DISSERTAÇÃO20

CAROLINE WERNER PEREIRA DA SILVA
ANLISE DE BIOFUDOS ATRAVS DE RMN ALIADA A

QUIMIOMETRIA PARA CARACTERIZAO DE TUMORES E SEU
DIAGNSTICO PRECOCE
Dissertao apresentada como requisito

parcial obteno do grau de Mestre pelo
Programa de Ps-Graduao em Qumica
rea de Qumica Orgnica, do Setor de
Cincias Exatas da Universidade Federal do
Paran.
Orientador: Prof. Dr. Andersson Barison

Co-orientadores: Prof. Dr. Fbio Simonelli
Prof. Dra. Francinete Ramos Campos
CURITIBA
2010
CAROLINE WERNER PEREIRA DA SILVA
ANLISE DE BIOFUDOS ATRAVS DE RMN ALIADA A

QUIMIOMETRIA PARA CARACTERIZAO DE TUMORES E SEU
DIAGNSTICO PRECOCE
Dissertao apresentada como requisito

parcial obteno do grau de Mestre pelo
Programa de Ps-Graduao em Qumica
rea de Qumica Orgnica, do Setor de
Cincias Exatas da Universidade Federal do
Paran.
Orientador: Prof. Dr. Andersson Barison

Co-orientadores: Prof. Dr. Fbio Simonelli
Prof. Dra. Francinete Ramos Campos
CURITIBA
2010
Para meus queridos pais.
AGRADECIMENTOS
Ao Professor Andersson Barison pela orientao.

A Professora Francinete Ramos Campos pela sua ajuda como orientadora e
amiga.
Ao Professor Fbio Simonelli pelas discusses neste trabalho.
Ao Professor Guilherme Ianzi Sassaki pelas horas que gastou me ajudando e
compartilhando seus conhecimentos e a seus alunos, especialmente o
doutorando Arquimedes Paixo de Santana Filho pelas anlises de CG.
A Professora Maria Regina Orofino, ao Professor Luiz Claudio Fernandez, a
Mestra Luize Zozula Blind Carrenho e a aluna de iniciao cientfica Caroline
Paola Uber pela colaborao no trabalho com o fornecimento, cuidado e
tratamento dos camundongos.
Ao Professor Roberto Pontarolo por ceder espao em seu laboratrio para
armazenar minhas amostras.
Aos amigos de laboratrio: Clebson, Aline, Thiago e Cnthia que muitas vezes
ajudaram a resolver meus problemas.
Ao meu namorado Joo Tiago que est sempre pronto a me ouvir e me encorajar
a continuar.
Aos meus pais, Aluisio e Rosane por terem me dado a vida e ensinado a viv-la,
me apoiando e dando a melhor herana que algum pode dar.
A meu irmo Leonardo.
A todos meus amigos.
Ao Programa de Ps Graduao de Qumica.
Ao CNPq que forneceu a minha bolsa de estudos.
A Jeov Deus acima de tudo e antes de qualquer outro.
SUMRIO
SUMRIO..............................................................................................................................i
LISTA DE ABREVIATURAS..............................................................................................iii
LISTA DE FIGURAS..........................................................................................................vi
LISTA DE TABELAS.......................................................................................................xvii
RESUMO.........................................................................................................................xviii
ABSTRACT.......................................................................................................................xix
1
INTRODUO.............................................................................................................1
1.1
O Cncer...................................................................................................................1
1.1.1
Tumor de Ehrlich...............................................................................................2
1.1.2
Sarcoma 180.....................................................................................................3
1.2
Diagnstico do Cncer...........................................................................................4
1.3
A Metabonmica......................................................................................................5
1.3.1
Tcnicas analticas...........................................................................................8
1.3.1.1
A Ressonncia Magntica Nuclear..............................................................10
1.3.2
Anlises quimiomtricas................................................................................11
1.3.2.1
Anlise por Componentes Principais..........................................................12
1.3.2.2
Anlise Discriminante com calibrao multivariada por Quadrados
Mnimos Parciais...............................................................................................................13
1.3.2.3
Anlise dos grficos de influncia................................................................14
OBJETIVOS...............................................................................................................15
MATERIAIS E MTODOS.......................................................................................16
3.1
Induo de tumores nos camundongos.............................................................16
3.2
Obteno das amostras.......................................................................................17
3.3
Espectros de RMN de 1H.....................................................................................17
3.4
RMN de 31P, 13C e experimentos 2D...................................................................18
3.5
Realizao de anlises quimiomtricas.............................................................19
3.5.1
Discriminao entre os grupos.....................................................................19
3.5.2
Identificao dos biomarcadores.................................................................20
3.5.3
Construo de modelos de classificao...................................................20
3.6
4
Cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massas......................20

RESULTADOS E DISCUSSO...............................................................................22
4.1
Determinao dos parmetros de obteno dos espectros de RMN de 1H 22
4.1.1
Tempo de centrifugao................................................................................22
4.1.2
Determinao da sequncia de pulsos utilizada para aquisio dos
espectros de RMN de 1H..................................................................................................22

4.1.3
Quantidade de soro utilizado na preparao das amostras....................26
4.2
Teste de sobrevida................................................................................................26
4.3
Anlise visual dos espectros de RMN de 1H.....................................................28
4.4
Atribuio dos sinais nos espectros de 1H........................................................30
4.5
Anlise quimiomtrica...........................................................................................37
4.5.1
Pr-processamento dos dados....................................................................37
4.5.2
PCA...................................................................................................................45
4.5.2.1
Discriminao entre amostras de grupos sadios e doentes....................47
4.5.2.1.1
TE em camundongos Swiss.....................................................................47
4.5.2.1.2
TE em camundongos Balb-C...................................................................54
4.5.2.1.3
S180 em camundongos Swiss................................................................59
4.5.2.2
Discriminao de acordo com o tipo de tumor..........................................66
4.5.3
PLS-DA............................................................................................................73
4.5.3.1
Discriminao entre amostras de grupos sadios e doentes....................76
4.5.3.1.1
TE em camundongos Swiss.....................................................................76
4.5.3.1.2
TE em camundongos Balb-C...................................................................81
4.5.3.1.3
S180 em camundongos Swiss................................................................86
4.5.3.2
Discriminao de acordo com o tipo de tumor..........................................93
4.5.4
PCA versus PLS-DA......................................................................................99
4.6
Avaliao de efeitos externos nas anlises....................................................101
4.6.1
Avaliao do efeito do ambiente sob a resposta fisiolgica do
camundongo.....................................................................................................................101
4.6.2
Avaliao do efeito da dieta na resposta do camundongo....................102
4.6.3
Comparao de anlises obtidas em espectrmetros de RMN de
diferentes campos magnticos......................................................................................106

4.7
Identificao dos biomarcadores......................................................................109
4.8
Construo de modelos de calibrao.............................................................113
4.9
Testes de estabilidade das amostras...............................................................122
CONCLUSO..........................................................................................................125
REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS.....................................................................127
LISTA DE ABREVIATURAS
COSY
Correlated Spectroscopy
CG-EM
Cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massas
CLAE-EM
Cromatografia
lquida
de
alta
eficincia
acoplada
espectroscopia de massas
CPMG
Carr-Purcell-Meiboom-Gill
Da
Daltons
D2O
xido de deutrio
FID
Free induction Decay
HMBC
Heteronuclear Multiple Bond Correlation
HSQC
Heteronuclear Single Quantum Coherence
Hz
Hertz
Constante de acoplamento em Hertz (Hz)
m/z
Relao massa/carga
PC
Principal component
PCA
Principal Component Analysis
PLS-DA
Parcial Least Square Discriminant Analysis
ppm
Escala dos espectros de RMN em partes por milho
RMN de 1H
Ressonncia Magntica Nuclear de Hidrognio
RMN de 13C
Ressonncia Magntica Nuclear de Carbono 13
RMN de 31P
Ressonncia Magntica Nuclear de Fsforo 31
RNA
cido ribonuclico
RNAm
cido ribonuclico mensageiro
ns
Number of scans
S180
Sarcoma 180
T1
Relaxao longitudinal (spin-rede)
T2
Relaxao transversal (spin-spin)
TE
Tumor de Ehrlich
TOCSY
Total Correlation Spectroscopy
TMSP-d4
Trimetilsililpropionato de sdio tetradeuterado
VL
Varivel latente
Deslocamento qumico
x
LISTA DE FIGURAS
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Carto de urina publicado em 1506 por Ullrich Pinder no seu livro
Epiphanie Medicorum. Relaciona cores, odores e gostos da urina com
diagnsticos de doenas..........................................................................................6
Figura 2: Espectros de RMN de 1H utilizando diferentes seqncias de pulso para
saturao de sinal da gua.....................................................................................23
Figura 3: Espectros de RMN de 1H obtidos com a seqncia de pulso CPMG,
variando os valores de tempo de relaxao (2n)..................................................24
Figura 4: Espectros de RMN de 1H utilizando a seqncia de pulsos noesypr1d
para saturao de sinal da gua com diferentes parmetros................................25
Figura 5: Expanso da regio 6,5-8,5 dos espectros de RMN de 1H obtido com a
seqncia de pulso (a) noesypr1d com 128 aquisies e com excitao seletiva
da regio aromtica utilizando (b) 128 e (c) 256 aquisies..................................26
Figura 6: Comparao dos espectros de RMN de 1H das amostras de controle e
inoculadas com TE por diferentes perodos em camundongos Swiss...................29
inoculadas com S180 por diferentes perodos em camundongos Swiss...............29
inoculadas com TE por diferentes perodos em camundongos Balb-C.................30
Figura 9: Correlaes 1H-1H observadas no experimento de DQF-COSY obtido a
partir de uma amostra de soro provinda de camundongo Swiss inoculado com
S180 por dez dias...................................................................................................32
xi
LISTA DE FIGURAS
Figura 10: Correlaes 1H-1H observadas no experimento de TOCSY obtido a
partir de uma amostra de soro provinda de camundongo Balb-C inoculado com TE
por trs dias............................................................................................................33
Figura 11: Correlaes 1J 1H-13C observadas no experimento de HSQC obtido a
por sete dias............................................................................................................36
Figura 12: Correlaes
LR
J 1H-31P observadas no experimento de HMBC obtido a

S180 por cinco dias................................................................................................37
Figura 13: (A) Grfico de escores de PC1 (98,2%) versus PC2 (1,2%) utilizando
buckets de 0,5 ppm das amostras de controle, trs dias, sete e dez dias. (B)
Grfico de influncias (loadings) de PC1 versus PC2 explicando a classificao
das amostras apresentada no grfico de escores..................................................40
as amostras de controle e cinco dias aps a inoculao com TE dos animais
mantidos com alimentao normal utilizando escalonamento em relao a regio
xii
LISTA DE FIGURAS
de referncia; e (B) grfico de escores de PC1 (77,8%) versus PC2 (11,8%) em
relao a intensidade total dos sinais.....................................................................44
as amostras de controle e cinco dias aps a inoculao com TE dos animais
mantidos em jejum utilizando escalonamento em relao a regio de referncia; e
(B) grfico de escores de PC1 (70,3%) versus PC2 (15,5%) em relao a
intensidade total dos sinais.....................................................................................45
Figura 18: Exemplo de um grfico de influence plot..............................................46
Figura 19: Exemplo de grfico de escores mostrando o Hotelling T2 com 95% de
nvel de confiana...................................................................................................47
as amostras de controle, trs, sete e dez dias (). (B) Grfico de influncias
(loadings) de PC1 versus PC2 explicando a classificao das amostras
apresentada no grfico de escores........................................................................49
as amostras de controle e trs dias. (B) Grfico de influncias (loadings) de PC1
versus PC2 explicando a classificao das amostras apresentada no grfico de
escores....................................................................................................................50
escores....................................................................................................................51
as amostras de controle e cinco dias. (B) Grfico de influncias (loadings) de PC1
xiii
LISTA DE FIGURAS
escores....................................................................................................................53
escores....................................................................................................................54
as amostras de controle, trs, sete e dez dias. (B) Grfico de influncias
escores....................................................................................................................57
escores....................................................................................................................58
as amostras de controle, trs, sete e dez dias. (B) Grfico de influncias
xiv
LISTA DE FIGURAS
escores....................................................................................................................61
escores....................................................................................................................62
as amostras de controle e sete dias. (B) Grfico de influncias (loadings) de PC1
escores....................................................................................................................63
as amostras de controle e dez dias. (B) Grfico de influncias (loadings) de PC1
escores....................................................................................................................65
as amostras de controle e dez dias. (B) Grfico de influncias (loadings) de PC1
escores....................................................................................................................66
as amostras de trs, sete e dez dias inoculadas com TE e trs, sete e dez dias
inoculadas com S180. (B) Grfico de influncias (loadings) de PC1 versus PC2
explicando a classificao das amostras apresentada no grfico de escores.......68
as amostras de sete e dez dias inoculadas com TE e sete e dez dias inoculadas
xv
LISTA DE FIGURAS
com S180. (B) Grfico de influncias (loadings) de PC1 versus PC2 explicando a
classificao das amostras apresentada no grfico de escores............................69
as amostras de sete dias inoculadas com TE e sete dias inoculadas com S180.
(B) Grfico de influncias (loadings) de PC1 versus PC2 explicando a
as amostras de dez dias inoculadas com TE e dez dias inoculadas com S180. (B)
as amostras de cinco dias inoculadas com TE e cinco dias inoculadas com S180.
(B) Grfico de influncias (loadings) de PC1 versus PC2 explicando a
Figura 39: Grficos de R2X e R2Y mostrando a varincia no explicada no eixo
y pelas matrizes X e Y, respectivamente, conforme aumenta o nmero de VLs no
eixo x para um conjunto de amostras antes da validao cruzada.....................74
eixo x para um conjunto de amostras aps a validao cruzada........................75
Figura 41: Grficos de DModX e DModY indicando a posio de cada amostra em
relao ao espao X e Y do modelo, respectivamente..........................................76
as amostras de controle, trs, sete e dez dias. (B) Grfico de influncias (X-
xvi
LISTA DE FIGURAS
loadings) de PC1 versus PC2 explicando a classificao das amostras
apresentada no grfico de T-escores.....................................................................78
Figura 43: (A) Grfico de T-escores de PC1 (53,4%) versus PC2 (16,4%)
utilizando as amostras de controle e trs dias. (B) Grfico de influncias (Xloadings) de PC1 versus PC2 explicando a classificao das amostras
utilizando as amostras de controle e cinco dias. (B) Grfico de influncias (Xloadings) de PC1 versus PC2 explicando a classificao das amostras
utilizando as amostras de controle, trs dias, sete e dez dias. (B) Grfico de
influncias (X-loadings) de PC1 versus PC2 explicando a classificao das
amostras apresentada no grfico de T-escores.....................................................82
utilizando as amostras de controle, trs dias, sete e dez dias. (B) Grfico de
xvii
LISTA DE FIGURAS
amostras apresentada no grfico de T-escores.....................................................87
utilizando as amostras de controle e sete dias. (B) Grfico de influncias (Xloadings) de PC1 versus PC2 explicando a classificao das amostras
utilizando as amostras de controle e dez dias. (B) Grfico de influncias (Xloadings) de PC1 versus PC2 explicando a classificao das amostras
utilizando as amostras de trs, sete e dez dias inoculadas com TE e trs, sete e
dez dias inoculadas com S180. (B) Grfico de influncias (X-loadings) de PC1
versus PC2 explicando a classificao das amostras apresentada no grfico de Tescores....................................................................................................................94
utilizando as amostras de sete e dez dias inoculadas com TE e sete e dez dias
xviii
LISTA DE FIGURAS
inoculadas com S180. (B) Grfico de influncias (X-loadings) de PC1 versus PC2
explicando a classificao das amostras apresentada no grfico de T-escores.. .95
utilizando as amostras de sete dias inoculadas com TE e sete dias inoculadas
com S180. (B) Grfico de influncias (X-loadings) de PC1 versus PC2 explicando
a classificao das amostras apresentada no grfico de T-escores......................97
utilizando as amostras de dez dias inoculadas com TE e dez dias inoculadas com
S180. (B) Grfico de influncias (X-loadings) de PC1 versus PC2 explicando a
classificao das amostras apresentada no grfico de T-escores.........................98
utilizando as amostras de cinco dias inoculadas com TE e cinco dias inoculadas
com S180. (B) Grfico de influncias (X-loadings) de PC1 versus PC2 explicando
a classificao das amostras apresentada no grfico de T-escores......................99
utilizando as amostras de controle de Curitiba e Itaja. (B) Grfico de influncias
(X-loadings) de PC1 versus PC2 explicando a classificao das amostras
apresentada no grfico de T-escores...................................................................102
utilizando as amostras de controle e cinco dias aps a inoculao com TE dos
animais mantidos em jejum de 12h. (B) Grfico de influncias (X-loadings) de PC1
versus PC2 explicando a classificao das amostras apresentada no grfico de Tescores..................................................................................................................104
utilizando as amostras de controle e cinco dias aps a inoculao dos animais
xix
LISTA DE FIGURAS
mantidos em jejum de 12h e controle e cinco dias inoculadas com TE com
alimentao normal. (B) Grfico de influncias (X-loadings) de PC1 versus PC2
explicando a classificao das amostras apresentada no grfico de T-escores. 105
utilizando as amostras de controle e cinco dias cujos espectros foram obtidos no
espectrmetro de 4,7 Tesla. (B) Grfico de influncias (X-loadings) de PC1 versus
PC2 explicando a classificao das amostras apresentada no grfico de Tescores..................................................................................................................107
utilizando as amostras de controle e cinco dias cujos espectros foram obtidos no
espectrmetro de 4,7 Tesla. (B) Grfico de influncias (X-loadings) de PC1 versus
PC2 explicando a classificao das amostras apresentada no grfico de Tescores..................................................................................................................108
Figura 63: Cromatogramas referentes a uma amostra de controle e a uma
amostra de cinco dias de inoculao de TE em camundongos Swiss.................111
Figura 64: Grfico de T-escores de PC1 (91,6%) versus PC2 (3,34%) do modelo
formado pelas amostras de controle, trs, sete e dez dias inoculadas com TE em
camundongos Swiss para predizer novas amostras............................................115
formado pelas amostras de controle e cinco dias inoculadas com TE em
formado pelas amostras de controle, trs, sete e dez dias inoculadas com TE em
camundongos Balb-C para predizer novas amostras...........................................117
xx
LISTA DE FIGURAS
formado pelas amostras de controle e cinco dias inoculadas com TE em
camundongos Balb-C para predizer novas amostras...........................................118
formado pelas amostras de controle, trs, sete e dez dias inoculadas com S180
em camundongos Swiss para predizer novas amostras......................................119
formado pelas amostras de controle e cinco dias inoculadas com S180 em
formado pelas amostras de trs, sete e dez dias inoculadas com TE e trs, sete e
dez dias inoculadas com S180 em camundongos Swiss para predizer novas
amostras...............................................................................................................121
ABSTRACT
xxi
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Alguns marcadores tumorais de valor clnico reconhecido......................5

Tabela 2: Tcnicas analticas mais utilizadas em metabonmica e as vantagens e
desvantagens respectivas........................................................................................9
Tabela 3: Resultado dos testes de sobrevida realizados para as duas linhagens de
camundongos com os tumores TE e S180.............................................................27
Tabela 4: Deslocamentos e atribuio dos sinais referentes a lipdeos conforme
observado no experimento de TOCSY...................................................................31
Tabela 5: Resumo dos resultados das anlises quimiomtricas obtidos a partir das
duas linhagens de camundongos com os tumores TE e S180............................100
Tabela 6: Porcentagem de cidos graxos presentes em amostras de controle e
inoculada com TE em camundongos Swiss obtidas nas anlises por CG-EM....110
Tabela 7: Porcentagem dos acares presentes em amostras de controle e
inoculada com TE em camundongos Swiss obtidas atravs da anlise por CGEM.........................................................................................................................113
Tabela 8: Resultados da validao dos modelos desenvolvidos a partir das
anlises quimiomtricas segundo dados fornecidos pelo programa AMIX..........114
Tabela 9: Resultados da predio das amostras utilizadas para teste de
armazenamento dentro do modelo desenvolvido.................................................123
estabilidade a efeitos de congelamento e descongelamento dentro do modelo
desenvolvido.........................................................................................................124
ABSTRACT
xxii
RESUMO
ANLISE DE BIOFLUIDOS ATRAVS DE RMN ALIADA A QUIMIOMETRIA PARA
CARACTERIZAO DE TUMORES E SEU DIAGNSTICO PRECOCE. O cncer
configura-se como um grande problema de sade pblica tanto nos pases
desenvolvidos como nos em desenvolvimento. Consiste em uma patologia que
no possui sintomas caractersticos, podendo ser detectado em vrios estgios
de evoluo histopatolgica e clnica. Destes fatos resulta, em grande parte, a
dificuldade do seu diagnstico e a afirmativa de que a suspeita de cncer pode
surgir diante dos sintomas mais variados possveis, alm da complexidade e
custos elevados dos mtodos. Para que o tratamento do cncer seja o mais
efetivo possvel, necessrio que haja uma deteco precoce, antes mesmo do
desenvolvimento de sinais e sintomas. No entanto, atualmente nem todos os tipos
de cncer podem ser detectados precocemente, o que torna a busca por novas
tcnicas mais abrangentes, de baixo custo e acessveis, uma prioridade pblica.
O surgimento e o desenvolvimento de uma patologia provocam alteraes
caractersticas de um ou mais metablitos especficos na composio qumica
dos tecidos e/ou biofluidos corporais, que podem atuar como biomarcadores.
Neste contexto, estratgias metabolmicas baseadas em dados obtidos atravs
da espectroscopia de RMN de amostras de biofluidos ou tecidos podem atuar
como perfis de diagnstico, uma vez que geram compreensveis perfis
bioqumicos caractersticos de metablitos de baixa massa molecular com a
vantagem de serem obtidos com o mnimo de preparo de amostra. Neste
trabalho, a RMN de 1H de soro sangneo aliada a anlises quimiomtricas foi
utilizada para identificar as alteraes metablicas ocorridas na composio
qumica de biofluidos, como conseqncias da presena de tumores, usando
camundongos como matriz inicial. Aps otimizao da metodologia, foi possvel
diagnosticar o tumor asctico de Ehrlich aps cinco dias e tumor Sarcoma 180
aps dez dias da inoculao com boa preciso. Identificou-se lipdeos,
lipoprotena VLDL e lactato como possveis biomarcadores da presena do tumor
no organismo. Desta forma, a RMN aliada a quimiometria uma ferramenta com
grande potencial para estudar os efeitos da presena de tumores na composio
de biofludos.
ABSTRACT
xxiii
ABSTRACT
NMR BIOFLUID ANALYSIS ALLIED TO CHEMOMETRICS FOR TUMOR
CHARACTERIZATION AND ITS EARLY DIAGNOSIS. The cancer is one of the
major public health problems both in developed and developing countries. It
consists of a condition that does not have characteristic symptoms, which can be
detected in various stages of clinical and histopathological development. Those
facts greatly contribute to the difficulty of cancer diagnosis and the assertion that
the suspicion of the presence of cancer can arise before the most varied
symptoms, besides the complexity and high costs of the methods. In order to
become the treatment of cancer as effective as possible, there must be an early
detection, even before the development of signs and symptoms. However,
nowadays the minority of the cancers types can be detected early, which makes
the search for most comprehensive, affordable and accessible techniques a public
priority. The emergence and development of a disease cause characteristic
changes of one or more specific metabolites in the chemical composition of
tissues or biofluids, which can act as biomarkers. In this context, metabolomics
strategies based on data obtained from NMR spectroscopy of samples of biofluids
or tissues can act as fingerprints, since they generate understandable
characteristic biochemical profiles of metabolites of low molecular weight, with the
advantage of being achieved with minimal sample preparation. In this work, serum
1
H NMR allied to chemometric analysis was used to identify metabolic changes
occurring in the chemical composition of biofluid as a consequence of the

presence of tumors, using mice as the initial array. After methodology optimization,
it was possible to diagnose the Ehrlich ascites tumor after five days and tumor
Sarcoma 180 after ten days of inoculation with good accuracy. Lipids, VLDL and
lactate were identified as possible biomarkers of the presence of tumor in the
body. Thus, NMR allied to chemometrics is a tool with great potential for studying
the effects of the presence of tumors in the composition of biofluid.
RESULTADOS E DISCUSSO
1
1.1
INTRODUO
O Cncer
Cncer o nome dado a um conjunto de mais de 100 doenas que tem em
comum o crescimento desordenado de clulas que invadem os tecidos e rgos,

podendo
espalhar-se
para
outras
regies
do
corpo.
Reproduzindo-se
rapidamente, estas clulas tendem a ser muito agressivas e incontrolveis,

determinando a formao de tumores, isto , o acmulo de clulas cancerosas.
Os diferentes tipos de cncer correspondem aos vrios tipos de clulas do corpo.
Por exemplo, existem diversos tipos de cncer de pele porque a pele formada
de mais de um tipo de clula. Se o cncer tem incio em tecidos epiteliais como
pele ou mucosas ele denominado carcinoma. Se tiver incio em tecidos
conjuntivos como osso, msculo ou cartilagem chamado de sarcoma. Outras
caractersticas que diferenciam os diversos tipos de cncer entre si a velocidade
de multiplicao das clulas e a capacidade de invadirem tecidos e rgos
vizinhos ou distantes, denominada metstases (INCA, 2009).
As clulas cancerosas surgem a partir de mutaes genticas, que
ocorrem quando uma clula normal sofre alteraes no DNA dos genes. As
clulas cujo material gentico foi alterado passam a receber instrues erradas
para as suas atividades. As alteraes podem ocorrer em genes especiais,
denominados protooncogenes, que a princpio so inativos em clulas normais.
Quando
ativados,
os
protooncogenes
transformam-se
em
oncogenes,
responsveis pela malignizao ou cancerizao das clulas normais (INCA,

1996). As clulas alteradas passam ento a se comportar de forma anormal.
Multiplicam-se de maneira descontrolada, mais rapidamente do que as clulas
normais do tecido sua volta, invadindo-o. Geralmente, tem capacidade para
formar novos vasos sanguneos que as nutriro e mantero as atividades de
crescimento descontrolado. O acmulo dessas clulas forma os tumores
malignos. Outra caracterstica que adquirem a capacidade de se desprender do
tumor e de migrar. Invadem inicialmente os tecidos vizinhos, podendo chegar ao
interior de um vaso sangneo ou linftico e, atravs desses, disseminar-se,
chegando a rgos distantes do local onde o tumor se iniciou, formando as
metstases. Dependendo do tipo da clula do tumor, alguns geraro metstases
mais rpidas e precocemente, outros o fazem bem lentamente ou at no o
fazem. As clulas cancerosas so, geralmente, menos especializadas nas suas

funes do que as suas correspondentes normais. Conforme as clulas
cancerosas vo substituindo as normais, os tecidos invadidos vo perdendo suas
funes. Por exemplo, a invaso dos pulmes gera alteraes respiratrias, a
invaso do crebro pode gerar dores de cabea, convulses, alteraes da
conscincia entre outros sintomas (INCA, 1996).
Atualmente, o cncer configura-se como um grande problema de sade
pblica tanto nos pases desenvolvidos como nos em desenvolvimento. Segundo
recente relatrio da Agncia Internacional para Pesquisa em Cncer (IARC)/OMS
(World Cancer Report 2008), o impacto global do cncer mais que dobrou em 30
anos. Estimou-se que, no ano de 2008, ocorreriam cerca de 12 milhes de casos
novos de cncer e sete milhes de bitos. O contnuo crescimento populacional,
bem como seu envelhecimento, afetar de forma significativa o impacto do cncer
no mundo. Esse impacto recair principalmente sobre os pases de mdio e baixo
desenvolvimento. A IARC/OMS estimou que, em 2008, metade dos casos novos e
cerca de dois teros dos bitos por cncer ocorreriam nessas localidades (INCA,
2009).
No Brasil, as estimativas para o ano de 2010, vlidas tambm para o ano
de 2011, apontam que ocorrero 489.270 casos novos de cncer (INCA, 2009).
Em 2010, so esperados 236.240 casos novos para o sexo masculino e 253.030
para sexo feminino. Estima-se que o cncer de pele do tipo no melanoma (114
mil casos novos) ser o mais incidente na populao brasileira, seguido pelos
tumores de prstata (52 mil), mama feminina (49 mil), clon e reto (28 mil),
pulmo (28 mil), estmago (21 mil) e colo do tero (18 mil) (INCA, 2009).
1.1.1 Tumor de Ehrlich

Tumores experimentais transplantados tem sido usados em estudos fsicos,
qumicos, virais e carcinognicos hormonais (Freitas e col., 2006). O tumor de
Ehrlich (TE) uma neoplasia transplantvel gerada a partir de um epitlio
maligno, que corresponde ao adenocarcinoma mamrio em ratos fmeas.
Quando inoculados intraperitonealmente ele cresce em forma asctica, ou seja, as
clulas tumorais crescem em meio ao lquido peritoneal. Por sua vez, quando
inoculado por via subcutnea, o tumor cresce na forma slida (Ehrlich, 1906).
Clulas de tumor de Ehrlich provocam uma forte resposta imune, um fato

que, junto com outras propriedades, torna este tumor um modelo interessante
para a anlise dos efeitos das drogas e de agentes ambientais externos sobre o
crescimento tumoral (Segura e col., 1997; Mashanova e col., 2005; Palermo-Neto
e col., 2008). Tambm tem sido usado para estudos da produo e consumo de
antgenos, lipdeos, acares e outras substncias em decorrncia da presena
deste tipo de tumor (Mettler e col., 1982; Carrascosa e col., 1984; Hriston e col.,
1997).
1.1.2 Sarcoma 180

Sarcoma
180
(S180),
um
dos
tipos
de
tumores
experimentais
transplantveis em camundongos, foi um dos primeiros tumores experimentais a

serem transplantados em animais. Inicialmente este tumor, descoberto em 1914
como uma massa slida na axila direita de um camundongo branco, foi
denominado de Tumor de Crocker. Esse tumor foi primariamente classificado
como carcinoma mamrio, mas aps vrias transplantaes subcutneas,
observou-se que suas caractersticas morfolgicas e seu comportamento eram
caractersticos de um sarcoma e passou, ento, a ser chamado de Sarcoma 180
(QI e XU, 2006).
Sarcoma 180 tem sido utilizado em estudos histopatolgicos e de atividade
antitumoral de novas drogas, pois cresce rapidamente em 90% dos casos,
regredindo em 8 a 10%, e desenvolve-se em todas as populaes de
camundongos (Assef e col., 2002; Sato e col., 2005; Machado e Melo-Junior,
2009). Alm disso, estudos tem usado este tipo de tumor para efeitos
comparativos com outros tipos de tumor, tais como tumor asctico de Ehrlich e
adernocarcinoma 755 (Graff e col., 1952; Mettler e col., 1982).
1.2
Diagnstico do Cncer
O cncer uma patologia com localizaes e aspectos clnico-patolgicos
mltiplos e no possui sintomas caractersticos, podendo ser detectado em vrios

estgios de evoluo histopatolgica e clnica. Destes fatos resulta, em grande
parte, a dificuldade do seu diagnstico e a afirmativa de que a suspeita de cncer

pode surgir diante dos sintomas mais variados possveis (INCA, 1999).
H ainda uma grande dificuldade para a realizao de testes diagnsticos,
devido complexidade e aos custos elevados dos mtodos, principalmente para
os tumores internos. Adiciona-se a isso a falta de preocupao por parte da
prpria populao o que no tem permitido a deteco de tumores em tempo
hbil para o tratamento, alm do fato de que quando o paciente procura o mdico,
a natureza da sua doena ainda desconhecida e, assim, no procura
diretamente um especialista (INCA, 1999). Para que o tratamento do cncer seja
o mais efetivo possvel, necessrio que haja uma deteco precoce, antes
mesmo do desenvolvimento de sinais e sintomas. No entanto, atualmente nem
todos os tipos de cncer podem ser detectados precocemente, o que torna a
busca por novas tcnicas mais abrangentes, de baixo custo e acessveis, uma
prioridade pblica.
Alguns tumores se caracterizam pela produo de substncias, cuja
dosagem usada como meio diagnstico e como parmetro de estadiamento,
isto , a medida da extenso local, regional e sistmica da doena. Essas
substncias so conhecidas como marcadores tumorais (biomarcadores),
algumas delas esto listadas na Tabela 1. necessrio ressaltar que,
dependendo da dosagem desses marcadores, eles podem ser interpretados como
resultado normal, suspeito ou patolgico (INCA, 1999). Dependendo do tipo do
tumor, o diagnstico definitivo da malignidade ocorre somente atravs de exames
citopatolgicos e/ou histopatolgicos de material obtido atravs de bipsia,
procedimento cirrgico para retirada de clulas ou tecidos.
Tabela 1: Alguns marcadores tumorais de valor clnico reconhecido.

Marcador
Antgeno
carcinoembrionrio
-fetoprotena
Gonadotrofina
corinica
Tirocalcitonina
Mtodo de anlise
Enzima imunoensaio por
imunofluorometria
Enzima imunoensaio por
imunofluormtria
Eletroquimioluminescncia
Quimioluminescncia
Problemas Especficos
Tumores do trato
gastrintestinal
Tumor do fgado, tumores
embrionrios
Tumores embrionrios e
placentrios
Carcinoma medular de
tiride
Mieloma mltiplo e linfoma
-2- Microglobulina
Quimioluminescncia
maligno
CA 125
Quimioluminescncia
Carcinoma de ovrio
CA 15-3
Eletroquimioluminescncia
Carcinoma de mama
Carcinoma de pncreas, vias
CA 19-9
Quimioluminescncia
biliares e tubo digestivo
Carcinoma de estmago e
CA 72-4
Eletroquimioluminescscia
adenocarcinoma mucinoso
de ovrio
PAP
Colorimetria
Carcinoma prosttico
PSA
Quimioluminescncia
Carcinoma prosttico
(Fonte: HTTP://www.inca.gov.br acessado em 28 jan. 2010)
1.3
A Metabonmica
O conceito de que o surgimento e desenvolvimento de uma patologia
provocam alteraes caractersticas de um ou mais metablitos especficos na

composio qumica dos tecidos e/ou biofluidos corporais retoma desde a Grcia
antiga. Cartes de urina (Figura 1) foram muito usados desde a Idade Mdia em
diante. Estes cartes correlacionavam cores, odores e gostos da urina com
condies mdicas. Tais modificaes eram na realidade de origem metablica. A
metabonmica e suas reas correlatas da metabolmica utilizam tcnicas
analticas modernas para analisar amostras biolgicas, porm o princpio de
correlacionar padres qumicos ao metabolismo o mesmo (Nicholson e Lindon,
2008).
Figura 1: Carto de urina publicado em 1506 por Ullrich Pinder no seu livro
Epiphanie Medicorum. Relaciona cores, odores e gostos da urina com
diagnsticos de doenas.
O termo metabonmica foi pela primeira vez definido por Nicholson e col.
como a medida quantitativa da resposta metablica dinmica de sistemas vivos a
estmulos patofisiolgicos ou modificao gentica (Nicholson e col., 1999).
Diferentes definies foram propostas na literatura diferenciando os termos
metabolmica, metabonmica e perfil metablico nos anos seguintes. O mesmo
grupo definiu recentemente que a metabonmica objetiva entender as mudanas
sistemticas que ocorrem ao longo de um perodo em sistemas multicelulares
complexos, enquanto a metabolmica por sua vez tem por alvo uma descrio
analtica de amostras biolgicas complexas, incluindo a caracterizao e
quantificao de todas as molculas de baixo peso molecular presentes na

amostra (Nicholson e Lindon, 2008). Porm na prtica os termos so muitas
vezes utilizados indistintamente e seguem procedimentos semelhantes.
Diretamente relacionado com esta rea da metabonmica, est o
metaboloma, definido como o conjunto de todos os metablitos e substncias de
baixo peso molecular (abaixo de 1500 Da) que podem ser encontrados em uma
clula, rgo ou organismo. Engloba toda uma faixa de substncias endgenas e
exgenas, tais como peptdeos, aminocidos, cidos nuclicos, carboidratos,
vitaminas, polifenis e qualquer outra substncia que possa ser usada, ingerida
ou sintetizada por uma dada clula ou organismo (Wishart, 2008). Os
componentes do metaboloma podem ser vistos como os produtos finais da
expresso gnica, o processo pelo qual a informao contida num gene
processada num produto gnico, tal como protenas e RNA, e definem o fentipo,
ou as caractersticas observveis, de uma clula ou tecido. Assim, a anlise quali
e quantitativa de um grande nmero de metablitos provem uma viso
abrangente do status bioqumico de um organismo, o que pode ser usado para
monitorar e acessar a funo gnica. Por outro lado, o transcriptoma e o
proteoma tem recebido crticas quanto capacidade de predizer a funo gnica.
Embora o transcriptoma represente o mecanismo de entrega do cdigo
translacional para a sntese de protenas nas clulas, aumentos nos nveis de
RNA mensageiros (RNAm) nem sempre se correlacionam com aumentos nos
nveis de protenas. Alm disso, uma vez traduzida, uma protena pode estar ou
no enzimaticamente ativa. Devido a estes fatores, mudanas no transcriptoma e
proteoma no necessariamente correspondem a alteraes no fentipo
bioqumico. Ainda outra limitao, que RNAm e protenas so identificadas
atravs de banco de dados o que pode ocasionar uma informao limitada,
dependendo da abrangncia de informaes do banco de dados utilizado
(Sumner e col., 2003). Portanto, a determinao do metaboloma pode realmente
prover a informao mais abrangente dentre as tecnologias omicas.
A maior limitao da metabonmica atualmente a incapacidade de
compreender todo o perfil do metaboloma, devido grande complexidade do
mesmo, varincia biolgica inerente da maioria dos organismos vivos e s
limitaes da maioria das tcnicas instrumentais. Duas diferentes abordagens
surgiram para processar e interpretar os dados metabolmicos. Na primeira
abordagem, chamada abordagem quimiomtrica, os compostos qumicos

presentes na amostra analisada, seja ela um tecido, clula ou biofludo, no so
previamente identificados. Apenas seus perfis espectrais so gravados,
estatisticamente comparados e usados para identificar as caractersticas
espectrais relevantes que distinguem as classes de amostras. Numa segunda
abordagem, denominada de metabolmica quantitativa, o foco na tentativa de
identificar e/ou quantificar quantos compostos forem possveis. Aps isto, os
dados so estatisticamente processados para identificar os biomarcadores mais
importantes ou informao sobre caminhos metablicos (Wishart, 2008).
A metabonmica ou metabolmica tem sido aplicada em estudar o efeito de
drogas no organismo (Holmes e col., 1998; Waters e col., 2001), toxicologia
(Holmes e col., 2000; Lindon e col., 2003), anlise fitoqumica de plantas e
desenvolvimento de novas drogas (Sumner e col., 2003; Shyur e Yang ., 2008) e
anlise de alimentos e seus efeitos nutritivos (Solanky e col., 2003; Wishart,
2008). Alm dessas aplicaes, a metabonmica tem sido muito empregada no
campo de diagnstico de doenas, tais como vrios tipos de cncer (Nicholson e
col., 1999; Lindon e col., 2003; Solanky e col., 2003; Azmi e col., 2005; Iorio e col.,
2005; Kirschenlohr e col., 2006).
1.3.1 Tcnicas analticas

As tcnicas de anlise mais utilizadas na metabonmica so a
espectroscopia de ressonncia magntica nuclear (RMN), cromatografia gasosa
acoplada espectrometria de massas (CG-EM) e a cromatografia lquida de alta
eficincia acoplada espectroscopia de massa (CLAE-EM), cada uma
apresentando vantagens e desvantagens conforme apresentado na Tabela 2
(Wishart, 2008).
Tabela 2: Tcnicas analticas mais utilizadas em metabonmica e as vantagens e

desvantagens respectivas.
Tcnica
RMN
Vantagens
Quantitativa
Desvantagens
Baixa sensitividade
No-destrutiva
Rpida
No requer derivatizao
No requer separao
Detecta todas as classes de
compostos orgnicos
Permite identificao de novos
compostos
Pode ser usada para imagem
de metablitos
Grande nmero de softwares e
banco de dados
Compatvel com slidos e
lquidos
Robusto
Relativamente barato
CG-EM
CLAE-EM
Quantitativo (se calibrado)

Requer menor quantidade de
amostra
Boa sensitividade
Grande nmero de softwares e
banco de dados
Detecta maioria das molculas
orgnicas e inorgnicas
Excelente reprodutibilidade de
separao
Altamente sensvel
Quantitativa
Tcnica muito flexvel
Detecta maioria das molculas
orgnicas e inorgnicas
Requer quantidades nfimas de
amostra
Pode ser realizada sem
separao (injeo direta)
Potencial para detectar o maior
nmero de metablitos
Instrumentao cara
No detecta sais ou ons
inorgnicos
No detecta compostos noprotonados
Requer grandes alquotas de
amostras
Requer muito espao de
laboratrio
Amostra no recupervel
Requer derivatizao da
amostra
Requer separao
Demorada
No pode ser usada em imagem
Difcil identificar novos
compostos
Amostra no recupervel
Instrumentao cara
Demorada
Nmero limitado de banco de
dados
Difcil identificar novos
compostos
1.3.1.1 A Ressonncia Magntica Nuclear

A RMN sem dvida uma das ferramentas mais poderosas e versteis
para a elucidao estrutural de compostos orgnicos. baseada na aplicao de
forte campo magntico e pulsos de radiofrequncia ao ncleo dos tomos. Para
ncleos com nmero atmico ou massa atmica mpar, como
H e
13
respectivamente, a presena de um campo magntico externo far com que estes
10
ncleos possuam um spin, denominado spin nuclear. A absoro da energia do

pulso de radiofreqncia permitir a promoo de estados de spin de baixa
energia para de alta energia, e a subseqente emisso de energia durante o
processo de relaxao ser detectada na forma de FID (Free Induction Decay) no
domnio do tempo (Silverstein, 2006).
Desde o surgimento em 1945, a RMN tem passado por grandes
transformaes, tais como o desenvolvimento de ims supercondutores, que
permitiram obter campos magnticos cada vez mais intensos, a transformada de
Fourier que possibilitou o uso da tcnica pulsada e com isso acumular FIDs,
sondas com gradiente de campo, as quais permitiram melhorar significativamente
a qualidade dos experimentos e mais recentemente as sondas criognicas, que
aumentaram muito a sensibilidade da tcnica. Todas estas sofisticaes
acumuladas ao longo do tempo possibilitaram ampliar cada vez mais o campo da
atuao da RMN, tornando a elucidao estrutural apenas uma das inmeras
aplicaes da tcnica.
Estratgias metabolmicas baseadas em dados obtidos atravs da
espectroscopia de RMN de amostras de biofluidos ou tecidos podem atuar como
perfis de diagnstico, uma vez que geram compreensveis fingerprints ou perfis
bioqumicos caractersticos de metablitos de baixa massa molecular. Em uma
amostra de biofluido tpica, todas as molculas que contem em sua estrutura
tomos de hidrognio, o que inclui aproximadamente todos os metablitos, daro
um espectro de RMN de 1H. O espectro de RMN ser, portanto a superposio
dos espectros de todos os metablitos presentes no fludo, definindo o perfil
caracterstico da amostra. Uma vantagem que estes perfis podem ser obtidos
com o mnimo de preparo de amostra, dispensando assim a necessidade de
laboriosos processos de extrao e/ou purificao, consumidores de tempo e
reagentes (Nicholson e col., 1999; Sumner e col., 2003). No entanto, para que os
metablitos sejam detectados na RMN necessrio que estejam presentes na
amostra em concentraes superiores ao limite de deteco.
A espectroscopia de RMN tem sido empregada na anlise de amostras de
tecidos humanos (biopsia) inclusive de carcinomas, tais como os de tiride,
mama, ovrio, prstata e tecidos cerebrais, entre outros (Hahn e col., 1997; Iorio
e col., 2005; Mountford e col., 2001; Odunsi e col., 2005; Russel e col., 1994;
Somorjai e col., 1995 e 1996; Soper e col., 2002; Wallace e col., 1997). Por outro
11
lado, a espectroscopia de RMN de alta resoluo, principalmente a RMN de 1H

aliada a quimiometria, tem sido empregada com sucesso, na anlise de amostras
de biofluidos (plasma, soro e urina), visando identificao ou diagnstico de
vrias patologias (Holmes e col., 2000; Lindon e col., 2003; Maher e col., 2007;
Nicholson e col., 1999; Salek e col., 2007), sendo esta uma realidade apenas nos
pases desenvolvidos.
1.3.2 Anlises quimiomtricas

A anlise quimiomtrica, quimiometria ou ainda anlise multivariada, uma
ferramenta estatstico-matemtica valiosa, que em combinao com diferentes
mtodos analticos possibilita a anlise de um grande nmero de variveis em
uma nica amostra.
Espectros de RMN de alta resoluo de amostras biolgicas, tais como
biofluidos e tecidos, podem ser muito complexos. Espectros de RMN de 1H, por
exemplo, contm inmeras frequncias de ressonncias. Em muitos casos, a
mera inspeo visual de tais espectros revela apenas uma pequena quantidade
de informao. Por isso, tem-se usado mtodos estatsticos computadorizados
para extrair o mximo de informaes de tais complexos espectros. Embora
mtodos estatsticos tenham sido aplicados a dados de RMN por muitos anos, a
primeira aplicao real da anlise quimiomtrica a espectros de RMN na rea
biomdica foi a classificao de espectros de RMN de 1H de urina de ratos de
acordo com o tipo de rgo alvo da toxina administrada aos animais, provendo
um meio no-invasivo de avaliar possveis drogas txicas (Lindon e col., 2001).
Atualmente fica claro que a metabonmica um meio efetivo de extrair
informaes por combinar a espectroscopia de RMN de biofluidos, clulas e
tecidos com mtodos estatsticos multivariados, denominados reconhecimento de
padres.
O reconhecimento de padres destina-se a agrupar as amostras com
caractersticas semelhantes e distingui-las das demais que por sua vez podero
vir a formar outro grupo. Nas anlises exploratrias multivariadas, todos os dados
obtidos sobre as amostras em questo so organizados em uma nica planilha, a
qual constituda por n amostras e i variveis, resultando em uma matriz n x
12
i. Desta forma, em um conjunto de dados formado por espectros de RMN de 1H,

por exemplo, as amostras so os prprios espectros e as variveis so os
deslocamentos qumicos ou as intensidades dos sinais nos espectros (Manual
Amix, 2008). O reconhecimento de padres pode ser realizado por diversos
mtodos, destacando-se aqui a anlise por componentes principais (PCA) e
anlise discriminante com calibrao multivariada por quadrados mnimos parciais
(PLS-DA). Ambas as tcnicas so baseadas na suposio de que quanto mais
semelhantes as amostras forem entre si mais prximas estaro em um espao
multidimensional.
1.3.2.1 Anlise por Componentes Principais

A anlise por componentes principais um dos mtodos mais antigos e
mais amplamente utilizados dentre as tcnicas multivariadas. O conceito por trs
da PCA descrever a varincia de um conjunto de dados multivariados em
termos de um conjunto de variveis ortogonais subjacentes, denominadas
componentes principais (PC). As variveis originais, os valores reas dos sinais
do espectro de RMN de 1H, por exemplo, formam a matriz X e podem ser
expressas como uma combinao linear especfica das componentes principais.
um mtodo no supervisionado no sentido que nenhuma informao a respeito
das amostras fornecida. A PCA um modelo linear aditivo no sentido que cada
componente principal contm uma poro da varincia do conjunto de dados.
Geralmente, uma pequena quantidade de componentes principais totalizam mais
de 90% da varincia total, e nestes casos, os dados podem ser redimensionados
em apenas algumas PCs, reduzindo assim a dimenso do conjunto de dados. A
plotagem dos dados no espao definido por duas ou trs PCs que possuam os
maiores valores de varincia explicada prove um meio rpido de visualizar as
similaridades e diferenas entre o conjunto de dados, possivelmente permitindo a
discriminao das amostras (Beebe e col., 1998; Sumner e col., 2003).
O mtodo de PCA tem sido utilizado em estudos de toxicidade por meio de
anlise de biofludos por RMN (Holmes e col., 1998; Holmes e col., 2000; Waters
e col., 2001; Idle e Gonzalez, 2007), deteco de cncer de ovrio por RMN de 1H
(Odunsi e col., 2005) alm de outras aplicaes.
13
1.3.2.2 Anlise Discriminante com calibrao multivariada por Quadrados

Mnimos Parciais
O mtodo PLS permite a relao entre diferentes blocos de dados a serem
derivados atravs da utilizao de modelagem com variveis latentes (VL) que
so derivadas por um procedimento interativo. As variveis latentes usadas no
PLS so mutuamente ortogonais em cada bloco de dados e so combinaes
lineares das variveis originais (Lindon e col., 2001). O PLS baseia-se, portanto,
em princpios similares ao do PCA, porm um mtodo supervisionado,
geralmente utilizado para desenvolvimento de modelos de calibrao em que uma
segunda tabela de dados fornecida, a matriz Y, com valores referentes a
medidas fsicas realizadas. Uma verso alternativa deste mtodo o PLS-DA, em
que a matriz Y formada por apenas uma coluna com informaes descritivas
identificando as amostras. Por exemplo, considerando dois grupos de amostras
um grupo de controle e outro grupo doente, denominam-se todas as amostras do
primeiro grupo como zero e as do segundo como um. Desta forma, a
separao entre os grupos melhorada em relao ao obtido pelo PCA, por
rotacionar os componentes do PCA de forma a obter o mximo de separao
entre as classes. Assim, tenta-se encontrar a melhor correlao entre as matrizes
X e Y usando relevantes combinaes lineares das variveis nestas duas
matrizes, buscando a parte da varincia na matriz X, a matrix dos dados dos
espectros, que melhor se encaixa aos dados da matriz Y (Manual AMIX, 2008;
Wishart, 2008).
O
mtodo
de
PLS-DA
tem
sido
recentemente
introduzido
em
metabonmica. J foi utilizado tanto em conjunto com anlises por PCA como
isoladamente, para discriminao entre grupos de amostra e para construo de
modelos de predio. Entre suas aplicaes inclui-se o diagnstico de doena
coronria por RMN de 1H (Brindle e col., 2002; Kirschenlohr e col., 2006), estudo
de efeitos de dietas de isoflavonas por RMN de 1H (Solanki e col., 2003), estudos
de comportamentos de doenas em modelos de camundongos (Griffin, 2006),
estudos
de
fentipo
humano
tambm
utilizando
como
ferramenta
espectroscopia de RMN de 1H de amostras de urina (Maher e col., 2007),

aplicaes em anlise de alimentos (Wishart, 2008), efeitos de dieta e
14
biomarcadores da aterosclerose (Martin e col., 2009), alm de outros estudos

(Nicholson e Lindon, 2009).
1.3.2.3 Anlise dos grficos de influncia

Quando observada a distino entre os conjuntos de amostras nas
anlises por PCA ou PLS-DA pela projeo das amostras no denominado grfico
de escores, possvel verificar quais as variveis que mais influenciaram para
que ocorresse a descriminao. Esta informao obtida atravs da anlise dos
grficos de influencias ou loadings, o qual obtido em conjunto com os grficos
de escores, e tem por objetivo explicar o resultado destes (Beebe e col., 1998;
Manual AMIX, 2008). Portanto, em uma discriminao obtida a partir de espectros
de RMN, a anlise dos grfico de influncia permite revelar quais foram os sinais
que mais influenciaram para que ocorresse a discriminao e, consequentemente,
inferir as substncias que caracterizam um ou outro grupo de amostras, seja
simplesmente por variaes na concentrao ou pela presena ou ausncia de
compostos,
possibilitando,
por
exemplo
identificar
biomarcadores
de
determinadas doenas (Griffin, 2006; Manual do AMIX, 2008; Nicholson e Lindon,

2008; Martin e col., 2009).
OBJETIVOS
Desenvolver metodologias rpidas e no invasivas baseadas na aquisio

de dados de RMN de soro sangneo e aplicao de anlises multivariadas para
identificar as alteraes metablicas ocorridas na composio qumica de
biofluidos como conseqncias da presena de tumores.
3
3.1
15
MATERIAIS E MTODOS
Induo de tumores nos camundongos
A maior parte do trabalho com os camundongos foi realizada no laboratrio
de pesquisa junto ao Centro de Cincias da Sade da Universidade do Vale do

Itaja - UNIVALI, atravs da orientao da Profa. Dra. Maria Regina Orofino
Kreuger. Aps junho de 2009 passou a ser desenvolvido no biotrio do
departamento de Nutrio da UFPR com a colaborao da Mestra Luise Zozula
Blind Carrenho e da aluna de iniciao cientfica Caroline Paola Uber, utilizando
mesma metodologia de manipulao e induo dos tumores realizados na
UNIVALI.
16
Nos experimentos foram utilizados camundongos de linhagem noisognica (Swiss) fornecidos pelo biotrio central do Departamento de Biologia,
sob coordenao do Prof. Dr. Luiz Claudio Fernandez, e linhagem isognica (BalbC) adquiridos do biotrio da UNIVALI. Para estes experimentos utilizaram-se
camundongos machos e fmeas, adultos de 7 a 10 semanas de idade e massa
corporal entre 22 a 30 gramas. Estes foram divididos em trs grupos cada, sendo
um de controle (grupo sem tumor), enquanto que os outros grupos foram
submetidos inoculao com clulas tumorais S180 e TE, considerados como
grupos com tumor.
As clulas tumorais utilizadas nos experimentos foram mantidas em
laboratrio, por meio de cultivo in vivo, e implantadas no peritnio dos
camundongos. Aps um perodo de 7 a 15 dias, os animais foram sacrificados e
suas clulas tumorais puncionadas com auxlio de uma seringa e 1,0 mL deste
material, em diferentes concentraes, foram implantadas em camundongos
sadios para a induo de novos tumores.
Antes da inoculao dos tumores foi necessrio se determinar e ajustar a
concentrao de clulas tumorais presentes no lquido tumoral retirado dos
camundongos utilizados no cultivo in vivo. Para tanto, preparou-se uma soluo
com 10 L de lquido tumoral retirado do camundongo, 100 L de corante Azul de
Tripan 0,4% e o volume foi ento completado para 1,0 mL com soluo de cloreto
de sdio 90%. Esta soluo foi colocada na cmara de Neubauer (Boeco
Germany) para contagem das clulas tumorais com o auxlio de microscpio tico
Polskie Zaklady Optyczne modelo Studar Lab com aumento de 40 vezes. A partir
da concentrao de clulas neoplsicas determinada, ajustou-se a concentrao
para 2,0x106 clulas tumorais/mL para camundongos Swiss e 1,0x10 6 clulas
tumorais/mL para camundongos Balb-C que foram implantada em camundongos
sadios para a induo de novos tumores.
3.2
Obteno das amostras

De cada animal dos grupos controle e com diferentes tipos de tumores
induzidos foram retiradas alquotas de sangue atravs de desvio da circulao do

olho por um capilar para determinao de micro-hematcitos sem heparina, sendo
recolhido em frasco tipo eppendorf e imediatamente centrifugado por 6 minutos a
12000 rpm na microcentrfuga HT modelo MCD 2000. O sobrenadante (soro) foi
17
imediatamente separado e congelado a -40 C no freezer Cnsul modelo 220 at

o transporte em gelo seco para Curitiba onde foram armazenados no Laboratrio
de Bioequivalncia do Departamento de Farmcia da Universidade Federal do
Paran em freezer modelo Revco Thermo Electron a -40 C para posterior anlise
e validao da metodologia atravs de espectroscopia de RMN. No caso das
amostras coletadas no biotrio do Departamento de Nutrio, estas foram
imediatamente congeladas no freezer do Laboratrio de Bioequivalncia. Aps a
retirada das alquotas os animais foram sacrificados, sendo as amostras coletadas
em perodos de 3, 5, 7 e 10 dias contados a partir da induo dos tumores.
3.3
Espectros de RMN de 1H
Espectros de RMN de 1H foram adquiridos diretamente das amostras de
soro sangneo de camundongos, referentes aos grupos com e sem tumor, no

espectrmetro de RMN Bruker AVANCE 400, operando a 9,4 Tesla, observando o
ncleo de hidrognio a 400,13 MHz, equipado com uma sonda multinuclear de
observao direta de 5 mm no Laboratrio de Ressonncia Magntica Nuclear do
Departamento de Qumica. Para tanto, alquotas de soro sangneo de volumes
entre 20 e 200 L conforme o volume de soro retirado de cada camundongo
foram coletadas com auxlio de uma micropipeta volumtrica e o volume
completado para 600 L pela adio de uma soluo de D 2O contendo TMSP-d4
em frasco tipo eppendorf. As amostras foram centrifugadas em Microcentrfuga
USA Scientific Modelo 100SD por 10 minutos a 6000 rpm e alquotas de 500 L
foram transferidas diretamente para tubos de RMN de 5 mm.
Os espectros foram adquiridos com 64K pontos, 128 transientes (scans) e
janela espectral de 4222,97 Hz (~10,5 ppm) com saturao do sinal da gua
utilizando-se a seqncia de pulsos noesypr1d, com tempo de relaxao de 2 s e
tempo de mistura de 100 ms. Os espectros foram processados no programa
TOPSPIN com 64K pontos aplicando-se uma multiplicao exponencial dos FIDs
por um fator de 0,3 Hz. Os deslocamentos qumicos foram calibrados em relao
ao sinal do TMSP-d4 ( 0,0 ppm).
3.4
18
RMN de 31P, 13C e experimentos 2D

Os espectros de RMN
31
de
P{1H} foram realizados no mesmo
espectrmetro dos experimentos de RMN de 1H observando o ncleo de fsforo a

161,98 MHz, utilizando a sequncia de pulsos zgpg30, com pulso de 30, 32K de
pontos, 100K transientes, janela espectral de 75187,97 Hz (~464 ppm) e tempo
de relaxao entre os pulsos de 0,2 s. O experimento de RMN 2D de correlao
1
H-1H com filtro de duplo-quantum (DQF-COSY), foi realizado em duas amostras
de soro utilizando a sequncia de pulso cosygpmfqf. A aquisio foi feita com 4K

de pontos com 128 transientes por incremento, janela espectral de 4194,6 Hz, e
400 incrementos em F1 para gerar a segunda dimenso, e completado com zeros
para 2K antes da transformada de Fourier. O tempo de relaxao entre os ciclos
de pulsos sucessivos foi de 1,5 s.
Os demais experimentos 2D, TOCSY, HSQC e HMBC, foram realizados no
equipamento Bruker AVANCE III 400, operando a 9,4 Tesla, observando o ncleo
de hidrognio a 400,13 MHz e carbono a 100,61 Hz, equipado com uma sonda
multinuclear de observao inversa de 5 mm. O experimento de correlao total
1
H-1H (TOCSY) foi coletado no modo sensvel a fase usando time-proporcional
phase incrementation (TPPI) e sequncia de pulsos MLEV17 para a trava de spin.

A aquisio foi feita com 2K de pontos com oito transientes por incremento, janela
espectral de 4222,97 Hz, e 500 incrementos em F1 para gerar a segunda
dimenso, e completado com zeros para 1K antes da transformada de Fourier. O
tempo de mistura utilizado foi de 0,11 s e o tempo de relaxao entre os pulsos foi
de 1,5 s. O experimento de correlao heteronuclear 1H-13C a ligao direta
(HSQC) foi adquirido no modo sensvel fase usando seleo de gradiente
echo/antiecho-TPPI e sequncia de pulsos hsqcetgpsi com desacoplamento
durante a aquisio. A aquisio foi feita com 4K de pontos com 32 aquisies por
incremento, janela espectral de 4222,97 Hz, e 312 incrementos em F1 para gerar
a segunda dimenso, e completado com zeros para 1K antes da transformada de
Fourier. O tempo de relaxao entre os pulsos foi de 1,0 s. Os experimentos de
correlao heteronuclear
H-13C e
H-31P a longa distncia (HMBC) foram
adquiridos com sequncia de pulsos hmbcgplpndqf, otimizado para constantes a

longa distncia de 8 Hz para 1H-13C e de 10 Hz para 1H-31P, com filtro de 1JC,H para
eliminar acoplamentos a uma ligao, sem desacoplamento. A aquisio foi feita
com 4K pontos com 64 aquisies por incremento, janela espectral de 4222,97
19
Hz, e 312 incrementos em F1 para gerar a segunda dimenso para 1H-13C e 500
para 1H-31P, e completado com zeros para 1K antes da transformada de Fourier. O
tempo de relaxao entre os pulsos foi de 1,0 s.
3.5
Realizao de anlises quimiomtricas
3.5.1 Discriminao entre os grupos

Os espectros de RMN adquiridos de vrias amostras de soro sangneo
dos diferentes grupos de camundongos foram submetidos anlise quimiomtrica
pelos mtodos de anlise por componentes principais (PCA) e por anlise
discriminante com calibrao multivariada por quadrados mnimos parciais (PLSDA) com auxlio do programa computacional AMIX , desenvolvido especialmente
para realizar anlises multivariadas de dados de RMN. A regio do espectro
utilizada para as anlises quimiomtricas foi de 0,40 a 4,50 dividida em
intervalos (buckets) de 0,01 ppm. Os mtodos de integrao e pr-processamento
usados
foram
respectivamente
soma
das
intensidades
absolutas
escalonamento em relao intensidade total dos sinais, mtodos providos pelo

programa. As amostras foram primeiramente discriminadas de acordo com a
presena ou ausncia de tumor. Posteriormente, as amostras provenientes de
camundongos doentes foram discriminadas de acordo com o tipo de tumor
induzido.
3.5.2 Identificao dos biomarcadores

A identificao dos sinais nos espectros de RMN de 1H responsveis pela
discriminao (biomarcadores) entre os grupos com e sem tumor e ainda de
acordo com o tipo de tumor, foi feita atravs da anlise dos grficos de influncias
(loadings), os quais indicam quais foram os sinais que mais contriburam para
uma dada discriminao. A partir dos dados fornecidos pelo grfico de influncias,
experimentos 2D de correlao homo e heteronuclear e anlises por
cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massas (CG-EM), foram
realizados para auxiliar na identificao destes compostos.
20
3.5.3 Construo de modelos de classificao

Os grupos de amostras de origem conhecida, agrupadas pela anlise
discriminante com calibrao multivariada por quadrados mnimos parciais (PLSDA), foram utilizados como modelos de classificao. Estes modelos foram
empregados para classificar novas amostras de acordo com a presena ou
ausncia de tumor e ainda de acordo com o tipo de tumor.
3.6
Cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massas

As amostras de soro sanguneo de amostras de controle e inoculada com
TE por cinco dias em camundongos Swiss foram pr-tratadas antes da injeo no

cromatgrafo. Aps eliminao da gua das amostras em vcuo, foi feita a
metanlise com 200 L de soro em 1,0 mL de HCl metanlico preparado por
adio de 400 L de cloreto de acetila em 4,6 mL de metanol anidro. A metanlise
foi realizada a 100 C por 4 horas. Aps este tempo o metanol e o HCl foram
removidos usando N2 gasoso temperatura ambiente. Em seguida foi feita a
acetilao com anidrido actico em piridina 1:1 por 30 minutos a 100 C. Padres
de acares utilizados na identificao, incluindo galactose, manose, frutose,
glucose, ribose e aracnose foram preparadas pelo mesmo procedimento.
A anlise por cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massas
(CG-EM) foi feita no equipamento Varian SATURN 2000R equipado com coluna
capilar de slica fundida BD-225-MS (J&W) (50% 3-cianopropil e 50%
fenilmetilsilicone) de 30,0 m de comprimento por 0,25 mm de dimetro interno e
0,25 m de espessura de filme. A deteco massas foi feita atravs de impacto
eletrnico a 70 eV a 200 C e analisador tipo on trap. As condies de operao
da anlise cromatogrfica foram as seguintes: temperatura programada da coluna
de 50 at 220 oC com taxa de aquecimento de 40 oC/min; a temperatura do injetor
de 250 oC e trap de 210 oC; o gs de arraste foi o helio com fluxo 1.0 mL/min. Os
espectros de massas foram analisados com auxilio do programa Saturn
Workstation 5.1.
21
A identificao dos compostos foi realizada pelos respectivos tempos de

reteno, espectro de fragmentao de massas, e, em alguns casos, por
comparao com padres autnticos, ou pela biblioteca de massas NIST
(National Institute of Standards and Technology).
4
4.1
Determinao dos parmetros de obteno dos espectros de RMN de
1
Primeiramente foram determinados os parmetros que seriam utilizados na

anlise das amostras utilizando uma amostra de controle provinda de um
camundongo Swiss preparada a partir de 130 L de soro e completada para 600
L com adio de D2O com TMSP-d4.
4.1.1 Tempo de centrifugao

O primeiro fator determinado foi o tempo de centrifugao. A amostra
preparada foi centrifugada por cinco minutos a 6000 rpm e observou-se formao
de um pequeno depsito no fundo do tubo. Repetiu-se o procedimento por 10 e
15 minutos e no houve aumento do corpo de fundo ou precipitado que poderiam
atrapalhar no ajuste do shimming e, consequentemente, na qualidade do
espectro. Fixou-se ento o tempo de centrifugao como 10 minutos a fim de
garantir de que apenas o soro seria analisado.
22
4.1.2 Determinao da sequncia de pulsos utilizada para aquisio dos

espectros de RMN de 1H
Visto a grande quantidade de gua no deuterada presente no soro
sanguneo, os espectros de RMN de 1H apresentaram o sinal da gua em 4,80
ppm bastante intenso (Figura 2a). Desta forma, foi necessria a aquisio dos
espectros de RMN com saturao do sinal da gua a fim de elimin-lo e para isto
testaram-se diversas seqncias de pulso (Figuras 2 a 4).
Iniciou-se pela seqncia mais simples e convencional em que a
freqncia de ressonncia do sinal da gua continuamente irradiada durante o
tempo de relaxao, porm o resultado no foi satisfatrio (Figura 2b). Tentou-se
ento a seqncia zgf2pr em que a saturao feita utilizando um segundo canal
de transmisso de radiofreqncia (f2) com a qual se fez dois experimentos, o
primeiro utilizando 128 varreduras e o segundo 256 (Figura 1c e d,
respectivamente), e obteve-se melhor saturao do sinal da gua do que no
experimento anterior, porm ainda no o suficiente para boa visualizao dos
sinais menos intensos.
23
a) zg
b) zgpr
c) zgf2pr 128 scans
d) zgf2pr 256 scans
5.0
0.0
ppm (t1)
Figura 2: Espectros de RMN de 1H utilizando diferentes seqncias de pulso para

saturao de sinal da gua.
Em seguida, os espectros foram adquiridos utilizando-se a seqncia de
pulso CPMG (Carr-Purcell-Meiboom-Gill), a qual consiste em uma seqncia de
ecos de spin [90- (-180- )n-FID] (cpmg1d), variando os valores de tempo de
relaxao, 2n, onde representa os intervalos entre os pulsos de 180 e n o
nmero de vezes em que a seqncia repetida. Esta seqncia tambm
utilizada para medida da relaxao transversal (T2), pois aps o pulso de 90
permitido um tempo para os ncleos relaxarem pelo mecanismo T2 no plano
transversal, tempo no qual ocorre perda da coerncia de fase por relaxao
transversal dos ncleos, o que resulta no desaparecimento dos sinais. Desta
forma, molculas com pequeno T2, tais como a molcula de gua, perdem a
coerncia de fase mais rpido que os sinais da amostra e, portanto, no
refocada pelo pulso de 180 seguinte. Variou-se o tempo de relaxao de 80 ms a
1500 ms sem um bom desaparecimento do sinal da gua, ao passo que houve
eliminao de sinais da amostra (Figura 3). Uma reduo seletiva da ressonncia
da gua pode ser conseguida se o tempo de relaxao dos hidrognios for
reduzido a ponto de ser muito menor do que os solutos. Isto pode ser atingido
24
pela adio de agentes de relaxao paramagntica, nas quais as molculas de

gua formam a esfera de hidratao, ou por reagentes que promovem a troca
qumica, sendo que cloreto de amnio e hidroxilamina tem sido usados com bom
efeito neste sentido (Claridge, 1999).
a) 80
b) 300
c) 600
d) 900
e) 1500
5.0
0.0
ppm (t1)
Figura 3: Espectros de RMN de 1H obtidos com a seqncia de pulso CPMG,

variando os valores de tempo de relaxao (2n).
Por fim, experimentou-se a seqncia de pulso noesypr1d compreendida
por: RD-90-t1-90-tm-90-FID, onde RD representa um tempo de relaxao
variado entre 1,5 e 2,0 s durante o qual a ressonncia da gua seletivamente
irradiada; t1 representa o primeiro incremento em um experimento NOESY e
corresponde a um intervalo fixo de 4 s; e t m o tempo de mistura na seqncia
NOESY e seu valor foi variado entre 100 e 150 s, tempo em que a ressonncia
da gua mais uma vez seletivamente irradiada. Desta forma, alm da saturao
do sinal da gua por irradiao contnua na freqncia de ressonncia desta, os
ncleos de hidrognio da gua no recebem magnetizao por NOE de nenhum
outro ncleo, resultando em um espectro de NOE total. Esta seqncia foi
utilizada em vrios estudos de soro sanguneo por RMN (Brindle et al., 2002;
Odunski et al.; Solanky et al., 2003; Waters et al., 2001). Os resultados foram
25
bastante satisfatrios (Figura 4), sendo que ambos apresentaram boa eliminao
do sinal da gua. O melhor resultado dentre todas as seqncias testadas foi na
segunda condio (Figura 4b) em que os valores foram de 2,0 s para tempo de
relaxao e 100 ms para tempo de mistura, e portanto, estas condies foram
escolhidas como padro para as anlises.
a) RD= 1,5 s e tm=150 ms
b) RD= 2,0 s e tm=100 ms
10.0
ppm (t1)
5.0
0.0
Figura 4: Espectros de RMN de 1H utilizando a seqncia de pulsos noesypr1d

para saturao de sinal da gua com diferentes parmetros.
Em uma tentativa de otimizar a relao sinal/rudo para a observao de
sinais na regio de hidrognios aromticos ( 6,5 a 8.5) fez-se espectros
irradiando seletivamente esta regio como um possvel experimento adicional,
utilizando o experimento de excitao seletiva com gradiente de campo com a
seqncia de pulso selgse. Porm, a melhora na relao sinal/rudo dos sinais
desta regio (Figura 5) no foi significativa o suficiente para compensar o tempo
adicional de anlise requerido pelo experimento e descartou-se esta opo.
26
a) noesypr1d 128 scans
b) Irradiao seletiva 128 scans
b) Irradiao seletiva 256 scans
8.50
8.00
7.50
7.00
6.50
ppm (t1)
Figura 5: Expanso da regio 6,5-8,5 dos espectros de RMN de 1H obtido com

a seqncia de pulso (a) noesypr1d com 128 aquisies e com excitao seletiva
da regio aromtica utilizando (b) 128 e (c) 256 aquisies.
4.1.3 Quantidade de soro utilizado na preparao das amostras

Visto que a retirada do sangue dos camundongos feita atravs do desvio
da circulao do olho, a quantidade de sangue retirado, e conseqentemente a
quantidade de soro disponvel para preparar a amostra, varivel dependendo do
estado de sade do animal. Nas primeiras anlises realizadas com as amostras
de tumor de Ehrlich, o volume de soro utilizado no preparo das amostras variou
de 20 a 200 L. Porm, volumes prximos ou iguais a 200 L dificultavam muito o
ajuste do campo magntico (shimming). Assim determinou-se como volume
mximo 100 L de soro para as anlises posteriores.
4.2
Teste de sobrevida
Com a finalidade de estabelecer e testar a metodologia proposta para o
estudo do efeito de tumores na composio de biofludos foram utilizados

camundongos, devido a estes serem um sistema comportado em que as variveis
podem ser previstas e controladas. Utilizou-se duas linhagens de camundongos:
camundongos Swiss, uma linhagem heterognea, isto , com variabilidade
gentica, e camundongos Balb-C, 99% isognicos.
27
Realizou-se testes de sobrevida em triplicata para a linhagem de

camundongos Swiss com os dois tipos de tumor, TE e S180, e Balb-C com TE,
para saber quanto tempo os camundongos sobreviveriam aps a inoculao do
tumor. Com este dado, pode-se determinar em que estgio da doena, ou quo
precocemente, possvel o diagnstico por meio da anlise do soro sanguneo
por RMN de 1H aliada a quimiometria. Os resultados so apresentados na Tabela
3.
Tabela 3: Resultado dos testes de sobrevida realizados para as duas linhagens
de camundongos com os tumores TE e S180.
Linhagem dos
camungongos
Swiss
Swiss
Balb-C
Tumor inoculado
Tempo de sobrevida
mdio (dias)
18,32,89
18,05,29
21,02,65
TE
S180
TE
Pelos resultados apresentados observa-se que o tempo sobrevida

influenciado principalmente pelo tipo da linhagem do camundongo. Considerando
a linhagem de camundongos Swiss os resultados foram bastante similares para
os dois tipos de tumor, sendo que para aqueles inoculados com S180 o desviopadro foi bem superior, indicando maior variao no tempo de vida entre os
camundongos. Por sua vez, a linhagem de camundongos Balb-C inoculado com
TE apresentou tempo de sobrevida 15% maior que a linhagem de camundongos
Swiss inoculados com o mesmo tipo de tumor. Porm, isto no pode ser
considerado
como
fator
concludente
com
respeito
velocidade
de
desenvolvimento do tumor nas diferentes linhagens, porque a concentrao de

clulas tumorais inoculadas nos camundongos Balb-C foi de 1,0x10 6 clulas
tumorais/ml, a metade da utilizada nos camundongos Swiss. Esta diferena na
concentrao foi estabelecida por causa do menor tamanho dos camundongos
Balb-C, que no suportariam a mesma concentrao utilizada para os
camundongos Swiss devido ao grande inchao causado pelo crescimento do
tumor.
A correlao entre o tempo de sobrevida de camundongos e humanos com
cncer bastante difcil, tendo em vista que o diagnstico em humanos
geralmente feito em estgios mais avanados da doena. Mesmo quando se
consegue o diagnstico em estgios iniciais da doena, logo se iniciam
28
tratamentos para combater o crescimento do tumor diferentemente do

experimento realizado neste trabalho em que no foi feito nenhum tipo de
tratamento, alm de que o desenvolvimento do tumor varia muito de pessoa para
pessoa.
Anlise visual dos espectros de RMN de 1H
4.3
A anlise visual dos espectros de RMN de 1H no permitiu identificar sinais

que diferenciem as amostras de controle das pertencentes aos grupos inoculados
com tumor, independente do tipo do tumor e da linhagem dos camundongos, o
que exemplificado nas Figuras 6 a 8 nas quais se comparam espectros de RMN
de 1H dos respectivos grupos de controle com aqueles obtidos de grupos
inoculados com cada tipo de tumor por diferentes perodos aps a inoculao.
Comparando-se as amostras de grupos inoculados com TE (Figura 6) com
aqueles inoculados com S180 (Figura 7), tambm no possvel perceber
visualmente um padro de diferenas entre os espectros dos dois conjuntos.
Assim tornou-se essencial a anlise quimiomtrica para tentar discriminar as
amostras em sadio e doente e de acordo com o tipo de tumor inoculado.
Controle
3 dias
7 dias
10 dias
5.5
5.0
4.5
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
ppm
29

inoculadas com TE por diferentes perodos em camundongos Swiss.
Controle
3 dias
7 dias
10 dias
5.5
5.0
4.5
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
ppm
Figura 7: Comparao dos espectros de RMN de H das amostras de controle e

inoculadas com S180 por diferentes perodos em camundongos Swiss.
Controle
3 dias
7 dias
10 dias
5.5
5.0
4.5
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
ppm
30

inoculadas com TE por diferentes perodos em camundongos Balb-C.
4.4
Atribuio dos sinais nos espectros de RMN de 1H

Os espectros de RMN de 1H obtidos a partir das amostras de soro dos
camundongos pertencentes aos grupos de controle e inoculados com TE e S180

apresentaram os sinais concentrados na regio de 0,5 a 5,5. A regio referente
a sinais de hidrognios aromticos, 6,0-9,0, apresentou sinais com baixa
relao sinal-rudo, no sendo possvel identificar substncias referentes aos
sinais desta regio. Os principais sinais foram atribudos atravs de comparaes
com dados da literatura (Nicholson e Foxall, 1995; Fan e Lane, 2008) e emprego
de experimentos de RMN 2D.
Os primeiros sinais atribudos foram em relao aos lipdeos presentes na
amostra, embora no tenha sido possvel uma atribuio exata de cada tipo de
lipdeo no espectro de RMN de 1H. Isto se deu em decorrncia dos sinais
alargados referentes a vrios tipos de lipdeos na amostra e a baixa resoluo do
espectro de RMN, insuficiente para distinguir cada um deles. A atribuio dos
sinais encontra-se na Tabela 4. Alm do auxlio da literatura (Nicholson e Foxall,
1995; Fan e Lane, 2008), pelo experimento de correlao 1H-1H DQF-COSY
(Figura 9), o qual identifica spins diretamente acoplados, observa-se a correlao
entre o sinal de 0,89-0,92 com o sinal 1,28-1,32, sendo ambos sinais bem
alargados, evidenciando presena de sobreposio de sinais de diferentes
metablitos. Pelo experimento de correlao 1H-1H TOCSY (Figura 10), no qual
possvel observar inteiros sistemas de spins, comprova-se a presena dos
lipdeos pela correlao do sinal em 1,28-1,32 com os sinais em 0,89-0,92,
1,54-1,63, 2,00-2,12, 2,23-2,26, 2,76-2,81 e 5,30-5,36, conforme mostra a
Tabela 4.
Tabela 4: Deslocamentos e atribuio dos sinais referentes a lipdeos conforme
observado no experimento de TOCSY.
RMN de 1H ()
0,89-0,92
Atribuio
CH3(CH2)n ; CH3CH2CH2C=; (principalmente LDL e VLDL)
1,28-1,32
1,54-1,63
2,00-2,12
2,23-2,26
2,76-2,81
5,30-5,36
31
CH3CH2-; -(CH2)n- (principalmente VLDL 1,29 ppm)

-CH2CH2CO- (principalmente VLDL 1,57 ppm)
-CH2C=C-CH2CO-C=CCH2C=C-CH=CHCH2CH=CH-; =CHCH2CH2-
ppm
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
5.0
5.5
5.5
5.0
4.5
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
ppm
Figura 9: Correlaes 1H-1H observadas no experimento de DQF-COSY obtido a

S180 por dez dias.
32
ppm
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
5.0
5.5
5.5
5.0
4.5
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
ppm
Figura 10: Correlaes 1H-1H observadas no experimento de TOCSY obtido a

por trs dias.
Pela anlise por CG-EM de duas amostras provindas de camundongos

Swiss, uma de controle e outra de inoculao com TE por cinco dias confirmou-se
a presena de cidos graxos, incluindo cido palmtico, esterico, olico e
linolico em maior quantidade. A presena destes lipdeos justifica a grande
intensidade do sinal em 1,28-1,32 atribudos aos metilenos conforme mostra a
Tabela 4, proveniente principalmente dos cidos graxos saturados palmtico
(C16:0) e esterico (C18:0).
Junto dos sinais referentes aos lipdeos na regio de 0,90 a 1,03 h
tambm sinais minoritrios sobrepostos. Observa-se na regio de 0,93 a 1,25
pequenos sinais que devem ser de aminocidos, tais como valina, leucina e
treonina, alm de 3-hidroxibutirato e isobutirato. Porm, no possvel observar
correlao para estes sinais com outros sinais que podem ser referentes a estas
substncias, como em 3,57, 3,60 e 3,69, os quais podem ser referentes aos
hidrognios da valina, treonina e leucina, respectivamente, devido baixa
33
intensidade dos sinais. Apenas pode-se propor estas atribuies por comparao
com dados da literatura (Nicholson e Foxall, 1995; Fan e Lane, 2008).
Em algumas amostras, junto do sinal em 2,23-2,26 tambm h um
singleto em 2,24, possivelmente referente ao aceto-acetato (Nicholson et al.,
1995).
O dubleto com grande intensidade em 1,34 foi atribudo ao lactato, pois
mostra correlao no experimento de DQF-COSY (Figura 9) com o quarteto em
4,12 ppm, ambos com constante de acoplamento (J) igual a 6,9 Hz.
Lactato
Outra substncia identificada foi a alanina, presente em quantidade muito
pequena nas amostras, referentes ao dubleto em 1,47 com J=7,2 Hz e do sinal
em 3,76 ppm, atribudos atravs do experimento de DQF-COSY (Figura 9).
Alanina
Quanto aos acares, atribuiu-se o dubleto em 5,23 com J=3,9 Hz ao
hidrognio H1 da -glucose, o qual apresenta correlao com o sinal em 3,54
referente ao hidrognio H2, no experimento de DQF-COSY (Figura 9). Pelo
experimento de TOCSY (Figura 10) foi possvel atribuir os sinais de correlao em
3,77, 3,34 e 3,82 tambm -glucose, que correspondem aos hidrognios H3,
H4 e H5, respectivamente, por comparao com os dados da literatura (Nicholson
e Foxall, 1995; Fan e Lane, 2008), s no sendo possvel atribuir os sinais dos
hidrognios H6 e H6. O dubleto em 4,66 com J=8,1 Hz que apresentou
correlao com o sinal em 3,26 foi atribudo -glucose, sendo os hidrognios
34
H1 e H2, respectivamente. Por sua vez, o hidrognio H2 apresentou correlao

com o hidrognio H3 em 3,48. Prximos ao sinal do hidrognio H3 tambm
esto os sinais dos hidrognios H4 e H5, conforme observado no experimento de
TOCSY (Figura 10), e aos hidrognios H6 e H6 foram atribudos os sinais em 3,
72 e 3,88. Vrios outros sinais foram observados na regio de 3,34 a 3,90,
caracterstica de acares, porm sem atribuio definida devido grande
sobreposio de sinais. Pelo experimento de HSQC de correlao 1H-13C a uma
ligao (1J) apresentado na Figura 11, observa-se a correlao dos sinais da
regio de 3,20 a 3,90 com os sinais de 13C na regio de 60 a 80, caracterstica
de acares, enquanto os sinais referentes aos hidrognios H1 da e -glucose
apresentam correlaes com os carbonos em 94,8 e 99,8, respectivamente,
deslocamentos qumicos caractersticos da carbonos anomricos. A presena da
glucose foi confirmada tambm na anlise por CG-EM, alm de outros acares,
incluindo galactose e manose, porm no se encontrou sinais no espectro de
RMN de 1H referentes a estes dois acares.
2
1
5
3
-glucose
1
-glucose
Os sinais em 3,20-3,24 foram atribudos a diferentes compostos de colina

podendo incluir colina livre, ligada a lipdeos, fosfocolina e glicerofosfocolina,
devido forte correlao deste sinal com o sinal de
13
C em 56,8 ppm no
experimento de HSQC, caracterstico de carbono ligado a nitrognio com carga

positiva. A presena da fosfocolina foi confirmada pelo experimento de correlao
1
H-31P a longa distncia (LRJPH) (Figura 12) pela correlao entre o hidrognio em
3,23 com fsforo em 0,0. Neste mesmo experimento observa-se outra

correlao do sinal do hidrognio em 3,64 com o fsforo em 0,15,
possivelmente atribudo fosfosserina por apresentar padro similar de
acoplamento a esta, porm no houve confirmao desta atribuio. Este sinal de
hidrognio no observvel no espectro de 1H mostrando o grande ganho de
sensibilidade pelo experimento obtido atravs da deteco indireta por meio do
1
H, e no pelo ncleo X, no caso o
31
P. A isto se soma o fato de ter sido adquirido
35
em sonda inversa, na qual a bobina correspondente ao ncleo 1H a mais interna

e a bobina correspondente ao ncleo X a mais externa, ao passo que os
espectros de 1H foram obtidos em sonda de observao direta, na qual a bobina
mais interna dedicada ao X e a mais externa ao 1H.
Colina
ppm
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
120
130
5.5
5.0
4.5
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
ppm
Figura 11: Correlaes 1J 1H-13C observadas no experimento de HSQC obtido a

por sete dias.
36
ppm
-1.0
-0.5
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.80
3.75
3.70
3.65
3.60
3.55
3.50
3.45
3.40
3.35
3.30
3.25
3.20
3.15
ppm
Figura 12: Correlaes LRJ 1H-31P observadas no experimento de HMBC obtido a

S180 por cinco dias.
4.5
Anlise quimiomtrica
Utilizaram-se dois mtodos para tentar discriminar as amostras: Anlise de
Componentes Principais (PCA) e Anlise Discriminante com Calibrao

Multivariada por Quadrados Mnimos Parciais (PLS-DA).
4.5.1 Pr-processamento dos dados

Para que as variveis utilizadas nas anlises quimiomtricas estejam em
funo apenas da composio qumica das amostras, fatores interferentes devem
ser ajustados antes de iniciar a anlise. Dentre entes fatores inclui-se o ajuste da
linha de base dos espectros, que deve ser a mesma para todos os conjuntos de
dados, evitando oscilaes que poderiam causar resultados equivocados. Outro
37
fator no caso dos espectros de RMN o ajuste da fase dos espectros, para que
no cause alteraes nas variveis, caso sejam as reas dos sinais, e a
calibrao de todos os espectros em relao a um sinal de referncia, neste caso
o sinal das metilas do TMSP-d4 em 0,0.
H vrias formas de se determinar as variveis de entrada nas anlises
quimiomtricas. Uma opo seria utilizar os sinais dos espectros de RMN, porm
muito difcil definir cada sinal e as variaes dos mesmos em espectros de
amostras complexas devido grande sobreposio dos sinais, especialmente em
espectros de RMN de 1H em que os sinais se concentraram em uma pequena
faixa de deslocamentos qumicos. Outra opo seria utilizar os pontos usados na
construo dos espectros, o que significa que um espectro adquirido com 64K de
pontos teria 64K variveis de entrada. No entanto, utilizar os prprios pontos
como variveis apresenta alguns inconvenientes, entre eles o grande nmero de
variveis, o qual no suportado por alguns programas computacionais de
anlise quimiomtrica ou torna os clculos muito lentos. Alm disso, os pontos
so muito suscetveis s variaes nos deslocamentos qumicos dos sinais nos
espectros, causados por efeitos de concentrao da amostra, homogeneidade do
campo magntico aplicado, alteraes na temperatura e no pH da amostra.
Assim, um determinado ponto no representar sempre o mesmo sinal em todas
as medidas.
Como mtodo alternativo, o programa computacional AMIX determina as
varveis dividindo o espectro em intervalos chamados buckets cujo tamanho
definido pelo analista (Manual AMIX, 2008). O programa apresenta ento
ferramentas de integrao dos sinais para clculo da rea dos buckets, incluindo
o denominado modo especial de integrao, o qual suprime efeitos causados pela
variao no ajuste da fase do espectro e na linha de base do espectro, porm
este no apresentou bons resultados no presente caso da anlise de soro
sanguneo. Foi utilizada ento a soma das intensidades absolutas, forma mais
comum de integrao que necessita dos ajustes prvios j citados, incluindo
calibrao do espectro, ajuste de fase e linha de base.
Utilizando o conjunto de dados que inclui amostras de camundongos Swiss
de controle e inoculados com TE por trs, sete e dez dias, realizaram-se as
anlises por componentes principais (PCA) com diversas regies do espectro,
desde o espectro todo at regies especficas, sempre excluindo a regio do sinal
38
da gua no deuterada (4,5-5,2 ppm) que afetada pela saturao do sinal

causando variaes nos deslocamentos qumicos e intensidades dos sinais
prximos. O melhor resultado foi obtido com a regio de 0,4 a 4,5 ppm, regio que
inclui a maior parte dos sinais mais intensos.
O tamanho dos buckets tambm foi variado desde 0,001 at 0,5 ppm.
Buckets maiores (0,1-0,5 ppm) no apresentaram boa separao dos grupos,
como mostrado no grfico de escores na Figura 13A utilizando buckets de 0,5
ppm. Por abranger uma rea consideravelmente grande, h perda da resoluo
espectral e perda de informaes, porque um bucket maior pode abranger sinais
prximos que passaro a ser considerados como uma nica varivel, dificultando
a deteco de pequenos sinais que sero mascarados por sinais maiores no
mesmo bucket. Os buckets menores que 0,05 ppm apresentaram separao dos
grupos similares entre si, como se pode ver nos grficos de escores utilizando
buckets de 0,01 e 0,001 ppm, Figuras 14A e 15A respectivamente. Porm,
buckets muito pequenos (0,001-0,005 ppm) no forneceram nenhuma informao
alm da fornecida pelo bucket de 0,01 ppm e seus grficos de influncia ou
loadings se tornavam confusos (Figuras 15B) porque passa a haver vrios
buckets para representar um mesmo sinal e no h ganho de informaes. Ainda
percebe-se que conforme o tamanho dos buckets diminui, a varincia explicada
pelas primeiras PCs tambm diminui, enquanto para o bucket de 0,5 ppm com 2
PCs 99,4% da varincia explicada, para o bucket de 0,01 ppm a soma da
varincia de PC1 com PC2 cai para 95,1% e para 90,4% para o bucket de 0,001
ppm. Considerando estas informaes, escolheu-se o bucket de 0,01 ppm que
tem boa capacidade de separao dos grupos de amostras sem grande perda da
varincia explicada e apresenta grficos de influncias coerente.
39
PC2
PC2
0.050
B
2.25
0.50
0.025
4.25
0.25
2.75
1.75
0.000
0.00
1.25
0.75
-0.025
-0.25
3.25
3.75
-0.25
0.00
0.25
-0.050
-0.25
0.00
0.25
0.50
0.75
-0.50
PC1
PC1
buckets de 0,5 ppm das amostras de controle (+), trs dias (), sete (x) e dez dias
(). (B) Grfico de influncias (loadings) de PC1 versus PC2 explicando a
classificao das amostras apresentada no grfico de escores.
40
PC2
PC2
0.50
1.28
0.50
1.29
0.25
0.25
2.23
1.27
2.24
0.890.883.22
3.23
2.01
3.83
2.02
3.49
0.87
2.22
2.00
3.89
2.75
0.90 2.25
1.57
2.76
1.56
3.40
1.26
4.28
3.20
3.46
3.88
4.11
3.82
0.85
0.84
1.58
3.74
2.74
3.21
1.99
3.92
4.07
3.54
3.47
2.03
1.55
3.69
3.52
3.55
3.45
4.09
3.63
3.71
3.78
3.42
3.91
1.25
4.28
2.21
4.26
3.64
1.46
3.87
3.19
3.67
3.70
0.86
2.85
4.07
3.04
2.38
4.05
3.58
2.71
2.55
1.98
1.92
2.67
2.68
3.65
3.63
1.54
3.77
0.83
4.30
3.38
3.35
3.18
2.99
3.00
1.25
2.84
3.15
3.17
2.89
2.90
2.72
3.66
2.41
2.40
1.83
1.84
1.24
2.86
3.33
3.16
2.91
2.51
2.96
2.97
2.98
3.01
2.20
1.97
1.81
1.82
2.88
3.12
3.14
2.70
2.61
2.63
2.66
4.44
4.26
1.45
1.78
1.80
1.85
3.36
3.37
3.39
3.32
3.13
2.60
2.62
2.64
2.65
2.92
2.54
2.94
2.95
3.02
4.45
4.46
4.47
4.48
4.49
4.42
4.43
3.68
2.19
1.96
4.01
1.79
3.31
3.10
3.11
2.59
2.93
2.34
3.59
4.39
4.41
1.66
1.67
1.44
4.03
1.68
1.53
1.95
1.86
1.69
1.70
3.98
1.21
3.08
2.73
2.56
3.03
2.33
2.50
2.36
2.37
4.38
4.40
4.24
3.81
2.43
4.20
4.21
4.22
2.18
1.47
1.71
1.75
1.77
0.82
0.50
3.30
0.51
0.52
0.53
0.54
0.55
0.56
0.57
2.69
0.58
0.59
0.60
3.61
2.52
2.53
0.61
0.63
3.62
2.49
0.64
0.71
0.74
4.23
4.19
2.17
1.72
1.76
2.04
1.59
2.87
2.57
3.07
2.35
0.65
0.66
2.42
0.67
3.72
1.52
3.99
0.81
2.31
3.41
2.48
4.36
1.43
0.70
4.18
2.13
0.78
0.79
3.97
1.94
1.19
0.80
2.80
2.82
4.32
3.51
2.44
0.75
0.68
0.76
0.77
1.88
1.73
1.20
0.96
1.22
2.81
0.72
1.65
0.73
0.69
3.79
1.91
1.48
1.51
1.03
3.06
4.34
3.27
2.47
2.38
2.39
2.14
3.96
1.12
1.02
2.16
1.90
4.17
1.13
0.95
2.46
2.45
1.89
1.14
1.16
1.93
1.11
4.30
2.15
1.15
1.18
3.95
1.09
1.08
1.42
3.57
1.17
2.30
3.88
3.84
3.29
4.34
3.53
1.50
1.05
1.07
3.94
0.00
2.13
2.77
1.64
3.05
3.86
1.04
0.97
4.32
2.12
3.73
1.06
1.00
3.75
2.05
4.11
2.79
3.43
4.16
0.98
1.01
1.41
3.80
3.93
0.99
2.78
4.13
1.60
1.63
3.56
0.94
3.44
2.29
2.11
3.76
2.07
4.13
3.90
1.62
1.63
1.40
4.15
2.10
3.28
3.50
3.48
3.24
2.27
2.26
2.09
3.26
2.08
2.28
4.14
1.39
1.38
1.38 3.25
0.93
1.32
0.00
0.91 0.92
1.37
1.31
-0.25
1.34
-0.25
1.30
1.35
-0.50
-1.00
-0.50
0.00
0.50
1.00
1.33
-0.60
-0.50
-0.40
-0.30
-0.20
-0.10
0.00
PC1
PC1
buckets de 0,01 ppm das amostras de controle (+), trs dias (), sete (x) e dez
dias (). (B) Grfico de influncias (loadings) de PC1 versus PC2 explicando a
41
PC2
PC2
0.200
B
1.29
1.29
1.29
1.29
1.29
1.29
1.29
1.29
1.28
1.29
1.00
1.28
1.28
1.29
1.30
1.32
1.33
1.32
1.30
1.30
0.00
1.33
1.32
1.30
-2.00
-1.00
0.00
1.00
2.00
2.24 0.100
2.24
1.28
1.28
2.24
1.28 2.24
1.28 2.24
1.28 0.050
1.282.23
1.282.24
1.27
2.24
2.24
1.27
0.90
0.90
2.23
2.24
0.90
0.901.27
0.90
1.27
3.49
2.23
0.88
0.88
2.24
0.88
3.47
0.88
3.23
1.27
0.88
3.49
3.23
0.88
2.23
3.47
0.900.90
3.23
3.89
3.72
0.88
3.84
3.23
3.83
3.43
3.22
3.50
1.27
2.23
3.24
0.89
4.11
3.89
0.90
2.25
3.84
0.88
3.47
3.83
3.43
2.23
3.40
3.42
0.89
1.27
2.25
4.11
0.90
0.88
2.02
2.02
3.72
3.22
3.49
3.83
3.92
2.01
2.02
3.50
3.84
3.72
0.89
2.75
2.23
3.40
3.52
3.89
1.27
2.01
3.55
2.26
2.25
0.89
2.02
2.25
2.01
2.75
2.01
3.47
3.54
0.88
3.24
2.00
3.83
0.89
2.03
2.75
4.11
4.09
3.70
2.76
2.22
3.56
3.43
3.69
0.90
2.25
2.03
2.77
1.57
1.57
3.21
3.75
2.76
1.57
1.27
2.75
2.00
3.22
0.89
0.89
2.26
1.58
4.11
3.52
0.87
1.57
3.04
3.55
3.82
3.83
0.89
1.56
4.27
3.41
3.46
2.76
4.28
4.27
3.38
3.72
3.84
3.92
0.85
0.85
2.25
1.58
1.56
1.27
2.22
2.00
3.47
2.25
2.75
3.20
3.21
2.38
3.69
3.88
3.78
3.90
0.86
1.56
3.22
3.79
3.86
1.58
4.06
3.45
3.64
3.42
3.41
1.92
0.91
2.74
3.50
3.55
1.99
3.45
3.74
3.77
2.03
1.56
4.27
3.56
3.82
3.54
2.77
4.28
4.09
1.26
3.40
3.70
3.58
3.27
3.46
3.72
0.84
0.87
0.86
2.26
4.10
4.07
1.55
3.47
3.39
3.04
2.22
3.52
4.06
3.71
3.24
3.41
3.20
3.65
3.59
3.79
1.46
1.47
3.86
3.75
2.04
1.59
4.09
3.38
3.22
2.68
3.63
2.38
3.68
3.49
3.53
3.78
3.87
3.90
3.91
1.24
1.25
4.11
2.84
2.21
4.26
1.55
2.37
3.93
2.25
3.84
3.69
1.99
4.30
4.08
2.74
2.55
3.72
3.67
4.05
3.58
3.77
0.87
2.77
4.29
2.85
3.34
3.35
3.19
1.26
3.55
3.64
3.43
3.27
2.71
3.62
3.42
2.41
3.54
1.98
0.84
0.86
0.91 2.05
4.10
3.17
2.91
2.67
2.56
2.51
3.00
1.54
3.71
1.92
3.88
0.83
2.83
3.18
3.33
2.89
2.69
2.90
2.72
2.92
3.66
3.04
3.52
2.97
2.99
3.82
3.74
1.81
1.83
1.84
3.90
1.23
3.41
3.40
3.16
3.15
2.88
3.11
3.05
3.56
3.48
3.59
2.96
2.98
3.01
4.44
3.68
2.20
1.46
1.82
1.85
1.79
1.78
1.25
4.11
4.31
2.86
3.12
3.14
2.65
3.50
3.10
2.70
2.66
2.59
2.60
2.61
2.62
2.63
2.64
3.46
2.93
2.38
3.53
2.94
3.02
1.26
4.42
4.45
4.50
4.25
4.26
3.51
3.79
1.45
4.04
1.97
4.01
1.96
1.80
1.21
2.05
3.36
3.31
3.32
3.13
3.08
3.09
2.58
2.54
3.60
2.95
2.35
2.33
4.41
4.43
4.46
4.47
4.49
4.39
4.40
2.37
2.42
2.40
2.19
4.21
3.84
1.66
1.67
4.03
1.68
1.69
1.26
4.02
1.95
1.71
1.70
3.98
3.91
2.26
1.59
4.29
4.30
3.38
0.51
3.30
2.74
2.73
2.52
3.62
2.50
2.36
4.48
3.27
2.49
4.38
3.69
3.58
4.23
4.24
4.22
3.54
2.18
4.20
1.53
1.86
4.00
1.75
1.77
1.72
3.93
2.05
2.77
2.25
2.87
3.39
3.35
3.37
0.50
0.54
0.55
0.56
0.57
0.58
0.59
3.07
2.69
2.31
2.32
0.60
0.61
0.62
3.03
2.53
2.34
0.64
3.45
0.71
0.65
4.37
2.43
0.75
4.19
2.17
1.48
3.77
2.13
1.93
1.52
3.75
1.74
1.76
1.20
0.82
3.86
1.03
2.04
4.10
4.13
2.86
0.52
3.41
0.53
3.72
3.61
0.63
0.66
0.67
0.68
0.70
4.18
3.81
1.87
1.49
0.78
0.79
3.99
1.94
0.80
0.81
3.90
0.96
2.83
2.57
3.04
0.72
4.36
2.48
2.44
2.45
1.44
1.47
0.76
2.14
1.92
1.88
1.73
0.95
3.97
1.19
1.22
1.04
1.23
1.02
2.80
2.81
4.32
3.06
3.05
1.43
4.34
4.35
2.39
1.65
0.74
3.71
0.77
3.88
3.87
1.51
0.97
3.96
2.82
3.48
2.47
0.73
2.46
0.69
3.79
2.15
4.17
1.91
1.90
1.89
1.14
3.84
1.21
1.13
1.12
1.11
1.09
1.60
4.11
3.50
3.74
3.28
2.38
3.74
0.96
2.77
4.29
3.56
3.29
3.42
3.91
3.93
2.25
4.30
3.39
2.31
1.42
3.57
3.72
2.13
2.16
1.48
1.15
1.16
3.73
1.18
3.86
3.95
1.10
1.08
3.94
2.04
4.12
3.40
2.30
3.53
3.80
1.49
1.17
1.94
1.07
3.24
3.49
3.81
3.44
0.95
1.06
1.04
0.96
1.02
2.26
4.32
4.13
3.43
1.64
1.65
3.54
3.77
3.84
3.90
0.91 2.05
3.06
3.71
2.39
2.12
4.17
3.88
1.51
1.00
2.80
3.45
2.11
1.50
1.05
1.01
0.000
3.29
3.05
3.28
3.50
0.97
1.60
4.32
4.33
3.53
3.51
3.48
3.80
4.16
3.94
3.76
1.07
3.93
2.30
1.42
2.77
3.56
3.57
3.75
3.44
0.99
1.02
1.64
3.54
3.81
0.95
0.98
3.91
2.79
4.11
1.41
3.85
1.00
0.98
3.43
2.11
3.43
3.71
1.50
3.73
1.01
2.26
2.78
2.79
4.12
3.42
3.28
3.77
3.90
2.30
3.45
0.94
2.06
1.60
1.63
4.14
4.13
3.29
4.16
3.93
2.78
2.29
3.56
3.48
3.43
2.10
3.50
1.61
3.49
3.27
3.24
1.63
3.44
3.51
3.77
3.91
2.07
1.41
4.14
3.90
2.06
1.61
4.12
3.42
2.06
2.26
2.29
3.29
3.28
4.16
1.61
0.94
3.76
1.63
1.40
2.10
4.15
3.50
3.25
1.62
1.61
1.62
1.62
1.62
4.12
4.13
2.28
2.09
2.09
2.10
0.91 2.07
3.29
3.48
4.16
3.24
2.09
3.44
3.49
0.94
3.51
4.14
2.26
2.28
1.40
2.29
4.15
2.27
2.09
3.28
2.07
4.12
3.51
2.28
0.94
3.48
2.08
1.40
2.29
4.15
3.27
2.28
2.26
2.28
2.28
3.51
2.07
1.40
3.49
3.25
2.08
1.39
1.39
0.94
4.14
3.48
2.08
2.27
1.39
3.51
2.08
1.39
4.14
3.26
0.94
3.25
1.38
0.91 1.37
3.26
0.94
1.38
3.25
3.26
1.38
1.37
1.37
1.38
1.38
0.94
3.25
3.26
1.37
0.94
3.25
1.37 0.93
1.34 0.911.37
0.93
0.93
0.93
1.34 0.91
0.93
1.37
0.91
0.93
0.91
0.91
0.92
0.93
0.93
0.92
0.92
0.93
0.93
0.92
0.92
0.92
0.92
0.92
0.92
1.36
0.92
1.34
-0.050
1.36
1.34
1.32
1.33
1.32
1.32
1.30
1.32
1.32
1.32
1.33
1.32
1.30
1.31
1.36
1.35
1.31
1.33
1.35
1.30 1.31
1.35 1.36
1.31
1.34 1.35
1.36
1.30 1.311.33
1.35
1.31
1.35
1.35
1.301.31
-0.100
1.36
1.35
1.31 1.33
1.30
1.35
1.31
1.31
1.35
1.36
1.34
1.36
1.36
1.36
1.331.34
1.33
1.34
1.33
1.34 -0.150
-1.00
-3.00
0.150
3.00
-0.150
-0.100
-0.050
0.000
PC1
PC1
buckets de 0,001 ppm das amostras de controle (+), trs dias (), sete (x) e dez
dias (). (B) Grfico de influncias (loadings) de PC1 versus PC2 explicando a
Para escolha do mtodo de escalamento, utilizaram-se conjuntos de
amostras de cinco dias de inoculao de TE em camundongos Balb-C e
respectivos grupo de controle com e sem jejum. Estas amostras foram preparadas
utilizando 100 L de soro e 500 L de soluo 1,03x10 -3 mol.L-1 de TMSP-d4 em
D2O, para se ter uma concentrao conhecida que pudesse servir de referncia
aos demais metablitos presentes na amostra. Assim, fez-se as anlises
quimiomtricas utilizando escalamento em relao regio de referncia, no caso
de -0,1 a 0,1 ppm, regio referente ao sinal do TMSP-d4 utilizado como referncia
interna e escalamento em relao a intensidade total dos sinais. O resultado
42
apresentado na Figura 16 e 17 comparando com os grficos de escores das

anlises utilizando os dois mtodos de escalonamento. Percebe-se que os
resultados foram muito similares, sendo que nos grficos de escores na Figura
17, o mtodo de escalamento em relao intensidade total dos sinais (Figura
17B) apresentou melhor separao das amostras em PC1 do que o escalamento
em relao regio de referncia. Assim, o mtodo de escalamento em relao
intensidade total dos sinais mostrou-se mais vantajoso do que o mtodo que
usando uma regio de referncia, sendo que este ltimo no contribuiu com
nenhuma informao relevante, alm de ser muito mais trabalhoso. Assim
escolheu-se o mtodo em relao intensidade total dos sinais, o qual normaliza
as integrais de cada bucket em relao soma total dos buckets, e, portanto, faz
com que as diferenas nas concentraes das amostras no interfiram nos
resultados. Sendo assim, no h necessidade de fixar a quantidade de amostra
analisada. Este pr-processamento extremamente til para as anlises
quimiomtricas dos espectros de amostras de soro, devido variao na
quantidade de sangue que se consegue retirar de cada camundongo, conforme
explicado na seo 4.1.3
PC2
43
0.30
PC2
PC2
PC2
0.30
1.34
1.34
1.35
0.25
0.20
0.20
1.37
1.35
3.26
4.13
4.14
3.73
3.28
3.48
3.900.930.92
3.44
4.15
3.93
3.76
3.86
1.38
4.16
3.25
3.24
3.80
3.77
2.11
2.39
0.98
1.40
1.391.38 0.91
0.94
2.09
1.00
2.29
1.50
3.88
1.05
3.95
2.15
2.28
4.17
3.71
4.11
4.34
1.07
1.02
3.29
1.41
2.27
2.12
1.63
2.42
3.91
0.96
3.97
3.94
1.63
4.18
1.51
1.01
2.10
3.96
4.34
1.93
1.42
4.36
4.19
4.01
4.38
3.99
1.75
2.17
4.32
1.64
4.40
2.13
1.46
1.43
0.99
4.20
2.47
3.81
1.45
1.44
1.62
2.07
2.16
1.77
1.48
4.46
4.47
4.49
4.41
4.21
4.03
1.94
1.73
2.30
3.06
4.48
4.42
4.43
4.22
4.23
4.39
3.98
1.76
1.52
4.44
2.49
4.45
4.24
1.72
1.70
1.08
1.65
3.45
1.90
1.71
2.31
1.53
1.92
1.75
4.05
1.91
2.38
2.18
3.87
2.36
1.68
1.69
3.88
2.46
1.78
3.69
1.79
1.80
2.19
3.42
1.66
1.67
1.47
1.54
2.48
2.44
2.40
1.85
1.88
1.11
1.03
0.95
2.08
4.26
1.95
1.82
2.35
1.09
4.30
2.57
2.53
3.05
1.89
1.81
1.83
1.86
2.20
1.04
0.97
1.84
2.34
1.06
1.96
2.37
2.33
1.50
2.50
2.51
3.02
1.12
2.78
3.30
2.14
1.55
2.94
3.49
2.45
2.43
3.08
3.07
2.54
3.03
0.73
1.97
2.21
1.13
1.60
0.89
3.10
2.95
2.69
0.70
0.78
3.79
4.09
3.32
2.96
2.99
0.74
0.69
0.76
2.73
2.41
0.79
0.80
3.11
2.52
3.01
4.07
0.77
0.71
0.81
2.82
3.13
2.59
2.64
2.66
2.97
2.55
2.98
3.00
3.04
0.75
0.72
0.82
2.79
3.38
3.33
2.60
2.61
3.31
2.92
2.93
4.32
3.12
2.62
3.66
1.98
1.26
0.68
4.07
2.88
0.50
0.51
0.52
3.14
3.15
0.56
2.63
2.88
2.91
0.67
4.28
2.87
2.84
0.53
3.35
3.36
0.60
0.54
2.65
2.67
0.61
0.63
0.64
2.56
0.65
3.68
1.56
2.26
0.55
3.17
3.13
0.57
0.58
3.39
2.70
0.66
2.81
3.16
0.59
2.74
2.22
3.37
2.89
2.90
2.80
0.83
3.18
1.99
2.04
2.71
2.86
3.19
4.28
1.59
0.87
3.51
3.83
2.85
3.65
1.57
1.13
3.46
2.68
2.72
1.58
0.88
2.38
3.20
3.41
3.75
2.05
3.40
3.82
2.00
3.70
3.78
1.27
3.50
2.03
3.67
0.84
4.09
2.01
2.75
2.76
2.77
2.25
3.84
3.38
0.86
3.21
2.23
3.922.02
3.22
3.43
3.74
3.27
0.85
3.47
3.72
0.90
3.89
4.13
0.10
0.00
4.11
3.23
2.24
1.37
1.31
1.30
0.10
4.14
3.28
3.73
0.92
3.44
3.48
1.38 0.91
1.38
0.93
3.90
4.16
4.15
2.27
3.86
3.93
2.39
3.80
2.28
1.39
3.76
3.77
3.29
1.40
2.29
2.09
4.11
1.63
2.11
4.17
4.34
1.62
2.26
4.32
4.18
2.42
2.15
4.49
2.47
4.36
4.47
3.06
4.34
4.40
4.48
1.63
4.19
4.46
4.38
3.45
3.88
4.42
4.43
4.44
4.45
2.49
1.60
2.07
3.95
4.20
4.41
4.30
4.39
3.71
4.22
1.41
4.30
4.21
4.24
3.30
3.97
1.50
4.23
2.57
4.01
0.98
2.17
2.48
2.53
4.26
2.46
2.08
1.05
4.03
4.05
3.05
2.51
2.12
3.10
3.32
1.64
3.38
2.30
3.99
3.81
2.50
3.08
3.07
3.13
3.11
3.33
3.96
2.44
2.94
2.54
3.42
3.31
1.75
4.09
1.07
2.40
3.49
3.12
2.31
1.00
2.95
2.96
2.38
2.59
2.55
2.36
2.64
2.66
2.60
1.42
4.32
2.10
2.16
3.02
2.69
2.52
2.61
2.63
3.15
3.35
3.36
3.51
2.87
3.94
3.98
1.77
1.93
2.62
3.14
3.91
1.94
1.90
2.97
3.03
1.65
2.82
1.73
2.45
2.18
2.98
2.99
2.92
2.93
3.16
3.17
3.37
1.76
1.72
1.70
1.51
2.13
2.43
2.19
3.04
2.35
2.88
2.84
1.71
1.92
1.46
1.44
3.13
2.65
2.37
2.34
4.28
4.07
2.78
1.02
1.75
1.45
3.01
2.20
4.07
1.43
2.67
1.91
1.78
1.80
1.68
1.66
1.67
3.00
0.94
3.18
2.86
1.59
1.79
1.88
1.69
2.41
0.50
0.51
2.56
0.52
2.33
2.89
1.85
2.90
2.91
4.28
1.86
1.48
0.56
0.54
3.19
1.13
1.89
1.82
1.83
2.21
0.55
0.53
1.95
1.81
2.70
2.85
3.87
1.84
0.57
3.69
0.58
3.39
2.79
1.52
0.60
0.59
1.96
1.47
0.73
1.53
0.61
2.73
2.81
1.08
3.88
0.71
1.54
0.74
0.70
0.72
0.64
0.63
1.01
0.69
2.14
0.75
0.65
2.22
3.66
0.76
1.97
0.96
0.78
2.71
1.55
2.80
1.58
0.77
1.50
0.66
1.11
0.99
0.68
2.68
3.25
3.20
2.04
1.09
0.79
0.67
1.03
1.04
3.79
2.74
1.56
0.80
1.06
1.57
1.12
0.81
1.98
3.65
2.25
3.68
0.82
3.46
1.13
2.05
2.72
3.40
0.97
0.95
4.09
1.99
2.38
3.83
3.38
3.82
0.83
2.77
0.89
2.76
3.41
2.23
3.24
2.75
3.21
3.50
2.03
3.70
3.75
3.67
3.78
2.00
2.01
3.22
3.43
0.90
2.02
3.84
3.27
0.84
3.92
3.74
3.47
3.72
3.89
0.88
1.26
0.87
1.27
0.85
0.86
4.13
4.11
0.00
1.32
1.28
0.00
1.33
-0.10
-0.25
-0.10
4.13
3.26
2.24
3.23
1.28
-0.20
-0.20
1.29-0.50
-1.00
-0.50
0.00
0.50
1.00
0.00-0.75 0.10
-0.50 -0.25
0.20 0.00 0.30
0.25
PC1
0.50
0.40
-0.30
0.75
0.00
PC1
PC1
as amostras de controle () e cinco dias () aps a inoculao com TE dos
animais mantidos com alimentao normal utilizando escalonamento em relao a
regio de referncia; e (B) grfico de escores de PC1 (77,8%) versus PC2
(11,8%) em relao a intensidade total dos sinais.
0.10
0.2
44
PC2
PC2
PC2
PC2
0.50
1.34
1.3
1.37
0.50
0.25
1.33
0.25
0.25
1.30
1.31
1.29
1.32
0.00
0.89
0.88
1.27
3.26
1.28 0.901.26
4.14
0.873.25
0.910.92
3.24
1.38
4.13
3.44
4.16 0.00
0.93
3.86
3.49
1.38
1.00
1.02
3.91
0.86
0.94
0.98
2.04
2.07
1.51
2.39
2.05
2.03
1.39
3.29
0.95
1.07
0.96
1.05
3.77
2.08
3.94
1.40
1.08
1.11
3.76
3.88
2.09
1.03
2.11
0.97
1.12
1.60
2.27
1.56
0.99
1.53
1.45
1.13
1.09
3.28
1.54
1.04
1.52
1.46
1.59
1.41
1.42
2.12
2.16
2.02
1.62
1.63
1.55
1.01
1.58
1.43
1.44
3.42
1.57
3.81
3.73
1.94
4.17
1.63
2.28
2.29
1.64
1.06
2.17
4.18
2.78
1.47
2.34
3.95
2.30
2.13
2.15
2.18
2.79
2.80
2.81
1.50
1.65
2.42
2.10
1.66
0.83
1.67
1.68
2.35
3.80
2.36
2.26
2.01
2.82
0.82
2.31
1.95
2.47
3.79
0.80
0.81
2.20
1.70
4.34
2.19
1.96
1.77
3.69
3.06
3.27
2.21
1.97
0.79
1.78
1.69
1.83
1.84
0.78
1.92
1.85
1.80
1.99
4.32
1.98
1.81
1.82
1.79
1.76
1.75
3.96
4.20
2.00
1.86
1.71
3.45
4.36
4.19
4.15
2.22
4.09
3.87
1.93
1.72
1.73
0.77
0.70
2.43
2.40
2.49
0.84
2.33
1.88
2.38
0.69
0.71
2.41
4.01
3.98
3.99
3.97
4.32
2.37
1.90
0.73
0.74
0.75
0.76
1.91
2.44
2.46
4.30
3.93
2.14
0.72
4.03
2.77
2.84
4.05
4.22
4.23
4.38
4.21
2.48
2.57
2.23
3.71
4.07
2.45
2.53
0.85
4.07
4.28
1.89
0.68
4.44
4.41
4.40
4.28
4.42
4.39
2.50
0.67
4.26
4.45
4.46
4.47
4.48
4.43
4.24
2.51
4.49
3.90
2.85
2.74
0.66
3.30
2.94
2.86
2.54
2.87
3.65
2.93
3.02
2.97
2.99
0.65
2.98
2.95
3.00
2.96
2.55
4.09
3.68
2.92
0.63
0.64
2.59
3.48
1.48
3.67
2.88
2.73
2.52
3.07
2.76
3.03
3.04
3.01
0.61
2.70
3.10
0.60
3.31
2.62
3.32
3.11
2.60
3.08
2.75
4.11
2.64
2.61
2.89
2.69
0.57
0.58
0.59
2.66
2.25
3.66
2.91
3.33
0.54
0.55
0.56
3.12
3.72
3.88
2.90
3.17
2.63
0.53
3.82
2.56
3.37
3.15
3.13
2.65
0.50
0.51
0.52
2.71
2.67
3.36
3.14
3.18
3.35
3.43
3.38
3.16
3.19
2.72
2.68
2.38
3.20
3.47
3.70
3.22
3.78
3.75
3.05
3.92
3.21
3.83
3.39
3.51
1.13
3.46
3.38
3.40
0.00
3.89
3.74
3.84
3.41
4.11
3.23
3.50
4.13
-0.25
1.32
1.3
2.24
1.35
1.30
-0.25
-0.50
-0.25
1.33
-0.50
0.00
0.50
1.29
-0.50 -0.75
-0.40 -0.50
-0.30 -0.25
-0.20 0.00
-0.10 0.25
0.00 0.50
0.10 0.75
0.20
PC1
-0.50
PC1
PC1
as amostras de controle () e cinco dias () aps a inoculao com TE dos
animais mantidos em jejum utilizando escalonamento em relao a regio de
referncia; e (B) grfico de escores de PC1 (70,3%) versus PC2 (15,5%) em
relao a intensidade total dos sinais.
4.5.2 PCA
O primeiro mtodo de classificao das amostras ou reconhecimento de
padres utilizado foi anlise por componentes principais (PCA), um mtodo no
supervisionado em que nenhuma informao a respeito das amostras fornecida.
Este mtodo alm de permitir classificar amostras permite identificar
amostras com comportamento anmalo, denominada outliers. Para isto na anlise
de PCA fornecido o grfico influence plot em que plotado no eixo y a posio
-0.25
45
de cada amostra em relao ao espao do modelo que consiste na varincia

explicada pelas PCs consideradas, e no eixo x a posio de cada amostra em
relao ao centro do modelo. Amostras alm das linhas de confiana, plotadas de
acordo com o nvel de confiana determinado pelo analista, de 95% no caso das
anlises deste trabalho, so possveis outliers (Figura 18). Alm disso, o Hotelling
T2 mostra no grfico de escores os limites das amostras que esto contidas no
modelo segundo o limite de confiana fornecido (Figura 19) (Manual AMIX, 2008).
Vale ressaltar que mesmo que uma amostra aparea como possvel outlier nestes
grficos antes de retir-la do modelo preciso primeiro analisar o que est
levando quele resultado, como por exemplo, contaminao da amostra, preparo
inadequado ou mesmo fatores inerentes ao sistema em estudo como a presena
de outro tipo de doena no camundongo do qual a amostra se originou. Baseado
nestas informaes em conjunto, em cada anlise foi avaliado se era necessrio a
retirada de alguma amostra.
0.250
Linhas de
confiana
Forte outlier
0.200
0.150
0.100
0.050
Espao do
modelo
0.000
0.050
0.100
0.150
0.200
Figura 18: Exemplo de um grfico de influence plot.
0.250
0.300
0.000
46
PC2
0.50
0.25
0.00
-0.25
Forte outlier
-0.50
-1.00
-0.50
0.00
0.50
1.00
PC1
Figura 19: Exemplo de grfico de escores mostrando o Hotelling T2 com 95% de

nvel de confiana.
4.5.2.1 Discriminao entre amostras de grupos sadios e doentes

4.5.2.1.1 TE em camundongos Swiss
O primeiro tipo de tumor testado foi o tumor asctico de Ehrlich (TE), um
tipo de carcinoma mamrio, o qual foi inoculado no peritnio dos camundongos e
amostras de sangue foram obtidas aps determinados perodos. A anlise
quimiomtrica das amostras de soro sanguneo do grupo inoculado com tumor de
Ehrlich e grupo de controle foi feita utilizando amostras de controle, com trs dias,
sete dias e dez dias de inoculao com TE. Uma amostra de dez dias teve de ser
retirada por apresentar comportamento anmalo, mostrada nas Figuras 18 e 19, a
qual apresentou sinais fortemente alargados no espectro de RMN de 1H, por
47
possvel perda da homogeinidade do campo magntico aplicado durante a

aquisio justificando seu comportamento nos grficos de influence plot e grfico
de escores incluindo Hotelling T2 com 95% de nvel de confiana.
O grfico de escores de PC1 versus PC2 (Figura 20A), onde PC1 explica
92,1% da varincia total e PC2 3,2%, somando 95,3% da varincia explicada,
permite separar as amostras em dois grupos. direita se encontram as amostras
de controle e de trs dias e esquerda se agruparam as amostras de sete e dez
dias, discriminando assim animais sadios (controle) e doentes a partir de sete dias
de inoculao em PC1. Esta discriminao explicada pelo grfico de influncias
ou loadings de PC1 versus PC2 (Figura 20B) onde se notam que as amostras de
sete e dez dias, mais a esquerda do grfico de escores, possuem o multipleto em
1,28-1,32 em maior intensidade do que as amostras de trs dias e controle,
referente principalmente a lipoprotena VLDL (very low density lipoprotein)
(Nicholson et al., 1995). Tambm apresentamos os sinais em 0,89-0,92
referentes a metilas dos lipdeos e VLDL e o dubleto em 1,33-1,35, referentes
ao lactato, um pouco mais intensos que as amostras de controle e trs dias.
Enquanto que as amostras de controle e trs dias apresentaram os sinais em
3,25 referentes possivelmente a colina em maior intensidade em relao s
amostras de sete e dez dias.
48
PC2
PC2
B
1.28
0.20
0.25
1.29
2.23
0.10
1.27 2.24
3.22
3.23
3.83
3.49
0.892.25
2.01
2.22
3.89
4.11
2.02
2.00
3.20
3.46
3.88
3.40
1.57
2.76
3.82
4.28
2.75
3.21
0.84
1.56
3.54
0.85
1.58
3.74
4.09
1.99
3.52
3.45
3.92
4.28
2.74
3.69
0.88
2.85
3.63
3.55
3.47
3.71
3.19
3.64
3.42
3.78
4.07
1.55
4.26
1.46
3.87
3.91
2.86
2.21
3.67
4.05
4.30
2.84
3.38
2.38
3.58
3.70
2.67
2.55
3.17
3.18
2.89
2.68
3.04
2.71
3.63
3.00
3.77
1.92
0.87
3.35
3.15
2.90
3.65
2.99
2.40
1.98
0.83
2.03
2.91
1.83
2.87
2.88
3.16
3.66
2.96
2.97
2.98
2.51
4.44
3.01
4.47
2.41
1.81
1.82
1.84
3.33
3.14
3.12
2.63
2.66
4.45
4.46
4.48
4.49
3.36
3.37
3.32
3.13
2.70
2.72
2.60
2.61
2.62
2.64
2.92
2.94
2.95
2.20
1.54
4.41
4.42
4.43
4.26
4.05
1.45
1.97
1.78
1.79
1.80
1.85
4.32
3.31
3.11
2.65
3.10
2.59
2.54
2.93
3.02
4.39
4.40
1.66
1.67
4.03
1.68
4.01
4.30
3.08
2.33
2.34
2.50
2.36
4.38
2.19
4.21
4.22
1.96
1.86
1.69
1.70
3.98
3.39
3.59
2.37
4.24
3.68
2.43
4.20
4.23
1.44
1.77
1.71
0.90 2.04
2.82
0.55
2.69
2.56
0.58
0.59
2.52
2.53
0.61
3.03
2.49
2.35
3.81
2.18
4.19
1.47
1.95
1.75
1.59
3.30
0.50
0.51
0.52
0.53
0.54
2.57
0.56
0.57
0.60
3.07
2.31
0.63
3.62
0.64
0.65
4.36
0.74
3.99
1.76
1.72
0.82
1.25
3.61
0.66
2.42
4.18
2.17
2.13
1.53
0.81
2.73
3.41
2.48
0.71
1.65
0.67
0.78
0.79
0.80
2.81
4.34
2.44
1.43
0.75
0.77
3.97
2.80
0.73
0.70
0.76
1.88
1.52
1.94
1.73
1.21
1.24
0.86
3.51
0.72
2.38
2.39
0.68
3.06
2.47
0.69
3.79
1.91
1.48
1.19
3.96
0.96
1.26
3.72
2.16
2.14
4.17
1.51
4.32
2.30
1.42
1.90
1.20
1.03
2.45
2.46
1.12
1.02
2.15
1.89
1.93
0.95
3.95
1.14
1.13
1.09
1.11
1.22
1.08
1.64
1.15
1.16
3.84
3.53
1.18
3.88
0.00
3.57
2.13
1.50
1.17
3.05
3.94
2.77
3.29
3.27
2.12
3.86
1.07
1.25
1.04
1.05
2.79
3.73
1.41
4.13
1.50
1.06
1.00
1.60
1.63
0.97
3.75
3.93
2.78
4.11
2.29
3.43
3.80
4.16
0.98
2.05
2.11
1.01
0.94
3.56
0.99
2.07
3.44
1.63
1.62
1.40
3.90
2.26
2.10
3.76
2.27
2.09
4.13
2.28
3.48
3.50
4.15
3.28
2.08
1.39
1.384.14
3.26
3.24
1.38 0.93
0.91
0.92 3.25
1.32
0.00
1.31
-0.10
1.37
1.30
1.34
-0.25
-0.20
1.33
-1.00
-0.50
0.00
0.50
1.00
-0.60
-0.50
-0.40
-0.30
PC1
-0.20
-0.10
1.35
-0.50
0.00
PC1
as amostras de controle (+), trs (), sete (x) e dez dias (). (B) Grfico de
influncias (loadings) de PC1 versus PC2 explicando a classificao das amostras
apresentada no grfico de escores.
Considerando apenas as amostras de controle e de trs dias que ficaram
agrupadas direita (Figura 20A), fez-se uma nova anlise quimiomtrica
considerando apenas estes dois grupos para verificar a possibilidade de
diagnosticar a presena da doena atravs dos espectros de RMN de 1H do soro
aps trs dias de inoculao do tumor de Ehrlich. O resultado foi uma
sobreposio parcial entre os dois grupos, sendo que o grfico de escores de
PC1 versus PC3 (Figura 22A) apresentou menor sobreposio que PC1 versus
PC2 (Figura 21A), onde PC1 explica 53,4% da varincia, PC2 16,4% e PC3
12,6%. Assim, considerando que a regio em que h presena de amostras dos
49
dois grupos significativa, ainda no possvel um diagnstico preciso da

doena durante este perodo, porm h uma indicao da presena da doena.
Pelos grficos de loadings (Figuras 21B e 22B), as amostras de controle mais a
direita ficaram mais dispersas e apresentaram os sinais em 1,30-1,35 em maior
intensidade, correspondendo a lipdeos e ao lactato. No h clara diferena entre
as amostras de controle e as inoculadas com TE por trs dias nos nveis
detectveis pela RMN.
PC2
PC2
0.50
0.50
1.29
2.24
0.25
1.33
0.25
3.23
1.28
1.30
1.32
0.85
1.25
0.86
3.24
3.89
2.23
1.25
4.13
3.47
4.11
1.27
1.26
3.72
3.84
0.87
3.22
2.02
3.21
3.83
2.01
3.41
0.84
3.92
1.24
3.50
2.03
2.76
3.70
3.46
2.00
3.55
3.40
2.77
3.75
1.22
3.52
3.43
2.75
3.67
3.20
3.74
1.58
4.09
0.88
2.04
1.99
3.78
1.57
1.59
3.64
1.21
2.72
3.68
3.38
3.82
3.65
2.22
1.20
4.11
2.05
0.90
3.63
1.46
1.56
1.47
3.79
1.98
3.66
4.28
2.38
2.68
2.71
0.83
3.39
3.69
3.42
4.07
2.41
2.73
3.56
1.84
3.00
1.19
1.83
1.97
3.59
3.19
2.74
1.60
3.88
1.92
2.91
2.90
1.82
1.55
3.53
3.02
1.45
1.85
1.96
3.90
2.99
3.04
2.92
2.89
4.07
1.81
4.28
3.01
1.50
3.15
1.44
1.70
2.98
3.18
2.67
2.69
1.79
1.80
1.69
4.09
1.54
2.56
3.16
4.32
3.71
1.43
1.72
1.68
2.97
1.53
3.17
2.70
1.86
2.96
2.21
2.93
2.64
1.78
1.93
1.71
2.20
2.94
3.63
2.63
2.55
2.88
3.14
4.30
1.48
1.67
0.95
2.95
2.66
2.61
2.65
2.78
2.07
0.82
1.95
2.19
1.66
2.37
1.18
2.62
2.38
1.75
1.76
0.96
2.52
1.52
1.17
2.60
2.42
3.13
2.33
3.37
1.88
2.40
2.34
2.35
3.35
3.36
2.86
1.42
0.97
2.43
0.67
3.62
3.12
2.36
3.38
2.18
1.73
2.51
3.10
3.11
3.03
2.87
0.81
1.77
1.13
2.14
0.66
0.68
0.65
2.59
3.31
4.05
4.26
0.64
2.54
1.65
2.85
2.08
0.80
1.12
1.16
0.61
0.63
0.60
4.30
4.32
3.32
3.33
3.05
2.79
1.62
4.45
1.14
1.04
2.50
0.59
3.08
0.58
2.31
1.03
4.46
1.09
0.79
0.77
0.75
1.15
1.51
0.55
0.56
0.50
0.52
3.99
3.87
4.47
1.88
0.78
4.39
0.74
0.76
2.49
2.53
0.57
0.51
0.53
0.54
4.01
4.03
4.21
4.42
4.43
4.44
1.11
1.91
2.44
0.69
3.61
2.57
2.80
1.41
3.98
4.48
4.22
4.40
4.41
4.26
3.93
0.72
4.49
2.17
1.90
1.89
0.71
1.64
4.20
4.23
4.24
4.38
0.70
0.73
3.07
2.81
4.19
1.94
4.36
2.48
2.30
2.10
1.08
3.54
2.45
2.15
4.34
2.84
1.63
1.63
0.89
3.58
4.34
1.06
1.00
2.47
2.26
2.13
2.46
2.39
1.05
2.82
2.09
3.88
2.16
2.28
3.97
1.02
4.18
0.98
1.07
3.45
3.30
1.50
3.27
3.48
1.40
3.96
3.06
2.27
2.13
0.99
3.49
1.01
2.29
2.25
1.39 0.91
3.95
3.80
2.11
4.17
2.12
3.86
3.91
3.81
3.77
0.94
4.13
3.57
3.94
3.73
3.76
1.38
3.28
3.44
4.15
3.29
4.14
4.16
3.510.93
3.250.92
0.00
0.00
1.38
1.35
1.31
3.26
-0.25
-0.25
1.34
1.37
-0.50
-0.75
-0.50
-0.25
0.00
0.25
0.50
0.75
-0.10
0.00
PC1
0.10
0.20
0.30
0.40
PC1
as amostras de controle () e trs dias (). (B) Grfico de influncias (loadings)
de PC1 versus PC2 explicando a classificao das amostras apresentada no
grfico de escores.
50
PC3
PC3
B
1.35
0.50
0.50
1.33
0.25
0.25
3.50 3.24
3.483.25
3.28
3.90
4.15
4.13
3.26
4.14
3.93
3.84
3.73
3.56
3.43
3.76
3.41
0.88
3.80
1.26
4.13
3.88
0.87
3.75
3.05
1.01
0.99
1.25
1.93
1.06
3.95
0.97
1.50
2.13
1.50
3.39
1.38
4.16
2.15
1.48
3.53
3.96
4.17
3.78
2.14
0.98
2.45
0.89
1.00
1.89
3.46
0.86
1.03
1.90
1.04
1.51
2.11
3.97
1.91
2.38
1.88
1.09
1.05
2.12
2.46
3.99
1.08
1.73
2.47
3.71
3.44
1.11
1.12
2.13
1.14
1.52
1.17
3.30
2.73
1.13
1.07
1.15
1.53
3.70
3.62
3.94
4.18
2.16
0.95
2.48
3.79
3.59
2.56
1.22
3.98
1.95
1.76
1.16
0.69
2.52
3.03
4.19
1.72
0.77
1.71
0.70
3.07
2.44
0.68
2.69
0.80
4.20
4.23
0.78
0.79
4.24
1.75
1.96
4.36
0.96
2.49
0.72
1.20
1.18
1.54
0.51
2.81
4.01
4.03
4.05
0.81
4.21
4.22
1.86
4.26
1.77
2.17
1.97
0.75
0.76
3.74
1.47
0.71
0.66
0.67
2.37
2.42
0.57
0.58
3.61
1.19
0.53
0.50
1.43
1.27
2.43
0.73
0.65
0.61
0.59
3.86
0.55
2.35
0.54
0.52
3.68
3.31
0.82
1.02
4.49
4.40
1.85
4.38
1.70
2.18
1.98
0.74
1.69
1.67
4.34
3.02
2.50
0.64
2.54
0.63
3.08
3.10
3.11
2.59
2.53
0.60
0.56
1.55
2.72
2.82
1.42
2.10
4.48
1.84
4.41
4.42
4.43
4.45
1.79
4.39
3.81
1.94
1.68
2.51
3.01
3.06
2.60
2.36
4.34
3.13
2.57
2.33
2.65
2.31
1.44
3.66
3.32
1.25
4.46
4.47
4.44
1.78
2.19
1.66
2.93
2.66
2.61
2.62
1.65
3.38
2.39
3.36
2.30
1.80
1.81
1.82
2.20
2.95
2.97
3.12
2.63
3.64
2.92
2.64
2.34
3.29
3.14
2.80
1.83
3.77
3.58
2.94
1.99
2.21
2.38
3.65
3.37
2.90
2.70
2.68
3.35
2.84
1.64
1.41
4.07
3.52
2.96
1.46
2.91
1.45
3.33
2.74
2.79
4.28
2.98
4.28
2.55
2.89
2.71
1.21
4.32
1.56
1.24
2.78
1.40
0.83
3.72
3.63
2.99
3.00
3.55
3.04
2.88
2.00
2.87
2.85
2.86
4.11
3.15
2.67
3.57
3.16
2.77
1.92
3.19
0.94
3.87
2.40
2.41
1.63
2.29
3.92
2.22
3.67
3.17
3.18
4.30
3.38
2.75
2.26
2.25
2.01
2.28
1.57
1.63
0
.93
4.11
2.76
2.02
1.39
1.38
4.09
3.69
3.42
0.85
3.27
1.58
3.54
1.62
2.03
3.82
2.09
3.45
1.59
1.60
3.20
2.08
0.84
3.88
4.09
2.07
3.21
2.27
0.91
3.83
3.91
3.89
2.05
3.402.04
0.90
0.92
3.51
2.24 3.47
3.23
3.22
2.23
3.49
1.28
0.00
-0.25
0.00
1.30
1.37
1.29
1.31
-0.25
1.34
-0.50
1.32
-0.75 -0.50
-0.25
0.00
0.25
0.50
0.75
-0.10
0.00
PC1
0.10
0.20
0.30
0.40
PC1
grfico de escores.
Considerando o resultado do teste de sobrevida dos camundongos Swiss
inoculados com TE foi de 18,32,89 dias, sete dias aps a inoculao j
corresponde a um estgio consideravelmente avanado do tumor, quando os
camundongos esto bastante inchados e possvel visualmente detectar a
doena. Por isso fez-se um novo experimento com inoculao por cinco dias a fim
de tentar diminuir o perodo do diagnstico.
A anlise inclui as amostras de controle e cinco dias aps a inoculao de
TE, com uma amostra sendo considerada como outlier por ter ficado fora dos
limites de confiana no influence plot e apresentou alargamento dos sinais. O
51
grfico de escores de PC1 versus PC2 (Figura 23A), no qual PC1 explicou 53,9%
da varincia e PC2 24,4%, totalizando 78,3% da varincia total, apresentou
separao parcial entre os dois grupos. O grfico de escores de PC1 versus PC3,
com PC3 explicando 8,68% da varincia total, totalizando 62,6%, embora explique
menor quantidade da varincia teve melhor separao entre os grupos (Figura
24A). Em ambos percebe-se nos grficos de loadings correspondentes, Figuras
23B e 24B, respectivamente, que as amostras de cinco dias possuem os sinais
em 1,29-1,33 em maior intensidade que as amostras de controle, referindo-se a
lipdeos e VLDL, bem como o sinal referente ao lactato em 1,33-1,35. Devido a
sobreposio entre os dois grupos, o diagnstico no perodo de cinco dias aps a
inoculao ainda incerto, pois se este modelo fosse usado para classificar
novas amostras, estas poderiam ser classificadas na regio de sobreposio dos
grupos e assim no seria possvel um diagnstico preciso, podendo at mesmo
resultar em falsos negativos ou positivos.
PC2
PC2
B
1.35
0.50
0.50
1.33
0.25
0.25
0.00
3.50
3.48
3.90
3.28
1.37
4.15
3.25
3.26
0.920.93
4.14
3.93
3.76
4.13
3.43
3.84
3.80
0.91
3.88
3.75
3.41
0.99
1.01
2.11
1.93
3.44
1.50
4.16
1.38
2.28
2.10
1.38
2.15
3.05
3.86
0.97
3.73
3.95
2.09
2.29
4.13
1.06
2.27
3.68
0.94
2.08
1.39
2.38
2.39
0.98
3.94
2.07
1.48
3.66
2.12
2.16
2.42
2.46
3.96
3.97
1.40
1.04
0.96
1.07
3.78
4.17
2.30
2.47
2.17
3.98
3.79
2.26
1.63
4.34
2.48
1.09
1.11
1.73
1.94
0.95
2.13
1.90
1.91
3.99
1.02
2.78
3.24
2.35
2.45
1.77
1.08
3.29
1.63
2.31
4.36
1.95
1.75
1.62
1.41
2.73
2.37
2.33
2.34
1.64
2.44
2.18
2.49
3.06
1.75
4.18
1.76
1.05
3.77
2.79
3.51
4.32
2.14
4.39
4.38
2.50
1.13
1.12
1.80
1.51
4.19
4.01
4.03
1.78
2.81
2.82
1.13
2.69
2.52
2.20
2.36
4.40
4.41
2.53
1.96
1.82
4.21
1.79
1.71
3.81
2.80
2.56
4.45
4.46
4.42
3.07
3.08
2.40
2.19
1.03
2.13
4.24
1.97
1.83
2.57
4.22
1.69
0.80
1.00
2.43
2.41
4.48
0.68
4.49
4.47
3.03
1.89
0.70
4.23
1.84
0.75
1.81
0.81
0.76
0.78
0.79
4.20
2.84
1.42
2.65
2.63
3.16
3.10
3.11
2.54
1.52
4.43
4.44
1.65
0.71
0.72
3.01
0.69
1.85
0.77
4.30
2.21
0.50
2.59
3.13
2.51
1.98
1.44
1.66
1.67
0.73
0.82
4.05
1.72
3.71
2.86
3.31
2.70
4.07
3.30
2.60
2.61
1.53
0.51
0.52
0.67
0.64
0.61
0.53
0.54
1.88
1.45
0.63
1.68
1.60
2.85
2.87
1.43
2.62
3.14
0.55
0.57
0.65
1.70
2.04
3.33
3.13
1.54
0.66
4.26
0.59
0.60
3.02
1.46
1.86
0.74
2.99
1.92
2.05
3.70
4.32
4.30
3.18
2.64
3.32
3.12
2.66
0.56
0.58
3.00
2.93
2.98
3.87
0.00
2.88
2.55
2.38
3.15
3.17
2.95
2.94
0.87
2.72
2.68
3.19
2.67
2.96
2.22
1.99
4.07
2.92
2.97
1.26
2.74
2.71
1.55
2.90
4.09
3.65
2.89
1.50
2.91
0.83
3.42
2.77
3.35
3.36
4.28
4.28
0.89
3.27
4.11
3.46
1.59
3.74
1.56
3.91
3.67
2.00
3.72
3.39
1.58
3.37
3.92
1.57
2.03
3.38
0.88
2.76
0.86
3.20
4.11
1.47
3.04
2.01
2.25
3.69
3.88
2.02
2.75
3.38
3.45
3.21
0.84
3.82
0.85
4.09
3.89
3.47
3.83
0.901.27
2.23
3.40
2.24
3.23 3.22
3.49
1.30
1.31
-0.25
1.281.34
-0.25
1.29
-0.50
1.32
-0.75
-0.50
-0.25
0.00
0.25
0.50
0.75
-0.40
PC1
-0.30
-0.20
-0.10
0.00
0.10
PC1
52
as amostras de controle () e cinco dias (). (B) Grfico de influncias (loadings)
grfico de escores.
PC3
PC3
B
1.33
0.30
0.25
0.20
1.29
4.13
3.23
4.11
1.28
3.89
3.72
3.47
0.86
3.74
0.85
0.87
3.92
1.27
0.88
3.27
3.84
1.26
3.70
3.24
3.38
0.84
3.22
3.83
3.67
3.78
3.75
3.40
3.82
3.21
2.24
3.46
2.02
2.01
2.38
3.50
2.00
3.43
3.25
0.95
2.75
0.83
2.77
2.76
4.09
0.89
2.23
3.68
0.97
1.06
2.14
1.04
1.50
2.72
3.41
1.99
1.47
0.82
3.65
2.68
3.20
2.41
1.13
0.90 2.031.57
1.03
0.81
3.66
1.92
0.96
1.98
1.09
0.80
1.55
0.67
0.68
1.12
0.74
2.22
2.71
1.48
0.66
0.65
0.69
0.78
0.79
3.37
2.90
2.56
3.04
1.89
1.88
0.75
0.77
1.56
2.74
2.91
0.72
1.01
0.76
1.54
1.53
3.69
0.63
0.60
2.13
0.70
1.97
0.73
3.13
0.64
0.71
2.89
1.52
0.61
0.56
0.58
1.84
1.86
1.69
3.19
0.57
0.59
1.96
1.90
2.73
2.67
2.21
2.45
0.55
1.83
1.85
0.99
1.81
1.11
2.43
0.51
1.44
0.54
3.03
2.92
1.67
1.82
1.79
1.71
3.87
1.43
2.52
0.52
0.53
1.45
1.72
2.88
3.18
2.65
0.50
2.20
3.01
2.93
1.91
1.68
1.58
3.38
2.70
3.17
3.00
1.66
2.98
1.80
2.97
1.75
1.08
2.80
3.36
4.07
3.15
2.13
3.39
4.07
1.73
1.76
2.81
4.28
1.13
2.63
2.61
2.69
2.19
3.79
1.78
1.70
2.85
3.35
2.37
2.33
3.16
1.46
2.96
4.28
2.60
2.62
3.14
2.66
2.44
2.40
2.18
3.88
1.95
2.05
2.79
2.86
2.87
2.55
2.34
2.64
2.59
3.02
2.99
2.04
1.42
3.33
3.12
2.54
1.65
4.05
2.95
1.77
2.82
2.35
2.94
3.71
2.84
3.11
4.26
2.15
3.51
3.13
3.10
2.51
3.07
4.03
3.99
1.94
4.32
3.31
2.38
3.32
2.36
3.08
3.96
2.17
3.98
4.01
2.78
2.10
2.50
3.05
1.93
2.31
2.12
2.48
2.46
4.22
3.97
1.75
4.09
4.23
4.24
1.51
0.00
2.53
4.21
1.59
1.64
4.19
4.20
1.50
1.41
3.30
4.45
4.47
4.44
2.16
4.30
2.57
2.49
2.47
4.11
4.46
4.42
4.39
3.49
4.48
4.49
4.43
4.40
4.41
4.38
1.00
2.30
4.36
1.02
1.05
4.32
4.34
4.18
2.08
4.30
4.17
1.07
3.06
1.63
0.94
4.15
3.95
0.98
3.94
3.42
2.42
2.07
3.81
1.60
4.34
3.45
2.26
3.88
1.63
2.11
1.62
1.40
2.39
3.91
2.09
2.25
2.29
1.39
2.28
3.77
3.93
3.80
3.29
4.16
3.90
2.27
1.38
0.93 3.76
3.86
0.91 1.38
3.44
3.73
0.92
1.35
3.48
3.28
4.14
4.13
0.10
0.00
1.32
3.26
-0.10
1.30
-0.25
-0.20
1.37
1.31
-0.30
-0.75
-0.50
-0.25
0.00
0.25
0.50
1.34
0.75
-0.40
-0.30
PC1
-0.20
-0.10
0.00 -0.500.10
PC1
grfico de escores.
53
4.5.2.1.2 TE em camundongos Balb-C

O mesmo tipo de tumor, TE, inoculado em camundongos Swiss, uma
linhagem heterognea, ou seja, sem homogeneidade gentica, foi tambm
inoculado em camundongos Balb-C, uma linhagem 99% isognica, ou
geneticamente igual, a qual constitui no modelo ideal para estudos biolgicos.
A anlise quimiomtrica foi realizada com as amostras de controle, de trs
dias de inoculao, de sete dias e de dez dias. Duas amostras de dez dias foram
consideradas como outliers, tendo ficado classificadas fora dos limites de
confiana no influence plot tanto referente ao espao do modelo como ao centro
do modelo. Por inspeo dos espectros, notou-se que uma delas apresentava
sinais no presentes em nenhuma outra amostra, por provvel contaminao e a
outra apresentava sinais muito alargados. O grfico de escores de PC1 versus
PC2 (Figura 25A), com PC1 explicando 90,9% da varincia e PC2 3,83%,
totalizando 94,7%, apresentou separao das amostras em PC1, com as
amostras de controle e trs dias de inoculao direita e as amostras de sete e
dez dias de inoculao esquerda similar separao observada para a
inoculao de TE em camundongos Swiss (Figura 18A). O grfico de loadings
(Figura 26B) tambm apresentou os sinais em 1,28-1,32, referente
principalmente a VLDL, e em 1,33-1,35 referente ao lactato, em maior
intensidade nas amostras de sete e dez dias. Isso mostra que a tcnica
independente do DNA, ou seja, que fatores genticos no influenciam nas
discriminaes.
54
PC2
PC2
B
0.30
1.28
0.25
0.20
1.32
1.29
1.27
0.10
1.34
1.31
0.00
-0.10
3.49
2.233.22
3.83
3.40
3.88
3.20
3.45
3.51
4.13
4.11
3.82
3.46
3.21
3.42
1.92
3.23
0.84
3.69
0.85
3.38
3.71
1.18
3.54
2.01
2.75
3.91
2.76
3.63
3.77
1.25
2.00
2.74
3.89
3.38
3.74
1.99
4.28
3.39
2.67
2.02
1.25
2.22
2.71
1.24
1.17
3.64
2.38
3.67
3.19
3.58
1.57
2.90
1.56
4.09
3.66
3.14
3.15
4.07
3.87
1.21
3.18
2.89
3.63
2.55
2.91
1.26
4.26
2.70
2.99
1.58
3.16
3.13
2.66
0.83
3.37
3.32
3.12
3.04
3.73
2.92
1.98
2.25
2.85
4.28
4.09
2.95
2.96
2.97
2.98
1.19
3.47
3.35
3.30
3.17
3.65
2.63
3.55
4.05
1.55
2.88
3.31
3.11
2.60
2.61
2.62
2.65
2.51
2.93
4.30
2.59
2.94
1.20
2.84
3.33
2.64
3.81
3.08
2.40
1.44
3.00
3.01
2.21
3.03
0.58
1.16
1.97
2.86
3.10
2.72
0.51
0.54
0.55
0.56
2.54
0.57
0.59
4.47
4.44
2.13
2.24
3.36
1.54
2.73
0.50
2.68
2.69
2.36
0.52
0.53
0.60
4.43
4.46
4.41
4.26
0.74
1.91
1.96
0.86
4.07
2.31
2.57
2.53
2.56
0.61
0.63
4.45
0.64
4.42
1.46
2.50
4.49
4.39
0.65
4.48
4.40
1.95
3.92
2.03
2.87
2.33
2.34
2.37
1.45
1.43
3.07
2.39
2.52
0.66
4.05
0.892.04
2.80
3.62
3.06
4.38
2.49
2.48
2.19
2.18
1.67
4.24
1.75
1.94
0.87
1.42
2.20
1.66
0.67
1.77
1.78
4.01
0.82
4.32
1.53
0.71
2.41
1.48
0.73
2.17
4.20
1.81
1.82
1.83
1.69
0.75
1.79
1.71
4.36
3.02
1.52
0.70
0.68
0.69
1.68
4.21
4.22
4.23
0.76
3.98
1.22
0.79
2.82
3.61
2.35
1.65
3.78
1.80
1.76
0.80
1.59
3.29
2.47
1.84
1.85
1.70
4.03
1.72
1.73
0.77
0.78
0.81
4.30
4.18
4.19
1.86
1.90
2.77
3.52
0.72
2.43
1.89
2.79
2.14
3.99
2.81
2.30
4.34
2.42
2.46
1.51
2.16
1.14
1.64
3.68
2.45
1.88
1.15
1.12
4.32
3.57
1.50
1.13
3.97
2.78
2.44
2.15
1.11
3.70
1.02
1.08
0.00
3.27
2.29
1.63
4.17
1.03
1.09
2.38
0.88
0.96
1.07
0.95
1.41
3.96
2.13
3.53
1.60
3.59
0.94
3.79
3.86
1.05
1.01
1.93
3.26
3.05
1.06
1.04
1.40
1.62
1.63
3.41
0.90 2.05
1.47
4.16
2.27
2.12
3.95
0.99
3.94
1.00
1.50
2.07
2.09
3.44
0.97
0.98
2.28
2.26
1.39
2.08
2.11
3.75
3.72
3.88
3.80
3.56
3.24
1.38
4.11
2.10
3.76
1.38 0.93
4.14
3.93
3.28
4.15
3.84
4.13
3.43
3.48
3.90
1.370.92
0.91
3.25
3.50
-0.25
1.30
-0.20
1.35
-0.50
1.33
-0.30
-1.00
-0.50
0.00
0.50
1.00
-0.50
-0.40
-0.30
PC1
-0.20
-0.10
0.00
PC1
Numa tentativa de discriminar as amostras de controle e trs dias, fez uma
nova anlise por PCA considerando apenas estas amostras. O resultado
apresentado no grfico de escores de PC1 versus PC2 na Figura 26A, com PC1
explicando 48,4% da varincia e PC2 25,0%, totalizando apenas 69,4% da
varincia total. No se observa nenhuma discriminao entre os dois grupos, no
havendo nem sequer a possibilidade de um diagnstico suspeito neste perodo.
55
PC2
PC2
B
1.35
0.25
1.33
0.25
3.50
3.25
3.48
3.90
3.28
3.24
3.93
4.15
3.26
4.14
3.43
3.80
3.84
3.76
3.56
3.88
0.93
3.95
2.11
1.37
4.16
3.44
3.94
0.98
3.96
3.86
2.10
3.05
0.880.92
3.75
1.93
3.59
0.87
1.00
2.12
0.97
3.97
0.99
4.17
1.50
1.06
3.73
1.01
1.04
2.13
3.99
1.47
0.94
3.41
1.05
3.61
4.13
4.01
3.29
1.09
1.07
4.18
4.38
1.08
3.98
4.19
4.34
4.03
3.81
4.22
0.96
1.11
0.69
3.57
4.36
0.78
4.20
4.34
0.91
0.77
0.68
0.70
4.21
3.53
1.12
1.13
0.71
0.95
1.26
4.23
4.38
4.39
4.48
4.49
0.79
0.73
4.01
0.67
4.05
0.72
4.24
3.62
4.40
3.79
0.80
0.81
0.76
1.02
2.15
4.45
2.44
3.68
4.32
0.89
1.15
0.75
0.65
0.66
0.64
0.60
1.50
3.02
4.41
4.42
4.43
2.45
1.38
0.61
0.57
1.88
0.55
4.46
2.46
0.82
1.14
1.73
0.63
0.58
1.89
0.59
4.26
3.06
4.44
2.28
0.74
1.03
0.56
1.51
0.53
4.47
1.22
3.71
1.76
1.90
1.72
0.51
0.52
0.50
2.16
2.42
1.39
1.77
1.70
0.54
3.03
1.40
1.86
2.57
2.14
2.47
1.64
1.41
1.75
1.79
2.73
1.63
2.29
2.68
4.05
1.80
3.36
3.07
2.43
1.94
1.71
1.85
1.52
4.26
2.69
2.82
2.81
1.20
1.16
1.78
3.63
1.81
2.56
1.82
1.84
2.52
2.53
4.30
1.63
3.01
1.65
3.78
3.35
2.72
1.68
1.53
1.48
1.66
3.08
2.17
3.10
2.49
1.42
3.33
2.30
1.91
3.00
1.83
1.69
3.70
2.35
2.79
1.96
2.13
1.67
1.45
4.07
3.32
2.09
1.95
2.94
3.37
1.54
2.54
2.50
2.39
2.07
2.18
2.48
4.30
3.91
2.93
3.11
2.20
1.43
2.33
2.38
4.32
2.78
0.86
0.83
1.97
2.97
2.98
2.96
2.59
2.19
3.30
2.08
2.95
3.12
2.65
2.37
3.58
2.99
4.07
3.17
2.64
2.36
2.31
2.41
2.80
1.38
3.66
2.60
1.55
2.34
4.09
2.84
2.92
1.46
1.44
3.13
2.61
2.62
2.63
2.51
1.62
1.98
3.16
2.70
2.66
2.21
2.87
3.27
2.40
3.04
3.31
3.77
2.55
4.28
2.88
2.27
1.18
3.18
4.28
2.24
2.91
3.14
1.25
3.87
3.52
2.86
3.55
2.74
3.39
2.89
2.88
1.56
1.60
2.26
2.85
1.24
3.51
3.63
2.71
3.15
2.22
3.38
1.99
2.90
3.19
2.38
2.05
2.67
3.64
2.77
3.46
3.72
2.04
4.13
3.88
4.11
1.57
1.25
3.65
3.69
1.59
3.54
4.09
2.00
1.58
3.74
3.42
4.11
3.38
1.21
3.92
2.75
2.03
0.84
3.67
1.17
2.76
3.82
2.01
1.92
2.25
2.02
0.85
1.27
3.45
1.19
3.20
0.90
3.21
3.23
3.89
3.83
3.47
2.23
3.40
3.22
0.00
0.00
1.30
1.31
3.49
-0.25
1.28
1.34
-0.25
1.29
1.32
-0.50
-0.25
0.00
0.25
0.50
-0.10
0.00
0.10
PC1
0.20
0.30
0.40
-0.50
0.50
PC1
grfico de escores.
Da mesma forma que ocorreu com o grupo inoculado com TE em
camundongos Swiss (Seo 5.5.2.1), fez-se um novo experimento com
inoculao por cinco dias. No houve discriminao dos dois grupos, como se
mostra na Figura 27 pelo grfico de escores de PC1 versus PC2, com PC1
explicando 77,8% da varincia e PC2 11,8%, somando 89,6% da varincia total.
Desta forma, utilizando a anlise de PCA s possvel diagnosticar a presena do
tumor aps sete dias de inoculao o que corresponde a um tero do tempo de
sobrevida mdio, o qual foi de 21,02,65 dias. Assim o tempo para o diagnstico
comparando as duas linhagens de camundongos foi menor para a linhagem Balb-
56
C, pois para a linhagem Swiss um diagnstico suspeito seria possvel com cinco
dias de inoculao, correspondendo a quase um tero do tempo de vida desta
linhagem inoculada com TE, mas apenas com sete dias de inoculao se teria um
diagnstico mais preciso.
PC2
PC2
0.30
B
1.34
0.20
1.35
1.31
0.251.30
1.37
4.13
3.26
0.10
4.14
3.28
3.73
0.92
3.44
3.48
1.38 0.91
1.38
0.93
3.90
4.16
4.15
2.27
3.86
3.93
2.39
3.80
2.28
1.39
3.76
3.77
3.29
1.40
2.29
2.09
4.11
1.63
2.11
4.17
4.34
1.62
2.26
4.32
4.18
2.42
2.15
4.49
2.47
4.36
4.47
3.06
4.34
4.40
4.48
1.63
4.19
4.46
4.38
3.45
3.88
4.42
4.43
4.44
4.45
2.49
1.60
2.07
3.95
4.20
4.41
4.30
4.39
3.71
4.22
1.41
4.30
4.21
4.24
3.30
3.97
1.50
4.23
2.57
4.01
0.98
2.17
2.48
2.53
4.26
2.46
2.08
1.05
4.03
4.05
3.05
2.51
2.12
3.10
3.32
1.64
3.38
2.30
3.99
3.81
2.50
3.08
3.07
3.13
3.11
3.33
3.96
2.44
2.94
2.54
3.42
3.31
1.75
4.09
1.07
2.13
2.40
3.49
3.12
2.31
1.00
2.95
2.96
2.38
2.59
2.55
2.36
2.64
2.66
2.60
1.42
4.32
2.10
2.16
3.02
2.69
2.52
2.61
2.63
3.15
3.35
3.36
3.51
2.87
3.94
3.98
1.77
1.93
2.62
3.14
3.91
1.94
1.90
2.97
3.03
1.65
2.82
1.73
2.45
2.18
2.98
2.99
2.92
2.93
3.16
3.17
3.37
1.76
1.72
1.70
1.51
2.13
2.43
2.19
3.04
2.35
2.88
2.84
1.71
1.92
1.46
1.44
3.13
2.65
2.37
2.34
4.28
4.07
2.78
1.02
1.75
1.45
3.01
2.20
4.07
1.43
2.67
1.91
1.78
1.80
1.68
1.66
1.67
3.00
0.94
3.18
2.86
1.59
1.79
1.88
1.69
2.41
0.50
0.51
2.56
0.52
2.33
2.89
1.85
2.90
2.91
4.28
1.86
1.48
0.56
0.54
3.19
1.13
1.89
1.82
1.83
2.21
0.55
0.53
1.95
1.81
2.70
2.85
3.87
1.84
0.57
3.69
0.58
3.39
2.79
1.52
0.60
0.59
1.96
1.47
0.73
1.53
0.61
2.73
2.81
1.08
3.88
0.71
1.54
0.74
0.70
0.72
0.64
0.63
1.01
0.69
2.14
0.75
0.65
2.22
3.66
0.76
1.97
0.96
0.78
2.71
1.55
2.80
1.58
0.77
1.50
0.66
1.11
0.99
0.68
2.68
3.25
3.20
2.04
1.09
0.79
0.67
1.03
1.04
3.79
2.74
1.56
0.80
1.06
1.57
1.12
0.81
1.98
3.65
2.25
3.68
0.82
3.46
1.13
2.05
2.72
3.40
0.97
0.95
4.09
1.99
2.38
3.83
3.38
3.82
0.83
2.77
0.89
2.76
3.41
2.23
3.24
2.75
3.21
3.50
2.03
3.70
3.75
3.67
3.78
2.00
2.01
3.22
3.43
0.90
2.02
3.84
3.27
0.84
3.92
3.74
3.47
3.72
3.89
0.88
1.26
0.87
1.27
0.85
0.86
4.13
4.11
0.00
-0.10
2.24
3.23
1.32
0.00
1.33
1.28
-0.25
-0.20
1.29
-0.75 -0.50 -0.25
0.00
0.25
0.50
-0.30
0.75
0.00
0.10
PC1
0.20
0.30
0.40
0.50
PC1
grfico de escores.
57
4.5.2.1.3 S180 em camundongos Swiss

Um segundo tipo de tumor testado foi o Sarcoma 180, o qual tambm foi
inoculado intraperitonealmente nos camundongos e retirado o sangue aps
determinados perodos.
A anlise quimiomtrica inicial incluiu as amostras de controle, grupo com
trs dias, sete dias e de dez dias de inoculao, sem outliers. O grfico de
escores de PC1 versus PC2 (Figura 28A), onde PC1 explica 79,1% da varincia
total e PC2 9,2%, somando 88,3% da varincia explicada, apresentou certa
sobreposio entre os grupos, ficando difcil defini-los. possvel perceber que as
amostras de trs dias ficaram mais agrupadas a direita junto com as amostras de
controle e as amostras de dez dias ficaram mais a esquerda, porm as amostras
de sete dias ficaram muito dispersas, se sobrepondo as amostras de controle e
dez dias. Portanto, fizeram-se anlises separadas incluindo apenas um grupo
inoculado por vez com o grupo de controle, inclusive do novo conjunto de
amostras com cinco dias de inoculao e seu grupo de controle, como aconteceu
com os experimentos com TE.
58
PC2
PC2
0.30
B
1.35
1.33
0.20
1.30
0.25
1.31
0.10
1.37
1.34
0.92
3.25
0.93
3.26
3.50
3.48
3.28
1.38
4.14
1.38
4.15
3.90
2.28
3.76
1.39
3.43
3.56
3.44
2.27
3.80
2.26
2.10
2.11
3.24
2.09
1.63
4.13
2.29
4.16
1.62
1.40
3.93
3.84
0.98
2.08
0.94
1.01
3.29
3.88
0.99
3.73
1.63
3.86
1.06
3.05
2.12
1.00
3.53
3.75
4.32
4.34
1.05
3.95
3.57
1.04
3.94
1.60
2.13
0.97
1.41
4.13
1.07
2.79
1.64
4.17
1.93
1.50
2.78
2.45
2.07
2.30
0.69
2.15
0.73
2.46
3.96
1.09
1.11
0.72
3.06
4.36
0.75
0.70
0.68
0.77
0.78
0.79
1.17
1.15
1.50
1.08
3.41
0.50
0.51
0.52
0.53
0.54
2.47
0.76
1.16
0.80
2.16
1.18
1.14
1.13
4.11
4.30
0.55
0.56
0.57
0.58
0.59
0.63
0.67
4.18
0.81
1.89
0.60
0.61
0.71
0.64
0.65
4.40
0.66
0.74
2.14
3.97
1.90
3.51
2.82
3.07
2.38
4.46
4.48
4.49
2.42
4.38
2.48
4.19
1.48
0.82
1.12
3.30
4.47
4.39
4.41
4.42
4.43
1.65
2.43
2.44
4.22
4.20
2.39
4.23
3.81
3.99
1.91
1.03
1.02
4.45
2.49
4.24
4.21
1.73
2.80
2.81
4.32
3.59
2.31
1.42
3.61
3.62
1.94
1.51
3.32
3.31
3.08
2.57
2.53
4.44
3.03
2.50
4.03
2.17
1.88
3.10
2.65
2.69
2.59
2.54
2.35
4.26
3.98
2.13
2.88
2.62
2.63
2.64
2.33
3.79
2.37
4.05
4.01
1.76
1.19
0.96
4.30
2.87
3.36
3.35
3.33
2.61
2.60
3.02
2.51
2.36
1.86
1.72
1.20
3.37
3.11
2.34
2.93
2.73
1.43
1.66
2.18
1.95
1.75
1.77
1.71
1.52
3.39
3.14
3.13
3.12
2.94
2.95
1.67
3.71
1.85
1.80
1.69
0.00
2.84
3.17
2.92
1.68
1.96
1.79
1.70
1.53
0.95
2.66
2.96
2.40
1.84
1.81
1.78
3.16
2.89
2.90
3.63
2.91
3.58
2.97
2.19
1.82
2.86
3.18
3.38
2.70
2.55
3.68
4.26
2.98
1.47
1.83
0.83
3.19
3.15
3.66
2.41
2.20
4.05
1.97
1.22
2.04
2.52
3.01
3.77
3.27
3.00
1.45
1.54
1.44
2.05
2.85
2.72
2.99
4.07
2.68
3.78
1.46
1.59
3.64
3.65
1.21
2.77
4.28
4.09
1.98
2.21
2.38
3.72
3.63
3.91
3.70
3.38
3.67
2.56
2.71
3.46
4.28
2.74
1.55
4.07
3.54
1.92
4.09
3.87
3.52
3.74
3.42
1.24
4.11
2.67
2.25
3.55
1.99
2.03
3.20
3.45
3.69
1.56
3.88
1.58
0.86
2.22
3.21
3.92
0.84
0.87
1.25
1.57
1.26
0.89
3.82
3.04
2.00
2.76
2.75
2.02
0.85
2.01
3.47
3.40
0.90
0.88
3.89
3.83
2.24
3.22
3.49
3.23
2.23
1.27
0.91
0.00
1.32
-0.10
-0.25
-0.20
1.28
1.29
-1.00
-0.50
0.00
0.50
-0.30
1.00
-0.50
-0.40
-0.30
-0.20
-0.10
0.00
PC1
PC1
O primeiro conjunto incluiu as amostras de controle e trs dias. Pelo grfico
de escores de PC1 versus PC2 (Figura 29A), sendo que PC1 contm 50,5% da
varincia explicada e PC2 18,2%, somando 68,7%, observa-se sobreposio
entre os dois grupos, sendo que as amostras de controle ficaram mais a direita e
as de trs dias mais a esquerda. Pelo grfico de loadings (Figura 29B) nota-se
mais a direita os sinais de 1.29-1.35 referentes a lipdeos, VLDL e lactato, mais
intensos nas amostras de controle, diferentemente do que ocorreu nas demais
anlises entre grupos de controle e sadios.
59
PC2
PC2
1.33
0.50
1.29
0.25
0.25
1.35
1.28
3.23
3.24
2.24
1.25
0.86
1.26
1.27
4.13
3.50
0.85
0.87
1.25
3.84
3.41
3.89
0.88
4.11
3.72
1.24
2.02
3.46
2.01
3.75
3.83
3.43
3.47
3.92
3.70
1.22
0.84
3.21
3.22
2.03
3.90
2.00
3.55
2.76
3.52
2.23
2.77
3.78
3.48
3.56
3.74
2.75
3.40
1.21
3.88
1.99
1.20
3.39
2.72
3.67
3.68
3.93
3.64
1.50
2.38
1.57
1.58
1.47
3.38
2.73
2.04
1.19
3.65
4.11
1.56
3.82
3.79
1.98
3.20
1.93
3.63
0.83
2.22
3.66
3.05
0.89
1.46
0.97
3.59
2.71
4.09
1.55
1.97
3.53
3.69
2.68
1.59
2.74
1.53
1.48
1.84
0.95
3.71
1.54
4.28
0.96
1.96
1.52
1.17
4.07
1.45
2.56
2.69
1.83
1.82
2.41
1.18
1.92
3.00
3.01
2.14
1.44
2.91
1.81
1.85
1.04
2.90
1.43
1.72
1.70
1.71
1.69
1.95
1.13
0.82
3.02
2.92
3.19
1.79
1.80
1.03
1.86
1.68
2.99
2.20
2.21
1.51
1.06
3.62
2.67
2.260.90
2.05
1.76
1.73
1.12
3.04
1.14
4.28
2.98
1.16
2.37
0.67
0.68
2.70
2.52
2.89
3.15
2.78
3.42
4.07
1.78
1.09
1.67
2.97
3.63
0.66
3.16
2.65
3.38
2.19
1.91
0.81
2.38
1.15
2.93
3.03
0.65
2.66
2.63
2.64
3.14
2.96
2.35
2.55
2.62
2.42
2.33
2.61
3.17
3.18
4.32
1.77
2.18
1.66
0.80
2.94
2.40
2.95
0.69
2.60
0.64
3.13
0.63
3.36
1.88
1.89
1.11
0.77
0.61
0.60
1.75
1.90
0.79
2.51
3.10
2.34
2.88
0.58
0.59
3.31
1.42
4.30
2.43
0.78
0.76
2.36
0.75
2.54
3.12
2.59
0.56
0.57
0.50
0.51
0.52
0.53
3.35
1.60
3.99
4.09
3.11
0.72
3.37
0.55
3.28
4.13
2.17
2.44
1.65
3.61
1.50
0.74
0.70
0.71
3.32
0.54
2.79
3.98
4.03
4.05
1.08
2.15
2.49
2.50
3.08
2.86
2.80
3.87
2.45
3.07
2.31
3.33
2.81
4.26
4.21
4.22
1.01
3.73
4.24
2.48
0.73
2.53
2.87
2.85
4.23
4.20
4.39
4.45
2.57
4.32
4.01
1.00
2.13
4.19
0.99
4.43
4.44
4.46
3.58
2.47
2.46
3.80
4.40
4.41
4.42
4.47
4.48
2.16
4.30
1.41
4.38
3.30
0.98
1.94
4.49
4.36
1.64
4.15
2.07
3.97
4.18
2.13
2.84
2.82
1.05
4.34
3.96
2.39
4.34
1.07
2.30
2.10
1.62
1.02
2.08
1.63
3.25
3.54
3.76
4.17
3.95
1.63
2.25
3.45
4.14
3.27
3.06
1.40
2.28
2.09
3.88
2.12
2.11
2.29
3.77
3.81
1.39
2.27
0.94
3.94
3.86
3.57
4.16 1.38 0.91
3.91
3.44
3.29
3.49
0.931.38
0.92
3.51
3.26
0.00
1.30
0.00
1.32
-0.25
-0.25
1.31
-0.75
-0.50
-0.25
0.00
0.25
0.50
1.34
1.37
-0.50
0.75
0.00
0.10
PC1
0.20
0.30
0.40
PC1
grfico de escores.
O segundo conjunto de anlise incluiu as amostras de cinco dias e de
controle, retirando-se a mesma amostra considerada como outlier na anlise de
cinco dias com TE. O grfico de escores de PC1 versus PC2 (Figura 30A), com
PC1 % explicando 54,5% da varincia e PC2 20,4%, totalizando 74,9%,
apresentou resultado muito similar ao obtido com as amostras de trs dias, com
sobreposio bastante significativa entre os grupos, ficando as amostras de cinco
dias mais direita e as de controle mais a esquerda. As amostras de cinco dias
apresentaram, pela anlise do grfico de loadings (Figura 30B), os sinais em
60
1,30-1,35 referente a lipdeos e lactato mais intensos que as amostras de

controle.
PC2
PC2
0.50
B
1.29
0.50
0.25
0.25
1.28
1.32
3.23
1.30
3.89
3.47
1.270.90
3.40
2.24
3.72
3.92
3.83
0.85
3.74
3.22
4.11
0.89
0.86
3.38
2.23
2.02
0.88
2.03
3.46
0.84
3.24
3.27
3.82
3.70
2.76
2.01
3.49
2.77
1.58
0.87
2.75
3.21
4.09
1.26
1.57
1.59
3.39
2.05
3.04
2.00
2.04
3.67
2.25
3.84
2.26
4.28
1.47
3.41
3.75
1.56
3.65
3.20
3.78
4.28
4.07
4.32
0.83
3.38
2.22
4.07
1.55
2.72
4.13
1.60
1.99
2.91
2.90
2.68
2.71
3.37
4.30
1.92
3.87
3.69
4.09
2.89
2.07
3.45
2.92
2.74
2.85
2.97
0.66
3.68
0.58
3.13
2.67
2.88
2.86
4.26
2.56
0.56
1.50
3.19
3.35
3.42
2.96
3.03
2.93
0.65
0.63
0.67
1.54
0.57
0.59
0.60
0.55
3.36
2.38
2.87
0.82
4.05
2.98
0.74
3.00
2.14
0.64
0.61
3.15
2.55
0.95
3.17
3.18
3.33
3.31
4.30
2.81
1.88
1.98
3.01
0.68
4.44
2.21
0.53
2.64
2.65
2.61
2.63
1.43
0.51
2.80
2.79
2.08 0.91
0.81
1.89
2.95
0.73
1.53
1.45
0.72
4.47
4.43
4.49
4.45
1.44
2.41
0.54
2.66
2.60
2.62
0.52
3.32
0.50
4.32
3.66
1.67
0.75
4.23
4.24
2.99
3.02
0.69
4.40
4.41
0.71
4.48
4.46
4.42
4.39
2.69
3.12
3.14
2.70
4.11
1.13
2.84
2.82
2.78
0.80
1.68
0.76
4.22
2.94
2.13
1.86
1.46
4.38
2.52
2.59
2.54
3.16
2.73
3.30
1.71
4.03
1.69
0.77
0.78
0.79
4.20
3.79
1.84
1.66
0.70
2.51
2.37
1.70
1.97
1.85
1.81
1.82
1.83
4.21
1.52
2.20
3.11
2.38
3.13
3.10
2.43
2.34
1.72
1.90
1.79
4.19
1.03
1.13
1.04
3.07
2.36
2.33
1.42
3.51
1.96
2.19
4.36
2.45
3.08
2.35
3.99
4.01
3.98
1.48
1.80
1.12
0.96
2.44
2.40
1.65
4.34
1.62
3.97
1.75
1.91
1.78
2.50
3.43
2.31
3.96
1.76
1.09
1.06
1.73
4.18
2.18
2.53
2.13
0.97
2.57
3.88
3.71
1.95
1.41
1.77
1.11
4.34
3.05
2.48
2.49
1.64
3.50
1.75
1.08
2.17
2.30
2.46
1.63
3.88
4.17
2.47
3.06
1.63
3.95
2.12
2.15
1.94
1.51
2.10
1.93
1.40
2.09
3.81
2.16
1.39
1.05
1.50
1.01
2.28
2.42
1.00
3.94
3.91
0.99
0.98
1.07
1.02
2.39
3.25
3.77
2.29
1.38
2.11
3.93
0.942.27
1.38
3.80
3.73
3.29
3.86
4.16
3.90
3.76
4.15
3.44
0.93
0.92
3.48
4.13
3.28
0.00
0.00
1.33
4.14
3.26
1.31
-0.25
-0.25
1.37
1.34
1.35
-0.75
-0.50
-0.25
0.00
0.25
0.50
-0.50
0.75
0.00
PC1
0.10
0.20
0.30
0.40
PC1
grfico de escores.
Considerando as amostras de sete dias e de controle, o grfico de escores
de PC1 versus PC2 (Figura 31A), sendo que PC1 % explica 72,6% da varincia e
PC2 11,8%, totalizando 84,4%, continuou apresentando sobreposio bastante
significativa entre os grupos, ficando as amostras de controle mais direita e as
de sete dias mais a esquerda. As amostras de cinco dias apresentaram, pela
61
anlise do grfico de loadings (Figura 31B), os sinais em 1,28-1,32 referente a

lipdeos e VLDL e em 1,33-1,35 referente ao lactato.
PC2
PC2
0.50
1.29
0.25
1.28
0.25
2.23
2.24
3.23
1.32
1.27
3.89
3.47
0.85
3.22
3.83
3.49
1.25
0.86
3.72
3.40
1.25
3.92
0.88
2.02
2.01
3.52
1.26
3.21
0.87
0.84
3.74
2.00
3.82
2.76
2.75
1.24
3.55
2.03
3.27
3.70
2.22
1.57
3.46
3.45
1.58
3.20
4.11
3.38
1.56
4.09
3.78
3.87
1.99
3.69
3.42
1.46
2.77
3.67
2.25
1.22
4.11
3.63
4.07
1.92
4.28
3.04
1.21
4.28
3.64
1.55
3.88
0.89
3.65
1.98
1.59
2.72
3.41
4.07
2.74
2.71
0.83
4.09
3.19
2.68
1.45
3.00
2.21
3.54
2.41
1.83
3.79
3.68
2.99
2.40
1.54
1.97
1.82
3.24
2.67
2.91
2.98
1.44
1.84
1.78
1.81
1.20
3.75
3.39
3.66
2.55
2.38
1.80
3.18
3.15
2.89
2.90
3.63
3.58
2.20
1.68
1.79
1.53
1.96
3.16
3.17
2.70
3.01
2.92
2.96
2.97
1.47
4.05
1.69
1.85
1.70
0.96
1.19
3.84
2.38
2.95
4.26
1.67
2.19
0.95
1.95
1.52
2.04
3.14
2.93
2.94
1.75
1.71
3.91
4.13
2.88
3.13
2.62
2.63
2.64
3.38
2.66
2.61
3.02
2.73
2.51
1.43
1.66
2.18
1.72
1.77
4.32
2.85
3.59
2.65
2.34
2.37
1.86
1.76
0.82
2.86
3.31
3.33
3.12
2.60
2.36
1.48
3.98
1.51
1.03
3.10
3.11
2.56
3.62
2.54
2.33
3.71
0.66
4.03
4.01
2.05
4.30
2.87
3.36
3.37
2.69
3.08
2.59
4.44
4.45
2.50
2.35
0.67
4.26
4.05
1.13
0.81
1.02
3.35
0.59
0.60
0.61
0.64
4.47
4.39
0.65
2.49
0.68
4.21
2.17
1.88
1.73
1.18
3.77
0.80
1.12
3.32
0.58
0.63
2.52
4.41
4.42
4.43
4.48
4.49
4.46
0.74
4.22
3.99
1.16
2.13
0.78
1.94
1.91
0.55
0.56
0.57
2.31
3.07
3.03
2.53
1.65
4.40
2.43
0.71
2.48
0.75
4.23
4.24
4.19
4.20
2.14
0.76
1.17
0.77
0.79
1.09
3.30
0.50
0.51
0.52
0.53
0.54
1.42
0.72
4.38
2.42
1.14
1.11
2.84
3.61
2.57
0.70
0.97
1.50
1.15
1.90
1.08
4.36
0.73
0.69
1.93
2.81
2.47
4.18
3.97
1.89
0.00
2.80
2.44
2.39
2.16
1.60
3.43
3.53
1.04
1.07
4.34
2.46
3.81
2.15
1.05
2.82
4.32
1.64
2.30
3.06
2.45
3.96
4.17
1.50
1.00
1.41
2.79
3.88
4.34
2.26
2.78
2.13
3.57
1.06
3.05
0.99
3.95
1.63
3.94
0.98
1.01
1.62
2.08
2.12
2.07
3.56
3.86
1.63
3.29
0.94
3.51
1.40
2.10
4.13
2.29
2.09
4.16
2.11
3.80
3.93
2.28
1.39
2.27
3.44
3.73
3.50
3.76
3.90
4.15
1.38
4.14
1.38 3.28
3.48
3.25
0.91
0.933.26
0.92
0.90
0.00
1.30
1.34
1.31
1.37
-0.25
1.33
-0.25
1.35
-0.50
0.00
0.50
-0.50
-0.40
PC1
-0.30
-0.20
-0.10
0.00
PC1
as amostras de controle () e sete dias (). (B) Grfico de influncias (loadings)
grfico de escores.
Por fim, fez-se a anlise de PCA incluindo apenas as amostras de controle
e de dez dias de inoculao. Os grficos de PC1 versus PC2 (Figura 32A) e PC1
versus PC3 (Figura 33A), nos quais PC1 explica 79,2% da varincia, PC2 8,79%
e PC3 5,01%, somando 88,0% da varincia explicada no primeiro e 84,2% no
segundo, ambos apresentaram boa discriminao entre os dois grupos de
amostras, sendo que PC1 versus PC3 teve melhor agrupamento de cada
62
conjunto. Os grficos de loadings (Figuras 32B e 33B) mostraram mais uma vez
que as amostras de dez dias possuem os sinais em 1,28-1,32 referente a
lipdeos e VLDL e em 1,33-1,35 referente ao lactato em maior intensidade que
as amostras de controle. Portanto, um bom diagnstico s seria possvel aps o
dcimo dia aps a inoculao. Considerando que o tempo de sobrevida dos
camundongos Swiss inoculados com S180 foi de 18,05,29 dias, dez dias de
desenvolvimento do tumor um perodo muito avanado da doena. Este
resultado pode ser justificado pela diferena no mecanismo de desenvolvimento
do tumor em relao ao TE, tendo em vista que os tumores do tipo sarcoma se
alojam em qualquer parte do corpo e desta forma deve interferir em diversas vias
metablicas, o que torna mais difcil identificar biomarcadores especficos. Por
isso, no foi feito o experimento com S180 em camundongos Balb-C, pois no se
justificaria o uso de mais animais com baixa perspectiva de bons resultados.
63
PC2
0.30
PC2
0.50
1.33
1.35
0.20
0.25
1.30
0.10
1.31
1.34
1.37
0.92 3.25
0.91
0.93
1.38 3.50
4.14
1.38
3.26
3.48
3.28
4.15
4.13
1.39
2.28
2.27
3.24
2.10
3.90
2.26
2.09
2.08
3.43
3.44
2.11
3.56
3.76
1.62
1.63
4.11
1.40
2.29
4.16
0.98
0.94
3.80
0.99
1.63
3.84
1.00
1.05
1.01
1.60
2.12
3.29
1.06
3.75
3.05
1.50
3.53
3.88
1.48
1.41
2.13
2.072.78
2.79
1.50
3.86
1.07
4.32
1.64
4.34
0.97
3.94
1.04
2.30
2.45
3.95
3.93
2.46
1.89
1.09
3.06
0.69
4.17
3.57
2.15
1.17
1.14
1.11
0.72
0.73
1.15
1.93
1.08
2.42
1.88
0.68
1.16
1.13
1.03
2.81
0.51
2.38
0.57
0.53
2.44
4.36
2.47
0.70
0.75
2.16
3.96
0.77
1.90
1.18
0.79
1.12
2.80
4.30
0.52
0.50
0.58
0.54
0.55
0.67
0.76
0.80
0.78
2.82
3.07
0.56
0.59
0.61
0.63
0.71
0.65
0.66
2.14
4.18
1.91
0.81
0.60
2.48
2.43
1.65
0.64
0.74
4.19
1.86
1.73
1.51
3.73
4.32
3.72
3.30
4.38
4.20
1.94
0.82
2.05
3.33
3.31
3.32
3.08
3.02
2.31
4.42
2.49
4.48
4.49
4.40
4.21
4.22
4.23
1.72
3.97
3.36
3.10
3.79
2.35
4.43
4.39
2.50
4.46
4.41
4.24
1.85
3.99
1.02
2.77
3.41
1.42
2.36
2.53
4.45
4.47
2.17
1.52
2.88
3.59
2.65
2.59
2.62
3.03
2.93
2.54
2.33
1.43
2.39
4.03
2.13
1.76
4.30
2.87
3.35
2.69
2.64
2.57
2.60
2.34
2.37
4.44
4.26
1.66
1.53
3.81
1.95
1.75
1.71
1.19
1.20
3.37
3.61
2.61
2.95
2.51
2.94
2.18
1.84
1.69
3.98
1.70
1.77
0.96
1.59
0.00
2.84
3.11
2.73
2.63
2.92
3.62
1.67
4.05
4.01
3.13
3.68
3.12
1.47
2.97
1.68
0.95
1.96
2.86
3.14
2.91
2.96
1.79
3.27
3.39
2.89
2.90
2.19
1.46
4.13
1.83
1.81
1.80
3.51
1.22
3.66
2.98
1.97
1.82
1.78
2.85
2.66
2.70
2.55
2.20
0.83
2.04
3.19
3.00
4.26
1.54
4.28
3.18
3.16
3.17
2.68
3.65
2.72
3.15
3.01
4.05
2.40
3.70
4.07
2.99
3.58
1.44
3.38
3.78
2.21
3.63
2.41
1.21
3.64
1.45
1.98
2.38
4.09
2.52
3.71
4.09
3.67
1.24
4.28
1.55
3.63
1.25
3.77
4.07
2.03
2.74
3.91
2.25
1.58
3.55
3.92
0.86
2.71
1.92
0.90 0.89
1.99
1.56
1.26
2.22
3.87
3.52
2.56
3.69
0.87
3.54
3.46
3.42
1.25
3.74
1.57
3.20
3.21
3.45
0.84
2.67
2.75
3.47
0.85
2.76
2.00
3.88
2.02
3.82
0.88
2.01
3.04
4.11
3.89
2.24
3.40
3.83
3.49
3.22
3.23
2.23
0.00
-0.10
1.27
1.32
-0.25
1.29
-0.20
1.28
-0.50
0.00
0.50
-0.30
-0.60
-0.50
PC1
-0.40
-0.30
-0.20
-0.10
0.00
PC1
as amostras de controle () e dez dias (). (B) Grfico de influncias (loadings) de
PC1 versus PC2 explicando a classificao das amostras apresentada no grfico
de escores.
64
PC3
PC3
0.30
B
1.34
0.50
0.20
1.37
1.32 1.31
0.25
0.10
0.00
3.51
3.26
4.13
3.49
1.38
0.92
0.93
4.14
1.383.88
3.91
3.29
4.16
0.94
1.27
3.77
1.39
3.44
2.27
3.57
1.40
2.29
3.86
3.54
3.81
4.11
2.09
3.45
2.11
2.07
3.94
0.89
3.22
3.73
2.12
2.05
3.42
3.06
2.84
1.41
3.69
2.80
2.67
1.63
3.58
2.39
3.25
2.28
1.63
2.82
4.30
4.17
2.04
2.10
4.34
3.95
2.30
1.42
3.87
2.08
3.04
2.79
3.61
4.18
2.78
2.85
2.74
3.33
3.30
2.57
2.13
1.62
2.81
1.64
3.71
4.36
2.16
3.76
3.40
2.38
2.31
4.44
4.38
1.50
1.01
4.26
2.53
4.47
4.48
4.49
4.41
4.42
4.43
1.94
2.87
3.35
2.71
3.32
4.46
4.39
4.40
4.24
2.46
3.97
1.02
0.99
2.86
2.88
2.70
4.45
4.19
3.96
2.56
3.38
3.31
2.21
4.32
2.59
2.44
4.22
4.23
4.20
4.21
2.47
3.80
3.27
3.18
2.52
3.17
2.66
3.12
2.55
2.34
3.08
1.65
2.17
4.28
3.36
3.37
3.16
3.11
2.60
2.54
2.51
4.05
2.50
1.44
2.48
4.01
2.45
1.07
0.900.912.03
4.09
3.15
3.13
3.14
3.66
2.61
2.65
3.07
3.03
2.36
2.33
1.45
2.20
1.43
2.49
2.40
2.19
1.60
1.55
2.89
3.63
3.10
2.99
2.62
2.63
2.64
0.53
0.54
0.55
0.56
2.35
2.42
2.43
2.18
4.03
3.98
2.15
3.82
3.01
2.69
0.50
0.51
0.52
0.57
1.54
0.71
1.66
1.92
0.70
0.73
4.15
1.56
4.30
3.19
2.90
2.96
2.98
2.94
2.95
2.37
0.58
0.59
0.74
1.77
4.32
3.20
2.91
2.92
2.73
3.62
2.97
2.93
0.60
0.61
1.67
3.99
1.89
1.51
1.91
1.08
1.57
3.83
4.07
0.72
0.63
0.64
1.53
0.69
1.52
0.76
1.73
1.16
3.28
1.06
2.41
1.68
0.95
0.65
0.66
1.88
0.75
1.78
1.75
0.96
1.90
1.15
1.11
1.05
2.75
3.59
3.00
1.69
0.67
2.14
1.95
1.80
1.76
1.71
1.18
1.14
0.78
0.79
0.00
2.22
2.68
3.65
0.68
1.79
0.77
1.12
0.98
1.59
1.98
1.97
1.85
1.96
1.86
1.81
1.13
0.80
1.04
1.58
0.88
3.63
2.72
3.67
3.39
1.99
1.82
1.70
1.21
1.09
3.68
1.83
1.72
1.19
3.93
0.81
0.82
0.83
3.02
1.17
2.76
4.28
3.38
1.84
1.48
1.03
1.00
3.64
3.79
4.09
2.00
4.07
1.47
3.05
1.46
3.53
0.97
1.93
1.50
1.20
1.24
3.55
2.01
2.38
0.84
3.74
2.26
2.02
1.22
2.25
2.77
1.26
3.21
0.87
3.78
3.70
3.88
3.48
3.56
3.46
3.90
3.52
2.23
3.92
1.25
3.47
3.75
3.41
0.85
0.86
1.25
3.89
3.43
4.11
3.84
3.72
3.24
3.23
4.13
1.353.50
1.28
-0.10
1.30
-0.20
2.24
-0.25
1.29
1.33
-0.50
0.00
0.50
-0.30
-0.60
-0.50
-0.40
-0.30
PC1
-0.20
-0.10
0.00
PC1
as amostras de controle () e dez dias (). (B) Grfico de influncias (loadings) de
de escores.
4.5.2.2 Discriminao de acordo com o tipo de tumor

O prximo passo foi tentar a discriminao das amostras doentes de
acordo com o tipo de tumor, no caso utilizando as provindas de camundongos
Swiss inoculadas com TE e S180. No se utilizou as amostras provindas de
camundongos Balb-C porque foi feito apenas o experimento com inoculao com
TE. A anlise de PCA foi feita primeiramente com todas as amostras de trs, sete
e dez dias inoculadas com os dois tipos de tumor, retirando apenas uma amostra
65
de dez dias de TE como forte outlier e que j havia sido retirado em anlises
anteriores. O grfico de escores de PC1 versus PC2 (Figura 34A), com PC1
explicando 91,5% da varincia e PC2 4,56%, somando 96,1%, mostra um
conjunto de amostras formado pelas amostras de trs dias de inoculao com os
dois tipos de tumor direta. As amostras de sete e dez dias inoculadas com S180
ficaram posicionadas mais acima e as de sete e dez dias inoculadas com TE mais
abaixo com certa sobreposio. Retirou-se ento as amostras de trs dias dos
dois tipos de tumor e fez-se uma nova anlise quimiomtrica. A anlise do grfico
de escores de PC1 versus PC2 (Figura 35A), com varincia explicada em PC1 de
85, 7% e em PC2 de 9,2%, somando 94,9%, permitiu observar melhor a
separao entre os grupos inoculados com os dois tipos de tumor. As amostras de
sete e dez dias inoculadas com TE se posicionaram mais abaixo e a direita,
apresentando os sinais em 1,28-1,32 referentes aos lipdeos em maior
intensidade, e as amostras de sete e dez dias inoculadas com S180 mais a
esquerda e acima, com os sinais em 1,33-1,35 referentes ao lactato e em
2,23, referente aceto-acetato ou lipdeos com maior intensidade. Porm, h uma
considervel regio de sobreposio dos grupos inoculados com os dois tipos de
tumor, ocorrendo, portanto uma discriminao parcial apenas, e no seria
possvel uma classificao exata do tipo do tumor. Esta sobreposio se explica
pela grande semelhana as alteraes causadas pelos dois tipos de tumor.
66
PC2
PC2
B
0.30
1.30
1.33
0.20
1.35 0.25
0.91
1.31
1.34
0.10
0.92
3.25
3.50
1.37 0.93
1.38
3.43
3.84
2.26
3.48
2.08
1.38
3.72
2.28
3.90
1.39
3.75
2.09
2.10
4.13
3.28
3.56
1.62
1.63
4.11
2.27
3.47
3.76
3.27
3.88
3.24
3.93
3.41
0.97
4.15
1.60
3.53
1.40
3.44
2.11
4.14
1.63
3.80
0.98
3.52
3.89
3.92
3.79
2.07
0.99
2.05
1.00
2.29
3.86
1.04
3.94
2.77
0.94
3.26
1.41
4.32
1.05
2.78
3.70
2.38
1.50
1.06
1.01
2.79
1.64
3.05
1.47
0.95
2.12
1.17
3.95
3.55
3.96
1.09
1.03
1.07
0.96
4.34
0.72
1.16
1.15
3.78
3.74
1.18
1.14
1.93
4.16
1.11
1.08
3.59
3.57
0.75
0.69
2.13
1.13
4.30
2.30
0.73
0.68
0.76
0.77
0.79
2.15
0.80
0.81
3.99
1.20
1.12
1.02
0.70
2.14
0.78
4.17
3.97
4.32
0.71
3.29
1.42
0.66
1.65
0.67
3.87
0.82
3.73
1.59
0.52
0.54
0.60
0.61
0.63
3.62
0.64
0.65
0.74
2.45
3.98
1.88
1.89
1.70
1.72
1.73
0.50
0.51
0.53
0.55
0.56
0.57
0.58
0.59
3.02
4.36
2.42
1.45
4.18
4.03
4.01
2.16
1.80
1.69
1.90
1.76
1.71
1.50
2.04
3.61
4.40
2.47
2.43
1.43
4.22
2.46
1.67
4.19
4.20
1.68
1.79
1.81
1.82
1.83
1.84
1.85
1.86
1.75
1.48
1.51
1.22
3.07
3.06
4.38
4.39
4.41
3.68
2.44
4.23
2.18
1.66
4.21
2.17
1.78
1.77
1.19
2.81
2.49
2.35
4.42
4.43
4.45
4.46
4.47
4.48
4.49
2.48
2.41
2.37
2.39
2.40
4.24
4.05
1.94
2.87
3.38
3.39
3.31
3.30
3.65
3.08
3.10
2.92
2.93
3.00
2.31
3.01
3.03
4.44
2.19
1.46
1.95
1.96
1.91
1.52
2.82
3.16
2.88
2.62
2.63
2.64
2.65
2.69
2.57
2.94
2.95
2.96
2.98
2.52
2.53
2.33
2.34
2.50
2.36
1.44
2.13
0.83
0.00
2.80
3.18
3.17
3.13
3.14
3.11
2.91
2.61
3.63
2.56
2.59
2.54
3.42
2.97
2.99
2.20
4.26
1.53
3.32
2.68
3.12
2.90
2.72
2.60
2.66
3.66
3.81
1.97
1.21
0.86
3.36
3.37
3.15
2.89
2.70
3.64
3.46
2.73
2.51
3.67
3.58
4.07
3.23
2.86
3.33
3.35
4.05
1.24
4.09
3.19
2.55
1.98
1.92
0.85
2.71
1.54
3.71
0.90 2.03
4.28
4.30
2.84
3.04
3.38
3.45
2.67
3.77
1.25
2.85
3.21
2.21
4.26
3.82
2.38
0.84
3.91
3.54
4.07
3.40
3.51
3.69
1.55
1.58
1.99
3.20
3.83
4.28
1.56
2.74
3.49
3.88
2.02
1.57
4.13
2.00
2.75
2.76
2.01
4.11
2.22
2.25
0.87
1.26
3.22
2.24
0.890.88
1.32
0.00
1.27
2.23
1.29
-0.10
-0.25
-0.20
-0.50
1.28
-0.30
-1.00
-0.50
0.00
0.50
1.00
-0.50
PC1
-0.40
-0.30
-0.20
-0.10
0.00
PC1
as amostras de trs (), sete ( ) e dez dias () inoculadas com TE e trs (), sete
() e dez dias () inoculadas com S180. (B) Grfico de influncias (loadings) de
de escores.
67
PC2
PC2
0.30
0.50
1.30
1.33
0.20
0.25
1.35
0.10
0.92
1.31
0.91
3.25
3.50
1.37 1.34
0.93 1.38
2.26
2.08
3.43
3.84
1.38
3.72
2.28
3.48
2.09
1.39
3.90
2.10
4.13
3.75
1.62
3.28
2.27
3.56
4.11
1.63
1.60
3.76
2.05
3.88
2.07
3.47
0.97
3.27
3.24
4.15
2.77
3.93
0.98
3.53
1.40
3.41
2.11
3.80
1.63
4.14
3.44
3.92
1.00
0.99
3.79
3.52
2.78
3.89
1.04
3.94
2.29
2.79
4.32
1.05
1.50
3.86
1.01
0.94
1.06
1.17
2.38
1.41
0.95
1.07
1.09
1.16
2.12
3.05
1.03
1.47
1.18
1.14
1.15
1.64
1.59
0.96
3.95
3.70
1.11
3.96
1.20
1.13
3.26
1.08
4.34
0.72
2.04 0.90
1.02
1.12
4.16
1.93
3.55
0.69
0.68
1.22
0.81
2.15
0.79
0.80
2.13
0.77
0.78
0.75
0.76
0.73
4.30
3.99
0.82
4.17
3.57
3.59
0.70
4.32
3.78
3.97
2.14
0.67
0.66
2.30
1.72
4.01
1.88
1.89
2.16
1.90
2.45
0.71
0.65
0.63
0.64
1.73
1.50
3.98
1.76
1.70
1.19
1.65
4.36
0.74
0.60
0.61
0.54
0.55
0.56
0.57
0.58
0.50
0.51
0.52
0.53
2.81
0.86
3.74
1.51
1.86
1.80
4.18
4.03
4.19
2.42
2.17
3.62
3.02
2.46
2.47
3.29
0.59
1.71
1.82
1.83
1.84
1.85
1.79
1.75
1.69
1.81
1.68
4.20
4.21
4.22
2.43
1.42
4.23
2.44
2.18
4.39
4.40
3.61
3.06
3.07
3.87
1.77
1.78
1.45
1.94
1.95
1.91
1.67
4.05
3.68
4.24
4.45
4.46
4.38
4.41
4.48
4.49
2.48
2.80
1.48
0.83
1.21
1.52
1.96
1.66
1.43
2.40
2.41
4.42
4.43
2.37
2.19
4.47
2.49
2.35
3.38
2.82
2.03
3.73
2.39
3.65
3.00
4.44
2.93
2.94
2.50
2.92
2.33
3.30
3.08
3.10
2.69
2.64
2.62
2.87
1.24
2.13
4.26
3.01
3.03
2.95
2.96
2.98
2.36
2.20
2.52
2.53
2.31
2.34
3.31
2.63
2.57
2.59
2.61
2.54
2.65
3.16
0.85
1.53
1.44
1.97
2.97
3.39
2.72
2.60
3.11
3.13
3.14
4.07
1.46
1.25
2.99
2.91
2.90
2.70
2.73
3.32
3.12
2.68
2.66
3.17
3.37
3.18
3.67
3.66
2.56
2.51
2.88
2.89
3.15
3.36
3.81
3.58
3.64
2.86
3.23
1.98
4.05
4.09
4.28
1.25
1.92
3.63
3.33
3.35
1.54
2.71
2.55
3.19
2.84
4.30
0.84
3.42
3.46
3.04
3.38
2.85
4.26
2.21
2.38
2.67
1.58
3.77
3.21
4.07
3.82
3.45
3.71
3.91
1.55
3.54
1.99
3.69
3.40
2.25
3.51
3.20
4.28
2.02
2.74
1.56
2.75
1.57
2.76
3.83
2.00
3.88
2.01
3.49
2.24
1.26
0.87
2.22
4.13
4.11
0.880.89
3.22
0.00
0.00
1.32
1.29
1.27
2.23
-0.10
-0.25
-0.20
-0.50
1.28
-0.75 -0.50 -0.25
0.00
0.25
0.50
0.75
-0.30
0.00
PC1
0.10
0.20
0.30
0.40
0.50
0.60
PC1
as amostras de sete ( ) e dez dias () inoculadas com TE e sete (x) e dez dias ()
inoculadas com S180. (B) Grfico de influncias (loadings) de PC1 versus PC2
explicando a classificao das amostras apresentada no grfico de escores.
Em seguida, repetiu-se a anlise considerando apenas as amostras de
sete dias dos dois tipos de tumor. Pelo grfico de escores de PC1 versus PC2
(Figura 36A), com varincia explicada em PC1 de 89,3% e em PC2 de 7,56%,
somando 96,9%, se observa discriminao entre os grupos inoculados com os
dois tipos de tumor, porm com uma pequena rea de sobreposio. As amostras
de sete e inoculadas com TE se posicionaram a esquerda, apresentando os sinais
em 1,28-1,32 referentes aos lipdeos em maior intensidade, enquanto as
amostras de sete dias inoculadas com S180 se posicionaram mais a direita
68
apresentando maiores quantidades de lactato, correspondente ao sinal em 1,331,35, e do sinal referente s metilas dos lipdeos em 0,89-92, indicando que
neste estgio da doena h maior diferena nas formas em que cada tumor afeta
o metabolismo.
PC2
PC2
B
1.28
0.50
0.20
0.10
0.25
1.27
1.29
2.23
0.890.883.22
0.87
1.26
3.49
2.01
2.24
2.22
2.00
3.88
2.02
3.83
3.23
2.76
2.75
4.11
4.13
2.74
1.57
1.56
1.25
3.69
3.40
3.54
1.25
3.51
3.71
3.20
1.99
3.45
3.91
0.85
2.25
1.55
3.82
3.46
0.86
3.21
0.84
4.28
3.42
1.58
3.38
3.77
2.38
4.07
3.35
2.21
1.24
2.85
3.33
3.36
4.26
2.67
2.71
2.55
1.54
3.19
1.48
2.84
3.37
3.32
3.39
2.73
3.63
3.67
3.58
1.98
1.92
2.68
2.70
2.72
3.04
2.51
3.64
3.66
1.46
2.034.28
2.89
2.90
2.91
4.05
3.81
3.24
2.86
3.38
3.12
2.60
3.03
1.97
1.53
1.21
3.15
2.88
3.11
3.13
2.66
2.64
2.63
3.31
2.69
2.65
2.59
2.61
2.62
2.54
2.96
2.97
2.99
3.68
0.83
3.87
3.74
2.80
4.09
4.30
3.18
3.14
3.30
3.08
3.10
2.57
2.92
2.53
3.65
2.93
2.94
2.95
2.98
3.00
2.50
2.36
2.34
2.20
3.01
1.52
3.17
2.49
2.33
4.26
2.37
2.19
2.43
2.44
2.13
1.96
1.85
3.73
2.82
4.07
2.87
3.16
0.50
0.55
3.06
3.07
2.56
4.44
2.52
2.48
2.31
2.35
2.40
2.41
1.95
1.91
1.44
1.86
3.78
1.51
0.51
0.52
0.53
0.54
0.56
0.57
0.58
0.59
0.60
0.61
4.43
3.61
3.02
2.46
2.18
3.55
2.42
2.39
2.17
1.43
1.66
1.94
1.19
1.83
1.84
1.75
1.50
1.22
2.81
0.63
4.47
4.48
4.49
0.64
0.65
4.45
4.46
4.38
4.39
4.41
4.42
2.47
0.66
4.24
0.67
4.19
4.20
4.21
4.22
4.05
2.45
1.88
1.78
1.67
1.68
1.82
1.77
3.70
1.71
3.29
0.71
4.40
3.62
4.23
0.74
4.18
4.01
4.03
2.16
1.89
1.79
1.81
1.76
1.69
1.70
1.72
1.73
4.36
0.70
0.68
1.42
1.90
1.80
1.45
3.98
3.59
0.69
3.57
1.65
2.14
3.97
0.82
4.34
0.73
2.13
0.78
0.79
0.80
1.20
2.30
0.75
0.76
4.17
0.77
2.15
3.99
0.81
1.12
3.89
3.26
0.72
1.13
1.93
1.11
1.14
4.16
1.47
1.50
1.08
1.02
1.03
3.05
2.12
1.16
1.18
1.15
3.96
1.07
1.09
3.92
1.59
2.38
3.95
1.05
0.96
3.86
0.00
4.32
1.64
1.17
0.90 2.04
2.79
4.30
1.06
3.52
0.95
3.47
3.79
3.94
1.01
1.41
3.44
0.94
1.00
3.41
2.78
4.32
3.27
0.99
2.29
3.53
1.04
4.14
2.77
3.80
0.98
2.11
1.63
4.15
3.88
1.40
0.97
3.76
4.11
3.93
3.56
3.75
2.05
1.60
4.13
2.07
3.72
1.63
3.28
1.62
2.10
3.90
2.27
3.84
3.48
2.09
3.43
1.39
2.28
1.38
2.08
2.26
1.38 3.50
3.25
1.34 1.37 0.93
0.00
1.32
-0.10
0.91
1.31
0.92
1.35
-0.25
-0.20
1.33
1.30
-0.50
0.00
0.50
-0.60
-0.50
-0.40
-0.30
-0.20
-0.10
-0.50
0.00
PC1
PC1
as amostras de sete dias inoculadas com TE () e sete dias inoculadas com S180
Fez-se o mesmo com as amostras de dez dias, retirando um outlier de dez
dias do grupo com TE. No grfico de escores de PC1 versus PC2 (Figura 37A),
com varincia explicada em PC1 de 75,7% e em PC2 de 15,3%, somando 91,0%,
observa-se grande sobreposio entre os grupos inoculados com os dois tipos de
69
tumor. Este resultado foi inesperado tendo em vista que com as amostras de sete
dias ocorre melhor separao enquanto do que com as de dez dias, podendo
sugerir que a reao devida aos dois tipos de tumores volta a se tornar
semelhante em estgios mais avanados da doena.
PC2
PC2
0.30
0.50
1.28
2.23
0.20
0.25
0.10
1.27
1.32
4.11
4.13
3.22
0.89 2.22
3.88
3.49
3.51
3.83
0.88
4.28
2.01
2.25
2.00
1.57
3.20
1.56
2.74
2.76
3.54
4.09
3.40
2.75
2.02
4.07
2.67
3.77
3.73
3.91
4.30
4.26
1.99
3.71
1.55
2.38
3.69
3.42
2.21
3.45
0.87
3.46
3.82
1.58
1.26
4.28
3.19
3.04
2.71
4.05
1.44
3.38
3.81
1.92
4.07
2.55
3.15
2.56
3.16
3.17
3.14
3.21
3.63
3.58
1.54
2.85
2.84
4.09
4.44
3.64
1.98
3.18
3.33
3.12
2.89
2.66
2.51
4.26
2.52
4.47
3.66
2.99
2.13
2.88
3.13
3.30
3.31
2.90
2.70
2.57
2.59
2.60
4.42
4.43
4.45
4.46
2.39
3.35
3.11
2.61
2.53
4.48
4.49
2.91
2.97
2.98
4.24
3.01
2.40
3.67
3.26
2.65
2.31
3.32
2.63
2.54
4.41
4.38
2.96
4.39
4.40
4.05
1.97
2.03
3.39
3.08
2.73
2.69
2.62
2.64
3.29
2.50
2.93
2.94
2.95
2.20
3.00
1.42
4.22
4.23
1.66
4.21
1.53
1.45
1.77
0.84
2.86
4.32
3.37
2.68
3.10
2.33
2.34
2.92
2.48
2.49
2.36
3.61
3.03
4.36
3.65
2.19
4.20
1.95
1.96
1.67
1.43
4.19
1.78
1.46
4.30
2.72
2.35
2.37
2.41
1.91
4.18
1.94
1.79
1.80
1.69
1.81
1.71
3.36
3.06
3.07
2.47
1.65
2.18
4.03
4.01
1.68
3.98
1.52
1.82
3.87
2.87
4.34
3.62
2.17
1.75
1.76
3.74
2.04
2.46
2.43
2.44
2.16
1.73
3.97
1.83
1.84
0.83
2.24
2.82
3.38
2.30
3.57
2.42
0.74
1.90
4.17
3.99
1.70
1.51
0.50
0.51
0.54
0.57
0.58
0.59
2.45
2.14
4.16
1.85
1.50
2.80
0.52
0.53
0.55
0.56
0.60
0.61
0.63
1.89
1.21
1.86
1.72
0.64
3.59
3.02
0.65
1.19
2.15
1.88
1.93
3.68
1.64
0.73
0.71
0.70
0.78
3.96
3.95
1.02
2.81
4.32
0.75
0.66
0.76
0.67
0.77
0.79
0.80
0.82
1.24
2.13
0.81
1.08
1.59
0.68
0.69
1.12
2.29
1.41
3.55
1.13
1.48
1.11
3.78
0.96
3.86
1.01
1.25
3.93
3.05
0.72
1.15
1.18
1.14
1.06
0.94
0.00
1.16
1.09
1.07
1.22
2.12
1.03
0.95
1.17
1.20
3.80
1.40
1.63
1.47
1.04
0.85
2.38
3.70
2.79
3.44
3.94
2.78
3.53
1.05
3.23
1.50
0.99
3.41
0.90 2.05
3.52
3.79
2.11
4.14
0.86
1.25
1.00
2.07
2.27
3.28
0.98
1.60
3.76
3.88
1.63
0.97
4.15
3.56
3.92
3.89
1.62
3.90
3.48
2.77
1.39
1.38
3.27
2.28
3.47
3.75
2.09
2.10
3.24
3.84
2.26
1.38
4.11
1.372.08
3.43
4.13
3.72
0.93
3.50
1.34
3.25
0.92
0.91
1.29
0.00
1.31
-0.10
1.35
-0.25
-0.20
1.30
1.33
-0.50
-0.25
0.00
0.25
0.50
-0.30
-0.60
-0.50
-0.40
-0.30
-0.20
-0.10
-0.50
0.00
PC1
PC1
as amostras de dez dias inoculadas com TE () e dez dias inoculadas com S180
Fez-se a mesma anlise apenas com as amostras de cinco dias, no
includas em nenhuma das anlises anteriores. Pelo grfico de escores de PC1
versus PC2 (Figura 38A), com varincia explicada em PC1 de 40,2% e em PC2
70
de 25,6%, somando apenas 65,8%, no apresentou nenhuma separao entre os

grupos inoculados com os dois tipos de tumor.
PC2
PC2
0.50
1.35
0.50
1.20
0.25
1.33
1.37
1.31
0.25
1.18
1.22
3.59
3.57
0.92 3.26
1.21
3.58
0.933.62
3.48
3.28
1.38 3.614.14
4.15
0.91
3.50
3.90
1.38
3.76
3.44
3.56
3.25
2.27
3.80
4.16
1.39
3.51
3.93
2.28
4.13
2.29
3.29
3.86
3.43
0.94
2.11
2.09
1.40
3.63
1.63
3.73
2.10
1.62
2.39
0.99
1.01
1.63
1.50
1.93
3.88
1.192.26
2.08
1.07
3.77
2.16
1.02
2.42
2.15
2.07
1.41
3.53
2.47
1.94
4.34
2.30
1.64
3.06
2.46
3.71
3.05
2.48
4.17
1.05
0.98
3.81
2.12
1.51
1.06
1.60
2.78
2.82
2.49
2.17
3.94
3.95
2.79
4.32
2.57
2.53
1.08
2.81
2.84
1.42
4.34
3.08
2.50
3.66
4.18
2.18
1.11
1.75
3.91
0.50
2.31
0.52
0.53
3.10
3.11
3.07
1.65
2.13
1.77
1.91
1.48
3.41
3.84
2.80
0.51
0.54
0.56
3.16
3.13
4.36
2.33
2.69
2.52
2.40
2.35
0.70
1.00
1.95
1.76
1.09
1.73
4.13
2.87
3.30
0.59
0.55
0.57
2.59
2.94
0.72
0.73
0.69
2.56
1.15
2.45
4.19
1.13
2.38
3.99
1.04
3.97
0.97
2.86
2.88
3.32
3.14
0.60
0.61
2.54
0.63
0.71
2.73
0.75
0.76
2.44
0.77
0.78
1.78
3.96
2.85
3.33
3.31
3.17
3.18
3.12
2.66
2.60
2.61
2.62
0.58
2.51
2.65
2.36
2.34
4.48
2.95
4.38
0.74
0.68
2.37
2.19
1.14
3.03
0.79
1.12
3.68
3.98
1.90
4.11
3.15
2.63
4.49
4.46
0.64
0.65
4.47
4.45
2.93
4.40
2.99
1.66
4.20
2.20
0.80
4.01
1.96
1.79
1.80
1.69
4.30
3.19
2.64
2.70
0.67
4.42
4.44
2.98
2.96
2.43
1.43
4.39
4.41
1.16
1.44
4.03
1.67
1.81
1.82
3.63
2.97
0.66
4.43
4.26
4.23
4.24
3.01
4.21
2.41
1.52
0.00
0.81
1.83
1.84
1.03
1.71
2.55
3.88
2.92
4.05
1.45
4.22
1.68
1.97
2.13
1.85
1.72
0.96
2.67
2.21
1.46
1.53
1.70
3.42
3.35
3.36
3.02
0.82
1.89
4.09
2.89
2.91
3.00
1.54
1.86
2.90
2.38
1.98
2.14
1.88
4.32
2.74
0.95
2.05
3.38
2.71
2.68
3.78
2.04
4.07
2.72
1.92
1.55
3.75
1.59
3.64
3.79
3.37
2.22
3.46
3.20
1.50
3.54
0.83
4.28
3.87
4.28
3.69
1.24
1.99
3.45
1.56
3.39
3.67
1.58
2.77
3.65
1.57
2.25
3.70
3.04
1.47
2.75
2.00
2.03
3.21
3.27
2.76
3.82
4.09
3.38
0.89
2.01
3.52
2.02
1.17
2.23
1.26
0.84
3.74
3.55
0.87
0.90 3.49
3.24
1.25
3.83
4.11
1.25
3.72
3.92
0.88
0.86
3.40
3.22
0.85
2.24
3.47
3.89
1.27
1.30
1.34
0.00
3.23
-0.25
1.32
1.28
1.29
-0.50
-0.50
-0.25
0.00
0.25
-0.25
0.50
-0.40
-0.30
-0.20
-0.10
0.00
PC1
PC1
as amostras de cinco dias inoculadas com TE () e cinco dias inoculadas com
S180 (). (B) Grfico de influncias (loadings) de PC1 versus PC2 explicando a
4.5.3 PLS-DA
O mtodo PLS-DA, ao contrrio do PCA, um mtodo supervisionado em
que fornecida a matriz Y, formada por apenas uma coluna com informaes
71
descritivas identificando as amostras, e a matrix X continua a ser composta pelas

amostras, no caso os valores das integrais dos buckets gerados a partir dos
espectros de RMN de 1H. Assim, tenta-se encontrar a melhor correlao entre as
matrizes X e Y usando relevantes combinaes lineares das variveis nestas
duas matrizes, buscando a parte da varincia na matriz X que melhor se encaixa
aos dados da matriz Y (Wishart, 2008).
Para a realizao do PLS-DA necessrio a escolha cuidadosa do nmero
de variveis latentes (VL), que equivalem s componentes principais. Deve-se
escolher um nmero de VL que seja suficiente para explicar a maior parte da
varincia das matrizes X e Y, porm no deve ser grande a ponto de introduzir
rudo nas anlises. O nmero de VLs para cada grupo analisado foi determinado
utilizando-se validao cruzada leave-one-out e tendo como base os grficos R2X
e R2Y, os quais mostram o valor da varincia no explicada das matrizes X e Y,
respectivamente, conforme aumenta o nmero de variveis latentes. No mtodo
de validao cruzada leave-on-out uma amostra retirada aleatoriamente do
conjunto de dados, e um novo modelo desenvolvido com as amostras (n - 1)
restantes (chamado ento de calibrao). A amostra retirada ento testada
como uma primeira validao do modelo criado. Esse processo ser contnuo at
que seja criado um n nmero de modelos testados. Para cada amostra retirada,
um modelo criado e testado. A exatido em classificao do modelo para n
nmeros de validaes e testes ento determinada (Manual da Amix, 2008;
Reche et al., 2009). A importncia da validao cruzada antes da determinao
exemplificada nas Figuras 39 e 40 que mostram os grficos R2X e R2Y antes e
depois da validao cruzada, respectivamente, para o grupo de amostras de
controle e com trs, sete e dez dias de inoculao de TE em camundongos Swiss.
Aps a validao cruzada percebe-se que o nmero ideal de variveis latentes
de quatro, pois com cinco VLs volta a aumentar a quantidade de varincia noexplicada indicando a introduo de rudo no sistema.
72
R2Y
R2X
0.0750
0.75
0.0500
0.50
0.0250
0.25
0.00
0.0000
0.00
5.00
10.00
15.00
20.00 0.00
5.00
10.00
15.00
20.00

eixo x para um conjunto de amostras antes da validao cruzada.
73
R2Y
R2X
0.90
0.0750
0.80
0.0500
0.70
0.60
0.0250
0.50
0.00
5.00
10.00
15.00
0.0000
20.00 0.00
5.00
10.00
15.00
20.00

eixo x para um conjunto de amostras aps a validao cruzada.
Na anlise por PLS-DA, tambm possvel identificar outliers pelos
grficos DModX e DModY que fornecem a distncia de cada amostra em relao
ao espao X e Y do modelo, respectivamente, ilustradas na Figura 41. Se
houverem outliers este apareceram alm da linha limite, determinada pelo nvel
de confiana fornecido pelo analista, no caso 95%. Como as anlises de PLS-DA
foram feitas em sequncia as de PCA, nenhuma amostra foi indicada como
outlier.
74
DModY
DModX
0.75
0.200
0.50
0.150
0.100
0.25
0.050
0.00
0.00
25.00
50.00
75.00
0.00
25.00
50.00
75.00
Figura 41: Grficos de DModX e DModY indicando a posio de cada amostra

em relao ao espao X e Y do modelo, respectivamente.
4.5.3.1 Discriminao entre amostras de grupos sadios e doentes

As anlises por PLS-DA foram realizadas utilizando os mesmos grupos das
anlises por PCA.
4.5.3.1.1 TE em camundongos Swiss

O grfico de T-escores de PC1 versus PC2 (Figura 42A) da anlise das
amostras de controle, trs, sete e dez dias de inoculao de TE em camundongos
75
Swiss, utilizando quatro variveis latentes e 95,8% da varincia explicada na

matriz X e 55,8% da matriz Y, permitiu discriminar as amostras em dois grupos.
direita se encontram as amostras de controle e de trs dias e esquerda se
agruparam as amostras de sete e dez dias, discriminando assim animais sadios e
doentes a partir de sete dias de inoculao. Esta discriminao explicada pelo
grfico de influncias ou X-loadings de PC1 versus PC2 (Figura 42B). Amostras
localizadas mais esquerda do grfico de T-escores, controle e trs dias,
possuem maior intensidades do sinal em 2,23-2,24, provavelmente referente ao
aceto-acetato, enquanto as amostras mais direita, sete e dez dias possuem
mais da substncia originadora dos sinais em 1,28-1,32, referentes a lipdeos e
principalmente VLDL, e do dubleto 1,33-1,35 ppm referente ao lactato. Desta
forma, s foi possvel discriminar as amostras doentes aps sete dias a partir da
inoculao assim como ocorreu com a anlise por PCA (Figura 20), porm com
melhor separao entre os grupos.
76
B
1.28
2.23
0.25
0.100
2.24
0.000
1.29
1.27
3.22
3.83
2.22
3.23
3.89
3.49
4.11
3.88
3.20
4.28
3.82
3.46
0.84
4.09
4.07
2.00
3.21
3.40
2.01
3.92
4.28
3.52
1.46
4.26
3.63
1.99
3.74
4.05
3.54
4.07
3.91
3.78
3.45
3.19
3.87
3.64
2.85
1.56
1.92
3.69
2.21
4.30
0.85
3.67
2.38
1.57
1.81
2.40
3.58
2.86
2.75
2.25
1.82
1.83
1.84
3.71
4.44
4.45
4.46
4.47
2.99
3.00
3.55
2.55
3.18
0.83
4.05
4.48
4.49
4.42
3.63
3.04
2.89
2.67
3.17
1.55
2.74
4.01
4.03
1.78
1.79
1.80
3.77
2.41
1.98
4.43
4.41
2.97
2.98
2.90
3.38
3.98
1.85
1.68
1.45
4.39
4.40
4.26
3.01
2.96
2.51
2.91
3.15
2.88
2.84
2.76
1.69
1.70
1.97
4.21
4.22
1.66
1.67
3.70
3.65
2.94
2.95
3.47
3.12
2.71
3.16
2.68
3.35
2.87
1.77
1.96
1.86
4.19
4.20
4.23
4.24
3.14
3.99
1.75
1.71
1.95
4.38
3.02
2.20
3.66
2.93
3.42
2.92
2.54
3.11
2.60
2.61
2.62
2.63
2.66
3.13
4.32
1.76
1.44
2.19
2.37
2.50
2.33
2.34
2.36
1.54
3.10
2.59
2.64
2.65
3.33
4.30
2.02
0.82
1.72
4.18
2.13
1.47
2.18
4.36
2.43
2.49
3.08
2.70
3.32
3.37
3.97
0.81
2.17
3.81
0.74
2.35
2.52
3.31
3.36
0.79
0.80
0.78
2.42
1.65
3.59
3.03
3.07
2.53
2.31
2.56
3.38
1.73
1.53
4.34
2.57
0.61
0.59
3.30
2.72
1.58
1.94
0.77
0.75
3.68
2.48
0.65
3.62
0.63
0.64
0.60
2.69
0.57
0.58
0.54
0.55
3.96
4.17
1.88
0.76
2.44
1.43
0.73
0.71
0.66
3.61
0.56
0.50
0.51
0.52
0.53
1.91
1.52
2.39
0.67
2.14
2.47
2.38
0.70
1.02
3.95
1.03
0.96
1.90
2.16
0.68
0.72
3.39
2.82
1.51
3.06
1.12
2.15
0.69
1.42
4.32
1.08
1.93
1.89
1.48
1.19
2.45
2.46
2.30
2.73
1.09
1.21
1.13
0.95
3.79
3.51
1.11
1.20
1.14
1.64
2.81
3.88
1.15
1.16
3.41
3.94
2.13
1.07
1.18
3.72
3.84
1.04
1.50
1.17
3.57
2.80
1.24
1.05
2.12
3.29
3.53
3.05
1.00
1.22
3.86
1.06
0.86
4.16
1.50
1.25
1.41
0.87
3.27
1.59
3.93
0.97
0.98
1.63
3.80
3.73
2.030.89
1.01
2.29
0.99
0.94
2.11
3.75
3.43
2.79
0.88
4.11
3.56
4.13
3.90
2.77
3.44
1.63
2.78
3.76
1.40
1.60
2.04
2.10
1.25
1.62
4.15
4.13
1.26
2.28
3.50
2.26
2.09
3.28
2.27
3.48
2.07
2.05 0.90
1.39
4.14 2.08
3.26
0.931.38
3.24
1.38
3.25 0.92
0.00
1.32
0.91
1.37
-0.100
-0.25
1.31
1.30
1.34
-0.200
1.35
-0.50
1.33
-0.50
-0.25
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
0.00
0.10
0.20
0.30
0.40
0.50
0.60
amostras apresentada no grfico de T-escores.
Considerando que as amostras de trs dias que ficaram agrupadas junto
com as de controle, ou seja, no foram discriminadas como doente, fez-se uma
nova anlise quimiomtrica para tentar separar estes dois grupos e verificar a
possibilidade de diagnosticar a presena da doena atravs dos espectros de
RMN de 1H do soro aps trs dias aps a inoculao de TE utilizando a anlise
quimiomtrica por PLS-DA. O grfico de T-escores de PC1 versus PC2 (Figura
43A), com sete variveis latentes e 86,8% da varincia explicada na matriz X e
52,4% da matriz Y mostrou melhor separao do que a correspondente anlise
por PCA (Figura 21), porm a discriminao foi ainda apenas parcial, no
77
permitindo nem sequer um diagnstico de suspeita da presena da doena.

Analisando o grfico de X-loadings (Figura 43B), as amostras de controle,
deslocadas mais esquerda, apresentaram os sinais na regio de 1,29-1,37
ppm referentes aos lipdeos e lactato mais intensos ao passo que as amostras de
trs dias mais direita apresentaram maior quantidade do sinal em 2,24 ppm,
referente ao aceto-acetato.
0.200
B
1.33
0.75
2.24
1.29
0.100
0.50
1.35
1.30
0.25
3.23
3.50
4.13
3.84
4.11
3.72
3.89
3.43
1.283.24
1.25
2.23
3.41
0.86
0.85
3.92
3.52
3.75
3.70
1.26
1.25
3.78
2.02
0.87
0.90
3.47
3.21
2.01
3.55
0.88
2.77
2.26
2.03
2.00
3.88
3.46
2.76
3.68
2.38
1.27
3.67
1.50
3.56
3.74
2.75
1.58
1.59
2.72
3.64
1.47
1.24
3.65
1.22
3.59
1.99
1.46
1.93
0.84
2.14
1.84
3.38
3.05
1.20
0.97
1.57
3.27
2.68
3.90
3.63
1.85
4.09
3.02
1.60
2.10
2.22
1.98
4.07
1.97
1.72
1.86
1.03
2.56
4.28
3.79
2.73
1.56
1.48
3.66
3.20
1.96
1.95
1.83
0.95
3.82
1.70
1.88
1.43
1.19
1.71
1.82
1.00
0.911.38
2.05
2.04
2.08
2.71
2.69
2.91
3.04
1.53
1.52
1.17
3.00
1.69
1.75
3.31
2.90
2.92
2.52
1.51
1.68
1.76
1.79
1.81
3.36
4.32
1.55
1.44
3.10
3.01
2.41
3.83
2.43
1.73
1.06
1.78
4.07
3.19
3.30
2.89
2.66
2.63
2.64
2.93
2.42
1.54
2.97
1.67
3.93
1.13
1.09
3.39
3.35
3.32
3.15
3.37
3.03
2.60
3.11
4.15
3.07
2.99
2.95
2.37
2.98
1.66
1.04
1.80
1.12
3.99
0.89
1.42
3.14
3.13
2.65
2.61
2.62
2.33
2.59
2.94
1.18
2.96
0.67
0.68
2.49
1.91
4.28
1.89
1.88
1.77
0.83
3.98
1.62
2.74
3.33
1.21
2.70
2.34
2.35
1.65
3.12
2.36
3.63
2.54
2.51
2.44
0.65
0.66
0.98
2.19
1.14
1.15
2.18
2.15
1.92
0.81
0.82
1.41
4.30
2.31
2.67
0.50
1.45
0.52
3.62
3.08
2.55
2.45
0.61
2.50
2.20
0.69
1.16
1.90
0.77
0.80
2.78
3.16
3.18
0.51
0.53
0.56
2.38
0.57
0.58
0.59
0.60
2.21
0.63
2.48
0.64
1.05
2.17
1.11
1.08
0.79
2.07
2.28
2.79
3.48
1.64
2.86
0.54
0.55
0.72
0.96
0.74
0.75
0.78
4.05
4.03
2.85
2.87
2.88
0.71
0.76
4.45
4.19
2.81
3.28
2.30
4.32
3.17
2.53
2.47
0.70
4.20
4.21
0.00
2.09
1.63
2.80
2.57
2.13
0.73
2.40
2.16
4.42
4.26
4.22
4.01
2.46
4.39
4.41
4.43
4.44
4.46
4.24
4.48
4.23
1.63
3.40
4.38
4.40
4.47
4.49
4.18
4.17
3.96
3.53
0.99
4.09
1.01
4.36
1.94
3.97
2.84
4.30
4.34
3.69
3.61
1.07
2.82
4.34
3.58
3.95
1.40
1.50
3.38
1.39
2.27
2.11
1.02
3.87
2.12
3.80
3.25
3.06
1.38
2.29
3.71
2.39
3.22
3.76
4.11
3.94
4.14
3.42
0.94
3.45
3.81
4.16
3.54
3.77
3.57
3.29
3.88
3.86
0.920.933.44
3.91
4.133.73
3.49
2.25
0.000
3.26
3.51
1.31
-0.100
-0.25
1.32
1.37
-0.50
-0.200
1.34
-0.75
-0.50
-0.25
0.00
0.25
0.50
-0.40
-0.75
-0.30
-0.20
-0.10
0.00
0.10
utilizando as amostras de controle () e trs dias (). (B) Grfico de influncias
apresentada no grfico de T-escores.
Como no se obteve um bom diagnstico com trs dias aps a inoculao,
fez-se a anlise com as amostras de cinco dias, para verificar se seria possvel
78
diagnosticar a doena neste perodo. O resultado apresentado na Figura 44A

pelo grfico de T-escores de PC1 versus PC2, utilizando trs variveis latentes
com 73,4% da varincia da matrix X explicada e 69,3% em Y. Observa-se boa
discriminao entre os grupos de controle e de cinco dias aps a inoculao do
tumor, superior a trs dias de inoculao e superior a obtida para a mesma
anlise por PCA (Figura 23). Amostras localizadas mais direita do grfico de Tescores, grupo doente, possuem maiores intensidades do multipleto em 1,281,32 referente aos lipdeos e VLDL, do dubleto em 1,33-1,35 e do sinal em
4,11-4,13 referentes ao lactato e do sinal em 3,23 referente colina, enquanto
as amostras mais esquerda, grupo sadio, possuem mais da -glucose em
3,26. Portanto, a partir de cinco dias de inoculao possvel boa discriminao
entre amostras sadias e doentes por meio da anlise por PLS-DA, mostrando-se
superior ao obtido por PCA, na qual no perodo de cinco dias houve apenas uma
discriminao parcial (Figuras 23 e 24).
79
B
1.33
0.25
0.30
4.13
4.11
3.23
0.20
0.87
0.86
1.28
3.89
3.72
1.27
0.85
0.88
1.26
3.47
3.92
3.24
3.74
0.84
3.27
3.22
3.70
3.38
3.84
3.67
3.78
3.75
3.83
0.95
3.21
2.00
2.38
2.01
3.82
3.25
0.83
0.97
1.50
2.75
2.02
1.04
1.99
2.14
0.82
1.13
3.40
1.06
0.96
1.47
4.09
1.03
2.41
2.76
3.68
2.24
2.72
1.09
0.81
1.12
0.89
1.92
1.98
0.80
2.23
2.77
1.01
2.68
1.97
1.88
3.65
3.20
3.43
0.78
0.79
1.11
0.99
1.89
1.53
2.22
0.77
1.96
1.84
1.86
2.13
0.69
0.68
3.37
3.79
0.75
1.52
0.67
1.48
1.55
2.74
0.74
1.90
1.83
1.85
3.04
1.54
0.76
0.70
0.65
3.69
0.66
2.71
1.08
1.79
1.81
1.69
1.82
0.71
0.72
1.72
0.73
1.71
2.21
3.66
3.87
2.20
0.64
2.45
2.43
2.90
1.56
1.75
1.95
1.73
1.91
1.80
0.63
2.73
1.78
1.70
1.68
1.67
0.60
1.76
2.15
0.61
2.13
3.13
2.56
1.00
2.19
1.45
2.91
1.44
2.89
1.77
2.18
1.66
0.59
2.67
3.19
3.46
3.00
3.01
0.57
0.58
2.52
3.50
2.70
1.43
2.17
4.15
2.44
1.46
0.54
0.55
0.56
0.52
2.37
2.34
1.94
3.03
2.92
2.40
2.12
0.51
3.38
2.65
2.80
2.03
1.02
1.51
3.02
0.53
3.17
0.50
3.36
2.33
3.18
2.98
2.93
3.15
2.88
1.13
2.81
1.57
1.75
3.96
4.07
2.61
3.16
2.38
2.63
3.99
2.97
3.98
2.99
2.16
2.69
2.62
2.64
2.35
3.35
3.14
2.36
2.66
2.60
2.55
4.28
2.85
0.98
4.05
3.88
1.65
3.12
2.59
2.54
1.07
1.05
2.96
4.03
1.50
3.97
3.07
2.46
3.13
4.07
3.33
2.82
2.79
2.94
2.95
3.41
4.22
3.05
2.50
3.11
2.51
1.42
2.87
2.86
2.84
3.71
3.94
4.26
2.48
3.08
3.10
2.31
3.51
1.93
2.47
2.10
4.01
4.21
4.24
2.53
4.23
2.49
3.39
3.32
0.94
3.95
3.31
4.28
4.19
4.20
2.57
3.49
2.42
1.64
2.78
4.47
4.44
4.45
4.39
3.30
4.11
4.43
4.41
4.42
4.17
4.18
4.49
4.40
4.38
4.46
2.30
4.32
1.58
3.06
4.48
3.81
4.36
4.09
1.41
3.91
4.34
3.88
2.11
0.90
2.39
2.05
3.45
4.30
2.04
4.32
1.63
4.34
3.42
3.77
1.59
2.08
4.16
1.40
2.07
3.93
2.09
1.63
2.29
3.80
3.29
1.60
2.25
1.62
3.86
3.76
3.90
2.28
1.39
2.26
1.35
4.140.93
2.27
3.44
1.38
3.73
4.13 1.38
3.28
3.48
0.92 0.91
3.26
0.10
0.00
1.29
0.00
1.32
-0.10
-0.25
1.37
1.34
-0.20
1.30
-0.30
-0.50
-0.25
0.00
0.25
0.50
1.31
-0.10
0.00
0.10
0.20
0.30
-0.50
0.40
0.50
utilizando as amostras de controle () e cinco dias (). (B) Grfico de influncias
4.5.3.1.2 TE em camundongos Balb-C

O grfico de T-escores de PC1 versus PC2 (Figura 45A) referente a
anlises das amostra de controle, trs, sete e dez dias de inoculao com TE em
camundongos Balb-C, com seis variveis latentes e 97,8% da varincia explicada
na matriz X e 57,7% da matriz Y, permitiu discriminar as amostras em dois grupos.
esquerda se encontram as amostras de controle e de trs dias e direita se
agruparam as amostras de sete e dez dias, discriminando assim animais sadios e
80
doentes a partir de sete dias de inoculao. Esta discriminao explicada pelo

grfico de X-loadings de PC1 versus PC2 (Figura 45A) onde nota-se que os sinais
responsveis pela separao das amostras encontram-se principalmente na
regio de 0,89 a 1,37 ppm. Amostras localizadas mais direita do grfico de Tescores, amostras de sete e dez dias, possuem maior intensidades dos
multipletos em 0,89-0,91 e 1,28-1,32, referente aos lipdeos e VLDL e do
dubleto em 1,35 referente ao lactato.
B
1.28
0.50
0.100
1.27
0.050
0.000
0.25
1.26 0.89
0.870.88
3.26
3.24
1.25
1.18
1.25
3.88
3.71
0.86
3.51
3.73
3.48
3.91
1.24
2.01
3.46
3.77
1.20
2.74
3.66
2.22
2.00
1.16
3.69
2.02
1.99
3.93
1.22
3.81
0.84
3.28
0.96
3.90
0.85
2.75
2.76
2.04
3.86
0.94
3.22
3.80
0.83
3.42
3.63
2.84
3.68
3.61
3.58
2.80
2.73
3.38
1.56
0.82
0.95
0.70
0.67
3.62
0.74
0.69
1.98
0.71
0.60
0.55
0.57
0.53
2.82
2.03
0.98
1.01
0.79
1.14
1.15
0.68
0.61
0.56
3.83
0.80
0.81
0.78
0.64
0.65
0.66
0.63
0.59
0.54
0.58
0.50
0.51
0.52
3.32
3.39
1.12
1.13
0.77
0.75
0.76
0.73
3.59
2.21
3.82
1.55
4.09
2.79
1.11
2.85
1.57
1.02
3.03
4.26
3.76
4.05
3.54
3.17
2.81
3.95
1.08
1.09
0.72
3.57
3.35
3.19
4.28
0.99
3.44
3.33
3.45
3.20
1.06
1.92
1.17
1.97
2.70
4.07
3.18
4.11
1.00
1.07
1.93
3.96
0.97
1.96
1.54
2.71
3.88
1.91
3.87
3.05
3.78
2.72
3.64
3.16
3.36
3.30
1.03
3.56
4.05
3.01
2.69
3.12
3.29
3.14
2.38
3.37
1.05
1.04
3.97
3.02
2.20
3.13
1.94
1.95
1.77
3.41
2.19
3.11
1.45
2.66
2.78
3.94
3.99
3.98
1.79
1.80
1.83
3.06
2.99
3.00
3.65
2.65
3.67
3.15
1.81
1.82
1.84
1.85
1.78
4.26
2.11
3.07
3.08
2.37
2.62
2.63
4.01
1.76
1.73
1.86
1.75
2.17
2.18
4.43
4.45
4.46
1.53
3.74
2.57
2.53
2.59
2.60
2.90
2.64
4.07
2.88
2.67
1.58
4.03
3.70
1.52
4.38
4.39
4.41
4.47
4.49
3.10
2.39
2.36
2.61
1.43
2.33
2.86
1.90
2.15
2.13
4.48
2.98
2.92
2.89
4.30
2.07
1.89
4.36
4.40
4.44
2.97
2.96
1.44
2.91
2.68
2.55
1.72
1.71
2.16
3.53
4.42
2.93
2.94
2.54
2.40
2.35
2.87
2.24
3.50
4.16
1.88
1.70
4.24
2.12
2.49
2.95
2.50
2.51
3.31
2.05
2.14
1.51
1.67
4.34
2.31
4.22
2.47
2.48
2.52
4.21
1.69
1.50
1.66
2.56
3.55
4.13
3.79
1.68
2.46
2.42
1.48
1.65
2.34
4.23
3.04
4.19
4.20
2.44
3.23
1.42
4.18
2.30
3.38
4.17
2.45
2.43
3.84
1.46
4.30
1.64
4.28
2.77
1.47
2.29
4.15
3.75
2.38
0.93
4.32
2.41
3.40
3.43
4.32
3.25
4.14
1.63
2.25 0.90
3.49
3.52
2.10
1.59
1.21
3.21
1.41
3.27
2.09
1.40
1.63
3.92
1.60
2.08
1.62
4.09
2.28
2.27
1.19
3.89
1.39
2.261.37
1.38
3.470.92
4.13 1.38
3.72
0.91
4.11 2.23
0.00
1.31
1.35
1.29
-0.050
1.30
-0.25
1.32
-0.100
1.33
-0.50
1.34
-0.50
-0.25
0.00
0.25
0.50
0.75
0.00
0.10
0.20
0.30
0.40
0.50
utilizando as amostras de controle (+), trs dias (), sete (x) e dez dias (). (B)
Grfico de influncias (X-loadings) de PC1 versus PC2 explicando a classificao
das amostras apresentada no grfico de T-escores.
Visto que as amostras de controle e de trs dias apresentaram ficaram
sobrepostas, fez-se uma nova anlise quimiomtrica a partir da anlise anterior
81
para tentar conseguir uma separao melhor entre os dois grupos. O grfico de Tescores de PC1 versus PC2 (Figura 46A), com cinco variveis latentes e 78,3%
da varincia explicada na matriz X e 65,1% da matriz Y, mostrou melhor resultado
que por PCA (Figura 26), com as amostras de trs dias levemente mais acima e a
direita enquanto as amostras de controle ficaram mais abaixo e a esquerda, mas
ainda assim a separao entre os dois grupos foi menor sem ser possvel
identificar substncias presentes em maior intensidade em um dos dois grupos
conforme se percebe pelo grfico de X-loadings (Figura 46B).
0.30
B
1.30
1.33
0.75
0.20
1.35
1.31
0.50
0.10
1.29
0.00
0.25
1.32
-0.10
0.91
1.37
0.90
0.89
0.92
1.34
1.28
-0.20
-0.25
0.00
0.25
-0.30
-0.50
-0.25
3.50
1.38 0.883.48
2.05
2.04
2.07
1.38
2.26
3.90
1.270.93
2.08
2.03
3.26
3.25
3.24
3.28
2.25
3.93
1.26
2.27
0.87
2.10
1.39
2.02
1.60
2.09
3.80
4.15
3.43
1.59
2.28
2.11
4.14
2.24
1.62
3.76
3.56
3.84
0.98
1.58
0.97
2.78
3.88
1.63
0.94
2.77
2.81
1.40
2.79
0.96
3.44
2.12
2.80
0.99
2.82
1.57
1.25
0.95
3.59
2.01
4.13
2.29
1.00
2.84
1.01
3.05
2.86
1.41
1.06
2.85
0.86
3.73
3.41
3.86
3.68
2.13
1.50
1.04
1.93
1.63
2.87
3.57
1.15
1.05
3.95
1.03
2.76
1.02
4.16
2.30
1.13
1.56
0.72
1.14
1.16
0.70
0.71
3.61
3.81
1.07
2.00
3.66
1.12
0.69
1.08
0.50
0.53
0.68
1.11
1.09
4.30
0.54
3.75
0.52
0.57
0.73
3.94
4.32
4.32
2.35
1.64
0.51
0.56
0.55
0.67
3.71
0.79
0.77
0.78
2.33
1.55
2.73
3.53
2.15
0.63
0.60
0.61
0.66
0.64
0.75
0.76
4.11
3.33
3.36
1.50
0.58
0.59
0.65
0.80
0.81
2.88
3.35
1.42
3.62
0.74
1.22
1.25
2.44
3.29
1.47
0.82
3.96 0.00
1.54
1.53
1.51
4.30
2.38
1.43
4.13
2.22
2.31
3.32
2.39
2.13
2.16
1.18
3.06
1.86
3.02
2.74
2.37
2.14
3.03
1.24
1.88
1.89
2.21
3.17
1.65
2.69
2.46
3.79
1.52
2.75
2.36
3.70
3.07
2.47
3.58
2.42
4.34
2.45
1.84
1.85
1.80
1.90
1.72
1.73
3.19
2.34
2.20
1.44
3.78
3.37
1.48
1.76
2.63
2.64
2.65
1.45
2.17
1.94
1.77
2.88
4.09
2.70
3.10
2.53
1.66
1.67
1.91
1.82
1.70
3.97
4.28
3.16
2.62
3.30
2.50
2.48
2.19
2.49
1.98
1.83
1.68
1.79
0.83
3.31
3.18
2.66
1.99
3.11
3.12
1.46
2.43
2.18
1.69
1.95
1.81
1.71
3.14
2.60
2.61
1.97
3.63
4.36
1.96
1.78
1.75
3.15
2.59
3.77
3.01
2.72
2.57
4.34
4.01
3.65
2.51
2.54
3.08
3.00
4.11
2.89
2.55
3.39
2.71
4.07
3.13
4.17
3.99
2.38
2.91
2.52
4.38
3.91
2.90
2.40
2.92
4.47
3.51
4.43
4.48
4.49
3.98
4.46
4.39
2.95
2.93
2.99
2.94
4.44
4.45
4.42
4.40
4.23
4.24
4.03
2.67
2.96
4.05
4.01
3.67
2.41
3.38
2.97
4.41
4.22
4.18
3.69
3.64
2.98
4.26
4.21
4.19
4.28
2.56
2.68
3.54
4.05
4.20
1.20
4.09
1.17
3.04
3.55
3.63
3.88
3.46
4.07
2.23
3.20
0.85
0.84
3.38
3.87
3.52
3.42
3.82
3.74
1.92
1.19
1.21
3.21
3.23
3.92
3.22
3.45
3.27
3.72
3.83
3.40
3.89
3.47
3.49
0.00
82

Similarmente s anlises com camundongos Swiss, fez-se um novo
experimento com inoculao por cinco dias para verificar se seria possvel
diagnosticar a doena neste perodo. O resultado apresentado na Figura 47A
pelo grfico de T-escores de PC1 versus PC2, utilizando trs variveis latentes
com 85,4% da varincia da matrix X explicada e 54,1% em Y. Observa-se
discriminao entre os grupos de controle e de cinco dias aps a inoculao do
tumor, diferentemente do que ocorreu com a anlise por PCA (Figura 27). Os dois
grupos de amostras se discriminaram principalmente em PC2, localizadas mais
acima do grfico de T-escores, grupo doente, possuem maior intensidades de dois
buckets especficos, em 1,29, atribudo especialmente a VLDL e em 1,34 que
pode ser referir ao lactato, porm os buckets referentes mesma substncia em
1,33 e 1,35 se localizaram no quadrante abaixo, no qual a maior parte das
amostras pertencem ao grupo sadio. Neste mesmo quadrante em que as
amostras de controle se concentraram, os buckets com maior intensidade foram
os em 0,86 a 0,89 e 1,26 e 1,27 referentes a lipdeos e 3,25 e 3,26 ppm
referentes a -glucose. Portanto, a partir de cinco dias de inoculao possvel
boa discriminao entre amostras sadias e doentes, diminuindo o tempo de
diagnstico de sete dias, obtido na anlise por PCA, para cinco dias.
Comparando com a anlise das amostras de TE em camundongos Swiss,
os resultados foram muito similares entre as duas linhagens, sendo que a
discriminao entre os grupos de trs e cinco dias com os grupos de controle foi
melhor para os camundongos Swiss, confirmando o fato que no h influncia de
variaes genticas nas anlises.
83
B
1.34
0.150
0.25
0.100
0.050
0.000
3.47
4.143.72
4.11
3.27
3.75
3.89
3.44
4.09
3.49
4.28
4.28
2.46
3.79
2.23
4.18
2.48
3.86
2.47
2.45
3.40
4.17
3.04
3.42
3.38
4.16
4.20
4.26
3.05
4.19
4.22
2.49
2.51
4.21
3.06
4.24
4.47
4.48
4.49
4.13
2.43
3.65
2.14
4.07
4.45
2.44
1.50
2.50
3.92
2.55
4.07
4.23
4.46
2.52
3.82
3.45
1.72
3.07
4.42
2.53
2.68
4.30
4.302.24
4.43
4.44
3.08
2.56
1.71
2.94
3.98
2.15
1.70
2.98
3.10
3.95
2.17
2.54
1.75
2.16
2.95
2.96
4.01
2.39
1.73
1.92
1.69
1.68
2.97
3.13
4.09
1.66
4.39
3.12
4.05
4.41
1.67
3.11
2.92
2.60
3.15
3.16
2.22
2.57
2.93
2.90
3.97
2.61
2.89
3.94
3.96
3.99
1.90
1.78
4.38
2.99
2.63
4.03
3.87
2.41
3.14
3.03
2.59
1.76
2.88
1.91
4.40
3.00
2.38
1.77
1.89
1.79
2.40
3.18
4.32
2.86
1.80
2.13
2.88
3.43
1.81
3.01
2.21
2.62
2.65
3.17
2.85
3.77
1.65
3.29
2.67
3.20
1.58
1.88
1.48
1.47
2.66
2.64
3.19
2.87
4.13
2.18
2.19
3.33
1.94
3.81
3.02
3.67
3.31
1.57
1.59
3.30
1.95
1.82
4.36
2.20
4.34
3.35
1.83
2.91
1.85
1.86
1.64
3.21
3.83
2.37
3.32
3.36
1.96
1.84
2.34
4.11
2.25
3.91
2.69
3.37
3.74
4.32
1.60
1.45
1.46
1.50
1.44
2.38
2.36
2.31
2.30
2.33
1.56
4.15
2.35
1.42
3.88
1.63
2.42
4.34
2.70
3.78
3.51
2.27
3.66
1.97
1.43
3.38
3.84
1.41
2.84
1.62
3.88
2.12
2.26
1.98
1.63
1.51
1.55
2.29
1.40
2.71
3.46
1.37
1.39
3.22
0.50
2.75
2.28
1.99
1.52
1.54
1.93
1.53
0.55
0.51
1.13
3.50
3.23
3.80
0.52
2.72
0.58
0.53
0.57
0.56
0.54
1.04
3.68
0.59
2.82
0.60
2.00
2.76
3.71
0.61
0.64
0.63
3.39
3.28
0.75
3.70
3.93
1.07
1.03
0.65
0.76
2.11
0.74
3.76
0.77
0.72
1.05
0.81
0.79
0.78
0.80
0.73
2.10
1.38
1.06
1.38
3.90
1.08
0.82
0.97
1.02
0.66
0.71
2.74
1.09
3.69
3.41
2.81
2.77
0.67
2.01
0.83
2.80
1.00
3.48
0.70
1.11
0.84
2.08
0.98
2.05
2.73
0.68
2.09
1.12
0.99
0.96
0.95
0.69
2.79
1.01
2.02
1.13
2.78
2.07
3.73
0.94
2.03
2.04 0.90
0.91
3.26
0.93 0.92
0.85
1.35
3.25 0.89
1.29
0.00
1.32
1.28
1.33
1.31
0.86
-0.050
-0.25
0.88
0.87
1.30
1.27
3.24
1.26
-0.50
-0.25
0.00
0.25
0.50
-0.100
0.75
0.00
0.10
0.20
0.30
0.40
0.50
4.5.3.1.3 S180 em camundongos Swiss

Na anlise das amostras de controle, trs, sete e dez dias de inoculao
com S180 em camundongos Swiss o grfico de T-escores de PC1 versus PC2
(Figura 48A), utilizando quatro variveis latentes e 90,1% da varincia explicada
na matriz X e 48,6% da matriz Y, apresentou certa sobreposio entre os grupos,
porm menor do que a apresentada pela anlise correspondente por PCA (Figura
84
28). As amostras de sete e dez dias ficaram posicionadas mais a direita (Figura
48A), apresentando os sinais em 1,28-1,35, englobando lipdeos, VLDL e lactato
em maior quantidade que as amostras de trs dias e controle localizadas mais a
esquerda conforme mostrado pelo grfico de X-loadings (Figura 48B).
1.28
0.20
0.10
0.00
0.25
1.29
1.27
2.23
3.23
3.49
3.22
3.83
0.88
3.89
0.85
3.40
2.24
0.87
3.47
1.26
0.86
2.00
2.01
1.25
3.04
2.75
3.82
0.84
2.76
3.88
3.92
2.22
2.02
3.21
3.69
3.45
1.24
1.99
1.57
1.56
3.87
3.74
3.20
2.67
3.91
3.42
3.55
1.92
3.54
4.07
1.55
2.74
4.11
3.46
2.71
2.56
4.28
1.21
3.52
1.98
3.67
2.38
1.22
3.77
2.21
3.63
3.70
4.09
3.78
3.38
1.58
0.89 0.90
1.54
1.46
1.97
4.05
1.44
1.45
2.99
3.64
3.65
4.07
3.72
4.09
0.83
1.83
2.20
2.52
2.72
2.68
4.26
1.47
3.00
3.01
4.28
1.78
1.70
1.53
0.95
1.84
1.81
1.82
2.41
3.27
1.96
1.79
3.71
1.68
2.19
3.58
3.68
2.98
3.66
2.70
2.55
2.85
2.25
1.20
1.95
1.77
1.71
1.52
1.80
1.69
2.40
2.97
3.63
3.15
0.96
1.72
1.85
1.67
2.96
2.90
2.91
2.66
3.38
3.19
1.75
2.13
1.76
1.86
4.05
2.18
1.66
2.94
2.95
2.92
2.89
3.16
3.18
2.03
1.19
3.98
1.43
2.73
3.12
2.88
2.86
1.02
1.51
4.03
4.26
3.02
2.93
2.51
2.36
2.34
3.11
3.13
3.39
3.14
3.17
1.73
1.94
4.01
2.17
3.79
2.37
2.33
2.60
2.61
3.37
2.84
3.51
1.91
3.99
3.81
4.44
3.03
2.35
2.54
2.62
3.33
3.35
3.36
1.12
3.97
1.88
1.03
4.21
4.24
2.50
3.61
3.62
2.53
3.08
2.57
2.59
3.10
2.69
2.63
2.64
2.77
1.90
0.82
1.48
4.20
4.22
4.23
4.45
2.49
1.42
2.65
3.32
4.30
2.87
1.89
2.14
4.19
2.39
2.48
2.43
2.44
4.47
4.39
4.41
4.42
4.43
1.65
3.59
2.31
3.31
3.96
1.13
4.18
4.46
4.48
4.49
1.08
1.09
1.11
1.50
1.18
1.14
2.16
1.16
0.81
0.74
4.40
2.42
0.71
3.07
3.30
1.15
0.80
2.47
4.38
0.66
0.67
0.64
0.65
2.38
2.80
2.15
1.17
0.78
2.46
0.76
4.36
0.63
0.60
0.61
2.81
1.50
3.94
1.07
0.79
0.77
0.75
0.70
0.68
3.06
0.58
0.59
0.56
4.32
2.82
1.93
4.17
2.45
0.69
0.72
0.50
0.51
0.53
0.55
0.57
3.95
0.97
0.73
0.52
0.54
3.41
1.04
2.13
4.34
1.59
3.57
2.30
1.05
4.30
3.73
1.00
1.64
1.06
3.86
2.12
1.01
0.99
3.05
4.34
4.13
1.41
3.75
2.79
3.53
2.04
2.05
3.93
3.88
4.32
2.78
0.98
3.29
4.11
0.94
3.24
4.16
3.84
1.63
3.80
2.11
2.29
1.60
2.07
1.40
3.76
4.13
3.56
3.44
2.10
1.63
3.43
2.09
1.62
3.90
2.08
4.15
1.39
2.28
2.27
4.14
2.26
3.28
3.26
3.48
3.501.38
0.93 1.38
3.25
0.00
1.32
0.92 0.91
1.37
-0.10
1.34
-0.25
1.31
-0.20
1.30
1.35
1.33
-0.30
-0.50
-0.25
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
0.00
0.10
0.20
0.30
-0.50
0.40
0.50
0.60
utilizando as amostras de controle (+), trs dias (), sete (x) e dez dias (). (B)
Grfico de influncias (X-loadings) de PC1 versus PC2 explicando a classificao
das amostras apresentada no grfico de T-escores.
Seguiu-se o mesmo procedimento realizado nas anlises por PCA, fazendo
anlises entre os grupos de controle e de cada perodo aps inoculao
separadamente.
85
Comeando pelos grupos de controle e de trs dias que ficaram fortemente

sobrepostos, o grfico de T-escores de PC1 versus PC2 (Figura 49A), com cinco
variveis latentes e 84,2% da varincia explicada na matriz X e 45,0% da matriz Y,
mostrou melhor separao entre os dois grupos que a mesma anlise por PCA
(Figura 29), porm ainda menor. Analisando o grfico de X-loadings (Figura 49B),
as amostras de trs dias, deslocadas mais direita e acima, apresentaram os
sinais na regio de 3,25 a 3,26 referentes colina e/ou -glucose e em 2,24
referente ao aceto-acetato mais intensos do que as amostras de controle mais
esquerda, as quais apresentaram os sinais de lipdeos, VLDL e lactato, na regio
de 1,29-1,37, com maior intensidade.
0.75
1.35
0.20
0.50
0.10
3.25
1.37
1.33
3.26
0.25
0.00
0.88
3.48
0.89
3.28
4.14
1.26
1.27
3.50
0.87
3.76
4.15
3.93
3.24
3.90
1.380.932.11
3.29
3.80
3.94
4.16
3.56
3.43
3.44
3.27
3.86
0.92
3.95
3.73
1.38
0.99
2.12
3.51
0.94
2.10
1.01
3.88
3.91
3.77
1.39
3.84
3.57
2.13
3.81
3.96
0.97
4.13
1.40
2.80
0.98
2.81
1.25
1.50
3.75
1.50
2.82
2.79
1.06
1.00
3.97
3.74
3.05
4.17
3.71
2.09
1.41
2.29
2.78
0.95
2.08
2.84
3.06
0.90
1.51
4.13
3.30
1.48
2.15
2.14
1.07
2.07
1.42
2.46
2.45
2.16
3.41
3.78
4.18
2.13
1.05
1.04
3.79
3.99
2.30
3.59
3.61
1.89
0.96
3.98
2.73
4.34
1.52
0.86
1.43
4.36
1.93
1.90
1.02
4.34
3.58
1.53
3.53
1.73
4.38
1.11
1.08
1.22
3.62
2.47
2.44
1.15
1.14
4.19
1.13
3.88
3.87
1.91
1.09
2.85
3.31
4.24
4.20
1.75
3.32
3.03
1.54
4.22
4.23
1.12
1.03
4.01
2.74
2.31
4.40
1.16
4.21
2.48
4.39
4.41
4.42
1.94
4.03
3.54
1.63
1.64
2.39
4.26
2.17
1.24
3.33
3.07
1.17
4.43
1.88
4.05
3.42
1.72
2.33
0.69
0.70
1.18
4.48
4.49
4.44
2.43
1.47
3.35
1.44
1.76
1.75
2.28
2.57
2.49
2.35
1.65
2.38
4.45
4.47
2.05
1.63
3.68
2.34
0.71
2.37
4.46
1.25
0.00
2.86
2.69
2.59
2.53
3.08
2.36
1.55
2.18
1.77
1.71
3.36
0.50
0.51
0.53
0.68
2.50
3.70
1.20
1.86
4.32
2.87
0.54
2.52
1.67
0.55
0.57
0.52
2.72
3.66
3.10
0.67
1.66
0.58
2.60
2.56
2.70
2.54
2.42
0.72
3.63
3.02
1.45
2.88
0.56
2.65
0.66
2.19
1.95
1.85
1.69
1.21
4.05
0.59
3.39
0.60
0.61
3.11
0.65
2.51
2.20
1.70
4.30
2.64
0.63
0.73
1.19
2.21
1.68
2.66
2.61
2.62
0.64
2.38
1.96
0.91 2.27
3.37
3.13
2.63
3.12
0.74
0.76
0.77
1.97
2.77
0.75
3.01
0.79
3.04
3.45
1.78
3.55
2.71
4.28
1.84
4.32
1.56
3.38
2.55
2.93
2.95
3.69
0.78
1.79
1.62
1.98
1.80
3.14
2.92
2.94
2.97
0.81
1.81
2.75
2.89
2.68
2.90
3.67
2.96
0.80
0.82
1.82
3.65
2.67
2.91
2.40
4.30
3.64
2.98
2.99
1.83
2.04
3.63
4.07
1.46
3.00
3.46
3.92
1.99
3.15
3.52
3.16
4.28
2.41
3.17
3.18
4.07
1.57
0.83
1.92
2.76
3.49
1.60
3.38
2.22
4.09
2.00
2.03
3.19
3.82
4.11
1.58
2.01
3.72
1.59
2.02
4.11
0.84
4.09
3.20
2.26
3.40
3.83
0.85
3.47
3.89
1.28 3.21
3.22
1.34
1.31
-0.10
3.23
2.23
2.25
-0.25
-0.20
1.30
1.32
1.29
2.24
-0.75
-0.50
-0.25
0.00
0.25
-0.30
0.50
-0.40
-0.30
-0.20
-0.10
-0.50
0.00
86
O segundo conjunto de amostras englobou as amostras de controle e as de
cinco dias de inoculao. O resultado apresentado na Figura 50A pelo grfico
de T-escores de PC1 versus PC2, utilizando cinco variveis latentes com 88,2%
da varincia da matrix X explicada e 46,6% em Y com baixa discriminao entre
grupos sadio e doente, no o suficiente para um bom diagnstico com cinco dias
de tumor, diferentemente do que ocorreu com o TE inoculado na mesma linhagem
de camundongos. Analisando o grfico de X-loadings (Figura 50B), as amostras
de cinco dias, deslocadas mais direita, apresentam os sinais na regio de
1,29-1,32 mais intensos do que as amostras de controle esquerda, possuindo
assim maiores quantidades de VLDL e alguns tipos de lipdeos.
87
0.30
B
1.29
0.50
0.20
1.28
0.25
0.10
0.00
3.23
1.27
3.89
0.88
0.86
0.87
0.85
3.47
3.24
3.72
1.26
3.92
4.110.890.90
2.24
3.74
3.40
4.13
3.83
3.22
2.02
0.84
3.27
3.38
2.01
3.70
2.76
3.84
2.23
2.77
2.03
3.82
2.75
3.75
2.00
3.21
3.78
1.47
3.67
3.04
1.57
4.09
3.46
3.41
1.58
0.95
1.56
3.39
1.99
4.28
3.65
3.25
0.83
0.97
1.55
2.72
2.22
2.04
3.50
4.28
1.50
2.38
2.05
0.96
3.20
1.92
2.14
4.07
3.68
2.68
3.87
4.07
1.04
1.54
2.71
2.74
1.48
3.79
1.88
1.89
1.98
1.06
1.53
4.32
2.81
1.03
2.90
3.37
2.80
1.52
2.91
2.41
3.43
3.49
1.59
0.82
1.13
4.26
2.21
2.89
3.38
2.85
2.79
1.90
1.71
2.13
3.69
3.03
1.45
1.44
2.56
2.73
1.97
1.86
2.37
1.43
2.86
0.81
1.69
1.83
1.84
3.01
1.46
0.66
3.13
2.67
2.88
4.30
2.82
3.98
3.96
3.05
1.85
1.82
1.12
4.24
2.92
4.47
4.41
2.20
0.67
0.68
4.49
4.43
4.44
4.45
4.46
4.39
2.65
2.34
2.78
3.97
1.72
1.73
1.96
1.91
1.81
1.68
1.09
1.67
4.22
4.23
3.00
4.40
0.65
4.48
4.42
2.38
2.35
2.55
3.36
3.19
3.35
3.31
1.13
2.84
1.01
4.03
1.70
1.79
1.80
0.80
3.02
2.19
0.69
0.71
0.64
2.69
2.45
2.52
2.36
2.64
2.61
2.63
2.43
4.09
2.70
2.33
2.87
3.99
4.05
0.79
4.21
0.74
2.93
1.66
0.72
0.70
0.63
4.38
0.58
3.15
2.60
2.62
3.33
3.18
0.77
0.78
2.96
2.97
2.98
0.75
2.44
0.73
2.13
0.59
0.60
0.61
2.54
3.14
2.66
3.32
3.17
2.25
3.88
4.01
1.76
1.78
1.11
4.20
0.99
0.76
2.18
4.36
2.51
0.56
0.57
3.12
2.59
0.55
3.16
0.51
3.30
4.19
2.99
2.40
3.07
0.52
0.53
0.54
0.50
1.42
3.51
3.66
1.95
2.95
3.13
3.10
3.11
2.31
2.26
2.07
3.95
3.45
3.08
2.50
4.34
4.32
2.15
1.08
1.77
2.94
2.17
4.30
1.75
1.65
3.42
4.18
4.11
1.50
2.46
2.48
2.53
2.49
2.57
2.12
2.08
1.51
0.98
1.00
3.94
2.47
4.17
3.71
4.34
2.30
1.41
1.05
1.93
1.60
2.16
3.06
1.94
1.64
2.10
3.88
2.42
1.02
1.07
3.81
3.93
2.39
3.91
1.63
3.77
2.11
1.62
2.09
1.40
1.63
3.80
0.94
3.90
2.28
1.39 0.91
2.29
4.15
3.76
3.29
4.16
3.73
3.86
2.27
1.38
3.28
3.48
3.44
4.13
1.38
4.14 0.93
3.26
0.92
1.33
1.320.00
1.30
-0.10
-0.25
1.35
-0.20
1.31
-0.50
1.37
-0.30
-0.50
-0.25
0.00
0.25
0.50
0.75
1.34
0.00
0.10
0.20
0.30
0.40
Mais um conjunto de amostras foi analisado, incluindo as amostras de
controle e sete dias de inoculao. O resultado apresentado na Figura 51A pelo
grfico de T-escores de PC1 versus PC2, utilizando quatro variveis latentes com
85,3% da varincia da matrix X explicada e 56,9% em Y obtendo discriminao
entre grupos sadio e doente muito superior a obtida pela anlise correspondente
por PCA (Figura 31), sendo possvel obter um diagnstico de suspeita da
presena da doena neste perodo. Pelo grfico de X-loadings (Figura 51B), as
amostras de sete dias, deslocadas mais direita, tambm apresentam os sinais
na regio de 1,28-1,35 mais intensos do que as amostras de controle
88
esquerda, possuindo assim maiores quantidades de VLDL, alguns tipos de

lipdeos e lactato. As amostras de controle por sua vez apresentaram maiores
quantidades de aceto-acetato e/ou lipdeos em 2,23-2,24.
0.50
1.29
0.100
0.25
0.050
2.24
2.23
0.000
-0.050
1.30
1.28
3.47
2.25
3.89
3.72
3.52
3.92
3.23
3.83
3.84
3.74
3.46
3.40
0.90
3.49
3.41
3.50
3.43
3.55
3.75
3.87
3.45
4.07
3.82
3.27
2.02
4.07
3.70
3.78
2.01
1.58
3.42
3.38
4.28
4.09
1.57
1.46
2.26
4.09
1.59
3.53
2.22
3.21
2.00
1.92
3.88
4.28
3.79
1.83
3.04
3.54
3.63
2.03
1.82
1.56
2.76
0.85
4.03
4.05
1.81
1.84
3.00
3.20
0.84
3.98
3.99
1.70
1.68
2.98
2.99
2.68
4.01
1.71
1.78
1.80
1.69
4.45
4.49
2.41
1.47
3.01
2.97
1.99
2.91
3.19
4.32
2.75
1.03
1.79
2.94
2.95
2.96
2.92
2.55
3.39
1.72
1.85
1.98
4.44
4.46
4.47
4.48
1.67
2.93
3.02
2.90
3.64
1.75
1.96
1.77
1.97
4.41
4.42
4.43
2.40
2.51
2.21
3.63
2.89
4.30
2.77
3.97
0.80
1.95
1.76
4.26
4.39
4.40
1.66
1.45
1.55
3.18
3.15
1.93
0.82
0.83
0.81
4.23
4.21
4.22
2.19
2.20
2.38
3.10
3.11
3.13
2.62
2.63
2.66
2.67
3.17
3.67
1.73
0.77
0.78
4.24
4.19
4.20
1.86
2.18
2.14
0.74
4.38
2.43
2.49
3.62
2.54
2.60
2.61
2.56
0.61
3.12
2.64
3.14
2.88
3.16
3.65
1.90
3.96
2.13
0.79
0.96
0.97
0.76
0.75
2.50
2.37
0.66
1.44
0.64
3.08
2.52
0.63
0.58
0.59
0.60
2.65
3.31
2.86
1.88
2.17
2.48
0.73
2.36
0.72
0.65
3.07
2.59
3.38
0.54
0.55
0.56
3.37
0.50
2.72
2.87
4.30
1.60
1.91
4.36
0.68
1.54
0.71
0.67
1.65
3.58
0.57
0.52
0.53
2.71
0.51
3.59
1.09
2.15
3.88
4.18
2.47
1.53
0.95
3.71
3.03
2.35
2.33
2.34
2.70
4.32
3.22
2.85
1.02
1.12
1.89
0.69
0.70
2.53
3.32
1.08
1.05
1.52
1.43
3.69
3.56
1.11
1.94
1.20
1.13
1.51
2.45
1.16
2.44
4.34
2.42
2.57
2.31
2.69
3.35
3.30
4.17
3.90
1.14
1.50
1.15
1.48
3.66
3.95
2.16
2.46
2.39
1.17
3.61
3.68
3.36
1.00
1.07
1.04
3.93
3.77
1.64
3.33
2.04
2.74
2.84
0.89
1.21
1.18
1.19
3.05
3.91
3.94
2.30
3.73
3.81
2.73
1.42
3.86
2.13
3.06
2.81
1.62
1.22
2.82
1.06
3.80
3.48
3.57
0.86
0.98
1.63
0.88
4.11
2.05 0.91
1.63
0.99
3.76
1.41
4.11
2.80
3.44
2.12
1.50
1.24
2.79
1.01
1.25
2.78
2.28
2.08
2.07
2.29
2.10
3.29
2.11
2.27
1.27
2.09
0.87
1.25
1.40
3.28
4.16
0.94
3.51
1.39
4.13
4.15
1.26
3.24
1.38
3.25
0.93 1.38
3.26
4.14
4.13 0.92
0.00
1.32
1.31
-0.25
-0.100
1.37
1.33
-0.150
-0.50
1.35
-0.200
1.34
-0.50
-0.25
0.00
0.25
0.50
0.75
0.00
0.10
0.20
0.30
0.40
-0.75
0.50
utilizando as amostras de controle () e sete dias (). (B) Grfico de influncias
O ltimo conjunto formado pelas amostras de controle e dez dias de
inoculao, apresentou tima separao entre os dois grupos como se nota na
Figura 52A pelo grfico de T-escores de PC1 versus PC2, utilizando sete variveis
latentes com 94,6% da varincia da matrix X explicada e 80,5% em Y, sendo
possvel obter um bom diagnstico da presena da doena neste perodo. Pelo
89
grfico de X-loadings (Figura 52B), as amostras de sete dias, deslocadas mais

direita, tambm apresentam os sinais na regio de 1,28-1,35 mais intensos do
que as amostras de controle esquerda, possuindo assim maiores quantidades
de VLDL, alguns tipos de lipdeos e lactato. No caso do diagnstico da presena
de S180 em camundongos Swiss, mesmo utilizando a anlise por PLA-DA s
seria possvel um diagnstico exato aps dez dias da doena, e suspeito a partir
de sete dias, perodo j avanado da doena.
0.20
B
1.28
1.29
0.25
0.10
0.00
1.32
1.27
2.23
3.49
3.23
2.24
3.22
3.83
3.40
3.04
2.25
3.89
2.01
4.11
3.88
3.82
2.67
2.00
2.76
3.45
2.75
3.47
2.02
1.57
3.54
2.56
3.20
3.46
0.89 0.90
3.74
0.88
0.84
3.42
3.21
3.87
2.22
3.52
1.56
0.85
1.92
3.69
4.07
1.99
3.91
2.71
1.58
3.77
3.92
3.55
4.28
2.52
4.09
2.74
1.55
4.09
2.38
4.07
3.71
3.67
2.03
1.25
1.98
4.05
3.63
1.44
2.41
1.45
2.99
2.21
3.64
4.28
3.58
3.01
3.15
3.38
3.38
0.87
2.40
4.26
3.00
3.78
3.16
3.18
2.68
2.55
3.17
2.66
3.65
3.19
2.85
1.21
1.78
2.98
2.20
3.51
0.83
1.97
1.81
1.82
1.83
1.54
2.70
2.72
3.70
1.79
1.80
4.05
2.19
1.46
2.96
2.97
2.91
2.90
2.89
2.88
2.86
0.86
1.24
1.68
3.13
3.14
3.12
1.77
3.98
1.96
1.70
1.67
2.94
2.95
3.66
2.92
3.11
3.39
3.37
3.27
1.26
4.03
3.81
1.69
2.18
1.84
4.26
0.95
4.44
2.51
3.62
2.61
1.47
2.84
4.01
1.95
1.71
2.39
1.66
2.93
3.61
2.57
2.60
2.63
4.30
2.87
1.59
1.76
2.17
2.13
4.45
4.46
4.47
2.37
3.03
2.59
2.54
2.33
2.34
2.62
2.64
3.68
3.35
2.04
0.96
3.97
1.75
3.99
4.24
1.53
4.49
4.39
4.41
4.43
2.53
2.36
2.73
2.69
2.65
3.73
1.22
1.02
1.19
4.21
4.22
4.23
1.85
4.48
4.40
4.42
2.49
2.50
1.43
3.08
3.10
1.20
1.72
1.52
4.20
4.38
2.35
3.02
3.59
2.31
3.36
0.82
1.94
1.73
4.18
4.19
0.74
2.48
1.25
1.42
3.31
3.32
3.33
4.32
0.80
0.81
1.91
3.96
1.86
2.43
1.65
0.64
3.07
0.59
0.60
3.79
3.30
3.41
3.72
0.78
1.51
0.76
2.14
4.36
0.66
0.71
0.63
0.65
0.61
0.58
0.56
4.30
2.77
1.90
0.79
0.77
0.75
2.47
0.67
2.44
0.50
0.51
0.52
0.54
0.55
0.57
2.82
1.12
1.03
2.16
0.70
0.53
1.08
1.93
1.13
4.17
1.88
0.73
0.68
4.13
0.72
2.38
2.81
1.11
1.18
1.16
3.57
2.15
4.34
2.42
3.06
2.05
3.95
3.93
1.89
1.14
1.15
2.46
0.69
2.80
1.09
3.94
1.17
2.45
2.30
1.07
1.04
3.86
1.64
4.32
0.97
2.13
3.88
3.05
1.50
3.53
1.48
2.79
1.06
1.50
1.41
3.29
2.78
2.07
1.05
3.75
2.12
1.01
1.00
1.60
3.80
1.63
0.99
3.84
0.98
4.16
0.94
2.29
3.76
3.44
1.40
1.63
1.62
3.56
2.11
2.26
3.90
3.43
4.11
2.09
2.08
2.10
2.27
2.28
1.39
3.28
4.15
3.48
3.26
4.13
3.24
3.50
1.38
4.14 1.38
0.93
0.91
3.25 0.92
0.00
1.37
-0.10
1.31
-0.25
1.30
1.34
-0.20
1.35
-0.50
1.33
-0.50
-0.25
0.00
0.25
0.50
0.75
0.00
0.10
0.20
0.30
0.40
0.50
0.60
utilizando as amostras de controle () e dez dias (). (B) Grfico de influncias
90

4.5.3.2 Discriminao de acordo com o tipo de tumor

Utilizou-se o mtodo PLS-DA para a discriminao das amostras de acordo
com o tipo de tumor, TE e S180, da mesma forma feita com a anlise por PCA, a
fim de tentar otimizar os resultados. Inicialmente foi utilizado o mesmo conjunto de
amostras de trs, sete e dez dias inoculadas com os dois tipos de tumor,
similarmente ao realizado com PCA. O grfico de T-escores de PC1 versus PC2
(Figura 53A), utilizando sete variveis latentes e 97,9% da varincia explicada na
matriz X e 60,1% da matriz Y mostra que as amostras de trs dias de inoculao
de TE e S180 ficaram agrupadas juntas, visto no ser possvel diagnosticar o
tumor neste perodo para ambos os casos. H agrupamento das amostras de sete
e dez dias de inoculao com S180 mais acima e direita, e das amostras de
sete e dez dias de inoculao com TE mais abaixo e esquerda com certa
sobreposio entre eles, sendo esta menor do que a apresentada na anlise por
PCA (Figura 34).
91
0.30
B
1.30
0.50
1.33
0.20
1.350.25
1.31
1.34
0.10
0.91
0.92
1.32
1.37
3.25
1.38 0.93
3.50
2.26
2.08
1.38
3.43
1.39
3.72
2.28
3.84
2.09
1.62
3.48
2.27
2.10
3.47
4.13
3.75
4.11
1.60
1.63
3.90
0.90 2.05
2.07
3.27
3.56
3.28
1.40
3.41
3.89
3.88
3.76
3.52
3.53
2.77
1.63
3.24
3.92
0.97
3.44
3.93
2.04
2.11
3.79
1.59
4.14
4.15
2.29
2.78
1.41
3.80
0.98
4.32
2.79
3.70
3.86
0.94
1.04
3.55
2.38
3.94
0.99
1.00
1.64
1.47
3.05
3.74
1.50
0.95
1.05
2.03
4.30
4.32
0.72
4.34
2.12
1.17
3.59
3.78
1.16
1.03
0.96
1.06
1.01
3.26
2.30
3.57
1.15
1.18
3.96
1.09
1.07
3.95
1.42
0.73
0.75
0.68
0.69
1.14
1.65
0.76
0.77
3.87
2.13
1.13
1.93
1.11
1.08
2.81
3.38
0.50
0.51
0.52
0.53
0.54
0.55
0.56
0.57
0.60
0.61
0.63
3.62
3.29
0.71
0.65
0.66
0.70
0.67
1.45
0.78
0.79
2.14
0.80
0.81
3.99
2.15
1.20
4.16
1.02
0.58
0.59
3.61
0.64
3.02
2.42
0.74
4.17
3.97
1.12
2.82
2.87
3.39
3.42
3.68
4.36
2.43
1.43
2.45
1.67
3.23
1.68
1.69
1.70
3.98
1.72
0.82
1.73
2.80
3.65
3.07
3.06
2.41
4.39
4.40
2.47
2.46
1.66
4.19
4.18
4.03
1.81
1.82
1.83
4.01
2.16
1.84
1.88
1.79
1.80
1.89
1.90
1.76
1.71
1.48
3.73
0.00
2.88
3.16
3.31
3.30
3.10
2.92
2.31
2.93
3.00
3.01
4.46
2.37
2.35
4.38
4.41
2.40
2.44
2.39
2.18
1.46
4.20
4.21
4.22
4.23
2.17
1.85
1.86
1.75
1.51
1.50
4.09
3.18
3.17
3.13
3.14
2.68
2.62
2.63
2.64
2.65
3.08
2.69
2.56
2.57
2.52
3.03
2.94
2.95
2.98
2.36
2.33
4.42
4.43
4.45
4.47
4.48
4.49
2.48
2.49
4.24
1.44
4.05
1.77
1.78
1.19
1.22
3.32
2.90
2.61
2.66
3.11
2.91
2.72
2.59
2.53
2.54
2.96
2.97
2.99
2.50
2.34
4.44
2.19
1.95
1.94
1.52
2.86
4.07
3.36
3.37
3.15
2.89
3.12
3.64
3.46
2.60
3.66
2.20
4.26
2.13
1.96
1.91
4.28
3.33
3.35
3.63
2.70
2.51
3.67
3.58
1.53
0.83
1.58
3.19
2.73
3.81
1.97
2.84
4.30
3.04
2.55
1.21
3.40
3.45
2.71
2.85
3.21
1.54
4.05
1.98
1.92
1.24
4.09
3.38
2.67
3.71
3.82
0.86
2.21
2.38
0.85
4.26
3.54
3.77
1.25
4.07
3.91
0.84
2.02
3.69
3.20
1.55
3.49
3.83
3.51
1.99
1.57
4.28
1.56
2.25
2.74
2.76
4.13
2.01
2.75
3.88
2.00
4.11
2.22
1.26
3.22
0.890.88
0.87
2.24
1.29
0.00
1.27
2.23
-0.25
-0.10
1.28
-0.20
-1.00
-0.75
-0.50
-0.25
0.00
0.25
0.50
-0.60
-0.50
-0.40
-0.30
-0.50
-0.20
-0.10
0.00
utilizando as amostras de trs (), sete ( ) e dez dias () inoculadas com TE e trs
(), sete () e dez dias () inoculadas com S180. (B) Grfico de influncias (Xloadings) de PC1 versus PC2 explicando a classificao das amostras
Ento, repetiu-se a anlise retirando as amostras de trs dias dos dois
grupos. O grfico de T-escores de PC1 versus PC2 (Figura 54A), utilizando seis
variveis latentes com 97,2% da varincia explicada na matriz X e 60,0% da
matriz Y, mostra discriminao entre amostras as amostras segundo o tipo de
tumor, com certa sobreposio entre os grupos.
92
1.30
0.50
1.33
0.20
1.350.25
1.31
0.10
0.91
0.92
1.34
1.37
3.25
1.38
3.50
0.93
2.26
2.08
1.38
3.43
0.90 2.05
1.39
2.28
2.09
3.72
3.84
2.27
1.62
2.10
2.07
1.60
4.13
3.48
4.11
1.63
3.90
3.75
2.77
3.28
3.56
3.27
3.47
0.97
3.88
3.76
1.40
4.15
2.78
1.59
2.04
1.63
2.11
3.53
0.98
2.79
3.80
3.41
4.14
3.93
3.52
3.44
2.29
3.79
0.99
3.89
1.00
3.92
3.24
1.04
4.32
3.94
1.41
2.38
1.50
1.05
2.03
2.12
1.17
1.06
0.94
3.05
1.64
0.95
1.01
4.30
1.15
1.16
1.18
1.14
1.47
1.07
1.09
3.86
4.32
0.72
1.03
4.34
1.13
1.20
3.96
3.70
1.11
3.95
0.96
0.75
0.68
0.69
3.55
1.12
1.08
2.81
2.30
3.59
0.73
0.76
2.13
0.77
0.79
2.15
0.80
0.81
4.16
1.93
1.02
0.70
4.17
0.78
3.99
0.52
0.63
0.71
0.65
0.66
0.67
3.57
2.14
3.78
0.82
1.22
2.80
0.50
0.51
0.53
0.54
0.55
0.56
0.57
0.58
0.59
0.60
0.61
0.64
2.45
0.74
1.65
2.16
1.89
1.90
1.88
3.97
2.82
3.29
3.62
3.02
4.36
2.46
2.47
2.42
4.03
3.98
1.72
3.26
3.38
3.07
3.06
4.39
4.40
4.23
1.42
4.18
4.19
2.17
4.01
1.19
1.80
1.86
1.73
1.76
1.70
1.50
2.87
4.41
4.45
4.46
4.48
4.49
3.61
2.48
4.38
4.21
4.22
2.43
2.44
2.18
4.20
1.68
1.45
1.79
1.81
1.82
1.83
1.84
1.85
1.69
1.75
1.51
1.71
0.00
3.10
3.08
4.42
4.43
4.47
2.49
2.35
2.37
4.24
2.19
4.05
2.41
3.68
1.91
1.66
1.43
1.94
1.95
1.67
1.77
1.78
3.74
4.07
2.88
3.16
3.30
2.62
2.64
2.65
2.69
2.57
2.53
2.92
2.93
2.50
2.31
2.33
4.44
3.65
3.00
2.94
2.36
2.39
2.40
1.96
1.52
1.58
4.28
4.09
3.18
3.13
3.14
3.17
3.31
3.11
2.59
2.60
2.61
2.63
2.72
2.54
2.95
2.96
2.52
2.34
4.26
2.98
3.01
3.03
2.20
1.21
0.83
1.48
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2.25
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3.37
3.12
3.39
2.73
2.68
2.66
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2.97
1.97
1.53
2.13
3.36
3.15
3.32
2.89
2.90
2.70
2.56
2.51
2.99
1.44
0.86
3.66
1.46
1.24
2.84
4.30
3.64
3.58
3.81
3.67
3.35
3.33
4.05
3.63
1.98
1.25
3.73
2.85
3.19
2.55
1.54
0.85
4.09
2.71
1.92
3.04
3.38
3.23
4.26
2.67
2.21
4.07
3.21
2.38
3.46
3.42
0.84
2.02
1.55
3.82
3.45
3.77
1.57
2.24
2.76
1.99
4.28
2.75
1.56
3.40
3.71
3.91
3.69
3.54
3.20
2.74
3.51
2.01
2.00
3.83
2.22
3.88
3.49
1.26
0.890.880.87
4.11
4.13
3.22
1.32
1.29
0.00
1.27
2.23
-0.25
-0.10
-0.20
-0.75
-0.50
-0.25
0.00
0.25
0.50
1.28
-0.60
-0.50
-0.40
-0.30
-0.50
-0.20
-0.10
0.00
utilizando as amostras de sete () e dez dias (x) inoculadas com TE e sete () e
dez dias () inoculadas com S180. (B) Grfico de influncias (X-loadings) de PC1
versus PC2 explicando a classificao das amostras apresentada no grfico de Tescores.
Em seguida, repetiu-se a anlise considerando apenas as amostras de
sete dias dos dois tipos de tumor. O grfico de T-escores de PC1 versus PC2
(Figura 55A), utilizando quatro variveis latentes e 97,6% da varincia explicada
na matriz X e 75,9% da matriz Y, mostra boa discriminao entre os dois grupos
doentes segundo o tipo de tumor, com pequena regio de sobreposio, similar a
da anlise por PCA. Pelo grfico de X-loadings (Figura 55B) possvel perceber
que as amostras do grupo inoculado com S180 possuem os sinais 1,33-1,35
referentes principalmente ao lactato com maior intensidade, enquanto as
93
amostras do grupo inoculado com TE possuem os sinais em 1,28-1,32

referentes a lipdeos e VLDL com maior intensidade.
0.50
1.28
0.20
0.25
0.10
1.27
0.00
2.23
0.87
3.22
0.880.89
1.26
3.49
3.23
3.88
3.83
2.01
2.22
2.00
4.13
1.25
4.11
3.69
0.86
3.71
3.40
2.74
0.85
3.54
3.51
2.75
2.24
3.91
3.45
1.56
2.02
0.84
1.99
2.76
3.46
3.82
3.20
3.42
1.57
3.21
3.77
1.55
1.24
2.38
4.28
3.24
3.38
1.48
3.33
2.21
3.35
1.54
2.71
2.55
2.67
4.07
1.92
1.98
3.67
3.58
3.63
4.26
3.36
1.46
3.39
3.32
3.19
2.85
3.87
1.21
3.81
3.66
3.64
3.04
2.51
2.72
2.73
2.68
3.37
3.74
0.83
1.53
1.97
4.05
2.90
2.70
2.89
2.84
3.73
3.68
3.03
2.91
3.12
2.88
1.85
2.13
1.52
2.95
2.96
2.97
2.98
2.99
2.54
2.60
2.61
2.62
2.63
2.66
2.64
3.38
4.09
1.58
1.22
1.51
1.96
3.65
3.01
2.36
2.93
2.94
3.00
2.50
2.34
2.20
2.92
2.53
3.31
3.11
2.69
2.65
2.59
3.13
3.15
2.86
1.50
3.78
1.84
1.86
1.88
1.95
1.91
1.44
2.43
2.44
2.41
2.19
4.26
2.37
2.49
2.33
2.57
3.30
3.08
3.10
3.14
3.18
3.70
1.71
1.83
1.75
1.77
1.94
1.78
1.19
3.55
1.66
1.43
2.42
2.46
2.40
2.18
4.44
2.48
2.35
3.06
2.52
2.31
3.17
4.30
2.25
1.70
1.72
1.73
1.81
1.82
1.76
1.69
1.67
1.68
4.20
4.21
4.05
2.45
2.39
2.17
4.24
4.42
4.43
3.61
3.02
2.47
0.64
3.07
2.56
0.60
0.61
0.53
0.55
0.56
0.57
0.58
0.59
3.16
0.50
0.52
2.87
1.79
1.80
4.01
1.89
1.90
4.18
4.19
4.03
2.16
4.22
4.23
0.67
4.39
4.41
4.45
4.46
4.47
4.48
4.49
3.62
0.65
0.66
0.63
0.54
0.51
4.07
2.80
3.98
0.82
2.14
1.45
4.38
0.74
4.40
0.71
3.29
2.82
3.89
3.26
3.97
1.20
3.57
1.65
1.42
4.36
0.70
0.68
4.28
1.12
0.81
2.13
0.78
0.79
0.80
0.69
4.34
3.59
2.81
3.92
1.02
1.08
1.11
3.99
4.17
2.15
0.77
0.75
0.76
0.73
1.03
1.93
4.16
1.13
2.30
3.86
0.96
1.05
3.95
1.50
1.07
1.09
1.47
1.18
1.14
0.72
3.96
1.15
1.16
2.12
3.05
2.03
1.17
3.47
1.06
2.38
1.01
3.94
3.79
0.95
1.64
1.00
3.52
0.94
4.32
3.41
3.44
4.30
0.99
1.41
1.04
3.27
2.79
4.14
3.53
0.98
4.32
3.80
2.29
2.11
4.15
2.78
1.59
1.63
2.04
3.93
3.76
3.88
0.97
3.75
3.56
1.40
2.77
3.72
4.11
4.13
3.28
3.90
3.48
1.63
3.84
2.10
1.60
3.43
1.62
2.07
2.05
0.90
2.09
2.27
2.28
1.39
1.38
2.26
3.25
3.50
0.932.08
1.38
1.37
1.34
0.92
0.91
1.29
0.00
1.32
-0.10
1.31
1.35
-0.25
1.33
-0.20
-0.50
1.30
-0.50
-0.25
0.00
0.25
0.50
0.75
0.00
0.10
0.20
0.30
0.40
0.50
0.60
utilizando as amostras de sete dias inoculadas com TE () e sete dias inoculadas
com S180 (). (B) Grfico de influncias (X-loadings) de PC1 versus PC2
explicando a classificao das amostras apresentada no grfico de T-escores.
Fez-se o mesmo com as amostras de dez dias. O grfico de T-escores de
PC1 versus PC2 (Figura 56A), utilizando seis variveis latentes e explicando
94,7% da varincia na matriz X e 70,7% da matriz Y, mostra menor discriminao
94
entre os dois grupos de dez dias segundo o tipo de tumor do que as amostras de
sete dias (Figura 56A). Pelo grfico de X-loadings (Figura 56B) possvel
perceber que os mesmos deslocamentos observados nas anlises de sete dias
continuam a ser os determinantes para a discriminao entre os grupos.
2.23
0.20
1.28
0.25
0.10
0.00
1.27
4.13
4.11
3.22
3.88
3.51
3.83
2.22
3.49
3.91
4.28
3.20
3.54
3.73
3.71
2.00
3.77
1.99
4.26
2.74
2.01
3.69
3.46
2.38
3.40
4.07
4.09
0.87
3.42
1.44
3.45
2.21
3.82
4.30
1.92
3.81
4.05
1.55
2.67
1.56
0.84
3.58
4.44
3.19
4.42
4.43
4.45
4.46
4.47
2.55
3.26
1.98
2.13
3.63
4.48
4.49
1.54
4.26
3.15
3.17
3.14
1.46
4.22
4.24
3.66
4.39
3.64
2.99
2.71
2.51
3.16
1.77
4.19
4.21
4.23
2.40
4.38
4.40
4.41
2.97
2.98
2.39
3.38
2.75
1.78
1.79
1.81
4.18
4.20
1.97
1.53
3.67
4.36
4.05
2.96
3.21
2.91
3.31
2.90
3.30
3.12
2.89
2.59
2.60
3.33
4.28
1.71
1.80
1.75
1.69
1.94
1.45
1.96
1.91
1.43
3.00
3.01
1.66
1.42
2.94
2.95
2.93
2.53
2.63
2.61
2.54
3.13
1.57
0.83
1.76
3.98
1.82
1.52
1.95
1.67
4.34
2.49
3.29
2.50
2.70
2.57
3.32
3.11
2.65
2.66
3.35
2.88
3.18
4.07
3.87
1.73
4.01
1.68
4.03
2.20
2.48
2.92
3.08
2.64
2.31
3.97
1.83
1.84
1.70
3.99
2.17
2.41
2.18
2.19
1.65
3.03
2.47
2.52
2.36
3.10
2.33
2.62
2.76
3.74
1.50
1.51
4.16
4.17
3.65
3.61
3.04
2.37
2.35
2.69
2.34
2.73
2.02
1.02
1.85
1.72
2.16
0.74
3.06
3.07
2.56
3.39
3.37
3.95
1.86
1.90
2.42
3.62
2.43
2.44
2.46
4.09
1.93
2.14
1.89
3.57
0.59
2.68
3.36
3.96
0.82
2.15
1.88
0.78
3.02
2.45
0.54
0.57
0.58
2.72
0.51
4.32
2.24
1.08
3.68
0.81
0.79
0.80
0.76
0.77
0.70
0.73
0.64
0.65
0.63
0.60
0.61
0.50
0.53
2.30
4.30
0.88
1.24
1.01
1.48
0.75
3.59
0.71
0.66
0.55
0.56
0.52
2.84
3.78
1.12
0.67
1.64
0.85
3.86
1.11
1.21
0.68
0.69
1.19
2.13
4.32
2.85
0.96
1.06
1.13
3.38
2.87
1.26
3.93
1.03
1.07
1.09
1.25
0.94
1.14
0.72
0.95
1.18
3.55
1.15
1.16
2.86
1.22
3.80
3.05
1.04
1.41
0.86
1.17
2.29
1.58
3.23
1.47
2.12
2.82
0.89
3.94
1.05
2.38
2.80
0.99
3.70
1.50
1.20
3.53
2.25
4.14
1.00
3.44
1.63
0.98
3.41
2.81
3.79
3.88
3.76
3.28
1.40
3.52
4.15
2.11
2.03
3.90
3.56
3.92
0.97
1.25
2.79
3.48
3.89
2.78
1.63
2.04
1.59
3.75
3.24
3.27
3.47
3.84
1.62
2.27
1.60
2.10
2.28
2.77
1.39
4.13
3.43
2.09
4.111.38
2.07
2.05
3.72
0.93
3.50
2.26
2.08
3.25 1.38
1.37 0.90
0.00
1.32
0.92
1.34
0.91
1.35
1.31
-0.25 1.29
-0.10
-0.20
-0.50
1.33
-0.25
0.00
0.25
0.50
0.00
1.30
0.25
0.50
utilizando as amostras de dez dias inoculadas com TE () e dez dias inoculadas
com S180 (). (B) Grfico de influncias (X-loadings) de PC1 versus PC2
explicando a classificao das amostras apresentada no grfico de T-escores.
Fez-se a mesma anlise apenas com as amostras de cinco dias, e o
resultado mostrado no grfico de T-escores de PC1 versus PC2 (Figura 57A),
utilizando trs variveis latentes e 52,9% da varincia explicada na matriz X e
32,8% da matriz Y, baixos valores de varincia explicada, alm de mostrar grande
sobreposio
entre
os
95
dois
grupos
doentes,
embora
menor
que
na
correspondente anlise por PCA (Figura 38).
1.32
1.34
1.31
0.50
1.30
0.25
1.29
0.00
1.19
0.25
1.37
1.28
1.20
0.90
0.91
3.58
3.57
3.59
1.18
0.92
1.38
1.17
3.61
1.27
1.38
0.89
2.05
1.22
2.24
2.25
2.04
2.27
2.26
2.03
3.49
1.60
1.59
2.07
1.39
2.08
1.62
0.93
3.55
1.58
4.11
2.02
2.28
3.512.09
1.63
2.23
4.09
3.62
1.57
1.40
2.77
3.22
2.76
1.26
0.88
2.78
2.01
4.30
2.29
1.63
3.27
3.40
2.75
2.79
3.47
3.29
3.45
4.32
4.30
2.80
3.69
4.11
1.24
1.56
4.28
0.94
1.41
2.84
4.13
3.63
3.20
3.56
2.81
2.85
2.86
3.21
2.10
2.82
4.32
2.87
3.67
4.09
3.37
3.63
3.38
2.88
3.19
3.72
3.44
3.38
3.35
3.36
2.74
1.25
3.91
3.54
2.30
3.17
3.18
2.55
2.89
0.50
0.51
0.54
0.55
2.68
3.04
3.30
3.15
0.52
0.53
0.56
2.00
1.64
3.33
3.12
2.66
2.64
4.28
2.67
2.22
0.60
3.82
3.23
3.88
3.42
4.34
3.31
3.32
2.70
2.63
2.71
0.57
0.58
0.59
2.90
2.72
3.66
2.38
2.60
2.62
3.13
0.61
3.65
1.42
3.13
3.14
2.61
2.51
3.16
2.59
0.63
0.64
0.65
3.83
3.77
2.57
2.31
1.47
3.11
2.54
1.55
2.91
1.16
0.66
0.67
3.64
2.53
3.10
3.08
2.43
2.92
2.65
0.71
3.89
3.81
3.06
3.02
1.50
3.39
0.72
2.39
3.07
2.50
3.00
2.97
0.73
0.74
0.70
0.68
2.49
1.65
2.94
2.95
2.34
2.99
2.93
2.21
4.07
2.98
0.69
2.36
2.96
2.40
1.99
2.33
1.43
1.54
2.69
2.73
2.52
0.75
2.56
2.41
0.84
1.51
2.47
4.43
4.44
4.46
4.47
2.48
4.48
4.49
4.42
2.35
4.45
2.20
1.15
0.76
2.38
4.16
3.86
2.11
4.36
3.87
1.66
4.41
2.37
2.19
4.40
2.45
1.14
0.77
1.46
1.44
4.39
3.71
1.53
0.78
0.79
3.68
3.70
3.52
4.38
2.18
2.44
1.98
0.80
0.83
1.45
4.23
4.24
4.26
1.86
3.01
1.13
0.81
2.12
1.94
2.42
4.20
1.52
2.46
1.12
0.82
2.16
4.21
4.05
1.95
1.68
4.22
1.85
1.67
1.97
4.14
1.02
4.18
2.17
2.13
1.70
4.19
1.96
1.83
1.84
2.14
4.03
1.81
3.79
3.03
1.82
3.74
0.85
4.17
4.01
1.78
1.80
1.11
1.00
1.92
1.08
1.79
1.88
3.46
1.03
1.77
1.69
1.89
3.92
1.76
1.09
3.53
1.72
0.95
3.94
1.75
0.87
1.75
3.98
3.99
1.71
1.07
1.91
1.04
4.13
1.90
3.73
1.05
0.86
3.26
3.96
0.96
1.73
3.78
0.98
3.97
1.93
3.25
2.15
1.48
3.95
1.06
0.97
1.50
3.05
3.24
3.75
3.88
3.43
4.15
3.41
3.76
3.80
0.99
1.01
3.28
3.93
3.84
3.48
3.90
-0.25
3.50
-0.25
0.00
0.25
1.21
-0.50
-0.25
0.00
1.33
0.00
1.35
0.25
utilizando as amostras de cinco dias inoculadas com TE () e cinco dias
inoculadas com S180 (). (B) Grfico de influncias (X-loadings) de PC1 versus
PC2 explicando a classificao das amostras apresentada no grfico de Tescores.
4.5.4 PCA versus PLS-DA

Para as anlises de espectros de RMN de 1H de soro sanguneo obtidos a
partir de camundongos Swiss e Balb-C inoculados com TE e S180 e grupos de
96
controle, o mtodo PLS-DA mostrou melhores resultados do que o mtodo de

PCA. Esta superioridade j era esperada visto que o mtodo de PCA um
mtodo no supervisionado em que cada uma das componentes principais (PC)
detecta as direes de maior varincia na matrix de dados X, enquanto que o
PLS-DA um mtodo supervisionado em que no qual se fornece dados
identificando as amostras que otimiza a separao entre os grupos por rotacionar
os componentes do PCA de forma a obter o mximo de separao entre as
classes.
Os resultados obtidos esto resumidos na Tabela 5. Pelo mtodo PLS-DA
foi possvel diminuir o tempo de diagnstico de sete para cinco dias aps a
inoculao para TE em camundongos Swiss e Balb-C, tornando o diagnstico
mais precoce. Em relao ao S180, embora o tempo de diagnstico mais preciso
foi o mesmo para os dois mtodos, porm no mtodo de PLS-DA possvel
conseguir um diagnstico suspeito no perodo de sete dias aps a inoculao.
Optou-se ento pelo mtodo PLS-DA para os testes subseqentes,
incluindo a construo dos modelos. No entanto, importante ressaltar que o
mtodo PLS-DA apresenta limitaes no que diz respeito predio de amostras
que no estejam englobadas em nenhum dos grupos usados para a anlise. Por
exemplo, nas anlises feitas neste estudo utilizou-se amostra obtidas em trs,
cinco, sete e dez dias aps a inoculao do tumor. Caso fosse necessrio prever
amostras de um perodo diferente dos utilizados, o modelo poderia apresentar
dificuldades para prediz-la corretamente, podendo acarretar em falsos positivos
ou negativos. Neste sentido o mtodo de PCA apresenta maior flexibilidade, pois
por se tratar de um mtodo no supervisionado as amostras no so identificadas
como acontece para a realizao do PLS-DA.
Tabela 5: Resumo dos resultados das anlises quimiomtricas obtidos a partir
das duas linhagens de camundongos com os tumores TE e S180.
Tumor
Camundongo
Diagnstico de suspeita da presena do
tumor (dias)
Diagnstico da presena do tumor (dias)
TE
Swiss
PCA
5
PLS-DA
--PCA
7
PLS-DA
5
TE
Balb-C
----7
5
S180
Swiss
--7
10
10
4.6
97
Avaliao de efeitos externos nas anlises
4.6.1 Avaliao do efeito do ambiente sob a resposta fisiolgica do

camundongo
Por causa da impossibilidade de continuar os experimentos em Itaja,
aonde vinham sendo realizados at ento, foi necessrio trazer os camundongos
e a metodologia para Curitiba. Devido a mudanas no ambiente foi necessrio
fazer um novo grupo de controle. Os possveis efeitos desta mudana na resposta
do organismo dos camundongos foram avaliados atravs de uma anlise
quimiomtrica por PLS-DA entre com os grupos de controle de Itaja e Curitiba. O
grfico de T-escores de PC1 versus PC2 (Figura 58A), percebe-se que h certa
separao entre os dois grupos, com pequena sobreposio. Desta forma,
preferiu-se no misturar as amostras obtidas em Curitiba com as obtidas em Itaja
para evitar resultados equivocados, por isso as anlises de amostras de cinco
dias de inoculao de todos os grupos, realizadas em Curitiba, foram feitas
separadamente das demais realizadas em Itaja. Isto significa que no seria
possvel um modelo universal, que servisse para qualquer populao,
principalmente no caso dos humanos em que as variaes de ambiente,
alimentao e hbitos so muito maiores.
98
0.40
1.29
1.32
0.30
0.25
1.28
2.24
3.23
0.20
0.10
2.23
0.85
3.22
0.86
1.27
2.25
3.49
3.89
1.25
1.25
0.87
3.47
0.84
3.72
1.260.90
3.21
0.88
3.83
2.02
3.40
3.52
2.01
3.92
1.24
2.03
2.76
3.74
3.20
3.82
4.09
0.89
2.00
2.75
2.77
4.11
2.04
3.46
0.83
3.55
2.22
3.38
1.57
3.88
3.91
1.58
3.45
2.05
3.67
1.56
3.69
1.99
1.46
1.47
3.27
3.54
4.09
3.63
1.45
1.59
1.55
3.70
0.82
2.41
0.96
3.87
1.92
3.42
2.40
3.17
3.19
0.95
2.74
4.07
1.83
3.04
3.00
3.38
3.64
1.82
4.07
3.18
4.28
2.71
2.72
0.81
1.81
1.98
1.84
2.91
2.90
2.21
2.89
1.54
0.80
1.80
2.98
2.99
2.68
1.44
3.24
0.74
1.68
1.16
0.66
2.92
3.15
2.67
3.16
2.79
0.78
1.79
1.70
2.96
2.97
4.28
1.03
1.17
1.13
0.65
1.85
1.86
1.14
0.67
0.68
3.01
2.20
2.88
1.53
3.37
2.86
2.85
1.02
0.79
1.78
0.77
0.76
0.75
2.94
0.73
1.69
0.71
0.72
0.63
0.64
1.66
4.11
2.87
2.80
2.26
3.51
2.95
1.12
2.93
2.19
1.67
0.70
0.60
1.15
0.69
2.78
4.05
1.97
0.58
0.59
0.61
2.55
0.56
1.04
3.02
2.70
1.43
2.81
0.55
2.38
3.14
1.52
3.36
1.60
1.96
1.09
1.11
2.18
1.71
0.57
3.12
2.66
2.61
2.63
2.64
1.65
2.34
3.35
0.97
2.84
3.71
1.72
0.53
0.54
2.62
0.51
0.52
3.65
2.37
2.33
4.32
3.33
2.82
1.77
1.08
3.39
3.13
0.50
2.36
2.65
2.43
2.35
2.73
1.42
4.03
1.76
2.51
1.88
3.10
3.11
2.60
3.03
1.51
2.07
4.01
1.19
4.47
3.78
2.56
3.32
3.31
1.00
4.46
3.63
4.39
2.54
2.59
4.30
1.50
1.64
1.95
4.26
4.48
4.49
4.44
4.45
4.40
3.08
2.52
2.69
2.38
2.31
2.08
3.98
4.22
4.23
4.43
4.41
4.38
2.50
2.13
3.07
1.21
3.99
1.75
4.20
4.21
4.24
2.17
4.42
2.53
1.89
4.32
1.94
2.49
1.73
4.36
1.63
1.41
1.62
4.19
2.57
3.68
1.05
1.90
1.91
4.34
2.44
2.39
2.30
1.07
3.06
2.14
3.30
0.98
1.22
3.81
3.79
2.48
3.66
1.06
0.94
1.63
3.77
3.97
3.96
3.94
2.45
4.34
4.18
2.47
2.16
2.42
1.48
2.13
2.09
3.53
2.46
2.12
0.99
4.17
3.62
2.10
1.40
3.58
1.18
3.29
3.75
2.15
1.01
2.29
1.93
3.61
3.95
3.84
2.28
3.86
2.27
3.41
3.05
1.50
1.39 0.91
2.11
3.88
3.43
3.44
3.73
3.564.13
3.57
1.38
3.59
4.16
0.93
3.80
1.20
3.93
0.92
3.76
3.90
4.15 3.25
1.38
3.50
4.13
3.48
3.28
3.26
4.14
0.001.30
1.31
1.34
1.37
-0.25
0.00
1.33
-0.50
-0.10
-0.20
-0.75
1.35
-0.30
-0.50
-0.25
0.00
0.25
0.50
0.75
0.00
0.10
0.20
0.30
0.40
utilizando as amostras de controle de Curitiba () e Itaja (). (B) Grfico de
amostras apresentada no grfico de T-escores.
4.6.2 Avaliao do efeito da dieta na resposta do camundongo

Tendo em vista que a dieta tem efeitos diretos na composio do soro
sanguneo, fez-se o experimento de cinco dias de inoculao com TE em
camundongos Balb-C tambm em jejum, junto com um respectivo grupo de
controle tambm mantido em jejum por 12 horas antes da retirada das amostras
de sangue.
99
O resultado apresentado na Figura 59A pelo grfico de T-escores de PC1

versus PC2, onde PC1 explica 70,3% da varincia e PC2 15,5%, totalizando
85,8% da varincia total, com trs variveis latentes e 83,3% da varincia
explicada na matriz X e 66,9% da matriz Y. Comparando-se com grfico de Tescores das amostras correspondentes dos grupos que tiveram alimentao
normal (Figura 47), observa-se que as amostras dos grupos com jejum
apresentaram maior separao entre grupos doentes e sadios, porm uma
amostra do grupo doente foi classificada junto com as amostras de controle. Pelo
grfico de X-loadings (Figura 59B) percebe-se, no entanto, que os sinais de
1,28-1,32 referente aos lipdeos e VLDL continuam a estar em maior quantidade
nas amostras do grupo com tumor, mostrando que isto ocorre independentemente
da dieta dos camundongos. Por sua vez, as amostras de controle ficaram
separadas em dois grupos, apresentando os sinais em 1,34 e 1,37 em maior
quantidade, estes deslocamentos so dominados pelo lactato, porm deve haver
outro sinal sobreposto influenciando a anlise, talvez algum tipo de lipdeo, pois
os demais sinais referentes ao lactato em 1,33 e 1,35 esto indicados como em
maior quantidade nas amostras de cinco dias. Porm no foi possvel explicar a
separao entre as amostras de controle de acordo com algum parmetro
observvel, pois estavam todos na mesma gaiola e eram todos camundongos
fmeas.
100
0.50
1.29
0.200
1.37
1.34
2.24
4.11
3.72
3.23
3.27
3.47
3.89
0.90
3.38
3.49
0.85
1.27
1.50
2.25
3.92
3.74
0.84
4.09
3.25
2.23
3.67
4.13
3.82
2.02
2.01
3.43
3.29
2.75
2.43
0.83
3.22
3.91
1.47
3.04
0.97
3.21
1.58
2.03
3.94
3.79
2.00
0.89
1.57
2.76
2.05
2.68
1.59
0.86
2.41
3.20
2.45
0.95
3.81
0.82
3.65
3.38
3.40
3.06
1.99
2.72
0.80
0.81
0.59
4.28
2.85
3.75
2.77
0.57
0.58
2.74
2.22
0.88
1.51
0.79
0.71
0.75
2.70
0.67
0.61
0.55
0.64
0.65
0.56
4.28
1.56
2.34
1.06
1.04
3.00
0.72
0.76
0.63
0.54
0.66
0.60
0.77
0.74
0.50
0.51
0.52
0.53
3.17
3.19
1.00
3.02
0.78
0.73
0.68
3.18
3.37
2.71
3.78
2.04
2.14
0.70
4.07
2.98
3.13
2.86
1.60
1.72
1.13
2.99
1.03
0.69
3.12
1.98
3.15
2.89
2.84
0.87
1.09
1.70
1.68
1.12
3.07
2.96
2.55
2.21
3.14
2.88
2.90
2.80
1.96
1.92
3.10
1.97
3.13
2.97
1.88
1.89
3.01
2.65
0.96
3.35
4.09
3.16
1.55
4.07
2.87
4.32
3.70
4.16
1.11
2.95
3.11
1.86
1.66
1.67
3.33
2.66
2.64
0.99
2.67
2.91
2.82
1.13
2.81
1.02
1.94
2.49
1.75
1.95
2.50
1.73
3.08
2.59
1.90
1.71
1.69
2.60
2.37
3.31
2.61
2.62
3.36
4.30
2.38
2.27
4.17
2.47
4.20
2.57
2.53
2.36
1.78
2.19
1.82
2.51
2.54
1.65
2.93
2.30
2.63
2.08
3.96
1.08
2.18
1.77
1.79
1.80
1.81
4.26
2.94
2.12
2.13
1.83
1.84
1.85
2.20
1.62
1.07
0.98
4.01
4.24
4.22
1.91
1.76
3.30
2.31
1.53
3.03
2.92
2.52
2.33
2.79
2.26
4.23
4.03
4.42
4.43
4.44
4.48
4.49
4.39
1.52
2.38
3.32
1.54
2.56
2.78
4.19
4.21
4.46
4.47
3.45
1.45
3.87
2.16
3.98
4.38
4.05
4.45
2.40
1.46
0.94
1.64
1.63
3.51
3.99
4.40
4.41
1.44
1.43
2.07
4.18
2.17
4.36
1.42
2.10
4.32
1.63
2.09
1.26
4.34
1.01
1.41
3.88
3.69
1.05
2.48
2.35
2.13
2.28
3.97
2.73
2.39
1.39
1.38
2.29
2.69
3.83
1.40
2.11
1.93
3.42
3.95
0.91
2.46
3.84
3.68
1.38
3.86
2.44
3.39
2.42
2.15
3.46
3.77
3.66
3.05
1.48
0.92
3.88
0.93
3.71
3.44
1.50
4.14
4.15
4.11
3.41
3.80 3.50
3.76
3.93
3.90
3.28
3.73
4.133.48
3.24
3.26
0.100
0.000
0.25
1.28
1.32
0.00
1.31
1.30
-0.25
-0.100
-0.50
1.35
-0.75
-0.50
-0.25
0.00
0.25
-0.200
0.50
1.33
-0.25
0.00
0.25
-0.75
0.50
utilizando as amostras de controle () e cinco dias () aps a inoculao com TE
dos animais mantidos em jejum de 12h. (B) Grfico de influncias (X-loadings) de
de T-escores.
Fez-se uma anlise incluindo as amostras de controle e com cinco dias de
TE dos grupos com e sem jejum para verificar diferenas entre estes. A Figura
60A mostra o resultado pelo grfico de T-scores de PC1 versus PC2, onde PC1
explica 70,1% da varincia e PC2 13,1%, totalizando 83,2% da varincia total,
com duas variveis latentes e 80,0% da varincia explicada na matriz X e 36,6%
da matriz Y. Observa-se grande sobreposio de todas as amostras, evidenciando
no haver grande efeito causado por dieta normal ou jejum no soro sanguneo, e
101
comprova-se que a alimentao no causou mudanas significativas que possam

mascarar os resultados obtidos.
B
1.33
0.30
0.25
0.20
2.24
1.35
4.13
3.23
4.11
3.50
3.89
3.84
0.85
3.74
3.41
3.92
3.75
3.72
3.47
0.86
3.83
3.43
0.84
3.78
3.70
3.46
3.22
2.38
3.40
3.38
3.88
3.21
3.82
1.48
3.67
3.05
2.00
0.97
3.39
0.83
3.27
2.01
3.90
3.66
3.68
1.28
1.99
2.75
2.14
2.72
2.23
0.95
2.68
1.89
3.79
3.65
4.09
1.50
0.82
0.87
3.93
1.72
1.71
3.87
1.47
0.99
1.98
2.56
2.76
1.06
0.81
3.20
1.73
1.88
0.96
1.91
1.90
1.69
1.04
1.01
1.70
2.45
1.97
0.80
2.71
1.76
2.13
1.86
0.79
2.90
2.22
2.02
1.92
1.79
1.81
1.82
1.68
1.84
0.77
3.04
3.01
4.11
4.15
1.78
1.96
1.85
1.50
1.03
1.67
0.78
0.75
0.76
3.03
0.64
0.65
0.66
3.19
3.96
1.75
3.98
1.80
1.83
1.66
3.48
3.00
2.52
0.67
2.91
1.95
1.93
0.74
3.13
0.59
3.16
2.67
2.89
3.97
3.99
1.77
2.43
4.26
2.98
2.99
4.07
3.71
0.72
2.92
2.69
0.68
0.63
2.65
2.33
0.57
0.58
0.60
0.61
4.28
3.18
4.01
1.09
2.41
3.02
2.97
2.21
0.73
2.93
2.63
2.73
4.03
1.12
2.13
1.13
2.96
1.65
0.53
3.14
0.55
0.56
0.50
4.07
3.95
4.22
4.23
4.24
2.44
2.61
1.54
1.43
0.51
3.15
2.70
0.52
1.55
2.46
4.21
4.05
2.19
1.45
3.08
2.95
2.20
3.07
1.53
1.44
0.69
0.70
0.71
3.12
2.60
2.55
2.64
2.62
3.17
0.54
2.88
2.74
4.28
2.25
1.11
2.40
1.46
2.94
1.52
2.66
1.56
2.77
1.08
3.10
2.59
2.37
3.35
3.38
4.19
2.15
2.51
2.54
3.11
3.37
2.88
1.57
2.48
2.38
1.42
3.36
2.10
4.20
2.18
4.43
4.45
4.46
4.49
2.50
2.35
3.33
3.51
1.13
4.42
4.44
4.47
4.48
4.39
1.64
2.85
1.94
4.41
2.12
2.31
3.31
2.87
2.86
3.94
2.16
4.40
2.34
0.94
3.32
2.17
4.38
2.53
3.69
3.80
2.36
2.30
4.09
4.32
2.47
1.05
0.98
2.49
4.36
4.30
4.17
4.18
1.07
1.41
2.42
2.57
4.30
4.34
3.30
1.58
3.42
3.45
2.84
1.02
1.00
1.51
1.63
3.81
2.80
3.76
4.34
2.03
4.32
3.88
2.11
3.06
2.81
2.79
2.82
1.26
2.29
1.59
3.91
2.78
3.73
1.63
1.27
1.40
2.05
3.77
1.62
3.24
1.60
2.04
2.28
2.09
0.88
3.86
2.08
2.39
1.39
2.26
3.49
2.07
4.16
3.28
3.29
2.27
0.93
3.25
3.44
1.38
4.13
4.14
0.89 0.90
1.38
0.92
0.91
3.26
0.10
0.00
1.29
0.00
1.32
-0.25
-0.10
1.31
1.30
1.37
-0.50
-0.20
1.34
-0.75
-0.50
-0.25
0.00
0.25
0.50
0.75
-0.10
0.00
0.10
0.20
0.30
0.40
0.50
utilizando as amostras de controle () e cinco dias () aps a inoculao dos
animais mantidos em jejum de 12h e controle (x) e cinco dias () inoculadas com
TE com alimentao normal. (B) Grfico de influncias (X-loadings) de PC1
versus PC2 explicando a classificao das amostras apresentada no grfico de Tescores.
4.6.3
102
Comparao de anlises obtidas em espectrmetros de RMN de

diferentes campos magnticos
Todos os espectros utilizados na discriminao entre os diferentes grupos
foram obtidos no espectrmetro de RMN Bruker Avance 400 de 9,4 Tesla.

Fizeram-se as anlises das amostras de cinco dias de inoculao de tumor de
Ehrlich e Sarcoma 180 e do grupo de controle respectivo tambm no
espectrmetro de RMN Bruker DRX 200 de 4,7 Tesla, com os mesmos
parmetros de anlise utilizados no equipamento de 9,4 Tesla, o que exigiu
aproximadamente 40 minutos, praticamente o dobro tempo necessrio para
aquisio no espectrmetro de 9,7 Tesla, com a finalidade de comparar os
resultados obtidos nos dois equipamentos.
O grfico de T-scores de PC1 versus PC2 da anlise do conjunto de
amostras analisadas no espectrmetro de 4,7 Tesla, sendo grupo de controle e de
cinco dias aps inoculao com tumor de Ehrlich, apresentado na Figura 61A,
onde PC1 explica 47,9% da varincia total e PC2 38,9%, somando 86,8%,
utilizando trs variveis latentes e varincia explicada na matriz X de 79,58 e da
matriz Y 30,6%, permitiu baixa discriminao das amostras dos dois grupos, com
as amostras de cinco dias mais direita e de controle mais a esquerda. Pelo
grfico de X-loadings (Figura 61B) nota-se que os sinais na regio de 1,28-1,31
referentes aos lipdeos e VLDL apresentam maior intensidade no grupo doente,
similarmente ao apresentado nas anlises no espectrmetro de 9,7 Tesla. Porm
a discriminao foi muito inferior a obtida pela anlise com os espectros obtido no
espectrmetro de RMN de 9,7 Tesla (Figura 44).
103
B
2.24
0.50
0.50
0.25
0.25
2.25
4.48
4.49
4.47
4.45
4.46
4.44
4.11
4.43
4.42
4.41
4.40
4.39
4.38
4.14
4.17
4.38
4.28
4.30
4.36
4.30
4.23
4.26
4.24
4.13
4.22
4.34
4.36
4.32
4.21
4.34
4.20
4.19
3.94
3.88
3.68
4.07
4.18
4.16
4.07
4.01
4.03
3.80
3.97
3.99
3.93
3.98
4.05
3.77
3.92
3.91
3.72
4.09
3.65
3.88
3.50
3.81
3.96
3.67
3.74
3.83
3.87
3.44
4.09
3.36
3.71
4.13
3.95
3.86
3.66
2.26
3.20
3.70
3.76
3.29
3.32
3.35
3.33
2.41
3.39
3.41
3.38
3.24
3.46
3.10
2.67
3.21
3.23
3.11
3.13
3.04
3.15
3.37
3.79
2.56
2.89
2.62
2.57
2.64
3.31
3.73
3.01
3.12
2.65
3.16
3.08
2.55
2.49
2.63
2.45
2.87
2.86
2.85
3.43
2.93
2.92
2.61
3.02
2.90
3.84
2.98
2.91
3.14
3.17
2.36
3.28
3.18
2.84
2.72
4.15
2.59
2.48
3.27
2.97
2.54
2.44
2.66
2.71
3.89
3.07
3.00
2.60
3.13
2.37
2.88
2.69
2.70
3.19
2.73
3.06
2.52
2.94
2.95
2.75
4.11
3.38
2.51
2.99
2.53
3.03
2.82
2.81
3.90
2.96
2.68
2.35
2.74
3.22
3.05
2.46
2.40
2.33
2.38
2.50
2.34
2.80
2.79
3.82
2.47
1.13
2.76
3.75
2.43
3.51
2.27
2.77
3.40
2.31
2.29
3.49
2.38
2.78
2.30
2.28
2.42
1.92
2.14
2.39
1.84
3.48
3.30
1.79
1.80
1.83
0.51
0.52
3.69
1.82
1.86
1.85
0.56
0.53
1.78
1.88
2.18
0.55
1.46
1.50
1.81
0.50
0.57
0.54
3.78
1.77
2.17
1.89
1.91
0.59
1.90
1.72
1.76
1.70
2.19
2.13
0.66
0.58
0.60
1.71
1.69
0.65
2.16
1.73
2.15
0.64
2.21
0.63
2.20
0.61
1.96
1.68
1.95
1.67
0.69
1.98
1.75
0.67
1.50
1.97
0.68
0.70
0.71
1.66
2.13
0.72
1.45
1.99
3.42
1.93
1.94
2.12
1.44
1.53
1.03
1.54
2.22
1.63
1.47
0.75
0.76
1.65
2.00
0.73
0.74
0.77
1.64
1.43
2.01
1.52
1.06
2.11
1.55
1.56
1.58
3.45
0.78
0.79
0.81
2.10
0.80
1.42
1.63
1.62
2.09
1.48
1.60
1.01
1.59
2.08
1.07
1.57
1.51
1.11
1.13
0.82
0.83
2.02
2.04
2.07
1.09
1.12
1.41
2.03
0.84
2.05
1.00
3.25
1.40
1.05
2.23
0.98
0.97
1.02
1.08
0.85
3.47
0.96
0.86
1.39
3.261.04
0.99
0.95
0.94
0.870.90
1.38
0.93
0.88
0.891.26
0.92
0.91
1.27
0.00
1.38
1.35
0.00
1.32
1.28
1.29
1.34
-0.25
1.31
1.30
-0.25
1.37
1.33
-0.50
-0.25
0.00
0.25
0.50-0.50
-0.10
0.00
0.10
0.20
0.30
0.40
utilizando as amostras de controle () e cinco dias () cujos espectros foram
obtidos no espectrmetro de 4,7 Tesla. (B) Grfico de influncias (X-loadings) de
de T-escores.
O grfico de T-scores de PC1 versus PC2 da anlise do conjunto das
amostras analisadas no espectrmetro de 4,7 Tesla, sendo de grupo de controle e
de cinco dias aps inoculao com Sarcoma 180, apresentado na Figura 62A,
onde PC1 explica 44,6% da varincia total e PC2 18,1%, somando apenas 62,7%,
utilizando dois variveis latentes e 47,9% da varincia explicada na matriz X e
apenas 38,9% da matriz Y, apresentou grande sobreposio das amostras dos
dois grupos, ainda pior do que as amostras analisadas em campo de 9,4 Tesla
(Figura 50).
104
B
2.24
0.50
0.50
0.25
0.25
2.25
4.48
4.49
4.47
4.45
4.46
4.44
4.11
4.43
4.42
4.41
4.40
4.39
4.14
4.17
4.38
4.28
4.30
4.36
4.30
4.23
4.26
4.24
4.32
4.13
4.22
4.34
4.36
4.21
4.34
4.20
4.19
3.94
3.88
3.68
4.07
4.18
4.16
4.07
4.03
4.01
3.80
3.97
3.99
3.93
3.98
4.05
3.77
3.92
3.91
3.72
4.09
3.65
3.88
3.50
3.81
3.96
3.67
3.74
3.83
3.87
3.44
4.09
3.36
3.71
4.13
3.95
3.86
3.66
2.26
3.20
3.70
3.76
3.29
3.32
3.35
3.33
2.41
3.39
3.41
3.38
3.24
3.46
3.10
2.67
3.21
3.23
3.11
3.13
3.04
3.15
3.37
3.79
2.56
2.89
2.62
2.57
2.64
3.31
3.73
3.01
3.12
2.65
3.16
3.08
2.55
2.49
2.63
2.45
2.87
2.88
2.86
2.85
3.43
2.93
2.92
2.61
3.02
2.90
3.84
2.98
2.91
3.14
3.17
2.36
3.28
3.18
2.84
2.72
4.15
2.59
2.48
3.27
2.97
2.54
2.44
2.66
2.71
3.89
3.07
3.00
2.60
3.13
2.37
2.69
2.70
3.19
2.73
3.06
2.52
2.94
2.95
2.75
4.11
3.38
2.51
2.99
2.53
3.03
2.82
2.81
3.90
2.96
2.68
2.35
2.74
3.22
3.05
2.46
2.40
2.33
2.38
2.50
2.34
2.80
2.79
3.82
2.47
1.13
2.76
3.75
2.43
3.51
2.27
2.77
3.40
2.31
2.29
3.49
2.38
2.78
2.30
2.28
2.42
1.92
2.14
2.39
1.84
3.48
3.30
1.79
1.80
1.83
0.51
0.52
3.69
1.82
1.86
1.85
0.56
0.53
1.78
1.88
2.18
0.55
1.46
1.50
1.81
0.50
0.57
0.54
3.78
1.77
2.17
1.89
1.91
0.59
1.90
1.72
1.76
1.70
2.19
2.13
0.66
0.58
0.60
1.71
1.69
0.65
2.16
1.73
2.15
0.64
2.21
0.63
2.20
0.61
1.96
1.68
1.95
1.67
0.69
1.98
1.75
0.67
1.50
1.97
0.68
0.70
0.71
1.66
2.13
0.72
1.45
1.99
3.42
1.93
1.94
2.12
1.44
1.53
1.03
1.54
2.22
1.63
1.47
0.75
0.76
1.65
2.00
0.73
0.74
0.77
1.64
1.43
2.01
1.52
1.06
2.11
1.55
1.56
1.58
3.45
0.78
0.79
0.81
2.10
0.80
1.42
1.62
2.09
1.48
1.60
1.01
1.59
2.08
1.07
1.57
1.51
1.11
1.13
0.82
0.83
2.02
2.04
2.07
1.09
1.12
1.41
2.03
0.84
2.05
1.00
3.25
1.40
1.05
2.23
0.98
0.97
1.02
1.08
0.85
3.47
0.96
0.86
1.39
3.261.04
0.99
0.95
0.94
0.870.90
1.38
0.93
0.88
0.891.26
0.92
0.91
0.00
1.38
1.35
0.00
1.32
1.27
1.28
1.29
1.34
-0.25
1.31
1.30
-0.25
1.37
1.33
-0.50
-0.25
0.00
0.25
0.50-0.50
-0.10
0.00
0.10
0.20
0.30
0.40
utilizando as amostras de controle () e cinco dias () cujos espectros foram
obtidos no espectrmetro de 4,7 Tesla. (B) Grfico de influncias (X-loadings) de
de T-escores.
Estes resultados eram esperados, pois quanto menor a intensidade do
campo magntico, menor a sensibilidade, pois menor ser o excesso de
populao de spins a favor do campo magntico, os quais iro gerar o sinal
eltrico na bobina ao retornarem para a posio inicial depois de cessar a
aplicao do pulso magntico, o qual faz com que esse excesso de populao
passe a estar na posio contra do campo magntico externo. Desta forma,
menos metablitos so detectados quanto menor o campo magntico, pois menor
105
ser o limite de deteco. Outro fator a maior sobreposio de sinais, pois o

deslocamento qumico dado em ppm calculado dividindo a diferena entre
freqncia de precesso do ncleo e a freqncia de uma referncia em Hz pela
freqncia de ressonncia do ncleo pela freqncia aplicada em Hz e ento
multiplicando por 106. Assim, quanto maior o campo magntico, maior ser a
freqncia aplicada, mais dispersos estaro os sinais diminuindo sobreposio de
sinais (Silverstein et. al., 2006).
4.7
Identificao dos biomarcadores

Pela anlise dos grficos de X-loadings das anlises quimiomtricas
realizadas percebe-se que os sinais que determinaram a discriminao das

amostras entre sadio e doente so: 0,89-0,92, 1,28-1,32, 1,33-35, 2,232,24, 3,23-3,26 e 4,11-4,13, sendo que a regio de 1,28-1,35 foi a mais
decisiva na maioria das anlises.
Conforme atribuio feita, os sinais em 0,89-0,92, 1,28-1,32 e 2,232,24 incluem diferentes tipos de lipdeos. As duas primeiras regies, referem-se
principalmente as lipoprotenas LDL (low density lipoprotein) e VLDL (very low
density lipoprotein) (Nicholson e Foxall, 1995), estando sempre em maior
quantidade nas amostras classificadas como doentes. Na dcada de 1980, os
sinais de ressonncia de hidrognios lipdicos foram considerados como
potenciais biomarcadores da neoplasia maligna (Mountford e Tattersall, 1987;
Hakumki e Kauppinen, 2000). Mais recentemente, Bathen e col. (2000)
utilizaram RMN aliada a redes neurais para analisar os perfis de lipdios e
lipoprotenas do plasma sanguneo de pacientes com uma variedade de tipos de
cancer em comparao com grupos de controle. Seus modelos foram 83% de
preciso em prever quais pacientes tinham tumores, com base no sangue, perfil
lipdico do plasma, e apenas 8% dos pacientes foram identificados como falsos
positivos. Alm disso, outro estudo (Negendark e Sauter, 1996) evidenciou que a
correlao entre a intensidade dos sinais de RMN de 1H de lipdeos e grau de
agressividade do tumor pobre, no entanto deve-se considerar que foi utilizado
em espectros de RMN in vivo neste estudo. No presente trabalho, a correlao
entre a presena do tumor e do perfil da composio lipdica foi evidente. Esta
106
correlao pode ser explicada pelo fato de as clulas tumorais se alimentarem

preferencialmente de lipdios transportados por lipoprotenas de baixa densidade
e albumina afetando as propores destes no soro sanguneo (Edwards e col.,
2004).
Pela anlise por CG-EM verificou-se a diminuio nos nveis de cidos
graxos saturados tais como o palmtico (C16:0) e o esterico (C18:0) nas
amostras com TE em relao s de controle, ao passo que os insaturados tais
como o olico (C18:1) e linolico (C18:2) aumentaram, conforme porcentagens
relativas mostradas na Tabela 6 e Figura 63. Isto corrobora com resultados da
literatura os quais identificam lipdeos saturados como metablitos biomarcadores
de tumores, pois apresentam alteraes em seus nveis relacionadas com
proliferao, inflamao, necrose e apoptose (Griffin e Shockcor, 2004).
Tabela 6: Porcentagem de cidos graxos presentes em amostras de controle e
inoculada com TE em camundongos Swiss obtidas nas anlises por CG-EM.
cido graxo
Tempo de reteno (min)
Palmtico
Esterico
Olico
Linolico
6,55
7,65
7,78
8,07
Porcentagem (%)
Controle
TE
31,45
26,93
23,45
13,30
15,66
22,90
29,43
36,87
O v e r la i d C h r o m a t o g r a m P lo t s
RESULTADOS
E DISCUSSO
P lo t 1 : c : \ s a t u r n w s \ d a t a \ a r q - s c 3 . s m s R I C
107
a ll
P lo t 2 : c : \ s a t u r n w s \ d a t a \ a r q - s t e 2 . s m s R I C a l l
M C o u n ts
9
R I C a ll a r q - s c 3 . s m s
Linolico
Controle
Palmtico
Esterico
Olico
Manose
Glucose
Galactose
1
0
M C o u n ts
R I C a ll a r q - s t e 2 .s m s
TE
0
5
10
15
20
m in u t e s
Figura 63: Cromatogramas referentes a uma amostra de controle (acima) e a

uma amostra de cinco dias de inoculao de TE em camundongos Swiss
(abaixo).
O lactato, cujos sinais so o dubleto em 1,33-1,35 e o quarteto em 4,114,13, considerado um metablito biomarcador de tumores (Griffin e Shockor,
2004). Assim, a maior quantidade deste nas amostras com tumor em relao s
de controle era esperada, visto o lactato ser o produto final da gliclise, principal
processo de produo de energia das clulas tumorais. Numa clula normal este
tipo de processo s ocorrer na falta do oxignio suficiente para ocorrer a
fosforilao oxidativa, sendo que esta produz cerca de 36 mols de ATP por mol de
glucose enquanto a gliclise anaerbica produz apenas dois. No obstante,
comprovou-se que clulas tumorais produzem energia por um processo de
gliclise aerbica, chamado de efeito Warburg, em que a glucose transformada
em piruvato e apenas 5% deste segue o processo de fosforilao oxidativa
108
normal, e 85% transformado em lactato, resultando na produo de cerca de

quatro mols de ATP por mol de glucose, embora os motivos para isto no serem
ainda bem entendidos (Vander Heiden e col., 2009).
Entre os dois tipos de tumor estudados, o TE apresentou maiores
propores dos sinais em 1,28-1,32 relativo principalmente ao VLDL enquanto o
S180 possui os sinais em 1,33-1,35 com maior intensidade, indicando que
diferentes vias metablicas so afetadas pelo tumor no organismo do
camundongo, porm esta diferena foi mnima
A colina e seus compostos relacionados so nutrientes essenciais que
funcionam como substratos da maioria das vias metablicas. E geralmente
observada em concentraes altas em anlises de tecidos tumorais (Loening, e
col., 2005), especialmente durante processos de apoptose e necrose (Griffin e
Shockor, 2004). Nas anlises quimiomtricas, observou-se deslocamentos
referentes colina em maior quantidade em amostras de trs dias aps
inoculao
com
TE
S180
em
camundongos
Swiss,
que
ficaram
significantemente sobrepostas s amostras de controle. Desta forma, a colina no

se mostrou ser um biomacador importante dos tipos de tumores estudados, talvez
devido as clulas no estarem em estgios de necrose ou apoptose.
Quanto possvel presena de acetato, ou derivado, provavelmente acetoacetato, em 2,24, no se encontrou nenhuma correlao direta entre a presena
de tumores e a produo deste. Como foram observadas grandes intensidades
deste de forma aleatria em todos os grupos de amostras, a sua produo pode
estar relacionada a outros fatores, como alimentao ou presena de outras
doenas.
Na anlise por CG-EM tambm se observou variaes nas propores
referentes aos acares, especialmente manose, conforme pode ser observado
na Tabela 7 e na Figura 63. No se observou resultado correspondente nas
anlises quimiomtricas, mesmo porque no se encontrou sinais referentes
manose e a galactose nos espectros de RMN de 1H. Tambm no se encontrou
relao entre o metabolismo de acares e a presena do tumor.
109
Tabela 7: Porcentagem dos acares presentes em amostras de controle e

inoculada com TE em camundongos Swiss obtidas atravs da anlise por CGEM.
4.8
Acares
Tempo de reteno (min)
Manose
Glucose
Olico
Linolico
12,3
12,9
13,6
13,9
Porcentagem (%)
Controle
TE
19,50
51,10
43,45
19,13
24,56
22,03
12,30
7,73
Construo de modelos de calibrao

Partindo dos resultados obtidos nas anlises quimiomtricas utilizando o
mtodo de PLS-DA, construram-se modelos de calibrao com aproximadamente

80% das amostras utilizadas nas anlises. As amostras restantes, escolhidas
aleatoriamente, foram usadas para validao dos modelos. O resultado da
validao para cada modelo mostrado na Tabela 8, com os respectivos valores
de sensitividade, ou seja, a porcentagem de quantas amostras de grupos doentes
foram preditas como doentes; e de especificidade, que representa a porcentagem
de amostras de controle foram preditas como tal. Tambm so apresentados os
valores de RMSEC (root mean square errors of calibration) e RMSEP (root mean
square errors of prediction) para cada modelo. Para clculo destes valores so
usadas as frmulas abaixo, em que yi* e yi so respectivamente os valores
preditos e originais de cada amostra, e n o nmero total de amostras (Manual
AMIX, 2008).
No clculo de RMSEC consideram-se as amostras que foram usadas na

construo do modelo, e, portanto, expressa quo bem o modelo prediz a si
110
mesmo. O valor de RMSEC deve ser o menor possvel. Por sua vez, o valor de
RMSEP expressa a capacidade de o modelo predizer valores de novas amostras.
Para isto um novo conjunto de amostras com valores conhecidos deve ser
fornecido, sendo que estas no foram includas na construo do modelo (Manual
AMIX, 2008).
Tabela 8: Resultados da validao dos modelos desenvolvidos a partir das
anlises quimiomtricas segundo dados fornecidos pelo programa AMIX.
Modelo
N de VLs
Varincia explicada em X (%)
Varincia explicada em Y(%)
N de amostras usadas no modelo
N de amostras usadas na
predio
Sensitividade (%)
Especificidade (%)
RMSEC
RMSEP
Figura correspondente
1
2
3
4
5
6
7
4
3
8
3
5
4
7
95,5 62,7 47,2 85,7 93,0 40,7 97,8
53,4 62,4 58,0 41,6 41,0 78,6 53,1
66
27
56
18
56
26
87
16
14
14
21
66,7 100 63,6 100 40,0 33,3 45,4

100 100 100 100 100 100
--0,68 0,24 0,44 0,27 0,60 0,27 0,80
0,73 0,21 0,37 0,18 0,91 0,37 0,88
63
64
65
66
67
68
69
Para o conjunto de amostras de controle e com trs, sete e dez dias aps a
inoculao com TE em camundongos Swiss (Modelo 1-Tabela 8), todas as
amostras foram preditas nos seus respectivos grupos com bons valores de
RMSEC e de RMSEP, os quais foram ambos abaixo de 1,0 como desejado e com
pequena diferena entre eles. Porm, no que diz respeito a predizer a presena
do tumor as amostras de trs dias so classificadas junto das amostras de
controle como no tendo tumor, ou seja, so falsos negativos, resultando em
sensitividade de 66,7% e especificidade de 100%, pois todas as amostras sem
tumor foram classificadas como tal como mostrado no grfico de T-escores na
Figura 64. Apenas a partir de sete dias de inoculao pode-se ter uma predio
de 100%, sem falsos negativos.
111
0.100
0.000
-0.100
-0.200
-0.50
-0.25
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
formado pelas amostras de controle (), trs (), sete () e dez () dias inoculadas
com TE em camundongos Swiss para predizer novas amostras: controle (), trs
( ), sete () e dez dias ().
Como as amostras de cinco dias no puderam ser includas no conjunto

anterior, fez-se um modelo para o conjunto de amostras de controle e com cinco
dias aps a inoculao com TE em camundongos Swiss (Modelo 2 Tabela 8).
Este tambm foi capaz de predizer as amostras com 100% de acerto (Figura 65).
Os valores de RMSEC e RMSEP, mais baixos que os do modelo anterior,
mostraram timo potencial e sensitividade de predio. Assim possvel
diagnosticar o cncer em amostras a partir de cinco dias aps a inoculao de TE
em camundongos Swiss com boa preciso. Sabe-se, porm que estes valores de
112
100% obtidos esto acima do esperado, devido ser um modelo pequeno, bem
abaixo do nmero ideal de amostras, e com poucas amostras utilizadas para a
predio.
0.30
0.20
0.10
0.00
-0.10
-0.20
-0.30
-0.50
-0.25
0.00
0.25
0.50
formado pelas amostras de controle () e cinco dias () inoculadas com TE em
camundongos Swiss para predizer novas amostras: controle () e cinco dias ().
inoculao com TE em camundongos Balb-C (Modelo 3 Tabela 8) foi muito
eficiente em predizer as amostras, porm ocorreu o mesmo que com o modelo 1,
com especificidade de 100% e sensitividade de 63,6% causada pela classificao
das amostras de trs dias no mesmo grupo das amostras de controle, como
mostra a Figura 66. Os valores de RMSEC e de RMSEP foram bem menores do
que 1,0 e prximos entre si, expressando ser um bom modelo com boa
113
capacidade de predio no que diz respeito a predizer cada amostra no seu

respectivo grupo.
0.150
0.100
0.050
0.000
-0.050
-0.100
-0.50
-0.25
0.00
0.25
0.50
0.75
com TE em camundongos Balb-C para predizer novas amostras: controle (), trs
( ), sete () e dez dias ().
Para o modelo com amostras de controle e cinco dias provindas de

camundongos mantidos sob alimentao normal e anlise quimiomtrica com
escalonamento em relao intensidade total dos sinais (Modelo 4 Tabela 8), a
sensitividade e especificidade mais uma vez foram de 100% (Figura 67) com
baixos de RMSEC e RMSEP e, portanto, o diagnstico possvel com boa
preciso e predibilidade com apenas cinco dias aps a inoculao.
114
0.150
0.100
0.050
0.000
-0.050
-0.100
-0.50
-0.25
0.00
0.25
0.50
0.75
formado pelas amostras de controle () e cinco dias () inoculadas com TE em
camundongos Balb-C para predizer novas amostras: controle () e cinco dias ().
inoculao com tumor S180 em camundongos Swiss (Modelo 5 Tabela 8), as
amostras utilizadas para testar o modelo ficaram preditas na sua maioria
corretamente, com exceo de trs das quatro amostras do grupo de sete dias
que ficaram classificadas como amostras de controle, devido sobreposio
desses dos grupos no modelo, alm das amostras de trs dias ficarem
sobrepostas as de controle como j ocorreu nos modelos 1 e 3, resultando em
sensitividade de apenas 40,0%. J as amostras de controle, ou sem tumor,
ficaram classificadas corretamente, resultando em especificidade de 100% (Figura
68). Os valores de RMSEC e de RMSEP foram abaixo de 1,0, porm com
diferena entre eles consideravelmente grande, e com valor de RMSEP bem
115
prximo de um, o que indica que o modelo no apresenta boa capacidade de

predizer novas amostras, o que ocorre em decorrncia da baixa separao entre
os grupos.
0.20
0.10
0.00
-0.10
-0.20
-0.30
-0.50
-0.25
0.00
0.25
0.50
0.75
com S180 em camundongos Swiss para predizer novas amostras: controle (),
trs ( ), sete () e dez dias ().
Para o conjunto de amostras de controle e com trs dias aps a inoculao

com S180 em camundongos Swiss (Modelo 6 - Tabela 8) mesmo com baixos
valores de RMSEC e RMSEP, apenas uma das trs amostras de cinco dias
utilizadas na predio foi classificada corretamente, resultando em sensitividade
de apenas 33,3%. As amostras de controle foram todas classificadas
corretamente, com especificidade de 100%, como mostrado na Figura 69.
116
0.30
0.20
0.10
0.00
-0.10
-0.20
-0.50
-0.25
0.00
0.25
0.50
-0.30
0.75
formado pelas amostras de controle () e cinco dias () inoculadas com S180 em
camundongos Swiss para predizer novas amostras: controle () e cinco dias ().
Desenvolveu-se tambm um modelo para tentar predizer amostras
segundo o tipo de tumor, incluindo as amostras de trs, sete e dez dias
inoculadas com os dois tipos de tumor (Modelo 7 Tabela 8). A sensitividade foi
de apenas 45,4% no havendo amostras de controle neste caso, sendo que a
visualizao no grfico de T-escores ficou dificultada por o programa no possuir
caracteres suficientes para o nmero de grupos diferentes, como mostra a Figura
70. Os valores de RMSEC e RMSEP foram um pouco mais altos que para os
demais modelos, porm ainda abaixo de 1,0. Considerando a grande
sobreposio entre os grupos, a predio de acordo com o tipo de tumor seria
pouco precisa. Levando isto em conta, no foi feito o modelo com as amostras de
117
cinco dias, pois na anlise quimiomtrica houve grande sobreposio entre os

grupos de cada tipo de tumor (Figura 57).
0.20
0.10
0.00
-0.10
-1.00
-0.75
-0.50
-0.25
0.00
0.25
0.50
-0.20
formado pelas amostras de trs (), sete ( ) e dez dias () inoculadas com TE e
trs (), sete () e dez dias () inoculadas com S180 em camundongos Swiss
para predizer novas amostras: trs, sete e dez dias inoculadas com TE, todas
simbolizadas por (); e trs (), sete () e dez dias () inoculadas com S180.
Portanto os modelos desenvolvidos para predizer novas amostras de
acordo com a presena ou ausncia do tumor mostraram baixos valores de
sensitividade. Isto se deu devido s amostras de trs dias de inoculao terem
sido preditas junto com as de controle, consistindo ento em falsos negativos. A
partir de cinco dias de inoculao a sensitividade passa a 100%. J os valores de
118
especificidade foram de 100% para todos os modelos. Comparando com outros

trabalhos presentes na literatura, obteve-se o diagnstico de cncer de mama por
RMN de 1H de tecidos com sensitividade de 93% e especificidade de 92%
(Mountford e col., 2008), de cncer de prstata pela mesma metodologia com
sensitividade de 100% e especificidade de 95,5% (Hahn e col., 1997) e de ovrio
com 100% de sensitividade e especificidade (Odunsi e col., 2005). Utilizando
anlise de biofudos por RMN de 1H, Buchthal e col. (1988) obtiveram apenas
70% de sensitividade e 69% de especificidade no diagnstico de cncer maligno.
Assim, os resultados obtidos neste trabalho foram melhores que os obtidos por
Buchthal e col. (1988), porm no a ponto de atingir os valores de sensitividade e
especificidade das anlises de RMN de tecidos. Pela metodologia usada neste
trabalho, foi possvel um diagnstico preciso aps cinco dias para o TE
independente da linhagem de camundongos utilizada, o que equivale a cerca de
um tero do tempo de sobrevida; e dez dias para S180, ou mais de metade do
tempo de vida mdio aps a inoculao.
4.9
Testes de estabilidade das amostras

Para se ter uma melhor confiabilidade nos resultados a estabilidade das
amostras foram avaliadas atravs do armazenamento das mesmas a 10 C e -18

C por um perodo de at 40 dias e avaliados os efeitos de congelamento e
descongelamento da amostras. Os conjuntos de amostras utilizados nas anlises
quimiomtricas foram utilizados como modelos de predio para prever a origem
das amostras usadas nos testes de estabilidade como pertencentes ou no aos
grupos do modelo.
Para
os
testes
de
estabilidade
das
amostras
submetidas
ao
armazenamento a 10C ou -18C foi utilizado amostras recm analisadas, sendo

armazenadas nos prprios tubos de RMN a aproximadamente 10C ou -18C. O
resultado apresentado na Tabela 9. As amostras dos grupos de camundongos
Swiss usadas como controle (SC e SC1) foram preditas nos modelos dos dois
tipos de tumor. Todos os resultados foram acompanhados por anlise visual dos
espectros junto com os grficos de X-loadings respectivos para identificar em
quais sinais ocorreram alteraes. Comparando-se com o que foi observado pela
119
anlise visual, apenas duas das 28 amostras utilizadas no teste no foram

classificadas corretamente, representando um acerto na predio de 92, 9%.
Ainda, as amostras de controle e de trs dias ficaram posicionadas em regies
com sobreposio dos dois grupos, visto o modelo no ser capaz de discriminar
estes grupos. Amostras armazenadas por mais de trs dias, independente da
temperatura sofreram alteraes, incluindo aumento de aceto-acetato ( 2,24
provavelmente causado por contaminao de bactrias presentes no ar,
diminuio nos sinais referentes ao lipdeos ( 0,84-1,00, 1,28-1,30 e multipletos
em 1,60-2,80) por provvel degradao destes e alteraes na regio de 3,204,40, referente a colina e derivados e acares. Desta forma, define-se como trs
dias o prazo mximo que a amostra pode ser armazenada tanto a 10 C como a
-18 C depois de preparada, pelos nveis detectveis na RMN.
armazenamento dentro do modelo desenvolvido.
Amostras*
Tempo
Temperatura
SC-a
SC-b
SC-c
1 dia
2 dias
3 dias
10 C
10 C
10 C
STE3d-a
25 dias
10 C
STE3d-b
40 dias
10 C
STE10d-a
STE10d-b
STE10d-c
STEC1-a
STEC1-b
STEC1-c
STE5d-a
STE5d-b
STE5d-c
1 dia
2 dias
3 dias
1 dia
2 dias
3 dias
1 dia
2 dias
3 dias
10 C
10 C
10 C
-18 C
-18 C
-18 C
-18 C
-18 C
-18 C
SS18010d-a
25 dias
-18 C
SS18010d-b
40 dias
-18 C
SS1805d-a
SS1805d-b
SS1805d-c
BCTE3d-a
BCTE3d-b
BCTE3d-c
1 dia
2 dias
3 dias
1 dia
2 dias
3 dias
-18 C
-18 C
-18 C
-18 C
-18 C
-18 C
Grupo de
Predio*
SC ou 3d
SC ou 3d
SC ou 3d
Fora do
modelo
Fora do
modelo
10d
10d
10d
SC
SC
SC
5d
5d
5d
Fora do
modelo
Fora do
modelo
5d
5d
5d
BCC
BCC
BCC
Sinais que sofreram

alteraes ()#
Nenhuma
Nenhuma
Nenhuma
2,24 e 3,20-4,40
2,24 e 3,20-4,40
Nenhuma
Nenhuma
Nenhuma
Nenhuma
Nenhuma
Nenhuma
Nenhuma
Nenhuma
Nenhuma
0,84-1,00 , 1,28-1,30 ,
1,60-2,80
0,84-1,00 , 1,28-1,30 ,
1,60-2,80
Nenhuma
Nenhuma
Nenhuma
Nenhuma
Nenhuma
Nenhuma
120
BCTE3d1-a
BCTE3d1-b
5 dias
7 dias
-18 C
-18 C
BCTE3d1-c
9 dias
-18 C
BCTE10d-a
BCTE10d-b
BCTE10d-c
1 dia
2 dias
3 dias
-18 C
-18 C
-18 C
BCC ou 3d
BCC ou 3d
Fora do
modelo
BCC
BCC
BCC
2,24 e 3,20-4,40
2,24 e 3,20-4,40
2,24 e 3,20-4,40
Nenhuma
Nenhuma
Nenhuma
*S: Swiss; BC: Balb-C; C: controle; TE: tumor de Ehrlich; S180: Sarcoma 180; tempo de desenvolvimento do
tumor: 3, 5 ou 10 dias; identificao da amostra quando h mais de uma do mesmo tipo: 1 ou a, b e c.
#
(= aumento e = diminuio na intensidade do sinal)
Os resultados dos testes de estabilidade a descongelamento aps 24 horas

do primeiro descongelamento so apresentados na Tabela 10. Os resultados da
predio se mostraram condizentes com exceo de um caso em que a amostra
ficou posicionada fora do modelo, porm no h mudana observvel no perfil
espectral, apenas pequena mudana nos deslocamentos qumicos, devido talvez
a alguma pequena alterao de pH. Porm no provvel que isto tenha
ocasionado este resultado, porque a utilizao de buckets nas anlises
quimiomtricas minimiza o efeito de variaes nos deslocamentos qumicos.
Portanto,
no
houve
efeitos
significativos
causados
pelo
segundo
descongelamento da amostra.
estabilidade a efeitos de congelamento e descongelamento dentro do modelo
desenvolvido.
Amostras*
SC
STE5d
SS1803d
SS1805d-1
SS1805d-2
BCTE3d
BCTE7d
Grupo de Predio*
SC
5d
SC ou 3d
5d
Fora do modelo
SC ou 3d
7d ou 10d
Sinais que sofreram alteraes

Nenhuma
Nenhuma
Nenhuma
Nenhuma
Nenhuma
Nenhuma
Nenhuma
*S: Swiss; BC: Balb-C; C: controle, TE: tumor de Ehrlich; S180: Sarcoma 180, tempo de desenvolvimento do
tumor: 3, 5 ou 7 dias; identificao da amostra quando h mais de uma do mesmo tipo: 1 ou 2.
CONCLUSO
A anlise quimiomtrica de espectros de RMN de
H adquiridos
diretamente de soro sanguneo de camundongos inoculados com TE em

camundongos Swiss e camundongos Balb-C permitiu diagnosticar o tumor aps
cinco dias com boa preciso, sendo que a partir deste perodo todas as amostras
121
foram preditas corretamente pelos modelos, correspondendo 27,8% do tempo de

vida mdio aps a inoculao. No caso da inoculao com tumor Sarcoma 180 o
diagnstico s foi possvel com dez dias aps a inoculao correspondendo
55,6% do tempo de vida mdio aps a inoculao, no qual os animais j esto
evidentemente em estgio bem avanado da doena, portanto, no possvel
diagnosticar precocemente a presena deste tipo de tumor pelo mtodo proposto.
Esta diferena se deu devido a diferentes mecanismos de ao dos diferentes
tumores no organismo.
Estes resultados foram obtidos atravs do mtodo de PLS-DA como
ferramenta para a anlise quimiomtrica em conjunto com o mtodo de PCA.
Comprovou-se que o mtodo de PLS-DA permite otimizar os resultados obtidos
pelo PCA, diminuindo o tempo de diagnstico no caso dos experimentos
realizados com TE.
Os sinais no espectro de RMN de
H que atuaram como principais
determinantes da discriminao entre grupos sadio e doente incluram os sinais

na regio de 0,89-0,92, 1,28-1,32, 1,33-35 e 4,11-4,13, sendo que a regio
de 1,28-1,35 foi a principal. Pela atribuio feita atravs de dados da literatura
comparados com os obtidos em experimentos de RMN 1D e 2D e CG-EM,
identificou-se os sinais em 0,89-0,92, 1,28-1,32 como lipdeos e lipoprotena
VLDL, estando estes em maior quantidade nas amostras diagnosticadas com
tumor. J para os sinais em 1,33-35 e 4,11-4,13 foi identificado o lactato como
possvel biomarcador tambm presente em maior quantidade nas amostras
doentes. Outros metablitos identificados foram colina, aceto-acetato, e
glucose e alanina.
No que diz respeito discriminao de acordo com o tipo de tumor, apenas
obteve-se uma discriminao parcial no perodo de sete dias aps a inoculao,
sendo que antes e aps este perodo ocorre sobreposio das amostras. Pelos
grficos de influncia percebeu-se que possui os sinais referentes a alguns tipos
de lipdeos e VLDL em maior intensidade ao passo que o S180 apresenta maior
produo de lactato, porm as diferenas na resposta metablica entre os dois
tipos de tumor foram mnimas o que justifica a sobreposio entre os grupos.
Os modelos para cada experimento tiveram em geral boa capacidade de
predio com baixos valores de RMSEC e RMSEP. Porm devido no ser
possvel identificar a presena da doena em estgios iniciais, os valores para
122
sensitividade foram baixos para a maioria dos modelos, ao passo que se obteve
valores timos de especificidade.
Estes modelos mostraram-se eficientes em predizer as amostras do teste
de estabilidade, com apenas duas amostras preditas erroneamente. Com estes
testes foi possvel concluir que se pode armazenar a amostra apenas por trs dias
sob refrigerao de 10 C ou -18 C, sem que ocorram alteraes em sua
composio qumica. Tambm se definiu que um segundo descongelamento no
causa degradao do soro segundo o que observado via RMN.
Portanto, a RMN aliada a quimiometria uma ferramenta com grande
potencial para estudar os efeitos da presena de tumores na composio de
biofludos, no entanto devido sua baixa sensibilidade no capaz de
diagnosticar estes tumores em estgios iniciais por meio de soro sanguneo, no
qual os metablitos esto presentes em concentraes muito baixas. Isto poderia
ser melhorado com o uso de campos magnticos mais intensos e sondas
criognicas que aumentam muito a sensibilidade da tcnica.
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discriminate analysis. Mag. Res. Med., v. 38, p. 569-576, 1997.
WHISHART, D. S. Metabolomics: applications to food science and nutrition
research. Trends Food Sci. Tech., v.19, p. 482-493, 2008.

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CAROLINE WERNER PEREIRA DA SILVA

ANLISE DE BIOFUDOS ATRAVS DE RMN ALIADA A

Dissertao apresentada como requisito

Orientador: Prof. Dr. Andersson Barison

CAROLINE WERNER PEREIRA DA SILVA

ANLISE DE BIOFUDOS ATRAVS DE RMN ALIADA A

Dissertao apresentada como requisito

Orientador: Prof. Dr. Andersson Barison

Para meus queridos pais.

Ao Professor Andersson Barison pela orientao.

A Ressonncia Magntica Nuclear..............................................................10

Anlise por Componentes Principais..........................................................12

Anlise Discriminante com calibrao multivariada por Quadrados

Anlise dos grficos de influncia................................................................14

Induo de tumores nos camundongos.............................................................16

Obteno das amostras.......................................................................................17

Espectros de RMN de 1H.....................................................................................17

RMN de 31P, 13C e experimentos 2D...................................................................18

Realizao de anlises quimiomtricas.............................................................19

Discriminao entre os grupos.....................................................................19

Identificao dos biomarcadores.................................................................20

Construo de modelos de classificao...................................................20

Cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massas......................20

Determinao dos parmetros de obteno dos espectros de RMN de 1H 22

Determinao da sequncia de pulsos utilizada para aquisio dos

espectros de RMN de 1H..................................................................................................22

Quantidade de soro utilizado na preparao das amostras....................26

Anlise visual dos espectros de RMN de 1H.....................................................28

Atribuio dos sinais nos espectros de 1H........................................................30

Pr-processamento dos dados....................................................................37

Discriminao entre amostras de grupos sadios e doentes....................47

S180 em camundongos Swiss................................................................59

Discriminao de acordo com o tipo de tumor..........................................66

Discriminao entre amostras de grupos sadios e doentes....................76

S180 em camundongos Swiss................................................................86

Discriminao de acordo com o tipo de tumor..........................................93

PCA versus PLS-DA......................................................................................99

Avaliao de efeitos externos nas anlises....................................................101

Avaliao do efeito do ambiente sob a resposta fisiolgica do

Avaliao do efeito da dieta na resposta do camundongo....................102

Comparao de anlises obtidas em espectrmetros de RMN de

diferentes campos magnticos......................................................................................106

Identificao dos biomarcadores......................................................................109

Construo de modelos de calibrao.............................................................113

Testes de estabilidade das amostras...............................................................122

Cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massas

Free induction Decay

Heteronuclear Multiple Bond Correlation

Heteronuclear Single Quantum Coherence

Constante de acoplamento em Hertz (Hz)

Principal Component Analysis

Parcial Least Square Discriminant Analysis

Escala dos espectros de RMN em partes por milho

Ressonncia Magntica Nuclear de Hidrognio

Ressonncia Magntica Nuclear de Carbono 13

Ressonncia Magntica Nuclear de Fsforo 31

cido ribonuclico mensageiro

Relaxao longitudinal (spin-rede)

Relaxao transversal (spin-spin)

Total Correlation Spectroscopy

Trimetilsililpropionato de sdio tetradeuterado

J 1H-31P observadas no experimento de HMBC obtido a

partir de uma amostra de soro provinda de camundongo Swiss inoculado com