Fundamento Terico das Aulas Laboratoriais

O material biolgico a ser estudado deve ser rico em organitos especficos e extremamente
activos na via metablica em estudo. Por exemplo:

Fgado mitocndrias
Hepatcitos lisossomas
Timo ncleos

Homogeneizao de tecidos
Procede-se a uma ruptura dos tecidos e membranas celulares com consequente libertao do
contedo intracelular.
Existem 3 tipos de homogeneizadores mecnicos:

Homogeneizador de lminas
o Parecido
com
uma
varinha
mgica
de
cozinha
o Usado para tecidos duros
(como o tecido muscular)
o O tecido cortado em
pequenos
pedaos
e
triturado na presena de
tampo, durante 1 minuto
o Apresenta
como
desvantagem ser uma
homogeneizao violenta
e indiscriminada, levando
desintegrao de parte
dos organitos
o usado para doseamento
de compostos celulares
solveis (como protenas,
lpido, cidos nucleicos)

Imagem

homogeneizador

de

lminas

1
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Homogeneizador de mbolo (Potter-Elvehjem)

o Utilizado para tecidos moles e friveis (como fgado, crebro)
o O tecido cortado em pequenos pedaos e homogeneizado na
presena de um tampo
o Tem como vantagem a boa preservao da estrutura e funo dos
organitos celulares
o As amostras devem ser mantidas em gelo

Imagem 2
homogeneizador
de mbolo

Homogeneizador de ultra-sons
o Utilizado para vrios tipos
de tecido, suspenses de
clulas
ou
culturas
microbianas
o Uma sonda de ultra-sons
gera ondas sonoras de alta
frequncia durante 30 a
60s, levando lise celular
o uma homogeneizao
rpida, mas bastante
violenta
o ideal para pequenos
volumes
o As amostras devem ser
mantidas em gelo

Imagem

homogeneizador

de

ultra-sons

O meio de homogeneizao constitudo por:

Soluo salina isotnica e tamponada (tampo Hepes-NaOH, pH 7,4) que rompe a

membrana mas mantm a integridade dos organitos atravs da presso osmtica
constante, e contm:
o Sacarose (pode influenciar ensaios enzimticos)
o Manitol/sorbitol
Agente quelante (aprisiona os ies Ca2+ e/ou Mg2+ de forma a inactivar protases
membranares)
o EDTA (cido Etilodiamino Tetractico)
o EGTA (cido Etileno Glicol Tetractico)

2
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Fraccionamento celular
O homogeneizado obtido anteriormente composto por uma suspenso de algumas clulas
intactas, organitos celulares e fragmentos de partculas intracelulares de tamanho e
composio diferentes (protenas, lpidos, cidos nucleicos). Estes componentes apresentam
todos densidades diferentes.

Esquema 1 etapas da homogeneizao por Potter-Elvehjem

Assim, recorremos centrifugao para separ-los. Devido s massas e densidades diferentes

de cada componente celular, conseguimos delinear a ordem de sedimentao de cada um
deles:

Clulas intactas e restos celulares (debris)

Ncleos
Cloroplastos
Mitocndrias
Lisossomas e outros microcorpos
Microssomas (fragmento do retculo endoplasmtico)
Ribossomas

+ pesado

+ leve

A centrifugao baseia-se na teoria de que todos as partculas sedimentam sob a influncia da

fora gravtica. Assim, as partculas sedimentam mais depressa se lhes aplicarmos uma fora
maior do que a fora gravitacional terrestre.
Esta fora definida por:
m massa das partculas
w velocidade angular do rotor
r raio do rotor
Esta fora expressa em termos de gravidade, atravs da Fora Centrfuga Relativa (FCR):
, onde g acelerao da gravidade
Esta medida pode ser expressa em rpm (rotaes por minuto), em vez de g, atravs da
utilizao de um normograma ou da seguinte frmula:
3
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(

, onde rpm o nmero de rotaes por minuto

Imagem 4 Normograma de converso de g em rpm

Ainda existe outra medida, o coeficiente de sedimentao, que caracterstico para cada
partcula/molcula, podendo ser usado para calcular a velocidade e FCR adequadas:
, expresso em Svedberg (S)
A centrifugao pode ter diferentes aplicaes, sendo:

Preparativa
o Isolamento e purificao de organitos celulares e outros componentes
o Grandes quantidades de material (como um meio de cultura)
Analtica
o Medies analticas de propriedades hidrodinmicas de macromolculas
purificadas ou organitos celulares
Estudo de macromolculas ou partculas puras
Pequenas quantidades de material
Usada para determinar forma, tamanho, densidade e caractersticas
de sedimentao

Existem, tambm, alguns tipos de centrifugao:

Centrifugao diferencial (sucessivas centrifugaes)

o Sedimentam primeiro as partculas maiores
4

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o
o

Em partculas com igual massa/tamanho, mas densidades diferentes,

sedimentam primeiro as mais densas
As partculas com densidades semelhantes (como os organitos) so
separadas se houver uma diferena de tamanho/massa superior a 10x
Mtodo mais usado para isolar organitos celulares a partir de um
homogeneizado
Resulta num meio com viscosidade e densidades diferentes
Precipitado (mais denso)
Sobrenadante
Tem como vantagens:
Ser rpida e simples
Os organitos no sofrem stress osmtico
Tem como desvantagens:
Resulta em precipitados heterogneos
Depende apenas da velocidade de centrifugao

Esquema 2 Centrifugao diferencial

5
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Centrifugao em gradiente de concentrao

o Zonal
Gradiente de densidade fraco (at
1,28 g/mL), previamente formado
Gradiente de solutos de baixo peso
molecular (sacarose ou glicerol)
A amostra aplicada no topo do
gradiente
A separao baseada no tamanho Esquema 3 centrifugao zonal
(no serve para separar organitos
de tamanhos iguais e apenas separa partculas de diferentes
densidades se a diferena de tamanhos for superior a 3x)
Utiliza um rotor oscilante
O fim da centrifugao dado antes de se formar precipitado
o Isopcnica
Gradiente de densidade forte (superior a 1,28 g/mL)
O gradiente formado durante a centrifugao (contnuo)
Gradiente de solutos de elevado peso molecular (cloreto ou sulfato de
csio, sacarose, slica coloidal) as partculas flutuam na zona do
tubo de igual densidade
Utiliza um rotor oscilante
Separao baseada na densidade
No separa protenas solveis (igual densidade)
ptima para separar organitos celulares

A formao do gradientes de densidade pode ser feita atravs de:

Autoformao (contnuo)
Sistema misturador (contnuo)
Mtodo de difuso (descontnuo) sobreposio de camadas

Esquema 5 sistema misturador

Esquema 4 diferentes gradientes de densidade

6
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O isolamento das bandas resultantes da centrifugao pode ser realizado por:

Pipeta
Pasteur

de

Seringa
hipodrmica

Agulha fina

Bandas visualmente detectadas

No necessrio remover o
gradiente

Perfura-se o lado lateral do

tubo de centrfuga

Perfura-se o fundo do tubo de

centrfuga
usado quando no h
precipitados
tambm usado um colector
de fraces

Os aparelhos usados na centrifugao as centrfugas so constitudos por um motor

elctrico com um eixo para rodas as amostras e um rotor (amovvel) para suportar os tubos
ou outras recipientes que contenham as amostras. Podem ser:

Centrfugas pequenas e/ou de baixa velocidade

o At 3000g (4000-5000rpm)
Exceo: microcentrfugas (16000g)
Centrfugas refrigeradas de elevada velocidade/capacidade
o At 40000g (5000 a 25000rpm)
o Tm sistemas de controlo de temperatura
o Podem trabalhar sobre vcuo
Ultracentrfugas
o At 500000g
o Tm sistemas de controlo de temperatura
o Podem trabalhar sobre vcuo
Imagem 5 Microcentrifuga

7
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Imagem 6 - ultracentrfuga

Imagem 7 centrfuga de elevada

capacidade

Quanto aos tipos de rotores, existem:

Tubos oscilantes ou basculantes

o Comeam na posio vertical, mas, durante a acelerao do rotor, oscilam
para a posio horizontal
o Durante a centrifugao, o tubo est perpendicular ao eixo de rotao e
paralelo fora centrfuga
o Durante a desacelerao, o tubo volta posio vertical
o utilizado para os dois tipos de centrifugao (diferencial e de gradiente de
densidade)

Imagem 6

Esquema 6 centrifugao com rotores de tubos oscilantes

ngulo fixo
o Os tubos esto colocados em buracos no corpo do rotor
num ngulo fixo de 10 a 40 em relao vertical
o Durante a centrifugao, devido fora centrfuga, as
partculas colidem e agregam-se na parede do tubo e a
zona com maior densidade (precipitado) acaba por
afundar
o utilizado nas centrifugaes diferenciais
Esquema 7 centrifugao
com rotor de ngulo fixo

8
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Verticais (0)
o Os tubos esto sempre alinhados verticalmente
o Durante a centrifugao, a soluo encontra-se perpendicular aos eixo e
paralela fora centrfuga, voltando posio original durante a
desacelerao
o utilizada na centrifugao de gradiente de densidade

Esquema 8 centrifugao com rotor vertical

NOTA:
Cuidados a ter com os rotores:
O filme protector de alumnio dos rotores muito fino e no confere proteco total
contra a corroso (o uso de solues cidas, bsicas e salinas pode danificar o rotor)
Equilibrar as amostras para evitar danos no eixo de rotao
Se pretendermos estudar a funcionalidade do organito, essencial avaliar a integridade dos
organitos isolados. Para isto, usa-se marcadores de organitos especficos, como as enzimas
(por exemplo, a catalase identifica peroxisomas e a citocromo oxidase as mitocndrias).
No entanto, necessrio fazer mais do que um ensaio pois as enzimas podem ser inibidas
durante o fraccionamento. tambm necessrio escolher com astcia a enzima pois algumas
identificam mais do que uma fraco subcelular particular.

Quantificao de Protenas Totais

Aps o isolamento das mitocndrias, pode-se proceder ao doseamento das suas protenas
atravs do mtodo de Bradford:

O reagente de Bradford (soluo cida de Azul Brilhante de Coomassie G-250) tem a

capacidade de se ligar a determinados aminocidos das protenas. Esta ligao altera a
absorvncia o reagente de 465nm para 595nm
sensvel entre 1 a 20g (micromtodo) e entre 20 a 200g (macromtodo)
Detergentes e tampes fortes interferem na ligao
Tem como vantagens:
9

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o
o
o
o
o
o
o
o
o
o

Elevada sensibilidade (maior do que a do mtodo de Lowry)

Ser muito simples
Ser muito rpido (a cor desenvolve-se em 2 minutos)
efectuado temperatura ambiente
feito num nico passo
Boa exactido
A cor estvel durante 1 hora
Existem poucos interferentes
Permite trabalhar a 250L, 1 mL e at 5,5mL
Permite a utilizao de clulas de espectrofotometria de plstico e vidro (mais
baratas que as de quartzo)
Tem como desvantagens:
o destrutivo no permite a reutilizao das protenas)
o inadequado para protenas de membrana por ser incompatvel com
detergentes
o A cor desenvolvida varia com o contedo de aminocidos bsicos (como a
arginina e a lisina) da protena
o Muitas vezes ocorre a formao de precipitado
o Mancha as clulas espectrofotomtricas, tendo ser utilizado material
descartvel

A separao de protenas pode efectuar-se com base em:

Propriedades cido-base
o Cromatografia de troca inica
o Electroforese
Diferenas de solubilidade
o Adio de cidos
o Adio de bases
Dimenses moleculares
o Ultracentrifugao
o Cromatografia de excluso molecular ou Gelfiltrao
Afinidade para outras molculas (metais, anticorpos)
o Cromatografia de afinidade

10
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Focando o nosso estudo na electroforese, esta tcnica baseia-se no facto de:

Uma partcula carregada migrar sob a influncia de um campo elctrico

Os ies ou grupos com carga elctrica efectiva migrarem num campo elctrico para o
ctodo (+) ou para o nodo (-), dependendo da sua carga
As protenas apresentarem carga a qualquer valor de pH diferente do seu ponto
isoelctrico, sofrendo migrao cuja velocidade depende da razo carga/massa
(densidade de carga)
Um campo elctrico ser removido antes de as molculas chegarem aos elctrodos,
sendo os seus constituintes separados de acordo com a sua velocidade de migrao
Ser uma forma incompleta de electrlise

Equipamento utilizado numa electroforese:

Fonte de energia (gera voltagem e corrente constantes)

Tampo
Unidade de electroforese (horizontal ou vertical)
o A reservatrio de tampo inferior
o B reservatrio de tampo superior
o C tampa
o D molde para mini-gis verticais
o E placas de vidro e alumnio
o F seringa de aplicao
o G espaadores
o H pentes
o

I molas

Imagem 8 equipamento utilizada numa electroforese

Montagem da unidade:

O gel formado entre duas placas (vidro ou alumnio), mantidas unidas mas separadas
por espaadores de plstico, sendo colocadas num suporte e presas com colas at
polimerizao do gel
Um pente de plstico colocado na soluo do gel durante a polimerizao para
formar os poos para aplicao das amostras, sendo depois retirado e os poos
lavados com tampo para remover sais e acrilamida
A placa de fel fixada entre 2 reservatrios de tampo e consequentemente tapada
O tampo do tanque de electroforese inferior envolve as placas de gel, conseguindo
arrefece-las, sendo este necessrio para manter um estado de ionizao constante das
molculas a serem separadas (uma variao de pH altera a carga global da molcula,
alterando a velocidade de migrao)
Os reagentes devem ser de elevada qualidade pois as impurezas podem influenciar a
electroforese no gel

11
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A aplicao da amostra feita em cada poo, seguida da aplicao da voltagem.

Esquema 9 aplicao da amostra nos poos do gel

Na electroforese podem ser usadas matrizes do tipo:

I (papel, acetato de celulose, slica gel, celulose)

o Materiais inertes que servem essencialmente de suporte
o A separao das protenas processa-se atravs da densidade de carga a
determinado pH
o Com excepo do acetato de celulose, estas matrizes so pouco utilizadas
II (agarose, amido e poliacrilamida)
o So gis (o primeiro a ser utilizado foi o de amido)
o Possuem poos (cuja dimenso vai influenciar a migrao e separao)

Uma das principais electroforeses realizadas a electroforese em gel de poliacrilamida (PAGE).

Este gel pode ser preparado a partir de reagentes altamente purificado e de forma
reprodutvel:

Vantagens:
o Boa resoluo (possuem uma vasta gama de tamanhos de poros)
o Transparncia
o Estabilidade fsica (sob uma variedade de valores de pH, temperatura e fora
inica)
o Inrcia qumica (praticamente no interage com as molculas a serem
separadas)
o Dimenso de poros muito varivel (permite a aplicao de grandes quantidade
de amostra)
o Grande reprodutibilidade
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o

Efeito electroendosmtico (fluxo de gua para o exterior induzido pelo campo

elctrico) desprezvel
o Aplicvel escala macro e micro
Desvantagens:
o um neurotxico (uma soluo de 1% pode causar irritaes cutneas e
distrbios do SNC, sendo possivelmente at cancergena)
o Os seus catalisadores e iniciadores (como o persulfato de amnio) so tambm
txicos

A polimerizao deste gel d-se pela formao de longas cadeias de bisacrilamidas (duas
molculas de acrilamida ligadas por um metileno) interligadas numa rede, sendo uma catlise
por radicais livres, iniciada pela adio de persulfato de amnio (S2O82) e de uma base N, N, N,
N tetrametiletilenodiamina (TEMED), que cede um electro:
S2O82- + e- SO42- + SO4-
A PAGE baseia-se na separao por tamanho e, para isso, h que se
proceder a uma uniformizao da carga e desnaturao das protenas,
atravs de gis desnaturantes:

A mistura proteica desnaturada por aquecimento a 100C, na

presena de um excesso de SDS (detergente dodecil sulfato de
sdio) e de um tiol (-mercaptoetanol), o que reduz as ligaes
dissulfureto, destruindo as estruturas da protena
o O SDS alm de romper as estruturas proteicas, liga-se s
mesmas numa proporo de 1 SDS : 2 aminocidos
As cargas intrnsecas das protenas so insignificantes, quando
comparadas negatividade do SDS, e, como este se ligou s
cadeias, todas apresentam a mesma carga (negativa)

Assim, a electroforese ocorre de acordo apenas com o tamanho das

molculas separadas:

Esquema 10 associao do SDS

Esquema 11 electroforese dependente apenas da massa

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Quando se pretende preservar a conformao das protenas e a sua actividade biolgica,
utilizam-se gis nativos/no desnaturantes).

J na preparao da amostra, h que ter em conta vrios aspectos:

Quantidade de amostra utilizada

o Sobrecarga da amostra conduz distoro das bandas no gel
o Insuficincia impede a deteco das mesmas
Desnaturar sempre antes da aplicao
Composio adicional do tampo:
o Sacarose (ou glicerol) confere densidade amostra e impede que esta se
mistura com o tampo de migrao
o Azul de bromofenol corante ionizvel que permite ver a linha da frente da
electroforese, permitindo a monitorizao da corrida

Nesta electroforese tambm so usados dois tipos diferentes de gis:

Concentrao (com tampo Tris-HCl, pH 6,8) apresenta poros largos, o que permite
uma aplicao de grande quantidade de amostra
Separao/Resoluo (com tampo Tris-HCl, pH 8,8) apresenta poros finos, o que
leva a uma melhor separao dos componentes da amostra

Isto implica uma escolha da concentrao de acrilamida, factor crtico para a separao ptima
dos componentes da mistura proteica.

Esquema 12 electroforese com gel de concentrao e gel de separao

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Aps a corrida, necessrio recorrer a uma colorao
das bandas, a fim de se poder quantificar o seu teor.
Usa-se uma soluo de metanol : gua : cido actico
glacial com 1% de corante Azul Brilhante de Coomassie,
o que leva a uma fixao das protenas enquanto o gel
corado. Recorre-se, depois, a uma lavagem com uma
soluo diferenciadora que leva remoo do corante
no ligado s protenas, ficando estas visveis como
Imagem 9 - electroforograma

bandas azuis num fundo transparente.

Esta colorao sensvel at cerca de 0,1g de protena, o que, nalguns casos, insuficiente,
sendo necessria a utilizao de nitrato de prata, que apresenta uma sensibilidade at cerca
de 0,1ng.
Por fim, para se proceder sua quantificao propriamente dita, regra geral, efectua-se uma
densitometria:

O gel corado passa atravs de um feixe de luz, medindo-se a luz

transmitida
definido um grfico dos picos de absorvncia em funo da
distncia de migrao, calculando-se a rea dos picos para
obteno da sua concentrao, tendo como desvantagens:
o A linearidade entre concentrao e absorvncia apenas
observvel numa gama limitada de concentraes
o Muitas vezes, quantidades iguais de protena no coram da
mesma maneira

Em alternativa, pode-se recorrer a uma espectrofotometria a 605nm,

cortando as bandas e eluindo-as em 50% de piridina.

Esquema 13 grfico de
densitometria

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Os lpidos so um grupo de compostos quimicamente muito diversos, tendo como

caracterstica comum a insolubilidade em gua (apenas so solveis em solventes orgnicos
como o ter). Apresentam diferentes funes biolgicas, associadas sua estrutura qumica:

Gorduras e leos (armazenamento de energia)

Fosfolpidos e esteris (membranas biolgicas)
Co-factores enzimticos
Transportadores de electres
Pigmentos
Agentes emulsificantes
Hormonas
Mensageiros intracelulares

Focando o nosso estudo nos fosfolpidos, estes so compostos inicos e polares, constitudos
por um lcool e diacilglicerol ou esfingosina (ligados atravs de uma ligao fosfosdister).
Apresentam caracterstica anfipticas, ou seja, uma cabea hidroflica e uma cauda
hidrofbica.

Esquema 14 estrutura de um fosfolpido

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Os fosfolpidos podem ser de duas classes:

Glicerol (glicerofosfolpidos ou fosfogliceridos)

Esfingosina

Ambos entram na constituio das membranas, mas os glicerofosfolpidos apresentam outras

funes:

Blis (solubilizam o colesterol)

ncoras de algumas protenas membranares
Componente do surfactante pulmonar (lquido existente nos alvolos)

Os glicerofosfolpidos so a maior classe de fosfolpidos e todos contm cido fosfatdico

(fosfoglicerido mais simples e percursor dos restantes da classe).

Esquema 15 estrutura de um glicerofosfolpido

Tendo em conta estas caractersticas, para o estudo das suas funes biolgicas e a sua
proporo em clulas e tecidos, durante a sua extraco e fraccionamento, necessrio o uso
de solventes orgnicos e mtodos pouco usuais no estudo de glcidos e protenas (como o
Mtodo de Folch).
As misturas lipdicas so separadas por diferenas de solubilidade e de polaridade dos seus
constituintes, em solventes no polares.
Os lpidos que apresentam cidos gordos ligados atravs de ligaes ster ou amida podem ser
hidrolisados por cidos, bases e enzimas especficas como a fosfolipase.
Para a extraco, atravs do mtodo de Folch, homogeneiza-se o tecido em estudo num
solvente de extraco composto por clorofrmio e metanol (alm de gua) que reduzem as
interaces hidrofbicas entre os lpidos e as foras electrostticas, bem como as ligaes de
hidrognio, que os ligam s protenas membranares. Esta homogeneizao origina duas fases,
resultado da diferena de solubilidade:

Orgnica (precipitado denso de lpidos)

Aquosa (protenas e glcidos)

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Para a separao da fase orgnica (que contm os lpidos totais), recorre-se a tcnicas de
cromatografia, baseadas nas diferenas de polaridade entre os lpidos:

Cromatografia de adsoro em coluna

Cromatografia de adsoro em placa (cromatografia em camada fina)

Na cromatografia em camada fina, aplicamos a amostra (extracto lipdico) numa placa de slica
(que est sobre vidro), placa esta que posta verticalmente numa cmara cujo fundo est
preenchido com uma mistura de solventes orgnicos. Por capilaridade, o solvente arrasta os
lpidos, separando-as porque os que apresentam menor polaridade sofrem uma maior
migrao pois existe uma menor afinidade com a slica.
Quando se aplica a amostra, tambm se aplicam amostras-padro para identificar o tipo de
fosfolpido presente.

- polar

+ polar

Para a quantificao dos fosfolpidos, pode-se recorrer sua revelao por fluorescncia
(ridamina) ou com exposio a vapores de iodo que tem como desvantagem o facto de a
reaco com os cidos gordos ser reversvel, tendo de ser delineadas as manchas castanhas,
resultantes da reaco, antes de desaparecerem.
Depois de marcados e identificadas as manchas, estas so raspadas e eludas em cido
perclrico (PCA), levando mineralizao do fsforo orgnico presente nos fosfolpidos. Uma
vez inorgnico, adiciona-se molibdato de amnio, com o qual reage, na presena de cido
amino-naftol-1-sulfnio (ANSA), originando cido fosfomolbdico, corado de azul. De seguida,
recorre-se a uma leitura espectroftomtrica a 800nm, para o clculo do teor em fosfolpidos.
Outra forma de identificar os fosfolpidos seria o clculo do Rf ndice de reteno que
caracterstico para cada tipo de lpido:

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Distncia percorrida pelo solvente

Distncia
percorrida
pelo
composto

Xoxo,
Gossip Boy :p

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