico?
Problema
O uso de antimicrobianos que alteram a
microbiota entrica est relacionado ocorrncia
de diarria causada por Clostridium difficile.
Em vrios casos nos quais h evidncias clnicas e
epidemiolgicas sugerindo essa etiologia, a
pesquisa das toxinas A e B nas fezes negativa.
Algumas cepas so mais virulentas em funo de
maior produo e toxinas
Analisando
Qual o padro ouro?
Cultura em meio seletivo seguido de teste de
toxigenicidade
Prazo de 5 a 7 dias
C. difficile
Performance do teste
Clostridium difficile
Outra estratgia
Animao
Reanalisando
Realmente simplificando
Neisseria gonorrhoeae
Paciente de 25 anos, sem parceiro sexual fixo,
apresenta cervicite e uretrite.
Foram coletadas amostras endocervical e uretral:
Bacterioscpico com raros diplococos Gram-negativos
intracelulares
Cultura em meio seletivo para Neisseria: NEGATIVA
Neisseria gonorrhoeae
Hjelmevoll, 2008
360 amostras (185 homens e 57 mulheres)
37 positivas por cultura e Rt-PCR para gene porA
15 positivas apenas por RT-PCR, confirmadas por
sequenciamento de rRNA 16S
Chlamydia trachomatis
Sem parede celular
Patgeno de multiplicao intracelular
obrigatria
Uretrite
Cervicite
Salpingite infertilidade/esterilidade
Mtodos disponveis
Isolamento em cultura de clulas McCoy
padro ouro
Imunofluorescncia sensibilidade 88%
RT-PCR/Amplicor sensibilidade 97%
SeptiFast
Deteco de DNA bacteriano ou fngico
em sangue total
Escherichia coli
Klebsiella sp.
Enterobacter sp.
Proteus mirabilis
Pseudomonas aeruginosa
Acinetobacter baumannii
Stenotrophomonas
maltophilia
Staphylococcus aureus
SCN
Streptococcus
pneumoniae
Streptococcus spp.
Enterococcus faecalis
Enterococcus faecium
SeptiFast
Deteco de DNA bacteriano ou
fngico em sangue total
Candida albicans
Candida tropicalis
Candida parapsilosis
Candida krusei *
Candida glabrata *
Aspergillus fumigatus
Tempo de Anlise
Hemocultura
Transporte/abertura de ficha
1 hora
Incubao em equipamento
com leitura a cada 10 min
Deteco em 6 a 72 horas
Bacterioscpico e semeadura
ou inoculao e sistema de
automao
8 a 24 horas identificao
Total 15 a 96 horas para
possvel interveno
SeptiFast
3 ml de sangue total
Transporte/abertura de ficha
Extrao do DNA = 2 h
Amplificao do DNA, anlise
e identificao da espcie = 3
h
Total 6 horas para possvel
interveno
Bases Moleculares
Bactrias de crescimento rpido e fungos tm
mltiplos operons de rRNA
Alvo com mltiplas cpias no cromossomo
maior sensibilidade
Como Funciona
Vrias reaes de PCR
Anlise de curva de melting
ICAAC 2008
Schaub et al. , Sua
Testes positivos
Comparando os Mtodos
Padro Ouro a Clnica
Consideraes
H necessidade de estudos para a avaliao
do impacto na mortalidade e tempo de
internao
Sensibilidade semelhante hemocultura
Menor tempo de resposta
Redirecionamento do tratamento na sepse
por P. aeruginosa, A. baumannii, S.
maltophilia ou Candida krusei/C. glabrata ?
Caso clnico
Paciente de 34 anos, sexo masculino, HIV
soropositivo apresenta, h duas semanas, febre,
diarria e dor em membro inferior direito em
topografia de cicatriz cirrgica.
H cerca de trs meses havia sido submetido a
cirurgia ortopdica com colocao de haste de
fixao em funo de fratura traumtica de fmur.
A tomografia computadorizada de MI evidenciou
abscesso no stio cirrgico e sinais de osteomielite.
Caso clnico
O paciente foi submetido drenagem cirrgica da
leso e o material enviado para cultura geral, fungos
e micobactrias
Foram iniciados ceftazidima e vancomicina
Aps duas semanas no houve crescimento
bacteriano ou fngico
Em funo da persistncia da febre foi solicitada a
coleta de trs hemoculturas
Giemsa
Identificao
Identificao
Realizada extrao do DNA do crescimento em
Karmali.
Amplificao e sequenciamento parcial do gene que
codifica a subunidade 16S do RNA ribossmico (rRNA
16S).
Outras aplicaes
Identificao do Complexo M. tuberculosis e
diferenciao de M. bovis e M. bovis BCG.
Complexo M. tuberculosis
55
55,0
Mycobacterium avium/intracellulare
22
22,0
Mycobacterium abscessus
8,0
Mycobacterium kansasii
7,0
Mycobacterium gordonae
2,0
Mycobacterium spp.
6,0
Regio DR
DR
DR
30
30
DR
DR
31
31
DR
DR
32
25
DR
DR
37
32
DR
DR
38
33
DR
39
DR
DR
40
DR
41
DR
42
M.tuberculosis
34
DR
35
DR
36
DR
37
M.bovis
selvagem
33
DR
34
DR
35
DR
36
M.bovis BCG
99 bp
DR
30
DR
31
DR
25
DR
32
DR
33
DR
172 bp
99 bp
PCR Multiplexo
No permite diferenciao
Espcies do Complexo MTB
Seqenciamento de DNA
Fundamentos
DNA
RNA
Ligao Fosfodister
Ligao Fosfodiester
Sequenciamento de DNA
cycseqpc.exe
Automao HIV-HCV-HBV
Automao
Automao
Automao