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Aula 1 Bio Mol
Aula 1 Bio Mol
Aula 1 Bio Mol
Coordenadores:
Cronograma
Data
Bio
15/ago
22/ago
Julio
Julio
Marcelo
29/ago
12/set
Julio
19/set
Julio
26/set
Julio
03/out
Julio
10/out
Julio
PROVA 1
REGULAO DA EXPRESSO GNICA
17/out
Julio
CONSTRUO DE BIBLIOTECAS
Lcia
24/out
31/out
Julio
INFORMAO GENMICA
07/nov
Julio
14/nov
Julio
SEMINRIOS
21/nov
Julio
Prova 2
28/nov
Julio
Prova Sub
05/12/2014
Julio
EXAME
Avaliao
2 Provas tericas (P1 e P2)
Seminrios (S)
P1+P2+S / 3 = Mdia
Mdia:
>= 6,0 aprovao direta
3,0 a 5,9 Exame
0 a 2,9 reprovao automtica
Frequncia
A frequncia importante? SIM ela FUNDAMENTAL !!!
Mnimo de 75% de frequncia, ou seja:
At 4 faltas Aprovado na frequncia
Seminrios
-Metilao do DNA
-TRANSGNICOS
-Engenharia gentica aplicada nanobiotecnologia: caracterizao
sntese e aplicaes da Spider Silk, Introduo biomecnica molecular
-Modificao do morango para uma melhor adaptao aos impactos
diversos das mudanas climticas.
-Determinao da presena de AKT no ncleo de clulas de melanoma e
sua interao com substratos envolvidos na regulao da sobrevivncia
celular.
-Investigao Forense
-Utilizao da PCR-TR no diagnstico de meningite
-Biologia Forense
No basta escrever........
Bibliografia
3- Biologia Molecular do Gene - 5 Ed. 2006 , Watson, James D.; Baker, Tania A.;
Bell, Stephen P.
Sugesto de leitura
FUNPEC-Editora
R$29,61 : submarino, americanas
Jacques Monod
1910 - 1976
Cincia Multi-disciplinar
Microbiologia
Bioinformatica
Paleontologia
Ecologia
Gentica
Bioqumica
Biologia Molecular
Frederick Griffith
(1879 - 1941)
Streptococcus pneumoniae
Cepa lisa virulenta (S)
Cepa rugosa no-virulenta (R)
Griffith, F., The significance of pneumococcal types (1928) J. Hyg. 27, 113-159.
O princpio transformante
Oswald Avery
Colin McLeod
Maclyn McCarty
1877 - 1955
1909 - 1972
1911 - 2005
Studies on the chemical nature of the substance inducing transformation of pneumococcal types, (1944) J. Exp. Med. 79:137-158.
O princpio transformante
Studies on the chemical nature of the substance inducing transformation of pneumococcal types, (1944) J. Exp. Med. 79:137-158.
O princpio transformante
Studies on the chemical nature of the substance inducing transformation of pneumococcal types, (1944) J. Exp. Med. 79:137-158.
O princpio transformante
Studies on the chemical nature of the substance inducing transformation of pneumococcal types, (1944) J. Exp. Med. 79:137-158.
O princpio transformante
Studies on the chemical nature of the substance inducing transformation of pneumococcal types, (1944) J. Exp. Med. 79:137-158.
O princpio transformante
Studies on the chemical nature of the substance inducing transformation of pneumococcal types, (1944) J. Exp. Med. 79:137-158.
Martha Chase
Alfred Hershey
(1930 - 2003)
(1908 - 1997)
Independent functions of viral protein and nucleic acid in growth of bacteriophage, (1952) J. Gen. Physiol.36: 39-56.
O Experimento do Liquidificador
35S
Protenas
Independent functions of viral protein and nucleic acid in growth of bacteriophage, (1952) J. Gen. Physiol.36: 39-56.
O Experimento do Liquidificador
35S
Protenas
32P
DNA
Independent functions of viral protein and nucleic acid in growth of bacteriophage, (1952) J. Gen. Physiol.36: 39-56.
Martha Chase
Alfred Hershey
(1930 - 2003)
(1908 - 1997)
Independent functions of viral protein and nucleic acid in growth of bacteriophage, (1952) J. Gen. Physiol.36: 39-56.
Martha Chase
Alfred Hershey
(1930 - 2003)
(1908 - 1997)
Independent functions of viral protein and nucleic acid in growth of bacteriophage, (1952) J. Gen. Physiol.36: 39-56.
Erwin Chargaff
(1905 - 2002)
Organismo
A/T
G/C
Mycobacterium
tuberculosis
15.1
14.6
34.9
35.4
1.03
0.99
Ourio-do-mar
32.8
32.1
17.7
18.4
1.02
0.96
Levedura
31.3
32.9
18.7
17.1
0.95
1.09
Rato
28.6
28.4
21.4
21.5
1.00
1.00
Homem (fgado)
30.3
30.3
19.5
19.9
1.00
0.98
Desoxypentosenuclease in Yeast and Specific Nature of Its Cellular Regulation, (1948) Science, 108(2814):628-629.
Maurice Wilkins
Rosalind Franklin
(1916 - 2007)
(1920 1958)
Wilkins, M.H.F., Stokes, A.R., and Wilson, H.R. (1953) Molecular Structure of Deoxypentose Nucleic Acids. Nature 171:738-740.
Franklin, R. and Gosling, R.G. (1953) Molecular Configuration in Sodium Thymonucleate. Nature 171:740-741.
Francis Crick
James Watson
(1916 - 2007)
(1928)
Watson and Crick, Molecular structure of nucleic acids, (1953) Nature 171::737-738.
25-04-1953
Watson, J.D. and Crick, F.H.C. (1953) Molecular structure of nucleic acids. Nature 171::737-738.
Linus Pauling
Descreveu a estrutura de alfa-hlice para protenas
(Mostrou que estrutura de alfa-hlice era possvel)
Wilkins
Perutz
Crick
Steinbeck
Watson
Kendrew
A
C
T
G
PURIFICAO DE DNA/RNA
DNA LIGASE
ELETROFORESE
Pergunta do projeto/seminrio:
o que vou estudar?
Dogma Central da Biologia
Mutaes, nmero de
cpias do gene: DNA
Programa
DNA LIGASE
ELETROFORESE
Relevncia
Geralmente, a extrao de DNA o primeiro
passo de uma anlise molecular:
Testes forenses
Identificao de organismos
Diagnstico de doenas
(identificao de mutaes)
Isolar genes = clonagem
Sequenciamento
Extrao de RNA:
- Determinar expresso gnica (RNAm)
- Isolar genes = clonagem
- Regulao da expresso gnica (microRNAs)
Consideraes Iniciais
Natureza/Origem do cido nuclico
DNA ou RNA
Procarioto ou eucarioto
Nuclear ou de organela
Genmico ou plasmidial
Quantidade (ilimitada/limitada)
Pureza/qualidade (baixa, alta)
Eucarionte
DNA
Cromatina
RNAm
DNA
Plasmidial
DNA
cromossmico
RNAr
RNAm
RNAt
DNA
Citoplasma
Membrana plasmtica
Parede celular
Cpsula
RNAr
RNAt
Precipitao
Regio hidrofbica
aninico
CH3 - Br
|
+
CH3- (CH2)15 - N - CH3
CH3
CH3
Triton X-100 ou Nonidet P-40
n = 9 - 10
CH3-(CH2)11-O-S-O- Na+
dodecil sulfato de sdio
lauril sulfato de sdio
SDS
HO
CH3
+
O- Na
brometo de N-cetil-N,N,N-trimetilamnio
(cetil = hexadecil) CTAB
sarcosina
lauroil
CH3
CH3
O
=
lauril
CH3 -C-CH2 -C
CH3
CH3
No inico
CH3
O- Na+
HO
deoxicolato de sdio
2- Extrao
Tampo de Extrao
Proteases
Clivam as protenas que se ligam ao DNA e enzimas que
degradam DNA e outras protenas, inativam nucleases.
(Pronase E ou Protenase K)
Inibidores de nucleases
DNases
A grande maioria depende de Mg2+ como cofator
EDTA quelante Mg2+ e inibe ao das DNases
RNases
Muito estveis
Resistem a desnaturao trmica
No requerem cofatores
Inibidores extremamente potentes DEPC (cancergeno)
Resultado: uma
sopa formada
pelos restos celulares,
cidos nuclicos e
contedo
citoplasmtico
3- Purificao do DNA
Solvel (DNA) vs. Insolvel
O extrato fracionado em
material solvel (DNA) e material
insolvel (restos celulares)
Centrifugao
Filtrao
3- Purificao de DNA
DNA vs. outros solutos
Solventes orgnicos
Fenol (pH8,0) / Clorofrmio
Desnatura e extrai as protenas
DNA na fase aquosa
Protenas na fase orgnica
Dificuldades
Demorado
Trabalhoso
Txico
Perde material
3- Purificao de DNA
Precipitao
Adio de sal (NaCl, NaOAc, NH4OAc, KOAc)
Os ctions monovalentes se ligam aos grupamentos fosfato do
DNA, neutralizando suas cargas eltricas
Minimiza a repulso eletrosttica entre as molculas de DNA,
permitindo que elas se agreguem e precipitem
Incubao a -20C
Diminui agitao das molculas
Facilita agregao
DNA pellet
3- Purificao de DNA
Colunas de Troca Inica
(tipo aninica - matriz com carga +)
Slica ou DEAE
DNA se liga a slica
Lavagens sucessivas
removem as impurezas
DNA eludo da coluna
Comparao
Mais rpido
DNA mais puro
Mais caro
3- Purificao de DNA
Eluio
O DNA (pellet ou coluna) deve ser dissolvido/eludo em
uma soluo de baixa fora inica (gua,TE)
Esta soluo pode conter RNase para destruir o
RNA presente
Extrao de RNA
Controle da contaminao com Rnases
Exgena
Endgena
Adio de Inibidores de Rnases
H2O DEPC
Extrao de RNA
Lise Celular: com Trizol: fenol e sais de guainidina:
iniben RNAases.
Tecidos: mecnica
Sangue: agitao
40ng/uL RNA
Desvantagens: no diferencia DNA de RNA
Interferncia com compostos contaminantes da
extraco
RNA
A260 /A280 = ~ 2 RNA de boa qualidade
A260 /A280 <2 contaminao com guanidina
A260 /A280 >2 contaminao com fenol clorofrmio
Hora do Recreio
Programa
PURIFICAO DE DNA
DNA LIGASE
ELETROFORESE
SOUTHERN BLOT
das enzimas de
restrio e suas
aplicaes nos
problemas de
gentica
molecular
Nobel de Fisiologia ou
Medicina - 1978
Werner Arber
Daniel Nathans
Hamilton O. Smith
1929
1928 - 1999
1931
A Guerra Natural
Bactrias vs. Fagos (bacterifagos)
A Guerra Natural
As bactrias desenvolveram um sistema de defesa
contra DNAs invasores
Duas poderosas Armas
As Enzimas de Restrio
As Enzimas de Modificao
Enzimas de Restrio
Enzimas que se ligam ao DNA e o cortam em stios
especficos (stios de restrio)
Tambm chamadas de endonucleases porque
cortam o DNA internamente
Enzimas de Restrio
Cada espcie de bactria tem a sua enzima de
restrio que reconhece um stio especfico
Mais de 3.000 enzimas de restrio j foram
identificadas
Exemplo: EcoRI
Gnero: Escherichia
Espcie: coli
Cepa: R
Enzimas de Modificao
Para garantir que apenas
o DNA viral (invasor) ser
degradado, a bactria
modifica o seu prprio
DNA nos stios que
seriam atacados pela
enzima de restrio
Sistema de Metilao
(A ou C)
Enzimas de Modificao
Enzimas de Modificao
A bactria destri o DNA no-modificado com as enzimas de.
Restrio,
enquanto o seu prprio DNA esta protegido por ao de
enzimas de modificao
Stios de Restrio
Tamanho: 4 a 8 pares de base
8
Recombinant DNA, Watson e col.
Stios de Restrio
Freqncia em que ocorrem:
4n
onde n o nmero de pares de base no stio de restrio
4-base cutter: 44 =
6-base cutter: 46 =
256 bp
4,096 bp
Stios de Restrio
So repeties invertidas (Palndromes- Maioria)
(comerciais)
socorram me em marrocos
subi no onibus
5----- G - A - A - T - T - C ----3
3----- C - T T - A - A - G ----5
Stios de Restrio
Por que um palndrome ?
As enzimas de restrio
so dmeros formados por
2 subunidades idnticas
O eixo de simetria da
enzima o mesmo da
seqncia do DNA
Stios de Restrio
Stios de Restrio
As enzimas de restrio cortam cada fita do DNA na
mesma posio do palndrome
Stios de Restrio
Os cortes das enzimas de restrio podem produzir
Extremidades abruptas (bunt-ends)
Extremidades coesivas (stick-ends)
Stios de Restrio
As extremidades coesivas podem ser
5- protuberantes (5- overhangs) P 3- protuberantes (3- overhangs) -OH
5- protuberante
3- protuberante
BamHI
BamHI
5.ACTGTACGGATCCGCTA.3
3.TGACATGCCTAGGCGAT.5
BamHI
BamHI
5.ACTGTACGGATCCGCTA.3
3.TGACATGCCTAGGCGAT.5
BamHI
5.ACTGTACG GATCCGCTA.3
3.TGACATGCCTAG GCGAT.5
BamHI
extremidades coesivas
(extremidades 5 protuberantes)
Extremidades Compatveis
5.ACTGTACG GATCCGCTA.3 BamHI
3.TGACATGCCTAG GCGAT.5
5.TGCTAGCG GATCCAATC.3 BamHI
3.ACGATCGCCTAG GTTAG.5
5.ACTGTACGGATCCAATC.3
3.TGACATGCCTAGGTTAG.5
BamHI
Extremidades Compatveis
5.ACTGTACG GATCCGCTA.3 BamHI
3.TGACATGCCTAG GCGAT.5
5.TGCTAGCA GATCTAATC.3
3.ACGATCGTCTAG ATTAG.5
BglII
5.ACTGTACGGATCTAATC.3
3.TGACATGCCTAGATTAG.5
BamHI
BglII
Extremidades Abruptas
EcoRV
5.ACTGTACGATATCGCTA.3
3.TGACATGCTATAGCGAT.5
Extremidades Abruptas
EcoRV
5.ACTGTACGAT ATCGCTA.3
3.TGACATGCTA TAGCGAT.5
Extremidades Abruptas
EcoRV
5.ACTGTACGAT ATCGCTA.3
3.TGACATGCTA TAGCGAT.5
extremidades abruptas
(Podem se ligar com outras molculas
de DNA com extremidades abruptas)
Extremidades Abruptas
5.ACTGTACGAT ATCGCTA.3
3.TGACATGCTA TAGCGAT.5
EcoRV
5.ACTGTACGATGGGAATC.3 EcoRV
3.TGACATGCTACCCTTAG.5 SmaI
Incubar 2hs
37oC
Programa
PURIFICAO DE DNA
DNA LIGASE
ELETROFORESE
SOUTHERN BLOT
A
C
T
G
DNA Ligase
DNA Ligase
extremidades coesivas
5.ACTGTACGAT
3.TGACATGCTA
GGGGCTA.3
CCCCGAT.5
Exonuclease X Endonucleases
Enzimas de restrio: endonucleases
Que so exonucleases?
- Enzimas que digerem o DNA , fita simples ou dupla, desde a extremidade
Lambda Exonuclease : atividade 5'3' exonuclease de fita dupla: cataliza a
remoo de mononucleotideos 5 mononucleotides da fita dupla de DNA
Exonuclease 1: atividade 3' 5 exonuclease de fita simples
Ex. DNA polimerase I
Mapa de restrio
Representao esquemtica de uma molecula de DNA (circular o linear) indicando os
stios de corte das enzimas de restrio
Mapa de restrio
Como analisar os fragmentos gerados aps digesto de DNA com enzimas de restrio?
Programa
PURIFICAO DE DNA
DNA LIGASE
ELETROFORESE
SOUTHERN BLOT
Eletroforese
uma importante ferramenta da Biologia Molecular
Pode ser usada para:
identificar molculas especficas de DNA obtidas aps
digesto com enzimas de restrio
Comparar genomas
Cincia forense
Eletroforese
Pode ser til para a avaliao da
integridade de uma amostra de DNA
DNA genmico de alta qualidade
>95% alto peso molecular
Banda intacta prxima ao topo do gel
Pouca evidncia de fragmentos
pequenos (smear)
Eletroforese
Pode ser til para a avaliao da
integridade de uma amostra de RNA
Eletroforese
Eletroforese
Aparato
Cuba de eletroforese
Fonte
Rack do gel (barquinha)
Pentes
Fonte
Cuba
Rack
Pentes
Eletroforese
Suporte
Gel para separao dos
cidos nuclicos
Agarose ou Acrilamida
Funcionam como
esponjas (polmero),
retardando a passagem
das molculas conforme
seus tamanhos
Agarose
Polissacardeo linear
extrado de algas
Repeties de Agarobiose
D-galactose
3,6-anhydro L-galactose
D-galactose
3,6-anhydro L-galactose
Agarose
Agarose solidificada
porosa, permitindo a
migrao dos cidos
nuclicos
Scanning Electron Micrograph of Agarose Gel (11 m)
Poli-Acrilamida
Poli-Acrilamida
Acrilamida (linear)
Bis-acrilamida (cross-linker)
Eletroforese
Horizontal
Vertical
Gel running
Power Supply
Gel
running
Eletroforese
Tampo de Corrida
Fornece a fora inica para passagem da
corrente eltrica
Composio
Agente Tamponante (Tris-HCl)
Sal (Borato, Acetato, Glicina)
Quelante (EDTA)
Velocidade de migrao
A migrao dos cidos nuclicos
depende apenas do seu tamanho
Molculas menores migram mais
rpido que as molculas grandes
Vai depender tambm
(-)
(+)
Tampo
Agarose
Tampo de Amostra
Glicerol (aumenta a densidade)
permite que o DNA permanea no poo
Corante
(Azul de bromofenol ou Xileno Cianol)
Carregando o gel
As amostras so aplicadas em cada um dos poos do
gel que est na cuba com tampo de corrida
Correndo a eletroforese
Ao aplicar um campo
eltrico, as amostras iro
migrar em direo ao plo
positivo
Correndo a eletroforese
(-)
DNA (-)
(+)
SYBR Gold
SYBR Safe
Gel Ready
Wards - QUIKView DNA
Stain
Carolina BLU Stain
Vantagens
Baratos
Menos txicos
Desvantagens
Menos sensveis
Necessita maior quantidade
de DNA no gel
Maior tempo de
colorao / descolorao
SYBR Gold
QuikVIEW stain
DNA
migration
bromophenol blue
(+)
(-)
(DNA Ladder )
12.000 bp
5.000
4.000
Permite a determinao do
tamanho dos fragmentos
de DNA submetidos a
eletroforese
3.000
2.000
1.650
DNA
migration
1.000
850
650
500
400
bromophenol blue
300
200
(+)
100