MICROBIOLOGIA GERAL/CURSOS REA DE SADE/FARMCIA/2015

APOSTILA PRTICA/TERICA

PRINCIPAIS TCNICAS DE COLORAO

BACTERIANA

I. COLETA
II. BACTERIOSCOPIA
III. METODOS DE COLORAAO: GRAM
E ZIEHL-NEELSEN
Profa. Dra Ana Laura Remdio Zeni Beretta
UNIARARAS
2015
Profa Dra. Ana Laura R. Zeni Beretta

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PASSOS FUNDAMENTAIS NO SUCESSO DAS COLORAES

O que coletar para diagnosticar uma infeco?
A coleta, a conservao e o transporte do material clnico constituem a base de todo o trabalho
microbiolgico, que culmina com a definio etiolgica do processo infeccioso. muito importante a
participao do laboratrio de Microbiologia na normalizao e superviso desses procedimentos. Nesse
sentido, a comunicao adequada entre o mdico e o microbiologista torna-se de grande importncia,
uma vez que nenhum dos mtodos disponveis isola todos os microrganismos patognicos conhecidos
nem os diferencia dos no patognicos. A escolha de determinado exame microbiolgico deve sempre
levar em conta a fase da doena suspeita, pois, dependendo da mesma, haver maior chance de isolar o
agente etiolgico especfico. Vrios cuidados devem ser observados na colheita de material clnico: a
amostra dever ser obtida em quantidade suficiente, (principalmente se houver solicitao de muitos
exames), antes da antibioticoterapia, em condies rigorosas que evitem contaminao, entre outros. A
manuteno e transporte adequado do material colhido so de vital importncia na recuperao do agente
infeccioso. O meio de transporte empregado dever manter a viabilidade bacteriana, mas no deve
permitir sua multiplicao. Por outro lado, preciso que o clnico solicitante d especial ateno aos
processos de coleta, conservao e transporte das amostras, orientando o paciente e aqueles que atuam
normalmente nessas atividades, de modo a assegurar eficcia nos procedimentos laboratoriais.
I- Coleta de material
a) O material deve ser representativo do processo infeccioso investigado, devendo ser eleito o melhor
stio da leso. Por exemplo: as crostas e os exsudatos das feridas devem ser removidos, uma vez que a
amostra apropriada vai localizar-se abaixo desse material. Devem ser tomadas as devidas precaues
para evitar a contaminao extrnseca nas punes de tecidos ntegros ou cavidades fechadas.
b) A coleta da amostra deve ser realizada, sempre que possvel, antes do incio da antibioticoterapia.
c) Quando vivel, preferir a colheita por aspirao com seringa e agulha, em substituio ao "swab", o
que reduz o risco de contaminao e de dessecao da amostra.
II- BACTERIOSCOPIA
Morfologia das bactrias ao microscpio ptico:
Objetivos
Conhecer caractersticas morfolgicas (dimenso, forma e tipo de associao) de bactrias ao
microscpio ptico.
Conhecer princpios e tcnicas de execuo de preparaes a fresco para microscpio ptico.
Executar e observar preparaes a fresco entre lmina e lamnula para visualizar a dimenso, a forma
e a mobilidade de clulas bacterianas.
Preparaes de microrganismos para microscpio ptico (colorao Gram)
Compreender princpios e qumica das coloraes diferenciais.
Executar e observar a colorao de Gram para visualizar a dimenso, a forma e o tipo de associao,
e para diferenciar os dois grupos de bactrias: Gram positivo e Gram negativo.
Esfregaos feitos a partir de meios de cultura lquidos ou slidos implicam tcnicas diferentes:
meios de cultura lquidos: mergulha-se a ala na suspenso microbiana e coloca-se diretamente no
centro da lmina; depois espalha-se, com o mesmo instrumento, de modo a ocupar uma rea de 1cm2.
meios de cultura slidos: coloca-se uma gota de gua destilada no centro da lmina; retira-se com a
ala uma pequena quantidade do inculo e suspende-se e homogeniza-se na gota; depois espalha-se a
suspenso de uma forma idntica anteriormente descrita.

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Qualquer tipo de tcnica para execuo de preparaes coradas envolve trs etapas idnticas e
fundamentais.
Executar o esfregao
Um esfregao consiste numa preparao seca de clulas microbianas numa lmina de vidro. Primeiro
importante que as lminas estejam limpas. Depois os microrganismos devem ser espalhados na lmina
em determinada concentrao de modo que fiquem adequadamente separados uns dos outros.
absolutamente essencial evitar esfregaos espessos, considera-se que um bom esfregao aquele que,
quando seco, aparece como uma fina camada esbranquiada.
Secar o esfregao
A secagem executada deixando a lmina ao ar ou colocando-a na estufa. Pode colocar-se a lmina
sobre dois dedos da nossa mo que mantida acima da chama do bico de Bunsen distncia que
conseguirmos suportar a intensidade do calor. A secagem deve ser feita pois com calor moderado (37C)
para que a gua seja evaporada lentamente e deste modo no ocorrer destruio ou distoro morfolgica
das clulas microbianas da preparao. importante uma boa secagem antes de se proceder fixao.
Fixar o esfregao
Esta etapa essencial pois se o esfregao no est fixado ao vidro da lmina ele vai ser removido durante
a fase de colorao.
A fixao pelo calor permite preservar a forma do microrganismo, mas alguns componentes celulares
podem ser danificados. Na fixao qumica (ex. etanol, formaldedo, glutaraldedo, etc.), geralmente,
no h destruio da estrutura das clulas que ficam fixadas lmina.
Durante o processo de fixao pelo calor (este deve ser mais forte do que na secagem) so inativadas as
enzimas que podiam alterar a morfologia celular, endurecidas as estruturas celulares para que no se
alterem durante a colorao e observao, dado que as protenas microbianas coagulam e fixam-se
superfcie da lmina. Para que as clulas fiquem aderentes ao vidro segura-se a lmina de um lado e
fazem-se 2 a 3 passagens pela chama do bico de Bunsen. Agora o esfregao est pronto para sofrer o
processo de colorao.
TIPOS DE COLORAO PARA MICRORGANISMOS:
1 Preparaes a fresco entre lmina e lamnula ou
2 Preparaes com colorao
2.1 Coloraes simples
Nestas coloraes o esfregao corado com um s reagente, de modo que todas as estruturas ficam
coradas da mesma cor. Os objetivos desta colorao so elucidar sobre a dimenso, a forma e o arranjo
das clulas microbianas.
Os corantes bsicos mais usados so o azul de metileno (cora em azul), o cristal violeta (cora em roxo),
a fucsina (cora em vermelho), o azul de metilo (cora de roxo) e o verde de malaquita (cora de verde).
Execuo prtica
Preparar o esfregao para ser corado (secagem e fixao).
Colocar a lmina no suporte prprio, cobrir a zona do esfregao com o corante indicado (gota a gota);
o tempo de exposio aproximadamente de 1 minuto.
Lavar com gua corrente para remover o excesso de corante, mantendo sempre a lmina paralela ao
jacto de gua para se reduzir a perda de fragmentos do esfregao.
Secar a preparao colocando-a entre duas folhas de papel de filtro, mas sem a esfregar .
Observar a preparao ao MO com objetiva de imerso.
2.2 Coloraes diferenciais
Envolvem mais do que um corante permitindo distinguir diferentes estruturas e tipos de clulas
microbianas pois, coram de cores diferentes. Permitem separar os microrganismos em grupos, pois
distinguem pelo menos dois tipos de comportamento diferente, ou seja, microrganismos com

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caractersticas de colorao diferentes. Duas das tcnicas mais importantes so o Gram e o ZiehlNeelsen. Servem tambm para corar especificamente certas estruturas microbianas como flagelos,
endsporos, cpsula, gorduras, etc.
As coloraes diferenciais requerem o uso de vrios reagentes qumicos aplicados sequencialmente:
corante primrio: o primeiro reagente a ser usado e a sua funo transmitir a sua cor a todas as clulas
da preparao.
mordente: substncia que aumenta a ligao do corante ao microrganismo. Os mais utilizados em
bacteriologia so: soluo de lugol (iodo), o calor e o cido fnico, mas o seu uso no obrigatrio em
todas as coloraes.
descorante: este reagente uma substncia que descora certos microrganismos anteriormente corados.
Baseando-se na composio qumica dos componentes celulares este agente descorante pode ou no
remover o corante primrio de toda a clula ou apenas de algumas estruturas celulares. Utilizam-se o
lcool-acetona e o lcool-cido, alcool a 95%.
Contra corante ou corante de contraste: o ltimo reagente a ser aplicado e tem uma cor que contrasta
com o corante primrio. Aps a descolorao se o primeiro corante no retirado o corante de contraste
no pode ser absorvido e a clula ou os seus componentes retm a cr do corante primrio. Se o corante
primrio foi removido ento os componentes celulares descorados absorvem e apresentam a cor do
corante de contraste. Assim, as clulas ou as suas estruturas podem ser distinguidas uma das outras
atendendo ao corante que retido por cada uma delas.
2.3 Colorao negativa
Trata-se de uma colorao especial que requer o uso de um corante cido, como a eosina e a nigrosina,
ou de tinta da china (suspenso de partculas de carbono). Este tipo de corante, como carregado
negativamente, no vai penetrar na parede celular que tambm est carregada negativamente. Assim, as
clulas no so coradas, mas distinguem-se facilmente do fundo corado da preparao.
A aplicao da colorao negativa permite observar a dimenso e forma naturais das clulas, pois no
necessria a fixao do esfregao pelo calor nem sujeitar as clulas aos efeitos agressivos dos qumicos.
Consiste em fazer um esfregao fino obtido por mistura homogenea da suspenso microbiana com o
corante cido ou a tinta da china (1/1 com gua destilada) de modo que o corante se deposita na lmina,
deixando apenas em branco os espaos ocupados pelas bactrias (as clulas aparecem com aspecto
claro num fundo escuro).
Execuo prtica
Colocar uma gota do corante ou de tinta da china numa ponta da lmina.
Colocar a ala com o inculo na gota e mexer fazendo uma pequena suspenso.
Com a ajuda de uma segunda lmina fazer um esfregao fino (para a luz do microscpio o atravessar),
arrastando-a em ngulo de 30 sob a primeira lmina.
Secar ao ar e no proceder fixao.
Observar ao MO com objetiva de imerso.
III- PRINCIPAIS MTODOS DE COLRAO:
A. COLORAO GRAM
As caractersticas da parede celular das bactrias que determinam a reao de Gram, uma tcnica
diferencial, a qual permite a separao destes microrganismos em dois grandes grupos: as Grampositivas e as Gram-negativas. Porm no se aplica para micoplasmas, bactrias desprovidas de parede,
para Micobactrias pela presena de muitos lipdios insolveis na parede e espiroquetas pela estrutura
muito delgada e pouco permevel aos corantes. Este tem sido um dos principais critrios utilizados na
taxonomia de bactrias. A colorao de Gram recebeu este nome em homenagem a seu descobridor, o
mdico dinamarqus Hans Cristian Joaquim Gram. Em 1884, Gram observou que as bactrias

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adquiriram cores diferentes, quando tratadas com diferentes corantes. Isso permitiu classific-las em
dois grupos distintos: as que ficavam roxas, que foram chamadas de Gram-positivas, e as que ficavam
vermelhas, chamadas de Gram-negativas. Um mtodo tintorial predominante utilizado em bacteriologia
Essa tcnica simples, rpida e tem capacidade de resoluo, permitindo o correto diagnstico em cerca
de 80% dos pacientes em carter de pronto atendimento em nvel local. Esta tcnica considerada um
instrumento essencial para classificao, identificao e caracterizao de microrganismos.
Esta tcnica utiliza 4 reagentes diferentes:
1) corante primrio: cristal violeta
o primeiro a ser usado e cora todas as clulas de roxo.
2) mordente: lugol (soluo de iodo)
Este reagente uma substncia que forma um complexo insolvel ligando-se ao corante primrio. O
complexo resultante serve para intensificar a cor do corante, ou seja, o lugol ajuda o cristal violeta a
penetrar nas clulas e a resistir descolorao. Nas bactrias Gram positivo este complexo mais difcil
de ser removido do que nas bactrias Gram negativo.
3) descorante: lcool-acetona (ou lcool etlico a 95 %)
Este reagente serve de solvente de lpidos e de agente desidratante das protenas. Assim, a sua ao
determinada pela concentrao lipdica das paredes celulares microbianas. Nas clulas Gram positivo a
concentrao baixa de lpidios importante para reter o complexo corante-mordente. Os lipidos so
dissolvidos pela ao do lcool causando a formao de pequenos poros na parede celular. Mas estes
so prontamente fechados pela ao desidratadora do lcool e como consequncia o corante primrio
difcil de ser removido e as clulas mantm-se roxas. Nas clulas Gram negativo a alta concentrao de
lipdios na membrana externa da parede celular dissolvida pelo lcool, formando-se grandes poros na
parede celular que no fecham apreciavelmente durante a desidratao das protenas da parede celular.
Isto facilita a libertao do complexo corante-mordente deixando as clulas incolores.
4) corante de contraste ou contra-corante: fucsina diluda (ou safranina)
Este o ltimo reagente a ser aplicado e cora de vermelho as clulas que foram previamente descoradas.
Uma vez que as clulas Gram negativas ficaram descoradas elas podem agora absorver o corante de
contraste. As clulas Gram positivas mantm a cor do corante primrio.
A diferena na colorao das bactrias Gram positivas e Gram negativas deve-se resistncia
descolorao pelo lcool:
Bactrias Gram +: so aquelas que retm o corante inicial e aparecem coradas de roxo.
Bactrias Gram -: so aquelas que perdem o corante inicial quando lavadas com o lcool-acetona ou
alcool a 95% e depois coram de vermelho com o corante de contrate.
As bactrias Gram-positivo apresentam uma parede espessa, homognea, geralmente no estratificada
e predominantemente constituda por peptideoglicano Gram-positivas a parede celular formada
principalmente por cidos teicicos. Por possurem grande quantidade de cidos teicicos, aps a
colorao, as Gram-positivas formam um complexo corado azul intenso, que no removido facilmente
com lcool-acetona.
As bactrias Gram-negativas apresentam uma parede estratificada, mais complexa que a das Gram
positivo, constituda por uma camada externa (constituda por lipossacarideos e lipoprotenas)
formada principalmente por lipdeos, e por uma camada mais interna que contm peptideoglicano ( mais
fina que a das Gram-positivo). As Gram-negativas no retm a colorao aps o tratamento com lcoolacetona e so reveladas posteriormente com soluo de fucsina ou safranina, apresentando-se na
colorao avermelhada.

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ESQUEMA DA PAREDE CELULAR DE BACTRIAS GRAM NEGATIVA E POSITIVA

Observaes importantes:
medida que as clulas envelhecem,
especialmente no caso das clulas Gram positivas,
os microrganismos tendem a perder a capacidade
de reteno do corante primrio e podem surgir
como Gram variveis: umas clulas coram de roxo
(Gram positivo) e outras de vermelho (Gram
negativo).
A maioria dos cocos Gram-positiva com
exceo dos gneros Neisseria e Veillonella que
so os nicos Gram-negativos; entre os bacilos
Gram-positivos incluem-se aqueles pertencentes
aos gneros Corynebacterium, Listeria, Bacillus,
Lactobacillus e Clostridium; os demais bacilos so
Gram-negativos (a maioria); os vibries so Gram
negativos.
A investigao das caractersticas morfolgicas e
de colorao (morfo-tintoriais) das bactrias etapa
inicial de grande importncia no isolamento e
identificao de bactrias de material clnico bem
como de alimentos. No entanto, a identificao
completa de uma bactria sempre necessitar de
dados fisiolgicos ou genticos da mesma.
ROTEIRO PRTICO PARA COLORAO DE GRAM:
OBJETIVOS
Aprender a preparar esfregao de bactrias;
Aprender o fundamento do mtodo de colorao de Gram;
Comparar a estrutura da parede celular das bactrias Gram-positivas e Gram-negativas;
Permitir a observao da morfologia bacteriana e fornecer informaes a respeito
do
comportamento do seu material celular diante dos corantes de Gram.
MATERIAL
Lminas
Kit colorao de Gram
Bico de Bunsen
Ala de platina
Cultura padro de: Escherichia coli, S. aureus e Bacillus cereus em BHI
Microscpio e leo de imerso.
PROCEDIMENTO TCNICO: Como fazer?
Fazer um bom esfregao e fix-lo ao fogo;
Cobrir o esfregao com a soluo de cristal-violeta (A), por 1 minuto;
Escorrer o corante aps o tempo determinado;
Cobrir o esfregao com a soluo de iodo/lugol (B), por 1 minuto;
Escorrer o corante aps o tempo determinado;
Descorar a lmina com a mistura lcool-acetona ou lcool 95%, at que o solvente escorra
incolor;

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Lavar com filetinho de gua corrente;

Cobrir o esfregao com a soluo de fucsina fenicada (C) diluda, por cerca de 30 segundos;
Escorrer o corante aps o tempo determinado e lavar com gua corrente;
Deixar secar ao ar e observar em microscpio ptico sob imerso.
As bactrias Gram-positivas retm o cristal-violeta e se apresentam com colorao violeta
enquanto as Gram-negativas so descoradas pelo lcool-acetona ou lcool 95%, e ficam coradas
em vermelho pela fucsina.

fundamental que o esfregao fique totalmente coberto com cada um dos reagentes e que o
reagente anterior seja completamente removido antes de se adicionar o seguinte.
Quando examinadas ao microscpio tico, usando objetiva de imerso, as bactrias gramnegativas aparecem coradas de vermelho e as gram-positivas de roxo (violeta azulado).
Solues em ordem de
aplicao
1- Cristal violeta - CV
2- Soluo de iodo (lugol)- I

3- lcool

4- Fucsina ou safranina

Gram positivas

Gram negativas

Clulas coradas em violeta

Clulas coradas em violeta
Formao do complexo CV-I no Formao do complexo CV-I no interior
interior
das
clulas,
que das clulas, que permanecem violetas
permanecem violetas
Desidratao
das
paredes Extrao dos lipdios da parede celular,
celulares,
diminuio
da aumentando a porosidade: O complexo
porosidade e da permeabilidade: CV-I removido das clulas
o complexo CV-I no pode sair
das clulas que permanecem
violetas.
As clulas no so afetadas, As clulas tomam o corante, tornando-se
permanecendo violetas.
vermelhas.

Vi
Lulu
Ali
A
Fumar
Algo
Cristal
Lugol
lcool gua
Fucsina gua
Violeta
Interpretao
O mecanismo da colorao de Gram se refere composio da parede celular, sendo que as Grampositivas possuem uma espessa camada de peptideoglicano e cido teicico, e as Gram-negativas, uma
fina camada de peptideoglicano, sobre a qual se encontra uma camada composta por lipoprotenas,
fosfolipdeos, protenas e lipopolissacardeos. Durante o processo de colorao, o tratamento com
lcool-acetona extrai os lipdeos, da resultando uma porosidade ou permeabilidade aumentada da
parede celular das bactrias Gram-negativas.
Assim, o complexo cristal violeta-iodo (CVI) pode ser retirado e as bactrias Gram-negativas so
descoradas. A parede celular das bactrias gram-positivas, em virtude de sua composio diferente,
torna-se desidratada durante o tratamento com lcool-acetona, a porosidade diminui, a permeabilidade
reduzida e o complexo CVI no pode ser extrado.
Outra explicao baseia-se tambm em diferenas de permeabilidade entre os dois grupos de bactrias.
Nas Gram-positivas, o complexo CVI retido na parede aps tratamento pelo lcool-acetona, o que
causa, provavelmente, uma diminuio do dimetro dos poros da camada de glicopeptdeo ou
peptideoglicano da parede celular. A parede das bactrias Gram-negativas permanece com porosidade
suficientemente grande, mesmo depois do tratamento com lcool acetona, possibilitando a extrao do
complexo CV-I.

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Esquematize suas lminas observadas ao MOC

GRAM NEGATIVA

GRAM POSITIVA

GRAM POSITIVA

B. COLORAO DE ZIEHL-NEELSEN
INDICAO
o mtodo de escolha para a pesquisa de bacilos lcool-cido resistentes (BAAR), incluindo os bacilos
da tuberculose, hansenase e Micobactrias atpicas. Nocardia e Actinomyces coram-se irregularmente
por esse processo.
MATERIAL
Soluo de fucsina fenicada
Mistura lcool-cido 3%
Soluo de azul de metileno
Cepas de BAAR (Micobactrias)
PROCEDIMENTO TCNICO
fazer um bom esfregao e fix-lo ao fogo;
cobrir o esfregao com soluo de fucsina fenicada;
com o auxlio de uma chama, aquecer a lmina pela sua parte inferior, at que desprenda vapor, no
deixando ferver nem secar.
Aps, deixar o corante agir por 3 a 5 minutos.
escorrer o corante aps o procedimento anterior;

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descorar com mistura lcool-cido at no sair mais corante;

lavar com gua corrente;
cobrir a lmina com azul de metileno durante 20 a 30 segundos;
escorrer o corante aps o tempo determinado e lavar com gua corrente;
deixar secar ao ar e observar em microscpio ptico sob imerso.
Os bacilos lcool-cido-resistentes retm a fucsina fenicada, apresentando-se com colorao
avermelhada, enquanto que os microrganismos no lcool-cido-resistentes apresentam
colorao azulada.

CONCLUSO DA AULA:
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