Obteno e manipulao de cidos nuclicos

Process

Cell lysis

Common procedure
Chemical

SDS, sarcosyl
CTAB

Enzymatic

Proteinase K
Lysozyme

Mechanic

Freezing
Sonication
Grinding

Organic solventsPhenol

chloroform

Protein removal

DNA precipitation

Salt

Sodium chloride
Sodium acetate

DNA binding

Membrane
Beads

Alcohol

Ethanol
Iso-propanol

Obteno e manipulao de cidos nuclicos

FERRAMENTA IMPORTANTE: Endonucleases de
restrio
Bacterifagos - > vrus infectam bactrias
1950s - fagos infectam cepas especficas
certos fagos restritos a certas cepas (Luria)
1962 - endonuclease clivam DNA no protegido
DNA no protegido degradado por endonuclease
restringindo infeco
1968 - purificao 1a endonuclease de restrio
1970 - purificao e caracterizao Hin dII
corte mesmo stios - mapa de restrio

Obteno e manipulao de cidos nuclicos

Clonagem molecular o processo de construo de molculas de
DNA recombinante e da sua propagao em hospedeiros
apropriados que possibilitam a seleco do DNA recombinante.

SOUTHERN BLOT
Restriction enzymes
molecular scissors

Southern blot steps

SEQUENCIAMENTO

-processo que determina a ordem dos nucleotdeos (blocos que constituem a

molcula de DNA) em uma amostra .

Marcadores moleculares
PCR Polymerase Chain Reaction
-sntese enzimtica in vitro de milhes de
cpias de um segmento especfico de DNA
na presena da enzima DNA polimerase.
-sua reao baseia-se no anelamento e
extenso

enzimtica

de

um

par

de

oligonucleotdeos (pequenas molculas de

DNA de fita simples) utilizados como
indicadores (primers) que delimitam a
sequncia de DNA de fita dupla alvo da

amplificao.

Marcadores moleculares
Marcador molecular todo e qualquer fentipo molecular
oriundo de um gene expresso (como em isoenzimas) ou de um
segmento especfico de DNA (expresso ou no).
- Isoenzimas
-RFLP
baseados em PCR
- RAPD

- AFLP
-Microsatlites
-SNPs

- Genes nucleares e mitocondriais

Marcadores moleculares
Eletroforese em gel - uma tcnica de separao de
macromolculas que envolve a migrao das mesmas em um
determinado gel durante a aplicao de uma corrente eltrica. As
molculas so separadas de acordo com o seu tamanho, as menores iro
migrar mais rapidamente que as de maior tamanho.

Marcadores moleculares
Genotipagem automtica anlise do produto amplificado em
sequenciador. O equipamento determinar o tamanho do fragmento
detectando a fluorescncia acoplada ao iniciador.

Marcadores moleculares
Isoenzimas variao allica de protenas.

- Eletroforese em gel de amido e visualizao do produto enzimtico por

mtodos histoqumicos;
-Diferenas na mobilidade de isoenzimas em um campo eltrico so
resultantes de diferenas ao nvel de sequncias de DNA que codificam tais
enzimas;
-Fentipo molecular - co-dominante.

Marcadores moleculares

Homozigoto

Heterozigoto

Marcadores moleculares
RFLP - Restriction Fragment Length Polymorphism
-polimorfismo no comprimento de
fragmentos obtidos por corte (com
enzimas de restrio) da fita dupla
de DNA ;
-co-dominantes.
PCR RFLP
- Amplificao de um dado gene e
posterior corte com enzimas de
restrio.

Marcadores moleculares
RFLP - Restriction Fragment Length Polymorphism

Anemia falciforme

PCR (Reao em Cadeia da Polimerase)

Amplificao in vitro de cidos nuclicos: aumento da
possibilidade de visualizar estas molculas

DNA molde (alvo)

Iniciadores
Nucleotdeos (dNTPs)
DNA polimerase
ons Magnsio (cofator da enzima)
Tampo (manuteno do pH timo)

Desnaturao: 95C
Anelamento: 55C
Extenso: 72C

25 a 40 ciclos

Marcadores moleculares
PCR Polymerase Chain Reaction

Marcadores moleculares
RAPD - Randomly
Polymorphic DNA

Amplified

-variao do protocolo de PCR, com

duas caractersticas distintas:
a) utiliza um primer nico ao
invs de um par de primers;
b) primer nico tem sequncia
arbitrria, e portanto sua
sequncia alvo desconhecida.
-dominantes

Marcadores moleculares

Heterozigoto ?

Homozigoto ?

Marcadores moleculares
AFLP

-Amplified Fragment
Length Polymorphism
- DNA total clivado com enzimas
de restrio;
-uma frao dos fragmentos
gerados

amplificada
seletivamente via PCR;
-rene a vantagem da PCR
especfica com a vantagem da
RAPD em se explorar sequncias
arbitrrias;
-dominante

Marcadores moleculares
MICROSSATLITES

-cada ilha microssatlite, (CA,

TG, ATG, etc.)constitui um loco
gentico
altamente
varivel,
multiallico, de grande contedo
informativo.
-cada segmento amplificado de
tamanho diferente representa um
alelo diferente do mesmo loco.

TTCGATTCTAAGGCCTTGCTAGCAGAAGC
CGGCGAATATCAGTTACACACACACACAC
ACACACACACACACACACACACACACACA
ACACTGTCTGCTAGGCTTCTGCTAGCAAG
GCCTTAGAATCACTAGTGAATTCGCGGCC
GCCT

Marcadores moleculares
Homozigoto

Heterozigoto

SINGLE NUCLEOTIDE POLYMORPHISMS

(SNPS)

Marcadores moleculares
SEQUENCIAMENTO