Manual Diagnostico Salmonella SPP Web

MINISTRIO DA SADE
Manual Tcnico de
Diagnstico Laboratorial da
Salmonella spp.
Braslia DF
2011
MINISTRIO DA SADE
Secretaria de Vigilncia em Sade
Departamento de Apoio Gesto de Vigilncia em Sade
Manual Tcnico de
Diagnstico Laboratorial da
Salmonella spp.
Diagnstico Laboratorial do
Gnero Salmonella
Srie A. Normas e Manuais Tcnicos
Braslia DF
2011
2011 Ministrio da Sade.
Todos os direitos reservados. permitida a reproduo parcial ou total desta obra, desde que citada a fonte e que no seja
para venda ou qualquer fim comercial. A responsabilidade pelos direitos autorais de textos e imagens dessa obra da rea
tcnica. A coleo institucional do Ministrio da Sade pode ser acessada, na ntegra, na Biblioteca Virtual em Sade do
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Srie A. Normas e Manuais Tcnicos
Tiragem: 1 edio 2011 1.000 exemplares
Elaborao, distribuio e informaes: Equipe de Elaborao:

MINISTRIO DA SADE
Secretaria de Vigilncia em Sade Laboratrio de Referncia Nacional de Enteroin-
Departamento de Apoio Gesto de Vigilncia em Sade feces Bacterianas/IOC/Fiocruz
Coordenao-Geral de Laboratrios de Sade Pblica Dalia dos Prazeres Rodrigues
Setor Comercial Sul, Quadra 4, Bloco A, Edifcio Principal, Eliane Moura Falavina dos Reis
3 andar Norma dos Santos Lzaro
CEP: 70304-000, Braslia DF Renata Garcia Costa
E-mail: svs@saude.gov.br
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Coordenao Miyoko Jakabi

Lcia Helena Berto CGLAB/SVS/MS Harumi Sakuma
Equipe de elaborao Produo Editorial:

Esta publicao foi elaborada por um grupo de profssio- Capa: NJOBS Comunicao (Eduardo Grisoni)
nais pesquisadores, tcnicos de bancada do Laboratrio Projeto grfico: NJOBS Comunicao (Eduardo Grisoni)
de Referncia Nacional de Enteroinfeces Bacterianas do Diagramao: NJOBS Comunicao (Marlia Assis)
Instituto Oswaldo Cruz IOC/Fundao Oswaldo Cruz Reviso: NJOBS Comunicao (Ana Cristina Vilela e
Fiocruz/RJ e do Instituto Adolfo Lutz IAL/SP. Fernanda Gomes)
Normalizao: NJOBS Comunicao (Ana Cristina
Equipe de Reviso Tcnica: Vilela e Fernanda Gomes) e Editora MS (Mrcia Cristina
Dalia dos Prazeres Rodrigues Tomaz de Aquino)
Miyoko Jakabi
Impresso no Brasil / Printed in Brazil
Ficha Catalogrfica
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Brasil. Ministrio da Sade. Secretaria de Vigilncia em Sade.
Manual tcnico de diagnstico laboratorial de Salmonella spp.: diagnstico laboratorial do gnero Salmonella /
Ministrio da Sade. Secretaria de Vigilncia em Sade, Fundao Oswaldo Cruz. Laboratrio de Referncia Nacional de
Enteroinfeces Bacterianas, Instituto Adolfo Lutz. Braslia : Ministrio da Sade, 2011.
60 p. : il. (Srie A. Normas e manuais tcnicos)
ISBN 978-85-334-1792-2
1. Anlise bacteriolgica. 2. Diagnstico. 3. Intoxicao alimentar. I. Fundao Oswaldo Cruz. II. Laboratrio de
Referncia Nacional de Enteroinfeces Bacterianas (Brasil). III. Instituto Adolfo Lutz. IV. Ttulo. V. Srie.
CDU 616-074:613.2.099
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Catalogao na fonte Coordenao-Geral de Documentao e Informao Editora MS OS 2011/0096
Ttulos para indexao:

Em ingls: Technical manual of laboratorial diagnostic from Salmonella spp.: laboratorial diagnosis of Salmonella genre.
Em espanhol: Manual tcnico de diagnstico de laboratorio de Salmonella spp.: diagnstico de laboratorio del gnero
Salmonella.
QUADROS
Quadro 1 Distribuio do nmero de sorovares de acordo com espcie e subespcie de Salmonella
Quadro 2 Caracterizao fenotpica das espcies e subespcies de Salmonella spp.
Quadro 3 Diferenciao bioqumica entre S. Typhi, S. Paratyphi A e sorovares de S. enterica subsp.
enterica mais frequentes
Quadro 4 Procedimentos de isolamento de Salmonella spp. aprovados por diferentes rgos
reguladores
Quadro 5 Confirmao de Salmonella spp. em alimentos ISO 6579:2007
Quadro 6 Avaliao de Salmonella spp. em alimentos MLG/FSIS, 2004
Quadro 7 Caractersticas dos meios de enriquecimento seletivos
Quadro 8 Caractersticas dos meios seletivos indicadores
Quadro 9 Caractersticas diferenciais dos meios TSI, KIA, MIO, MILi e LIA
Quadro 10 Reaes nos meios de triagem TSI e KIA
Quadro 11 Reaes no gar Lisina-Ferro LIA
Quadro 12 Reaes observadas no meio de Costa e Vernin CV
Quadro 13 Interpretao do meio EPM
Quadro 14 Caractersticas bioqumicas de Salmonella spp.
Quadro 15 Percentuais de positividade de Salmonella spp. nas provas bioqumicas
Quadro 16 Caractersticas bioqumicas diferenciais de Salmonella spp.,
Proteus spp. , Citrobacter spp. e Edwardsiella tarda
Quadro 17 Diferenciao bioqumica entre S. enterica subespcie enterica,
Citrobacter spp. e Edwardsiella tarda
Quadro 18 Diferenciao entre Citrobacter freundii e Salmonella arizonae e S. diarizonae
Quadro 19 Diferenciao entre Salmonella Paratyphi C e S. Choleraesuis
Quadro 20 Durao mxima de meios de cultura: envase em placas de Petri
Quadro 21 Durao mxima de meios de cultura: envase em tubos
Quadro 22 Durao mxima de meios de cultura: meio lquido em tubos
Sumrio
1 Taxonomia 5
2 Caractersticas Gerais 7
3 Habitat 9
4 Ecologia 10
5 Caractersticas Clnicas e Patogenia 11
6 Epidemiologia 14
7 Diagnstico Laboratorial 16
8 Aspectos Gerais Antgenos das Enterobactrias 40
9 Caracterizao Antignica de Salmonella spp. 42
10 Meios de Cultura 45
11 Figuras 47
Referncias 52
Anexo 55
4
1 Taxonomia
A designao do gnero Salmonella foi adotada em 1900, por Lignires, em homenagem a Daniel
Salmon, o qual isolou o microrganismo conhecido como Salmonella enterica sorovar Choleraesuis de
sunos. Sua nomenclatura teve como orientao inicial informaes relacionadas s condies clnicas ou
ao hospedeiro do qual o microrganismo era isolado.
Entretanto, a diversidade inicial de sorovares que apresentavam etiologia no especfica de um
determinado hospedeiro levou, inicialmente, designao do mesmo sorovar em hospedeiros distintos,
em locais diferentes. A partir de 1920, um grupo de microbiologistas, liderados por Fritz Kauffmann, em
Copenhagen, e por Philip Bruce White, em Londres, unificou a taxonomia, tendo seu trabalho reconhecido
pelo subcomit de Salmonella da Sociedade Internacional de Microbiologia, em 1933, como esquema de
Kauffmann-White. A partir de ento, sua nomenclatura passou por algumas modificaes, tendo por base
a utilizao de mtodos clssicos e de mtodos moleculares, como AFLP e sequenciamento 16S rRNA,
MLEE e AFLP.
Na atualidade, o gnero est constitudo de duas espcies geneticamente distintas: S. enterica
e S. bongori, sendo que a primeira est dividida em seis subespcies, que receberam as seguintes
denominaes: enterica, salamae, arizonae, diarizonae, houtenae e indica.
Na forma da redao da nomenclatura atual, de acordo com as modificaes taxonmicas
estabelecidas, os sorotipos ou sorovares no so mais considerados espcies, razo pela qual os
sorovares da subespcie enterica devem ser designados da seguinte maneira: Salmonella typhimurium:
Salmonella enterica subsp. enterica sorovar Typhimurium ou, de maneira mais simples e objetiva,
Salmonella sorovar Typhimurium ou ainda Salmonella Typhimurium. Portanto, na nomenclatura
atual, os sorovares Typhimurium, Agona, Enteritidis, entre outros, no indicam uma espcie, motivo
pelo qual o sorovar no deve ser escrito em itlico ou sublinhado.
Salmonella o gnero de maior relevncia na famlia Enterobacteriaceae, embora sua relao
filogentica seja, de certo modo, conjuntural. Dependendo do mtodo empregado, S. enterica
mais relacionada com Citrobacter spp. do que com Escherichia coli (homologia de DNA) ou em
sentido inverso, quando empregado mtodo de avaliao de grandes fragmentos (23S rRNA).
Em geral, acredita-se que Salmonella e E. coli descenderam de um ancestral comum h 160-180
milhes de anos, durante o perodo tercirio, em paralelo com os invertebrados. Ao longo da avaliao, E.
coli e a maioria das cepas de Salmonella difsica se adaptaram aos mamferos e, de modo semelhante, os
sorovares monofsicos permaneceram adaptados aos rpteis.
5
Manual Tcnico de Diagnstico Laboratorial da Salmonella spp
Em cada subespcie so reconhecidos diferentes nmeros de sorovares tendo por base a

caracterizao de seus antgenos somticos (O) e flagelares (H). Entre as espcies, a subespcie S.enterica
apresenta maior nmero de sorovares, sendo responsvel por 99% dos isolamentos, usualmente de
animais de sangue quente. Em 2002, foram includos 18 novos sorovares, sendo 12 pertencentes a
S.enterica subespcie enterica, 2 subespcie salamae, 2 diarizonae, 1 houtenae e 1 S.bongori. Atualmente
so reconhecidos cerca de 2500 sorovares includos em duas espcies S.enterica e S.bongori, cuja
distribuio editada por Grimont e Weill (2007) apresentada no Quadro 1.
Quadro 1 - Distribuio do numero de sorovares de acordo com espcie e

subespcie de Salmonella
Espcies/Subespcies Sorovares
Salmonella enterica subsp. enterica 1.490
Salmonella enterica subsp. salamae 500
Salmonella enterica subsp. arizonae 94
Salmonella enterica subsp. diarizonae 320
Salmonella enterica subsp. houtenae 72
Salmonella enterica subsp. indica 12
Salmonella bongori 22
Em 2004, uma nova espcie foi proposta, Salmonella subterranea, isolada em sedimento
subterrneo de solo com baixo pH na Oak Ridge, Tennessee. Essa amostra apresentou forte inter-relao
com S. bongori, por meio de sequenciamento 16S rRNA, alm de algumas caractersticas metablicas,
como indol positivo, H2S e lisina descarboxilase negativa, pigmento amarelo e um flagelo lateral. A
amostra-tipo proposta ATCC BAA-86.
6
2 Caractersticas
Gerais
As salmonelas pertencem famlia Enterobacteriaceae, sendo que, morfologicamente, so

bastonetes Gram negativos, geralmente mveis, capazes de formar cido e, na maioria das vezes, gs a
partir da glicose, com exceo de S. Typhi, S. Pullorum e S. Gallinarum ( 5% produzem gs). Tambm
fermentam arabinose, maltose, manitol, manose, ramnose, sorbitol, trealose, xilose e dulcitol. A maioria
das salmonelas de interesse clnico no fermenta lactose, contudo, muitas cepas podem adquirir essa
caracterstica por meio de transferncia plasmidial. So oxidase negativa, catalase positivo, indol, Voges-
Proskauer VP, Vermelho de Metila VM, malonato e ureia negativa. Produzem gs sulfdrico a partir
da reduo do enxofre por ao da enzima cistena desulfidrase. Apresentam ainda como caractersticas
metablicas a capacidade de descarboxilao dos aminocidos lisina e ornitina, reduo de nitrato a nitrito
e utilizao do citrato como nica fonte de carbono, podendo ocorrer variaes em funo do sorovar e/ou
da subespcie. Por exemplo, S. Arizonae no fermenta o dulcitol, mas frequentemente malonato positivo.
S. Pullorum no fermenta o dulcitol e S. Gallinarum no descarboxila ornitina, sendo ambas imveis.
S. Typhi, S. Pullorum e S. Gallinarum no produzem gs a partir da fermentao da glicose.
A diferenciao fenotpica das espcies e subespcies de Salmonella est apresentada no quadro
2 e a caracterizao bioqumica entre S. Typhi, S. Paratyphi A e Salmonella enterica subespcie enterica
(predominantes em isolamentos de fontes humanas e animais) esto descritas no quadro 3.
7
Quadro 2 - Caracterizao fenotpica das espcies e subespcies de Salmonella spp.

Espcies S. enterica subsp.
diarizonae
houtenae
arizonae
salamae
enterica
Subespcies
indica
S. bongori S. subterranea
Caractersticas
Dulcitol + + - - - d + +
ONPG (2h) - - + + - d + +
Malonato - + + + - - - -
Gelatinase - + + + + - + -
Sorbitol + + + + + - + -
Crescimento KCN - - - - + - + +
L(+) Tartarato(a) + - - - - - - +(e)
Galacturonato - + - + + + + ND
g-glutamyl transferase + (b) - + + + + + ND
b-glucuronidase D D - + - d - ND
Mucato + + +
- (70%) - + + ND
Salicina - - - - + - - ND
+
Lactose - - - (75%) - d - -
(75%)
Lise-fago O1 + + - + - + D ND
Sangue
Habitat normal animais Sangue frio e meio ambiente ?
quente
Notas: (a): d-tartarato; (b): S. Typhimurium (d), S. Dublin (-); +: 90% reaes positivas; 90% reaes
negativas; d: diferentes reaes (sorovares); (e): crescimento sem produo de cido.
Quadro 3 - Diferenciao bioqumica entre S. Typhi, S. Paratyphi A e sorovares de S. enterica

subsp. enterica mais frequentes
S. enterica
S. Typhi S. Paratyphi A
subsp. enterica
Glicose (gs) - + +
cido:
Dulcitol +/- + +
Arabinose -/ + + +
Descarboxilao:
Lisina + - +
Ornitina - + +
Dehidrolao da Arginina +/- + +
Produo de H2S +* - / (+) +
Citrato de Simmons - - +
Notas: +: positivo; - : negativo; (+) 75% positivo aps 48 horas; *: fraco
8
3 Habitat
O habitat natural das salmonelas pode ser dividido em trs categorias, com base na especificidade
do hospedeiro e padro clnico por ele determinado: altamente adaptadas ao homem, incluindo S. Typhi
e S. Paratyphi A, B e C, agentes da febre entrica (febres tifoide e paratifoide); altamente adaptadas aos
animais, representadas por S. Dublin (bovinos), S. Choleraesuis e S. Typhisuis (sunos), S. Abortusequi
(equinos), S. Pullorum e S. Gallinarum (aves), responsveis pelo paratifo dos animais. Entretanto, em
determinadas situaes (idade jovem, pacientes com doenas crnicas, idosos, imunocomprometidos),
os sorovares S. Dublin e S. Choleraesuis podem determinar no homem um quadro septicmico, isto ,
mais grave do que o causado por S. Typhi.
A terceira categoria inclui a maioria dos sorovares que atingem indiferentemente o homem
e os animais, designadas salmonelas zoonticas, as quais so responsveis por quadro de gastrenterite
(enterocolite) ou por doenas de transmisso alimentar. Sua distribuio mundial, sendo os alimentos
os principais veculos de sua transmisso. So responsveis por significantes ndices de morbidade e
mortalidade, tanto nos pases emergentes quanto nos desenvolvidos, determinando pequenos e grandes
surtos, envolvendo, principalmente, o consumo de alimentos de origem animal, como ovos, aves, carnes
e produtos lcteos.
9
4 Ecologia
A Salmonella spp. eliminada em grande nmero nas fezes, contaminando o solo e

a gua. A sobrevida no meio ambiente pode ser muito longa, em particular na matria orgnica.
Pode permanecer vivel no material fecal por longo perodo (anos), particularmente em fezes secas,
podendo resistir mais de 28 meses nas fezes de aves, 30 meses no estrume bovino, 280 dias no solo
cultivado e 120 dias na pastagem, sendo ainda encontrada em efluentes de gua de esgoto, como
resultado de contaminao fecal.
Os produtos agrcolas no processados, como hortalias e frutas, e os alimentos de origem
animal, como as carnes cruas, o leite e os ovos so veculos frequentes de salmonelas. A contaminao de
origem fecal geralmente a fonte para os produtos agrcolas, pela exposio gua contaminada; para o
leite e os ovos, por meio da exposio direta; e para a carne, usualmente durante as operaes de abate.
Em comparao com outros bastonetes Gram negativos, as salmonelas so relativamente
resistentes a vrios fatores ambientais. A adaptabilidade fisiolgica de Salmonella demonstrada
por sua habilidade para proliferar em valores de pH entre 7.0 e 7.5 (extremos 3.8 e 9.5), temperatura
de 35oC a 43oC (extremos 5oC a 46oC) e uma atividade hdrica (> 0,94), ocorrendo variaes entre
sorovares e/ou cepas. Nos produtos secos, como o chocolate, o cacau em p, as especiarias ou o leite
em p, e em produtos congelados, como os sorvetes, o normal a sobrevivncia por perodos de tempo
prolongados. A bactria sensvel ao calor, no sobrevivendo temperatura superior a 70oC. No entanto,
a termorresistncia pode incrementar-se com menor coeficiente de atividade de gua.
A inativao ocorre rapidamente em temperatura de pasteurizao em alimentos com atividade
de gua 0,95 a qual, quando inferior, aumenta a termorresistncia. Essa associao entre tolerncia ao
sal e cido resistncia so interdependentes. Certos processos como salmoura ( 9,0%) e defumao tm
efeito limitado na sobrevivncia das salmonelas, pois elas podem sobreviver por vrios meses na salmoura
com cerca de 20% de sal e em produtos de elevados teores proteicos ou de gordura. Como exemplos,
podem ser citados a carne seca defumada e o pescado, nos quais as salmonelas apresentam capacidade
de sobrevivncia de vrias semanas a meses. A relativa resistncia que esses microrganismos apresentam
dessecao, congelamento, salmoura e defumao explica por que sobrevivem em muitas classes de
alimentos. O efeito bactericida das condies cidas varia de acordo com a natureza do cido utilizado
no processo, sendo que os cidos actico e propinico so mais inibitrios que os cidos ltico e ctrico.
10
5 Caractersticas Clnicas
e Patogenia
A dose infectante varia de 105 a 108 clulas, porm, em pacientes imunocomprometidos, tm

sido observadas doses 103 para alguns sorovares envolvidos em surtos de doenas de transmisso
alimentar DTA. A manifestao clnica inclui quadros entricos agudos ou crnicos, alm de
localizao extraintestinal, como infeces septicmicas, osteomielite, artrite, hepatite etc.
Os microrganismos penetram por via oral, invadindo a mucosa intestinal, com disseminao
para a submucosa, resultando em enterocolite aguda. Normalmente, o quadro diarreico moderado, sem
a presena de sangue, entretanto, em alguns quadros clnicos, pode ocorrer perda de pequeno volume de
fezes associado a tenesmo e sangue.
Seu transporte, atravs do sistema retculo endotelial, aliado capacidade de multiplicao
no interior dos macrfagos, possibilita sua manuteno e disseminao no organismo. Indivduos
subnutridos ou com deficincias do sistema imune podem apresentar infeces de extrema gravidade,
como a incidncia de bacteremia em pacientes aidticos, dos quais 20% a 60% relatam infeco
gastrintestinal prvia.
Sua virulncia multifatorial, incluindo mobilidade, habilidade de penetrar e replicar nas clulas
epiteliais, resistncia ao do complemento, produo de entero, cito e endotoxina, sendo desconhecido
o exato papel de cada um, para a manifestao da doena. Em alguns sorovares, a virulncia mediada
por um plasmdio, em uma regio do operon de 8Kb que contm os genes spvR ABCD, cuja origem
ainda desconhecida. A relao entre a presena desse plasmdio de virulncia e sorovar j se encontra
bem estabelecida em S. Dublin, S. Gallinarum e S. Choleraesuis.
Em pacientes imunodeprimidos, a salmonelose pode ser assintomtica ou ainda determinar
diarreia autolimitada em 95% dos casos. As infeces clnicas humanas determinadas por Salmonella
spp. apresentam quatro sndromes clnicas distintas: gastrenterite, febre entrica, septicemia com ou
sem infeces localizadas e determinam o estado de portador assintomtico. Entre a totalidade de
sorovares, S. Enteritidis e S. Typhimurium so os sorovares de maior prevalncia em casos de septicemia
e infeces localizadas.
11
Infeces gastrintestinais
O quadro clnico humano pode variar com fezes diarreicas de caractersticas aquosas,
semelhante diarreia colrica, a fezes consistentes com sangue oculto, ou visvel, e muco. O quadro
diarreico regride, usualmente, de trs a quatro dias. Pode ocorrer febre (39C) em cerca de 50% dos
casos, normalmente de curta durao (dois dias), clicas abdominais leves a intensas quando houver
invaso dos linfonodos (linfadenite mesentrica), que podem mimetizar apendicite. Desenvolvimento
de sndrome de clon irritado SCI, que se caracteriza por diarreia branda persistente seguida de
quadro agudo de gastrenterite.
Em pacientes portadores de SCI, h persistncia como portador assintomtico em 31% aps cinco
anos. Em pacientes hospitalizados, portadores de cncer, o quadro reincide, ocasionando pneumonia
semelhante quela ocasionada por Pneumocystis, e Salmonella. permanecendo presente nas fezes aps
cessarem os sintomas, com uma mdia de excreo durante o perodo de cinco semanas. O estgio de
portador persiste por at nove semanas em 90% dos adultos, sendo, em crianas < 5 anos, inferior a sete
semanas. A frequncia desse estgio entre manipuladores de alimentos usualmente reduzida (0,5%).
Entre esses profissionais, normas de educao e higiene no manuseio de alimentos representam os
principais aspectos para minimizar o risco de transmisso alimentar.
Bacteremia
A febre entrica usualmente determinada por S. Typhi, S. Paratyphi A e C e S. Sendai,
entretanto pode ser determinada por outros sorovares. Sua frequncia mais elevada entre pacientes
do sexo masculino, acometendo de 1% a 4% dos pacientes imunodeprimidos (especialmente doenas
do sistema reticuloendotelial, linfoma, leucemia, cncer, lpus sistmico e outras doenas vasculares).
O risco de desenvolvimento de bacteremia entre pacientes portadores do vrus da imunodeficincia
adquirida HIV de 20 a 100 vezes maior do que na populao normal. Entre esses, somente 20%
dos pacientes apresentam quadro posterior diarreico.
Usualmente, a bacteremia apresenta elevada prevalncia em adultos, os quais tm como histrico
o uso prvio de drogas imunossupressoras. Entre esses pacientes, a complicao subsequente usualmente
a pneumonia, sendo responsvel por elevados ndices de letalidade entre idosos.
Infeces do Sistema Nervoso Central

As infeces incluem meningites, abscessos, empiema subdural. A presena de diarreia e de
outros sintomas gastrentricos so apontados em 50% dos casos. Embora a bacteremia seja comum em
pacientes portadores do vrus da imunodeficincia adquirida, complicaes do sistema nervoso central
raramente so apontadas. A maior prevalncia dessas infeces ocorre entre pacientes de longo perodo
de hospitalizao, drenagem cirrgica e terapia antimicrobiana prolongada.
Os sorovares de maior prevalncia em bacteremia e nas infeces do sistema nervoso central so
S. Typhimurium e S. Enteritidis.
12
Infeces em outros stios

As infeces variam de bacteriria ao comprometimento de juntas (mais comuns), ossos e tecidos
e endocardites (< 1% a 0.1%). Podem ocorrer no bao e no trato genital, assim como em complicaes
pulmonares. No trato urinrio, h maior prevalncia em mulheres, das quais 50% apresentam quadro
diarreico. Os principais fatores de risco so imunossupresso, cistite, pielonefrite e abscesso renal,
entretanto a maioria dos casos ocorre em pacientes sem fatores de risco conhecidos.
A Salmonella tambm reconhecida por ocasionar leses endovasculares e osteomielite,
acometendo 7% a 10% dos pacientes > 50 anos.
Em pacientes que apresentam como fatores de risco diabetes, infeco por HIV (vrus da
imunodeficincia adquirida) e aterosclerose (composta especialmente por lipdios e tecido fibroso que se
formam nas paredes dos vasos), a presena de Salmonella observada nas placas aterosclerticas, tendo
em vista a propriedade de se multiplicar nos fagcitos dessas placas.
Entre as complicaes da gastrenterite, podem ser citadas a rabdomilise (leso do msculo
esqueltico, usualmente acompanhado de falha renal), a osteomielite, que pode levar ao aparecimento
de aneurisma abdominal artico, com elevado ndice de mortalidade, a linfadenite mesentrica, a
apendicite, a peritonite, a colecistite, a pericardite, a pleuropneumonia e a insuficincia renal, que tm
sido amplamente apontadas como infeces extraintestinais determinadas por Salmonella spp.
Artrite reativa, artrite inflamatria e a sndrome de Reiter (ocorrncia simultnea de uretrite e/
ou cervicite, conjuntivite e artrite) tm sido reportadas por uma ampla variedade de enteropatgenos,
incluindo Salmonella spp. A incidncia de artrite reativa e de sndrome de Reiter em surtos varia de 6%
a 29% e 3%, respectivamente. Estudos recentes apontam que pacientes com o marcador imunogentico
HLA-B27 apresentam elevada probabilidade de desenvolver a sndrome de Reiter. A antibioticoterapia no
efetiva para o tratamento de artrite reativa.
13
6 Epidemiologia
A salmonelose considerada a zoonose mais difundida do mundo. Como o ciclo de transmisso
de salmonela envolve praticamente todos os vertebrados e sua veiculao est associada ingesto de
alimentos, seu controle representa um desafio para a sade pblica, tendo em vista a emergncia de
novos sorovares e a reemergncia de outros em determinadas reas, tanto nos pases emergentes quanto
nos industrializados.
O fator epidemiolgico mais destacado nos animais o estado de portador, no qual a falta de
sintomas e as dificuldades tcnicas para sua deteco antes ou durante a inspeo dos produtos de origem
animal os convertem em fonte contnua de contaminao do meio ambiente e, portanto, dos alimentos.
Considerando que a principal via de transmisso de Salmonella spp. est na cadeia alimentar, sua
presena em animais, criados com objetivo comercial, aponta esse microrganismo como o mais incidente e
relevante agente etiolgico de enteroinfeces. Isso ocasiona perdas de milhes de dlares para a indstria,
particularmente de bovinos, sunos e aves, tanto para o mercado interno quanto para exportao, sendo
que, em alguns pases, a rigidez na inspeo representa necessidade constante de qualidade.
Particularmente nas aves, a transmisso de Salmonella spp. pode ser do tipo vertical ou horizontal.
Por sculos, o consumo de ovos sem coco era uma prtica comum do homem, porm, na atualidade,
diferentes surtos, determinados pelo sorovar S. Enteritidis e, mais recentemente, por outros sorovares
(S. Heidelberg, S. Agona e S. Virchow), levaram ao reconhecimento de sua capacidade de transmisso
transovariana, levando disseminao, para o homem, por meio de alimentos que so utilizados sem
a devida coco, como tortas, maioneses, omeletes etc. (WHITE; FEDORKA-CRAY; CHILLER, 2006).
A transmisso horizontal envolve todos os sorovares, os quais apresentam caractersticas ubquas.
Pode ocorrer pelo meio ambiente, em que roedores assumem o papel de portadores assintomticos, por
longos perodos (> 10 meses), disseminando tais microrganismos entre diferentes reas. Outra via, a qual
ainda objeto de especulao, est representada pelas raes. Embora, na literatura nacional, entre as
dcadas de 1980 e 1990, seja apontada ausncia dos sorovares adaptados s aves em matrias-primas de
origem animal, algumas medidas tm sido adotadas pelos criadores, no sentido de minimizar possveis
contaminaes, tendo em vista a impossibilidade de sua eliminao total (BACK et al. 2006).
Os produtos agrcolas no processados, como hortalias e frutas, e os alimentos de origem
animal, como carnes cruas, leite e ovos, so veculos frequentes de salmonelas. A contaminao de
origem fecal geralmente a fonte para os produtos agrcolas, pela exposio gua contaminada;
14
para leite e ovos, a contaminao se d por meio da exposio direta e para a carne, usualmente
ocorre durante as operaes de abate (ORGANIZACIN MUNDIAL DE LA SALUD, 1988).
Os animais ocupam o ponto central na epidemiologia das salmonelas entricas, representando
uma fonte de infeco de grande importncia sanitria, porm de difcil controle. Com exceo dos
poucos sorovares adaptados espcie humana, no h dvida de que o homem contrai a infeco, cuja
manifestao clnica gastrentrica, usualmente resultante do consumo de alimentos de origem animal.
Soma-se, nesse contexto, o aumento da resistncia de Salmonella spp. aos antimicrobianos, com
o percentual elevando-se de 17% na dcada de 1970 para 31% ao final dos anos 1980, incluindo-se a
resistncia s fluoroquinolonas. Tal fato vem culminando, neste sculo, com o aparecimento, em diferentes
pases, de cepas produtoras de diferentes tipos de beta-lactamases.
A incidncia de resistncia bacteriana a antimicrobianos representa risco sade humana e
animal. Esse tema de extrema importncia tem sido objeto de ateno de instituies como a Organizao
Mundial da Sade OMS, o Escritrio Internacional de Epizootias OIE e o Codex Alimentarius, que
vm discutindo solues globais para o problema. Tal fato tem por base sua distribuio mundial,
sendo detectada na maioria das espcies animais utilizada para consumo humano, alm de animais
silvestres e domsticos.
Embora a terapia antimicrobiana no seja recomendada na maioria das infeces diarreicas,
esse procedimento indicado nas infeces invasivas e ocorre, na prtica, muitas vezes de modo
indiscriminado, resultando no aumento de amostras resistentes aos antimicrobianos, podendo representar
grave problema, especialmente nos pases emergentes.
Como resultados, podem ser citadas diferentes situaes, como a resistncia, no sudeste da sia,
de 50% de Salmonella Typhi ao cloranfenicol, tetraciclina e ampicilina, com o uso de fluoroquinolonas,
excetuando-se crianas, para as quais esta substituda pela ceftriaxone.
O uso de antimicrobianos na teraputica tambm requer o conhecimento ou suspeita quanto
ao agente infeccioso e seu perfil de sensibilidade. Contempla um regime posolgico, cuja dosagem e
durao possibilitam o controle do processo infeccioso, reduzindo-se riscos de desenvolvimento de
resistncia bacteriana.
15
7 Diagnstico
Laboratorial
Espcimes clnicos
Sangue
O hemocultivo reveste um interesse especial no caso de febre tifoide e paratifoide, porm
no constantemente positivo. Os percentuais de positividade, na ausncia de tratamento prvio com
antibiticos, so de 90% durante a primeira semana de evoluo, de 75% na segunda, de 40% na terceira
e de 10% na quarta semana.
Os hemocultivos so negativos nas infeces transmitidas por meio dos alimentos (infeces
gastrintestinais), determinadas pela maioria dos sorovares, podendo causar septicemia em indivduos
imunocomprometidos.
1. Principais cuidados para coleta
A coleta deve ser realizada antes da utilizao de antimicrobianos devendo-se efetuar a
desinfeco da superfcie dos frascos de cultivo (lcool 70GL) e assepsia do stio de puno (lcool
70GL ou soluo iodada) em movimentos concntricos do centro para a extremidade.
2. Volume para cultura
Nos adultos, o volume dever ser de duas coletas de 10mL com intervalo de uma hora, os
quais so inoculados em dois frascos de meio de cultura (inocular 10mL/100mL de meio enriquecido,
acrescido de anticoagulante SPS Polianetolsulfonato sdico). Para crianas, mantendo a proporo
(1mL/10mL de meio enriquecido, acrescido de SPS), devem ser tomados volumes variveis de acordo
com o peso (< 1,5kg a < 4kg 1mL; 4kg a 13kg 3mL; 13kg a 25kg 10mL; > 25kg 20mL).
No processamento das amostras de sangue por hemocultura tradicional, os frascos devem
ser incubados a 35C e avaliados por sete dias e deve ser empregada, paralelamente, semeadura direta
em meio seletivo-indicador. A partir do crescimento de colnias com morfologia tpica, dever ser
efetuado o isolamento e subsequente identificao bioqumica e antignica. No caso de recebimento de
sangue coagulado, dilacerar o cogulo, por meio de uma pipeta e, em sequncia, semear em meio de
enriquecimento e, paralelamente, em meio seletivo-indicador.
Fezes
A procura de uma metodologia ideal para o isolamento de Salmonella spp. tem sido constante
entre os pesquisadores, o que tem trazido melhorias na especificidade e na sensibilidade, bem como
simplicidade e rapidez na execuo dos exames bacteriolgicos.
16
Numerosos mtodos e tcnicas clssicas e moleculares vm sendo descritos, visando ao

isolamento de diferentes sorovares de Salmonella spp. procedentes de distintas fontes de infeco.
Nas amostras clnicas, se um espcime apropriadamente obtido na fase aguda da doena, no
necessria a utilizao de meios de enriquecimento, tendo em vista a presena de grande nmero de
clulas. Contudo, na forma crnica ou mesmo na identificao de portadores, indicada a utilizao de
meios de enriquecimento e de meios seletivos para facilitar seu isolamento.
1. Aspectos relevantes para a coleta
As fezes devem ser coletadas durante a fase aguda, antes de iniciar o tratamento com antibiticos.
Em pacientes com infeco ativa, do mesmo modo que para crianas ou indivduos com dificuldade de
obteno de amostras, deve ser priorizada a utilizao de swabs retais. Em pacientes com suspeita de febre
tifoide, a pesquisa de Salmonella Typhi nas fezes indicada a partir da segunda semana da doena, assim
como na fase de convalescena e na deteco de portadores.
2. Fezes de emisso espontnea
Essas amostras devem ser coletadas em pequenos recipientes, de vidro ou polietileno, de boca
larga, limpos e/ou esterilizados. O material dever ser analisado at duas horas aps a coleta, quando
mantido temperatura ambiente. Deve ser colhida de 0,5g a 2g de fezes e, quando da presena de sangue
ou de muco, essa deve ser a poro selecionada para a avaliao laboratorial. Evitar a coleta de espcimes
fecais a partir das roupas do paciente, da superfcie de camas e/ou cho.
3. Espcimes retais
Umedecer o swab em soluo fisiolgica ou em gua destilada esterilizada e introduzir na ampola
retal do paciente ou comunicante, comprimindo-o em movimentos rotatrios suaves por toda a extenso
dessa regio. O processamento laboratorial deve ser efetuado at duas horas aps a coleta e, caso no seja
possvel, introduzir o swab retal ou fecal impregnado de fezes no meio de conservao Cary e Blair. Nessa
condio, as salmonelas sobrevivem por uma a duas semanas em temperatura de refrigerao.
4. Coleta de fezes em papel-filtro:
Podem ser utilizadas tiras de papel-filtro, tipo xarope ou mata-borro, com dimenses de 2,5cm
de largura por 6,0cm de comprimento. As fezes diarreicas ou suspensas em gua devem ser espalhadas
em dois teros de uma das superfcies do papel, com auxlio de um fragmento de madeira (palito
individual) ou de qualquer outro material semelhante, disponvel no momento. Em sequncia, devem ser
acondicionadas em invlucros plsticos aps dessecar naturalmente. Sob essas condies, a Salmonella se
mantm vivel por um perodo aproximado de 30 dias.
5. Transporte:
So utilizados contineres plsticos ou isopor para transporte das amostras e manuteno por
curto perodo de tempo (> 2h < 4h). Estas so acondicionadas em embalagens de plstico ou de papel
e colocadas no interior da caixa de transporte, sendo que as fichas contendo as informaes clnicas e/
ou epidemiolgicas so mantidas parte dos espcimes clnicos. Para reutilizao dos contineres para
transporte, dever ser efetuada a desinfeco, utilizando-se soluo de hipoclorito de sdio (100ppm).
17
Exame direto de fezes avaliao presuntiva
uma ferramenta para orientar o profissional de laboratrio na metodologia a ser adotada. Os

resultados podem ser individualizados da seguinte forma: a presena de picitos e clulas mononucleares
indicam processo inflamatrio; a presena de polimorfonucleares indicativa de sndrome disenteriforme
ou colite determinada por patgenos invasivos; e a presena de clulas mononucleares predomina em
pacientes com febre tifoide.
1. Metodologia
Utilizar soluo de azul de metileno de Loeffler, misturada em igual quantidade com as fezes;
essa mistura deve ser colocada sobre lmina, coberta por lamnula e examinada com microscpio tico
(objetiva de 10x e 40x).
FLUXOGRAMA
Isolamento de Salmonella spp. em espcimes fecais
Fezes (suspenso)
Swab fecal/retal
Semeadura Direta Enriquecimento
gar EMB Caldo Selenito Cistina

gar MacConkey Caldo Tetrationato Kauffmann
Caldo Rappaport Vassiliadis*
18h/24h-37C 18h/24h-37C
*18h/24h-43C
gar Hektoen e/ou

gar SS e/ou
gar XLD e/ou
gar Sulfito Bismuto e/ou
gar Verde Brilhante
Isolamento 5 -10 colnias:

Meio de Triagem
Caracterizao bioqumica
Identificao antignica
18
Espcimes oriundos de outros stios orgnicos

Os procedimentos de rotina empregados na anlise microbiolgica dos diferentes espcimes
clnicos tambm podem ser utilizados no isolamento de Salmonella spp. A morfologia colonial fornece as
primeiras informaes para a sua identificao.
importante conhecer o potencial de crescimento de cada meio de cultura e observar as
caractersticas das colnias. Por exemplo, semeadura em gar Sangue e em gar MacConkey pode
apontar morfologia semelhante ou, ainda, tamanhos distintos.
Um dos aspectos mais importantes na anlise de amostras oriundas de diferentes stios orgnicos
a coleta e o transporte at o laboratrio.
Fluidos orgnicos e secrees: em sua maioria, os lquidos (pleural, asctico, biliar, de
articulaes e outros) so coletados por procedimento mdico, devendo ser transportados
imediatamente ao laboratrio e processados dentro da rotina de diagnstico de diferentes
grupos microbianos.
Espcimes oriundos de infeces sistmicas e localizadas: em pacientes com spsis aguda,
meningite, osteomielite, artrite ou pneumonia devem ser coletadas duas amostras (10mL a
20mL por amostra) de punes venosas distintas, antes da antibioticoterapia, com intervalos
de cinco a 15 minutos entre as punes.
Urina: a coleta deve ser feita pela manh, preferencialmente da primeira mico do dia, ou
ento aps reteno vesical de duas a trs horas. A coleta deve seguir normas de assepsia
rigorosa prvia dos genitais com gua e sabo neutro, posterior secagem e coleta do jato
intermedirio espontneo.
Lquor: a coleta deve ser realizada por equipe mdica especializada, sendo recomendado
que o paciente esteja em jejum. O transporte da amostra para o laboratrio deve ser feito
imediatamente e, quando tiverem sido coletados dois ou mais tubos, o laboratrio dever
utilizar o tubo que contiver menos sangue, o que facilita o isolamento bacteriano.
Salmonella spp. em alimentos

A salmonelose uma das zoonoses mais complexas em sua epidemiologia e controle, cujos
padres diferem de uma regio para outra. Isso se deve a diferenas nos hbitos alimentares, prticas
de elaborao de alimentos, criao de animais e padres de higiene e saneamento. Seu controle
um trabalho rduo, tendo em vista a emergncia de novos sorovares e a reemergncia de outros em
determinadas reas, tanto nos pases emergentes quanto naqueles industrializados (ORGANIZACIN
MUNDIAL DE LA SALUD, 1988).
Qualquer alimento que contenha Salmonella spp. um risco potencial para o consumidor, cuja
veiculao facilitada, na atualidade, pela mudana nos hbitos alimentares da populao. A necessidade,
cada vez maior, de elevar a produo/oferta de alimentos leva ao aumento dos fatores de risco, resultantes
de falhas quanto ao manuseio, transporte muitas vezes em condies inadequadas, aliados ausncia de
critrios bsicos de higiene e saneamento, os quais favorecem a disseminao.
Nos produtos secos, como chocolate, cacau em p, especiarias ou leite em p, e em produtos congelados
como os sorvetes, o normal a sobrevivncia por perodos de tempo prolongados. Esse microrganismo
19
sensvel ao calor e no sobrevive temperatura > 70oC, no entanto, a termorresistncia pode ser suplementada
com menor coeficiente de atividade de gua, como inativao que ocorre rapidamente em temperatura de
pasteurizao em alimentos com atividade de gua 0,95.
A associao entre tolerncia ao sal e cido resistncia so interdependentes. Certos processos
como salmoura ( 9,0%) e defumao tm efeito limitado na sobrevivncia das salmonelas, podendo
resistir por vrios meses na salmoura com cerca de 20% de sal, em produtos de elevado teor proteico ou
de gordura. So exemplos a carne seca defumada e o pescado, em que tm capacidade de manter-se vivos
por vrias semanas a meses. A relativa resistncia que esses microrganismos apresentam dessecao, ao
congelamento, salmoura e defumao explica por que permanecem em muitas classes de alimentos.
O efeito bactericida das condies cidas varia de acordo com a natureza do cido utilizado no processo,
sendo que os cidos actico e propinico so mais inibitrios que os cidos ltico e ctrico.
Deve ser salientado que, em alimentos com elevado teor lipdico, como ovos e chocolate, as
salmonelas ficam dentro dos glbulos de gordura, protegidas, no sendo afetadas pelas enzimas digestivas
ou pela acidez gstrica, fato que reduz a dose infectante (FORSYTHE, 2002).
Nos alimentos, o isolamento de Salmonella spp. representa um problema para os bacteriologistas
em funo do reduzido nmero de microrganismos presentes, associados a uma microbiota mista e
numerosa, aliada ainda complexa composio de alguns tipos de alimentos.
Desse modo, a anlise de alimentos para deteco de Salmonella spp. requer mtodos diferentes
daqueles utilizados em laboratrios clnicos. A metodologia convencional recomendada por diferentes rgos
regulamentadores segue basicamente quatro etapas, que podem ser aplicadas a qualquer tipo de alimento,
embora apresentem algumas variaes na seleo de meios de cultura e na forma de preparao das amostras.
FLUXOGRAMA PARA ISOLAMENTO E IDENTIFICAO EM ALIMENTOS
Pr-enriquecimento
25g ou 25mL da amostra + 225mL de meio
35 1C/18h-24h
Enriquecimento seletivo
0,1mL do cultivo 1mL do cultivo

+ 10mL de RV + 10mL do caldo TT
42 0,2C/24h 35 1C/24h
Isolamento em meio seletivo
HE e XLD
35 1C/24h
Identificao Presuntiva
TSI, LIA e Ureia
35 1C/24h
Caracterizao antignica
20
Caractersticas dos meios de cultura usualmente empregados

Pr-enriquecimento
As salmonelas podem estar presentes nos alimentos em pequenas quantidades e, geralmente, sofrem
os efeitos resultantes do processamento e do armazenamento. Necessitam, portanto, de pr-enriquecimento
em meios no seletivos para sua recuperao. Os danos s salmonelas resultam na perda ou na alterao das
funes celulares, o que as tornam suscetveis a agentes seletivos, que refletem na incapacidade de formar
colnias em meios mnimos salinos, entretanto, so visualizadas em meios complexos.
Microrganismos que sofreram danos estruturais no so capazes de proliferar ou sobreviver
em meios contendo agentes seletivos (concentraes crescentes de sal, lauril sulfato, desoxicolato, sais
biliares, detergentes e antibiticos). O dano s reversvel se as clulas forem expostas s condies
favorveis de desenvolvimento em um meio no seletivo e rico em nutrientes. Essa recuperao pode ser
conseguida utilizando-se vrios meios, como gua peptonada tamponada, caldo lactosado, gua destilada
verde brilhante, caldo tripticase de soja, entre outros (Quadro 4).
A gua peptonada a 1,0% tamponada e o caldo lactosado so comumente usados, mas outros
meios, tais como triptona de soja e caldo nutriente, podem ser empregados. O caldo lactosado pode,
eventualmente, ser inconveniente como pr-enriquecimento quando utilizado em amostras que contm
populao elevada de microrganismos fermentadores da lactose, pois a subsequente reduo do pH
do meio pode limitar a multiplicao das salmonelas, em particular das clulas com danos estruturais,
embora a literatura aponte que a Salmonella spp. se multiplica em uma faixa ampla de pH (pH 3.8 a 9.5).
Quadro 4 - Procedimentos de isolamento de Salmonella aprovados

por diferentes rgos reguladores
Meios de Pr- Meios Seletivo-
Mtodo(a) Meios de Enriquecimento(a)
enriquecimento(a) Indicadores
ISO 6579 APT(b) 37C 1 / RVS 41,5 1C / 24h 3h XLD - 37C 1 / 243h
(2007) 182h(c) MKTT 37C1C / 24h 3C 2C opcional(e)
RV 42C 0,2 / 242h HE 35C 0,2 / 242h
BAM/FDA(f) CL 35C
TT 35C 2 / 242h ou SB 35C 2 / 242h
(2006) 2 / 242h(c)
42C 0,2 / 242h(d) XLD 35C 2 / 242h
VB 35C 0,2/18-24h
MLG/FSIS APA 35C 2 / RV ou RVS 42C0,5 / 222h
XLT4 ou DM-LIA
(2004) 1824h TTH 42C 0,5 / 222h
35C2 / 18-24h
SS 35C 2 / 242h
CL 35C SC 37C1C / 24h3C
APHA(f ) (2001) BS 35C 2 / 242h
2 / 242h(c) TT 37C1C / 24h3C
HE 35C 2 / 242h
Notas: (a) ISO International Standartization Organization; BAM/FDA Bacteriological Analytical Manual da
Food and Drug Admistration on-line; e MLG/FSIS Microbiological Laboratory Guidebook on-line da Food
Safety And Inspection Service, United States Department of Agriculture.
21
(b)
APT gua Peptonada Tamponada; CL Caldo lactosado; SC Caldo Selenito Cistina; RVS Caldo
Rappaport Vassiliadis Soja; MKTT Caldo Tetrationato de Kauffmann com novobiocina; RV Caldo Rappaport
Vassiliadis modificado; TT Caldo Tetrationato; TTH Caldo Tetrationato de Hajna; XLD gar Xilose Lisina
Desoxicolato; HE gar Entrico Hektoen; SS gar Salmonella-Shigella; SB gar Sulfito de Bismuto;
DM-LIA gar Lisina Ferro duplamente modificado; VBS gar Verde Brilhante Sulfa; e XLT4 gar Xilose
Lisina Tergitol 4.
(c)
Existem algumas variaes apontadas na descrio do procedimento tcnico.
Alimentos com carga microbiana reduzida, incubar a 35C, e com carga microbiana elevada a incubao
(d)
dever ser a 43C.

(e)
Selecionar meio seletivo indicador adequado para o isolamento de cepas lactose positiva e dos sorovares
S. Typhi e S. Paratyphi. Podem ser empregados o gar Verde Brilhante VB e o gar Sulfito de Bismuto SB.
FDA e APHA, alm do caldo lactosado, para uso geral, recomendam a utilizao de: gua destilada verde
(f)
brilhante, para leite em p e misturas lcteas; leite em p desnatado verde brilhante, para chocolates, balas
e confeitos; caldo triptcase de soja para condimentos; caldo nutriente, para glacs e coberturas similares.
Quadro 5 - Confirmao de Salmonella spp. em alimentos ISO 6579:2007

Testes
Autoaglutinao Testes antignicos Interpretao
bioqumicos
Poli O, H ou Vi Confirmado como
Tpicos1 No
positivos Salmonella spp.
Tpicos1 No Todos negativos
Tpicos1 Sim No se aplica
Pode ser Salmonella spp.2
Poli O, H ou Vi
Atpicos No/Sim
positivos
No confirmado como
Atpicos No/Sim Todos negativos
Salmonella spp.
Notas: 1Resultados tpicos: TSI com bisel alcalino; acidez na profundidade; H2S; lisina descarboxilase positiva;
urease, -galactosidade , VP e indol negativos.
2
As cepas devem ser enviadas ao Laboratrio de Referncia Nacional para a confirmao definitiva.
22
Quadro 6 - Avaliao de Salmonella spp. em alimentos

Aglutinao
gar TSI gar LIA Ao
Poli O Poli H
Base cida/pice alcalino Base e pice alcalino com
+ + Continuar
com H2S H2S
Base cida/pice alcalino Base e pice alcalino com
+ - Continuar
com H2S H2S
Base cida/pice alcalino Base e pice alcalino sem
+(?) - Continuar
sem H2S H2S
+ + Continuar*
sem H2S H2S
Descartar
sem H2S H2S
Base cida/pice alcalino Base cida e pice alcalino
+(?) Continuar
com H2S com/sem H2S
Base e pice cidos Base alcalina ou cida e
Descartar
sem H2S pice sem H2S
Base e pice cidos Base e pice alcalinos com
+(?) Continuar**
com H2S H2S
Sem alterao de cor nos meios de cultura Descartar
Fonte: (USDA, 2004)
Nota: *S. Typhisuis pode ser encontrada em sunos.
**S. enterica subesp. arizonae ou diarizonae.
23
Enriquecimento Seletivo
O enriquecimento seletivo determina aumento contnuo de Salmonella, restringindo a
proliferao da microbiota acompanhante. Devido utilizao dos diferentes agentes inibitrios
adicionados aos meios, estes tambm diferem em sua seletividade e aplicao especfica.
Diferentes tipos de inibidores tm sido propostos para enriquecimento seletivo de salmonelas,
sendo a bile, o tetrationato, o selenito e corantes, como o verde brilhante e o verde malaquita, os mais
usados. Esses inibidores so incorporados aos meios, isolados ou em combinao. Particularmente para
produtos gordurosos como leite de coco e coco ralado, utilizar Tween-80, Triton X ou Tergitol 7.
A seletividade melhorada pela incubao a 41C-43C. Nessa etapa, recomenda-se a utilizao
de dois diferentes meios, devido variao de resistncia da Salmonella spp. aos agentes seletivos. Os meios
comumente usados so: caldo Rappaport Vassiliadis modificado RV ou Rappaport Vassiliadis Soja RVS
e diversas formulaes do caldo tetrationato TT. Entretanto, o primeiro no deve ser utilizado, caso haja
suspeita de S. Typhi.
Para amostras clnicas, podem ser utilizados diferentes meios de enriquecimento, destacando-se
o Caldo Tetrationato, o Caldo Tetrationato Verde Brilhante, o Caldo Selenito, o Caldo Gram Negativo, o
Caldo Cloreto de Magnsio Verde Malaquita, o Caldo Rappaport Vassiliadis e variaes desses.
As principais caractersticas dos meios de enriquecimento seletivos mais empregados esto
descritas na Quadro 7.
1. Caldo Tetrationato
A seletividade do caldo tetrationato depende de sua capacidade de restringir a multiplicao de
coliformes. Sorovares de Salmonella (exceto S. Choleraesuis, S. Typhisuis, S. Gallinarum e S. Pullorum)
possuem a enzima tetrationato-redutase e, consequentemente, so capazes de multiplicar-se no meio.
Porm, o desenvolvimento excessivo de Proteus spp., que tambm produz essa enzima, pode interferir na
deteco de Salmonella spp. Nesse caso, o caldo tetrationato verde brilhante, segundo Muller-Kauffmann,
contendo verde brilhante e bile, inibe a multiplicao de espcies de Proteus
2. Caldo Rappaport
O Caldo Cloreto De Magnsio Verde Malaquita (Caldo Rappaport) vem demonstrando eficcia
na deteco de Salmonella spp. A associao do cloreto de magnsio com um corante bacteriosttico
(verde malaquita) constituiu-se no meio de enriquecimento para a maioria dos sorovares de Salmonella
spp., com exceo de S. Typhi. Posteriormente, uma modificao desse meio, resultante da diminuio
da concentrao de verde malaquita, com temperatura de 43oC para incubao, o qual foi denominado
meio de Rappaport Vassiliadis, vem evidenciando maior eficincia quando da utilizao de pequenas
quantidades de inculo, bem como por ter maior capacidade de inibio dos microrganismos competitivos.
3. Caldo Selenito
Esse meio vem sendo recomendado para o enriquecimento de Salmonella spp. em espcimes
fecais, especialmente para o isolamento de S. Typhi e S. Paratyphi B, sendo tambm til para a
deteco de outros sorovares de Salmonella spp., mesmo quando os microrganismos esto presentes
em pequeno nmero. A adio de cistina melhora a qualidade do meio de cultura.
24
4. Caldo Gram negativo Caldo GN

Esse meio utilizado para o enriquecimento seletivo de bactrias Gram negativas,
particularmente Shigella spp. e Salmonella spp., a partir de todo tipo de espcimes clnicos. Devido
concentrao relativamente baixa de desoxicolato, menos inibidor de Escherichia coli e de outros
coliformes, enquanto a maior concentrao de manitol em relao glicose limita o crescimento de
espcies de Proteus e favorece o de Salmonella spp. e Shigella spp., que so fermentadores do manitol.
Quadro 7 - Caractersticas dos meios de enriquecimento seletivos

Substncias Bactrias Bactrias
Meios Indicao
inibidoras inibidas favorecidas
Coliformes
S. Typhisuis,
Espcimes
Caldo Selenito Selenito de sdio S. Choleraesuis, Salmonella spp.
clnicos
S. Gallinarum,
S. Pullorum
Citrato Gram positivos,
Espcimes Maioria das
Caldo GN desoxicolato coliformes,
clnicos enterobactrias
de sdio Proteus spp.
Espcimes Cloreto de Gram positivos,
Caldo Rappaport clnicos magnsio verde coliformes S. Salmonella spp.
Alimentos malaquita Typhi Shigella
Gram positivos,
coliformes,
S. Typhi,
Espcimes
Caldo Sais biliares S. Paratyphi,
clnicos Salmonella spp.
Tetrationato Iodo S. Pullorum,
Alimentos
S. Gallinarum,
S.Typhisuis,
S. Choleraesuis,
Meios seletivos-indicadores
No esquema de diagnstico das enterobactrias, os meios seletivos indicadores, de natureza
slida, desempenham funo primordial para o isolamento de diferentes membros dessa famlia.
Todos esses meios objetivam a diferenciao de Salmonella spp. de outras bactrias, em funo
de suas propriedades inibitrias e do aspecto macroscpico das colnias (Quadro 8).
Esses meios so comumente baseados na incapacidade da maioria das salmonelas em fermentar
a lactose e, em alguns casos, outros substratos, tais como a sacarose e a salicina, bem como a capacidade
de produo de sulfeto de hidrognio.
25
Vrios meios, tais como o gar Verde Brilhante, o gar Entrico de Hektoen, o gar Xilose Lisina
Desoxicolato, o gar Salmonella-Shigella e o gar Sulfito de Bismuto, so indicados nos procedimentos
aprovados por diferentes rgos reguladores para o isolamento de salmonela a partir de alimentos.
Como algumas cepas de salmonela podem produzir reduzida quantidade de gs sulfdrico
H2S, muitas vezes no detectado nos meios seletivos, ou ainda perder a capacidade de produzir esse gs,
particularmente na anlise de alimentos, importante que o segundo ou terceiro meio de isolamento
no seja baseado nessas duas caractersticas. Uma dessas opes o gar Verde Brilhante BG gar,
que se baseia na fermentao da lactose, mas no na produo de H2S, e o gar Bismuto Sulfito BS
gar, que se baseia na produo de H2S, mas no fermenta a lactose.
O gar Sulfito de Bismuto particularmente recomendado para o isolamento de S. Typhi,
entretanto no deve ser utilizado se foi preparado em perodo superior a 24-36 horas.
Por outro lado, esse meio inibe o crescimento de outros sorovares de Salmonella spp., a menos
que seja refrigerado a 4oC por, no mnimo, 24 horas antes de sua utilizao.
Mais recentemente, novos meios de cultura que incorporam substncias cromognicas em
sua frmula esto disponveis no mercado, os quais, por serem seletivos e indicadores, permitem
a diferenciao de Salmonella spp. de outras bactrias, pelo desenvolvimento de cores caractersticas
para cada gnero/grupo bacteriano. Dentre os meios cromognicos, podem ser citados: gar Rambach,
Cromocen SC, CHROMagar Salmonella, Colorex Salmonella.
O gar Rambach vem sendo utilizado para identificar Salmonella spp. em gneros alimentcios
e amostras clnicas, permitindo a diferenciao com membros do gnero Proteus e outras bactrias
entricas. Alm de um composto cromognico que indica a presena de b-galactosidase, prpria dos
coliformes, possibilita a identificao de Salmonella spp. por formar cido a partir do propilenoglicol que,
em combinao com um indicador de pH, resulta em uma colorao vermelho carmim, caracterstica de
suas colnias.
A presena de fragmentos de -galactosidase, caracterstica dos coliformes, evidenciada
pelo desenvolvimento de colnias azul-esverdeadas ou violeta-azuladas. Outras enterobactrias ou
bactrias Gram negativas, como Proteus., Pseudomonas, Shigella. S. Typhi e S. Paratyphi A apresentam
colnias incolores.
Cromocen SC um meio para a deteco, isolamento, diferenciao e/ou contagem de
Salmonella (exceto S. Typhi), coliformes totais e de outras bactrias Gram negativas. O meio se baseia
na combinao de uma reao cromognica para detectar a atividade -galactosidase e uma reao
bioqumica de degradao de fontes de carbono que produzem diminuio do pH, com a consequente
alterao de cor do indicador includo na formulao. A Salmonella (exceto S. Typhi) apresenta
colnias com centro vermelho e bordas mais claras; coliformes (exceto Klebsiella spp. e Citrobacter
spp.), colnias verde-azuladas; e Klebsiella spp. e Citrobacter spp. colnias violeta. As colnias incolores
ou com pigmentao prpria correspondem a outras bactrias Gram negativas.
26
CHROMagar Salmonella um meio seletivo e diferencial para o isolamento e a identificao

presuntiva de Salmonella spp. de outras bactrias coliformes e no coliformes em amostras fecais e de
alimento. Colnias de Salmonella, incluindo S. Typhi caracterizam-se pela cor prpura, e outras espcies
bacterianas so inibidas, incolores ou azuis.
Colorex Salmonella um meio cromognico para isolamento e diferenciao de Salmonella spp.,
incluindo S. Typhi, diretamente de espcimes clnicos e de alimento. Apresenta, em sua composio,
mistura cromognica especial que permite diferenciar Salmonella spp. de outras bactrias, com base
na cor e na morfologia das colnias, alm de inibir bactrias Gram positivas. Colnias de Salmonella
spp. se apresentam na cor prpura; E.coli e outros coliformes, na cor azul-esverdeada, enquanto os
microrganismos incapazes de hidrolisar o composto cromognico so incolores.
Nos espcimes clnicos, a recuperao de mltiplos sorovares de Salmonella spp. requer dois ou
mais meios seletivos indicadores e a escolha de um deles, ou do esquema a ser utilizado para o isolamento
e identificao desse microrganismo, , em grande parte, questo de preferncia pessoal. Portanto, na
escolha do meio de cultura, deve ser levado em considerao o espcime a ser analisado e os sorovares
usualmente detectados.
importante lembrar que a interao dos meios de enriquecimento e seletivos com a temperatura
e tempo de incubao so fundamentais para melhor isolamento dessa bactria.
A prevalncia de Salmonella spp. no ambiente e em alimentos e a necessidade de reduo do
intervalo de tempo das anlises laboratoriais tm levado busca e ao consequente uso de procedimentos
analticos mais rpidos. Entretanto, esses devem ser equivalentes, em sensibilidade e em especificidade,
aos mtodos clssicos, podendo ser citados: testes bioqumicos miniaturizados, mtodos baseados em
anticorpos, hibridizao de DNA e variaes do mtodo de PCR.
Apesar de vrios desses mtodos serem considerados rpidos, a maioria dos sistemas de
deteco de Salmonella spp. ainda recorre ao cultivo para recuperar clulas que sofreram danos
estruturais e ampliar a populao de Salmonella spp. em meios lquidos. Dessa forma, os procedimentos
de pr-enriquecimento e/ou enriquecimento seletivo, devem ser empregados em conjunto com os
mtodos rpidos.
27
28
Quadro 8 - Caractersticas dos meios seletivos indicadores
gar Verde gar Sulfito de

gar EMB. Mac Conkey gar SS gar Hektoen gar XLD
Brilhante Bismuto
Proteose peptona Proteose peptona Proteose peptona

Fontes de Peptona Proteose
Proteose peptona Extrato de Extrato de levedura Extrato de Extrato de
aminocido Proteose peptona peptona
levedura levedura levedura
Xilose
Lactose Lactose
Carboidratos Lactose Lactose Lactose Lactose Glicose
Sacarose Sacarose
Sacarose
Azul bromotimol Sulfito de
Eosina Vermelho neutro Vermelho de fenol Vermelho de
Indicadores Vermelho neutro Fucsina cida bismuto

Azul de metileno Citrato frrico Citrato frrico fenol
Citrato frrico Sulfato de ferro
Xilose
Fermentao
Lactose
Fermentao Fermentao Lactose Fermentao Produo de H2S
Fermentao da Sacarose
Detectado da lactose Lactose Sacarose Lactose Reduo do
lactose Produo de H2S
Sacarose Produo de H2S Salicina Sacarose bismuto
Descarboxilao da
H2S
lisina
Verde brilhante
Eosina Sais biliares Sais biliares Desoxicolato
Inibidores Sais biliares Verde brilhante Sulfito de
Azul de metileno Cristal violeta Citrato de sdio de sdio
bismuto
Salmonella
Bactrias Salmonella spp. Salmonella spp. Salmonella spp.
Enterobactrias Enterobactrias Salmonella spp. particularmente
Favorecidas Shigella spp. Shigella spp. Shigella spp.
S. Typhi
Fermentadoras:
Fermentadoras:
Fermentadoras: amarelas S. Typhi
Fermentadoras: ncleo rosado,
Fermentadoras: salmo No fermentadoras: Fermentadoras: colnias negras
vermelhas periferia clara
prpura/verde No cor do meio amarelo- circundadas por
No No
Aspecto das metlico fermentadoras: Descarboxilao da esverdeadas halo de brilho
fermentadoras: fermentadoras:
Colnias No verde-azuladas lisina vermelho- No metlico
incolores/ incolores
fermentadoras: Produo H2S: prpura ao redor das fermentadoras: Outros sorovares:
discretamente Produo H2S:
transparentes ponto negro no colnias vermelhas colnias negras
amarelas ponto negro no
centro Produo de H2S ou verdes
centro
ponto negro no centro
Identificao Bioqumica Presuntiva (Meios de Triagem)

Uma vez selecionadas colnias sugestivas nos meios indicadores seletivos, estas sero
transferidas para meios de triagem, tais como gar ferro triplo acar gar TSI, gar dois acares
ferro (Kligler KIA), gar Lisina Ferro LIA, meio de Costa e Vernin CV, meio IAL (modificao do
meio de Rugai e Arajo), gar Motilidade-Indol-Lisina MILi, gar Motilidade-Indol-Ornitina MIO
e meio EPM Escola Paulista de Medicina.
As caractersticas diferenciais dos meios de triagem mais utilizados esto descritas nos quadros
9, 10, 11, 12 e 13. Esses meios podem ser empregados de forma isolada ou em associao e possibilitam
caracterizao bioqumica presuntiva, indicando os testes bioqumicos complementares necessrios para
sua identificao.
1. gar ferro-acar triplo (gar TSI)

Esse meio utilizado para diferenciao de bastonetes Gram negativos com base na fermentao
e produo de gs dos carboidratos: glicose, lactose e sacarose e produo de sulfeto de hidrognio.
Permite verificar a fermentao da glicose por meio do aparecimento de colorao amarela na base
e a produo de gs, indicada pela formao de bolhas ou rachaduras no meio. A mesma colorao
tambm observada na poro superior do tubo quando ocorre fermentao da lactose e/ou sacarose.
Quando esses dois acares no so fermentados, o pice permanece com a cor original (mbar). A
produo de H2S indicada pela cor negra na base da poro central do tubo. Microrganismos como
Proteus mirabilis, Edwardsiella tarda, Citrobacter freundii e Salmonella spp. podem apresentar perfil de
comportamento semelhante.
gar ferro - dois acares (Kligler Iron gar KIA)

Esse meio apresenta as mesmas indicaes, leitura e interpretao do gar TSI, porm com
diferena na sua formulao por no conter sacarose.
gar Lisina-Ferro LIA

Esse meio de cultura usualmente empregado em associao com outro meio de triagem
para identificao presuntiva de enterobactrias, visando ofertar maior nmero de informaes para a
identificao presuntiva. A descarboxilao da lisina evidenciada pela colorao prpura (alcalina) da
base e, quando esta no ocorre, a cor amarela aponta somente a fermentao da glicose. A desaminao
da lisina visualizada no pice (vermelho-cobreado) e a produo de H2S (negro), usualmente, da base
at a poro central do tubo.
Meio de Costa e Vernin CV

Esse meio uma modificao do meio de Monteverde, apresentando camada inferior
semisslida e outra slida, permitindo avaliar as seguintes reaes: indol (tampo de algodo ou tira
29
de papel de filtro embebida no reativo), fermentao da lactose e sacarose, produo de gs, hidrlise
da ureia, produo de H2S, formado na interface do meio semisslido e slido, e mobilidade.
O ataque lactose ou sacarose, ou a ambas, com a produo de cido, torna o meio vermelho.
A presena de um anel negro na base da camada slida indica produo de H2S; a turvao difusa ou
no da parte semisslida revela a mobilidade; a colorao azul, distribuda por todo o meio, identifica as
bactrias produtoras de urease. Alm desses testes, o aparecimento de uma colorao rsea ou vermelha
na tira de papel de filtro ou no algodo caracteriza as bactrias produtoras de indol.
Meio IAL (PESSOA; SILVA, 1972)

Elaborado para triagem de enterobactrias, permite a leitura das seguintes provas bioqumicas:
indol (tampo de algodo ou tira de papel de filtro embebida no reativo), fermentao da sacarose
e da glicose, produo de gs, desaminao da fenilalanina, hidrlise da ureia, produo de H2S,
descarboxilao da lisina e mobilidade.
Meios MIO Motilidade-Indol-Ornitina e Meio MILi Motilidade-Indol-Lisina

Esses meios evidenciam a descarboxilao dos aminocidos ornitina ou lisina, a mobilidade e a
produo de indol. A mobilidade interpretada pela difuso do microrganismo na zona da inoculao;
a descarboxilao da ornitina ou lisina evidenciada pela colorao prpura (alcalina) da base, que
neutraliza o cido (amarelo), formado pela fermentao da glicose. A produo de indol observada pela
formao de um anel vermelho aps acrescentar 2 a 4 gotas do reativo de Kovacs superfcie do meio.
Meio EPM
O meio EPM uma modificao do meio de Rugai e Arajo, evidenciando a produo de
gs por fermentao da glicose, produo de H2S, hidrlise da ureia e desaminao do triptofano.
Quadro 9 - Caractersticas diferenciais dos meios TSI , KIA, MIO, MILi e LIA
TSI e KIA MIO/MILi LIA
Fontes de Peptona Peptona Peptona
aminocidos Extrato de carne Extrato de levedura Extrato de levedura
(desaminao) Extrato de levedura ornitina ou lisina lisina
Aminocidos
No Ornitina ou lisina Lisina
(descarboxilao)
Fermentao de lac+sac+glic = TSI
Glicose (0,1%) Glicose (0.1%)
carboidratos lac+ glic = KIA
Vermelho de fenol: Bromocresol prpura: Bromocresol prpura:
Indicador de pH cido = amarelo cido = amarelo cido = amarelo
alcalino = vermelho alcalino = prpura alcalino = prpura
(continua)
30
(continuao)
TSI e KIA MIO/MILi LIA
Fonte para produo
Tiossulfato de sdio No Tiossulfato de sdio
de H2S
Indicador da
Sulfato ferroso No Citrato frrico amoniacal
produo de H2S
Quadro 10 - Reaes nos meios de triagem TSI e KIA*

Leitura Interpretao Diagnstico presuntivo
Reao cida (amarelo) e gs Fermentao da glicose
Escherichia, Klebsiella
na profundidade Fermentao da lactose e/ou
Enterobacter
Reao cida na superfcie sacarose, com produo de
Providencia, Serratia
Ausncia de H2S gs
Reao cida e gs na
Fermentao da glicose sem Salmonella,
profundidade Superfcie
ataque lactose Edwardsiella
alcalina (vermelha)
e/ou sacarose Citrobacter, Proteus
Presena de H2S
Reao cida sem gs na Fermentao da glicose Shigella, Salmonella
profundidade, superfcie Nenhuma ao sobre a lactose Proteus, Providencia, Serratia,
alcalina Ausncia de H2S e a sacarose Yersinia
Fermentao da glicose com
Meio inteiramente cido com
gs Fermentao da glicose e/ Citrobacter, Proteus
gs Presena de H2S
ou da sacarose
Fermentao da glicose com
Meio inteiramente cido, sem formao de cido Escherichia coli,
gs Ausncia de H2S Fermentao da lactose e/ou Serratia
sacarose
Nota: *Para a interpretao do gar Kligler (KIA) no considerar a fermentao sobre a sacarose.
Quadro 11 - Reaes no gar Lisina Ferro LIA

Microrganismos Base pice H2S
Salmonella Prpura Prpura +
Proteus, Morganella Amarelo Prpura avermelhado +/-
Providencia Amarelo Prpura avermelhado -
Citrobacter Amarelo Prpura +
Escherichia Amarelo/ Prpura Prpura -
Shigella Amarelo Prpura -
Klebsiella Prpura Prpura -
Exceo: S. Paratyphi A = base amarela/ pice prpura
31
Quadro 12 - Reaes observadas no meio de Costa e Vernin CV

Leitura Microrganismos
Salmonella spp.
Meio inalterado, com certa alcalinidade no pice (esverdeado ou
Edwardsiella tarda
azulado). Presena de H2S; ausncia de gs; mvel ou imvel
Citrobacter freundii
Certos sorovares de
Reaes idnticas s acima citadas, sem H2S
Salmonella
Meio inalterado no prazo de 24h, podendo se acidificar em perodos mais Shigella spp.
longos (fermentao lenta); ausncia de H2S; mvel ou imvel Providencia sp.
Meio inteiramente azul, com produo ou no de H2S; dificuldade na
Proteus sp.
leitura da mobilidade
Camada slida azul (superfcie) e amarelo-azulado na poro semisslida
(base), indicando ao sobre a sacarose. Proteus vulgaris
Presena de H2S
Meio totalmente vermelho, por vezes podendo apresentar reas Escherichia,
amareladas (reduo); grande produo de gs. Ausncia de H2S. Enterobacter
Mobilidade presente ou no. pice do meio slido com discreta Klebsiella e Serratia
alcalinidade na Tribo Klebsielleae (sem gs)
Meio com discreta acidez na profundidade, ligeira alcalinizao na
superfcie. Presena de H2S, mvel
Meio inalterado com 24h; pequena alcalinizao na superfcie,
acentuando-se aps 48h. Forte tonalidade azul-esverdeada na superfcie. Pseudomonas
Ausncia ou discreto crescimento no meio semisslido
Quadro 13 - Interpretao do meio EPM

Produo de gs Formao de bolhas ou rachaduras no meio
Presena de pigmento negro de qualquer
Produo de H2S
Base intensidade
Colorao azul-esverdeada (fraca) na base indica
Hidrlise da ureia
prova positiva
Desaminao do Reao positiva: verde-escuro ou acastanhado
Superfcie
triptofano Reao negativa: superfcie inalterada
Caracterizao bioqumica complementar

Embora seja possvel uma identificao preliminar, com base na morfologia colonial e nas
reaes bioqumicas, nos diferentes meios indicadores seletivos e de triagem, a identificao de
membros da famlia Enterobacteriaceae requer a utilizao de provas bioqumicas complementares.
Entre as provas preliminares, destacam-se a deteco da enzima citocromo-oxidase e a reduo do
nitrato a nitrito, caractersticas intrnsecas da famlia. Alm dessas, dispe-se de uma variedade
de provas diferenciais complementares, as quais permitem avaliar as caractersticas metablicas,
contribuindo para a identificao posterior dos gneros/espcies.
32
Essas caractersticas so: fermentao de carboidratos, reao de vermelho de metila VM,

utilizao de citrato, produo de acetona VP, indol, urease, sulfeto de hidrognio H2S, descarboxilao
de aminocidos e mobilidade.
As principais caractersticas bioqumicas e diferenciais de Salmonella spp. esto descritas nos
quadros 14, 15, 16, 17, 18 e 19.
1. Citocromo-Oxidase
Os citocromos so hemoprotenas que contm ferro e funcionam como a ltima ligao da
cadeia respiratria aerbica, transferindo eltrons (hidrognio) ao oxignio com a formao de gua. O
sistema citocromo encontrado nos organismos aerbios ou microaerbios e anaerbios facultativos.
Portanto, o teste da oxidase importante na identificao de microrganismos que no possuem a enzima
ou so anaerbios obrigatrios. O teste muito til em estudos preliminares para diferenciao de
Enterobacteriaceae (negativas, exceto Plesiomonas shigelloides) de outras famlias como Aeromonadaceae,
Pseudomonadaceae e Vibrionaceae, positivas nesse teste.
A prova de citocromo-oxidase utiliza certos reativos corantes, como o dicloridrato de
p-fenilenodiamina ou oxalato de p-amino-dimetil-anilina, que atuam como aceptores artificiais de
eltrons, substituindo o oxignio. Esses so incolores no estado reduzido, mas na presena da enzima
e do oxignio atmosfrico se oxidam, formando produto de tonalidade azul ou rosa, respectivamente.
2. Reduo de Nitratos
A capacidade de um microrganismo reduzir nitrato a nitrito uma caracterstica importante
utilizada na identificao e na diferenciao de espcies de muitos grupos de microrganismos. Todas
as enterobactrias, exceto certos biotipos de Panthoea agglomerans e Erwinia, reduzem nitratos. Os
microrganismos que reduzem nitratos tm a capacidade de retirar oxignio destes para formar nitritos e
outros produtos de reduo.
A presena de nitritos no meio teste evidenciada pela cor vermelha aps adio do
reativo de Griess-Ilosvay, composto de duas solues: soluo A (cido sulfanlico 0,8g, cido
actico 30mL, gua destilada 75mL) e soluo B (alfa-naftilamina 0,5g, cido actico 30mL,
gua destilada 75mL).
3. Pesquisa da produo de indol

O indol um dos produtos metablicos de degradao do aminocido triptofano.
As bactrias que possuem a enzima triptofanase so capazes de hidrolisar e desaminar o triptofano
com produo de indol, cido pirvico e amnia. A prova est baseada na formao de um complexo
de cor vermelha quando o indol reage com o grupo aldedo do p-dimetilaminobenzaldedo (reativos
de Kovacs ou Ehrlich).
4. Prova do Vermelho de Metila VM

uma anlise quantitativa de produo de cidos fortes (ltico, actico, frmico), a partir da
glicose, por meio da via da fermentao cida mista. Como muitas espcies de enterobactrias podem
33
produzir quantidades suficientes de cidos fortes detectveis pelo indicador vermelho de metila, durante
as fases iniciais da incubao, somente os organismos que podem manter esse pH baixo aps incubao
prolongada (48h a 72h), superando o sistema estabilizador de pH do meio, que podem ser chamados de
vermelho de metila positivos. Para reduzir o tempo de incubao e leitura do teste, pode ser empregada,
como alternativa, a semeadura da cepa em 1mL do meio bsico, envasado em tubos 18x180, e aps o
perodo de 24 horas, efetivada a adio do reativo conforme a metodologia original e leitura conclusiva.
5. Prova de Voges-Proskauer VP
O cido pirvico, composto principal formado pela degradao fermentativa da glicose,
metabolizado por meio de vrias vias, de acordo com os sistemas enzimticos que possuem as diferentes
bactrias. Uma dessas vias leva produo de acetona (acetil-metil-carbinol), um subproduto inativo.
Os microrganismos do grupo Klebsiella-Enterobacter-Hafnia-Serratia produzem acetona como principal
subproduto do metabolismo da glicose e formam quantidades menores de cidos mistos. Na presena de
oxignio atmosfrico e de hidrxido de potssio a 40%, a acetona convertida em diacetila e o alfa-naftol
atua como catalisador para revelar um complexo de cor vermelha. Esse teste pode ser agilizado quanto
execuo e leitura, efetuando semeadura da cepa em 1mL do meio bsico envasado em tubos 18x180 e,
aps o perodo de 24 horas, efetivada a adio dos reativos (0,2mL de KOH 40% e 0,6mL de -naftol 5%),
repouso por 30 minutos e leitura conclusiva.
Mecanismo bioqumico dos testes de VM e VP
Glicose
cido pirvico
Acetilmetilcarbinol Fermentao cida mista

(Acetona) pH < 4,5
(VM +)
Butilenoglicol Diacetila KOH + O2
Alfa-naftol
Complexo vermelho (VP +)
6. Utilizao do citrato
O citrato de sdio um sal de cido ctrico, composto orgnico simples, que constitui um dos
metablitos do ciclo dos cidos tricarboxlicos (Ciclo de Krebs). Algumas bactrias podem obter energia
34
por via diferente da fermentao de carboidratos, utilizando citrato como nica fonte de carbono. A
avaliao dessa caracterstica importante para identificao de certos gneros e espcies da famlia
Enterobacteriaceae. Os meios de cultura empregados para detectar a utilizao de citrato so isentos de
protenas e carboidratos como fontes de carbono.
O meio de cultura tem como nica fonte de carbono o citrato de sdio, um nion, apresentando
ainda fosfato de amnia como nica fonte de nitrognio. As bactrias capazes de utilizar o citrato tambm
so capazes de extrair nitrognio do sal de amnio, levando alcalinizao do meio a partir da converso
do NH3 em hidrxido de amnia (NH4OH). Como indicador, utilizado o azul de bromotimol, que nas
reaes positivas (pH > 7.6) torna o meio de tonalidade azul.
7. Hidrlise da Ureia
A urease uma enzima presente em muitas espcies de microrganismos que podem
hidrolisar a ureia. A ureia uma diamina do cido carbnico; todas as aminas so facilmente
hidrolisadas com liberao de amnia e de dixido de carbono. A amnia reage em soluo para
formar carbonato de amnio, resultando na alcalinizao e aumento do pH do meio.
Podem ser utilizados dois meios para a deteco de urease, o caldo ureia de Stuart e o gar
Ureia de Christensen. O primeiro tamponado com sais de fosfato a um pH 6,8, sendo indicado para
identificao de microrganismos produtores de grandes quantidades de amnia para superar o sistema
e elevar o pH do meio para produzir uma viragem do indicador (> 8.0), sendo seletivo para espcies
de Proteus. O gar Ureia de Christensen possui um sistema tampo muito mais fraco, permitindo
detectar produes menores de amnia, sendo, portanto, apropriado para a anlise de bactrias que
apresentam formao reduzida de urease ativa.
8. Produo de sulfeto de hidrognio H2S

Capacidade de certas espcies bacterianas para liberar enxofre na forma de H2S a partir
de aminocidos ou de outros compostos. A produo de H2S pode ser detectada em um sistema
analtico se as seguintes condies estiverem presentes: liberao de sulfeto a partir da cistena ou
do tiossulfato por ao enzimtica bacteriana; acoplamento do sulfeto com o on hidrognio para
formar H2S; deteco do H2S pelos sais de metais pesados, tais como ferro, bismuto ou chumbo,
na forma de sulfeto de metal pesado, um precipitado negro.
H2S + metal pesado = sulfeto = precipitado negro
9. Descarboxilases
As descarboxilases representam um grupo de enzimas substrato especficas, capazes de atuar
sobre a poro carboxila dos aminocidos, formando aminas de reao alcalina. Lisina, arginina e
ornitina so os trs aminocidos habitualmente avaliados na identificao das enterobactrias cuja
descarboxilao resulta na liberao das seguintes aminas especficas:
Lisina cadaverina
Ornitina putrescina
Arginina citrulina
35
Na converso de arginina para citrulina intervm uma dehidrolase, ao invs de uma

descarboxilase, visto que, na primeira etapa, o NH2 retirado da arginina. Em sequncia, a citrulina
transformada em ornitina que, em seguida, sofre descarboxilao para formar putrescina.
Durante os perodos iniciais da incubao, o meio torna-se amarelo devido fermentao da
glicose presente. Se o aminocido for descarboxilado, formam-se aminas alcalinas e o meio volta cor
prpura original.
10. Fenilalanina desaminase

A fenilalanina um aminocido que, por desaminao, forma um cetocido, o cido fenilpirvico.
Entre os membros da famlia Enterobacteriaceae, somente espcies dos gneros Proteus, Morganella e
Providencia possuem a enzima desaminase, necessria para essa converso.
O teste da fenilalanina baseado na deteco de cido fenilpirvico, o qual liberado no meio,
aps o crescimento do organismo teste. Sua presena visualizada pela adio de uma soluo de cloreto
frrico a 10%, quando aparece uma cor verde.
Fenilalanina desaminao __ cido fenil pirvico ____________ precipitado verde (piruvato)

Cloreto frrico 10%
11. Fermentao de carboidratos

So extensivamente empregadas nos meios de cultura como fonte de energia para a bactria
e, mais particularmente, para diferenciao de gneros e identificao de espcies. A fermentao
um processo metablico de oxidao-reduo que tem lugar em um ambiente anaerbico, no qual um
substrato orgnico serve como aceptor final de hidrognio (eltron) ao invs do oxignio. Nos sistemas
de provas bacteriolgicas, esse processo detectado por observao da mudana de cor dos indicadores
de pH quando os produtos cidos so formados. A fermentao dos carboidratos produz cido e gs ou
somente cido, sendo que a produo de gs (dixido de carbono e hidrognio) se detecta pelo acmulo
de gs em um tubo de vidro (tubo de Durham) invertido no meio. A fermentao de substratos orgnicos,
tais como carboidratos, resultam em produtos finais reduzidos e oxidados.
Quadro 14 - Caractersticas bioqumicas de Salmonella spp.

Meios Reaes
Ureia Reao negativa
LDC Lisina Positivo: Reao alcalina (cor prpura do meio) e amarelo no meio
descarboxilase controle (exceto S. Paratyphi)
ODC Ornitina Positivo: Reao alcalina (cor prpura do meio) e amarelo no meio
descarboxilase controle (exceto S. Gallinarum ODC negativo)
VM Vermelho
Colorao vermelha do meio aps adio do reagente
de metila
(continua)
36
(continuao)
Meios Reaes
VP Voges-
Meio sem alterao aps adio dos reagentes
Proskauer
Fenilalanina
Meio inalterado aps colocao do reagente
desaminase
Utilizao do citrato Positivo: Reao alcalina cor azul do meio
SIM
Indol Negativo anel amarelo aps colocao do reagente Kovacs
Presena de pigmento negro de qualquer intensidade ou somente na
H2S
picada (cepas imveis)
Motilidade Crescimento ao longo da picada (imvel) ou turvao do meio (mvel)
Fermentao de acares
Glicose Positivo (reao cida) com/sem gs no tubo de Durhan
Lactose Negativo/Positivo
Manitol Positivo
Sacarose Negativo
Quadro 15 - Percentuais de positividade de Salmonella spp. nas provas bioqumicas
Percentual de Salmonella
Meios de cultura Reao positiva ou negativa
que apresenta essa reao1
TSI glicose (cido) + 100
TSI glicose (gs) + 91,9 2
TSI lactose - 99,2 3
TSI sacarose - 99,5
TSI H2S + 91,6
LIA + 98
SIM (H2S) + 97
SIM (indol) - 98,9
SIM (motilidade) + 97
Hidrlise da ureia - 99
Lisina descarboxilase + 94,6
Ornitina descarboxilase + 97
Reao de Voges-Proskauer - 100
Reao do Indol - 98,9
Notas: Esses percentuais indicam incidncia de cepas com reaes marcadas como + ou -.
1
2
S.Typhi anaerognica.
3
Salmonella enterica subespcie arizonae: reaes +/ para lactose, -galactosidase positiva; Salmonella
enterica subespcie salamae: reao para lactose e -galactosidase.
37
Quadro 16 - Caractersticas bioqumicas diferenciais de Salmonella spp.,

Proteus sp., Citrobacter sp. e Edwardsiella tarda
Cirobacter diversus
Edwardsiella tarda
Salmonella Typhi
Proteus vulgarsis
Proteus mirabilis
Salmonella spp.
amalonaticus
Citrobacter
Glicose (gs) +/- + + + + +/- + -
Fermentao
Manitol + + + - - - + +
Lactose +/- +/- -/+ - - - - -
Sacarose +/- -/+ -/+ - -/+ + - -
Dulcitol -/+ -/+ - - - - + -
ONPG +/- + + - - - - -
Vermelho metila + + + + + + + +
Voges-Proskauer - - - - +/- - - -
Indol -/+ + + + - + - -
Citrato Simmons +/- + + - +/- -/+ + -
Acetato -/+ +/- +/- - -/+ -/+ + -
Malonato -/+ + - - - - - -
H2S +/- - -/+ + + + + +
Mobilidade +/- + + + + + + +
Hidrlise ureia -/+ +/- +/- - + + - -
Fenilalanina
- - - - + + - -
desaminase
Lisina
- - - + - - + +
descarboxilase
Arginina
+/- +/- +/- - - - +/- -
dehidrolase
Ornitina
- + + + + - + -
descarboxilase
KCN +/- - + - + + - -
Nota: + : positivo; - : negativo.
38
Quadro 17 - Diferenciao bioqumica entre S. enterica subespcie enterica, Citrobacter sp.

e Edwardsiella tarda
S. enterica Citrobacter Citrobacter Edwardsiella

sub. enterica freundii diversus tarda
Descarboxilao:
Lisina + - - +
Ornitina + [-] + [+]
Indol - - + +
Citrato + + + -
Simmons
H 2S +/ [+] - +
Urease - +/- +/-
KCN - + + -
ONPG - + - -
Notas: + : positivo; - : negativo; [+]: 76 a 89% positivo; [-]: 11 a 25% negativo.
Quadro 18 - Diferenciao entre Citrobacter freundii e Salmonella arizonae e S. diarizonae

LDC1 Glicerol Malonato ODC2 Gelatinase
Citrobacter freundii - + - - -
Salmonella arizonae + - + + + (lenta)
Salmonella diarizonae + - + + + (lenta)
Notas: Lisina descarboxilase.
1
2
Ornitina descarboxilase.
Quadro 19 - Diferenciao entre Salmonella Paratyphi C e S. Choleraesuis
Dulcitol H2S Mucato

S. Paratyphi C (Vi + ou Vi-) + + -
S. Choleraesuis - - -
S. Choleraesuis var. Kunzendorf - + -
Nota: S. Paratyphi C adaptada ao homem e S. Choleraesuis possui caracterstica ubiquitria.
39
8 Aspectos Gerais Antgenos
das Enterobactrias
Antgenos comuns: todas as espcies da famlia Enterobacteriaceae apresentam um antgeno

comum, tambm designado de antgeno de Kunin. Sua presena usualmente no avaliada, tendo em
vista que no representa um critrio relevante para a diferenciao entre gneros ou espcies.
Antgeno de parede ou antgeno O Ohne: composio lipopolissacardica
(hexosamina 3.5% a 4.5%; complexo fosfolipdico 20% a 30%; polissacardeos 60%).
termoestvel (1hora/100oC), no sendo destrudo pelo lcool etlico a 50oGL. Esse antgeno composto
de trs partes:
poro lipdica, responsvel pela toxicidade e caractersticas pirognicas;
poro basal ou core;
polissacardeo, caracterstico da especificidade somtica das formas lisas (S).
constitudo de cadeias repetitivas, cujo arranjo espacial confere natureza definida. Esta,
aliada ao tipo de ligao, determina a especificidade dos antgenos O.
Cepas em fase lisa (S Smooth) apresentam colnias com superfcies homogneas, brilhantes
e bordos regulares indicativos de antgeno O completo. A ocorrncia de mutao que afete sua poro
basal, ou na sntese de sua cadeia, resulta na perda da especificidade do antgeno. So designadas rugosas
R (Rough) de superfcie e bordos irregulares. So autoaglutinveis em soluo salina, facilmente
fagocitveis e sensveis ao do complemento e, como consequncia, perdem sua capacidade patognica.
No procedimento laboratorial para a confirmao antignica, a aglutinao das clulas
bacterianas (somtica ou antgeno O) pelo antissoro especfico apresenta como caracterstica a formao
de grnulos finos no dissociveis pela agitao, tendo em vista que a reao ocorre pela inter-relao das
paredes das clulas bacterianas.
Antgeno flagelar ou antgeno H (Hauch): est presente nas enterobactrias mveis e sua
composio proteica, designada flagelina. As diferenas antignicas surgem devido a variaes na
estrutura primria (contendo aminocidos) das diferentes molculas de flagelina.
A estrutura flagelar possui como caracterstica importante a termolabilidade, podendo ser
destrudo a 100oC por uma hora, bem como aps ao lenta do lcool 50oGL, sendo resistente soluo
de formol a 0,5%.
40
A aglutinao flagelar apresenta como caracterstica a formao de grumos espessos que se

dissociam rapidamente por meio de agitao. Esta ocorre em tempo mais rpido do que aglutinao
somtica, devido ao elevado nmero existente na clula, quando comparado aglutinao somtica
(entre as clulas bacterianas).
O arranjo espacial e as caractersticas intrnsecas ao gnero possibilitam a produo de dois
tipos de flagelos distintos. Em uma populao bacteriana de uma cepa de Salmonella spp., que produza
dois tipos distintos de flagelo, a frequncia de variao de clulas que apresentam um dos tipos ou fases
na ordem de 104.
Antgeno de superfcie ou envoltrio Vi (Flix e Pitt): apresenta sua localizao espacial
externa, a qual impede a deteco do antgeno somtico. Usualmente, encontra-se presente em cepas
de S. Typhi isoladas de pacientes, podendo tambm ser detectados em S. Paratyphi C e S. Dublin. So
termolbeis, podendo ser destrudos pelo aquecimento da suspenso a 100oC/10 a 15 minutos. Apresenta
como relevncia a possibilidade de uso como ferramenta epidemiolgica por meio de um conjunto de
preparados fgicos.
41
9 Caracterizao Antignica
de Salmonella spp.
A sorotipificao constitui importante ferramenta epidemiolgica complementar na identificao

de Salmonella spp., permitindo determinar a prevalncia/emergncia ou apontar tendncias de um
sorovar em distintas zonas geogrficas, bem como identificar surtos, conhecer as fontes de infeco e
vias de transmisso. A distribuio dos sorovares esto catalogadas no esquema de Kauffmann e White
(POPPOF; MINOR, 2001) e envolve a identificao dos antgenos somticos e flagelares.
Esquema de Kauffmann-White
Baseado nos componentes antignicos somticos O e flagelares H, foi estabelecido o esquema
denominado Kauffmann-White, que contm informaes quanto s espcies, subespcies e apresenta
listadas as frmulas antignicas de todos os sorovares. Sua editorao efetuada pelo Centro Colaborador
para Referncia e Pesquisa em Salmonella da Organizao Mundial de Sade (Instituto Pasteur-Paris),
sendo revisado anualmente quanto caracterizao de novos sorovares. A editorao completa dessa
listagem efetivada a cada cinco anos.
Apresenta-se sob a forma de tabela, contendo o conjunto das caractersticas antignicas.
Compreende na primeira coluna a estrutura somtica, cujos sorovares que possuem tais caractersticas
so identificados por letras maisculas. Ex.: grupo A (O:2), grupo B (O:4), grupo C1 (O:6,7), grupo C2
(O:6,8,20), grupo D1 (O:9), grupo E1 (O:3,10), grupo E2 (O:3,15), grupo E4 (O:1,3,19) etc.
A segunda e a terceira colunas apresentam suas estruturas flagelares, indicadas por letras
minsculas e nmeros,fase 1, e a fase 2, representada por nmeros arbicos, alm de letras minsculas.
Em relao aos antgenos O e H, alguns aspectos devem ser considerados:
1. Antgeno O de Salmonella spp.:
O grupo antignico identificado por alguns fatores, como: O:4, O:9. Outros tm pouco ou
nenhum valor discriminatrio e se apresentam normalmente associados, por exemplo: O:12, com O:2,
O:4 e O:9; S. Paratyphi A (O:1,2,12), S. Typhimurium (O:1,4,5,12) e S. Enteritidis (O:1,9,12).
Determinados antgenos surgem como consequncia de uma modificao da estrutura, por
exemplo: O:1 resulta da insero de uma cadeia de galactose no polissacardeo e O:5, de uma reao
de acetilao, presente nas unidades repetidas do polissacardeo, responsvel pela especificidade, por
exemplo: O:4,12 como o caso do sorovar S. Typhimurium O:1,4,5,12.
42
2. Antgenos H de Salmonella spp.:

Os fatores antignicos H de Salmonella so representados por letras minsculas nas fases
especficas (H1), como i em S. Typhimurium e z10 em S. Hadar, ou associadas, q, m, f, g, h etc. A outra
fase, definida como no especfica ou H2, representada por nmeros arbicos, como 1,2; 1,5; 1,6; 1,7,
alm de letras minsculas e.n, x, z4, z6 etc.
Identificao antignica
Determinadas caractersticas bioqumicas especficas podem ser observadas em alguns
sorovares, como S. Typhi: ausncia de gs em glicose, produo reduzida de H2S, lisina descarboxilase
positiva, ornitina descarboxilase e utilizao do citrato de Simmons negativas; S. Paratyphi A: produo
de gs em glicose, ornitina descarboxilase positiva, produo de H2S, lisina descarboxilase e citrato
de Simmons negativas. Entretanto, a confirmao do sorovar somente poder ser dada por meio da
identificao antignica conclusiva.
Principais cuidados para a execuo do teste

Nunca utilizar crescimento a partir de meios de cultura que contenham carboidratos.
Semear, preferentemente, a cepa em tubo 13x100, contendo gar nutriente inclinado,
envasado com bisel longo (4cm a 5cm).
Preparar suspenso utilizando soluo salina (0.85% NaCl).
A suspenso dever apresentar turbidez semelhante ao tubo 3 da escala de MacFarland.
Usualmente, o volume de soluo salina adicionada de aproximadamente 1,5mL.
Realizar o teste somente a partir de cultivos recentes (mximo de 18 a 24 horas de
crescimento a 37C).
Em amostras com antgeno de envoltrio, efetuar a retirada, por meio do aquecimento da
suspenso em (100C por 15 minutos).
Observar se a suspenso apresenta-se homognea antes de realizar o teste, certificando-se
de que esteja em sua forma lisa.
Cepas que apresentarem grumos que se depositam aps um perodo em repouso so
consideradas autoaglutinveis e devem ser submetidas a um reisolamento para tentativa
de isolamento de cepas lisas. Estas devero ser reavaliadas e, caso persista o perfil de
autoaglutinao, encaminhadas ao laboratrio de referncia.
Execuo do teste de soroaglutinao rpida

Semear a cepa isolada em gar nutriente inclinado e incubar 37oC/18h-24h.
Preparar suspenso, adicionando soluo salina (0,85g% NaCl).
Homogeneizar a suspenso.
Observar a homogeneidade da suspenso e, no caso de dvidas, observar ausncia de
aglutinao em lmina e dar prosseguimento para a confirmao do gnero Salmonella.
Em uma lmina de vidro, adicionar uma gota (10l) de antissoro polivalente OH ou
antissoro polivalente somtico e uma gota da suspenso bacteriana, homogeneizando com
o auxlio de uma ala de platina ou com um palito de madeira.
43
Impelir movimentos rotatrios e observar, at o perodo de um minuto, em caixa de

Huddleson, a presena de aglutinao (grumos).
Repetir o procedimento, empregando antissoros polivalentes flagelares.
No diagnstico de S. Typhi, empregar inicialmente o antissoro Vi para caracterizao do
antgeno de envoltrio. Caso a reao seja positiva, aquecer a suspenso em (100oC/15
minutos) reavaliar com antissoro Vi e, caso no seja observada aglutinao, confirmar a
estrutura somtica por meio do antissoro OD. Para identificao conclusiva de S. Typhi,
efetivar a caracterizao do antgeno flagelar Hd.
Todas as cepas de Salmonella spp. devem ser encaminhadas para o Laboratrio de Referncia
Nacional (IOC/Fiocruz) para identificao antignica conclusiva e realizao de ensaios complementares.
Variaes que afetam a Tipagem Antignica em Salmonella spp.

1. Variao Capsular V-W: fenotpica
Impede aglutinao somtica.
Utilizada em avaliao epidemiolgica (lisotipia em S.Typhi).
2. Variao da Estrutura Somtica S-R: genotpica

de natureza genotpica.
Determina alteraes quanto morfologia colonial.
Usualmente, apresenta ausncia de estabilidade em soluo salina.
3. Variao Flagelar OH-O: fenotpica

Permite a formao de grandes flocos que se dissolvem com agitao.
Importante na caracterizao conclusiva dos sorovares de Salmonella spp.
Quando da perda de uma de suas fases, podem ser, na maioria das vezes, recuperados,
utilizando o meio de Craigie (gar semisslido 0,5%):
Ilustrao 1 - Induo de fase: semeadura em meio de Craigie
Semear a cepa
Repicar cepa e
caracterizar a fase
Adicionar desconhecida
antissoro de fase
conhecida
4. Variaes Mediadas por Fagos

Presena de fagos temperados: grupos A, B, D de Salmonella spp.
Converso lisognica: frao 12 (Salmonella spp.)
44
10 Meios de Cultura
1. Principais aspectos quanto manuteno e estocagem:

Somente devem ser recebidos meios de cultura, adquiridos por meio de compra, cujo prazo
de validade seja seis meses da data de recebimento.
Apertar todas as tampas dos frascos.
Observar prazo mximo de estocagem.
Registrar o quantitativo em estoque, recepo e sada.
Nenhum meio de cultura pode ser utilizado aps a data de vencimento.
A revalidao somente pode ser efetuada pelo fabricante.
Os meios de cultura preparos devem ser estocados sob proteo da luz solar.
A manuteno deve, preferencialmente, ser efetuada sob refrigerao a 4C.
2. Preparo dos meios de cultura:

Na re-hidratao ou preparo devem ser seguidas, obrigatoriamente, as instrues do
fabricante.
Preparar a quantidade mnima, suficiente para o uso.
Observar o tempo de validade de meios preparados, estocados sob condies adequadas.
Quadro 20 - Durao mxima de meios de cultura
Meio slido envase em placas de Petri
4C
Meio de cultura 4C
Embalagem plstica
gar sangue 15 dias 50 dias
gar EMB 15 dias 60 dias
gar MacConkey 15 dias 60 dias
gar SS 6 dias 10 dias
gar XLD 5 dias 10 dias
gar Hektoen 5 dias 10 dias
gar Verde Brilhante 2 dias 4 dias
gar Sulfito Bismuto 24 horas 24 horas
45

Meio slido envase em tubos
Fechamento
Bucha de algodo Bucha de algodo
hermticoplstico
Meio de cultura 4C TA
4C
No semanas No semanas
No meses
gar LIA 1-2 1-2 3-6
gar TSI 1-2 2-4 3-6
gar KIA 3-4 2-4 2-4
gar Mller Hinton 1-2 2-4 3-6
gar Nutriente 3-4 1-2 2-4
gar Ureia 3-4 1-2 2-4
gar Citrato 3-4 1-2 2-4
gar Fenilalanina 3-4 1-2 2-4
Meio lquido - envase em tubos
Bucha de Bucha de Fechamento Lacre de
algodo algodo hermtico alumnio
Meio de cultura
4C TA Plstico 4C TA
No semanas No semanas No meses No meses
C. Mller Hinton 3-4 1-2 2-4 3-6
C. Infuso Corao 3-4 1-2 2-4 3-6
C. Tripticase Soja 3-4 1-2 2-4 3-6
C. Peptonado 3-4 1-2 2-4 3-6
C. Nitrato 3-4 1-2 2-4 3-6
C. Selenito 3-4 1-2 2-4 3-6
Meio-fermentao
3-4 1-2 2-4 3-6
carboidratos
3. Controle de qualidade dos meios de cultura
Controlar o pH de cada partida de meio.
Efetuar teste de esterilidade.
Realizar teste de desempenho: inocular uma ala do crescimento da cepa padro e incubar
nas condies de rotina at obter turvao correspondente ao tubo 0.5 da escala de
MacFarland.
Anotar e registrar resultados em cada lote, como o exemplo a seguir.
Ilustrao 2 - Ficha de registro das caractersticas de qualidade dos meios de cultura
Data Data - Lote Data Desempenho Esterilidade
pH Responsvel
Controle Fabricao Vencimento +/- +/-
Meio de cultura: ______________________________________

Cepas para controle: P
ositivo: ___________________________
Negativo: __________________________
46
11 Figuras
Figura 1 - Invaso de Salmonella Typhimurium em cultura de clulas
Fonte disponvel em:

<http://science.nasa.gov/science-news/science-at-nasa/
2003/01dec_yeast/>

Figura 2- Fotomicrografia de Salmonella Enteritidis
Fonte disponvel em:

<http://www.healthhype.com/tag/salmonella>
Figura 3 - Crescimento de Salmonella spp. em Agar Sangue
Fonte disponvel em:

<http://www.path.cam.ac.uk/partIB_pract/P16/>
47
Figure 4- Crescimento de Salmonella spp. em Agar Desoxicolato CitratoColnias
Fonte disponvel em:

<http://www.biotechlearn.org.nz/media/images/news_images/salmonella_sample>
Figura 5 - gar Mac Conkey morfologia colonial de Salmonella spp.
Fonte disponvel em: <flickr.com/photos>
Figura 6 - gar XLD morfologia colonial de Salmonella spp.
Fonte disponvel em: <http://www.bact.wisc.edu>
Figura 7 - gar Entrico Hektoen morfologia colonial de Salmonella spp.
Fonte disponvel em: <labent/ioc/fiocruz>
48
Figura 8 - gar Eosina- Azul de Metileno
Fonte: (KONEMAN; SOMMERS,1989)

!
Figura 9 - gar Salmonella-Shigella gar SS colonias de Salmonella spp.
Fonte disponvel em: <labent/ioc/fiocruz
Figura 10 - TSI gar ferro trs acares
Fonte disponvel em:

<users.stlcc.edu/kkiser/biochem.html>
Figura 11 - LIA gar Lisina Ferro
Fonte disponvel em:

49
Figura 12 - Reao do Vermelho de Metila VM
Fonte disponvel em:

<people.rit.edu/.../PDFfiles/20081MicroLab4.pdf>
Figura 13 - Positivo: Reao de Voges-Proskauer VP
Fonte disponvel em:

Figura 14 - Utilizao do Citrato de Simmons
Fonte disponvel em:

Figura 15 - Descarboxilao de aminocidos (Moeller)
Fonte disponvel em:

50
Figura 16 - Utilizao do Malonato
Fonte disponvel em:

Figura 17 - Utilizao da ureia- ;gar Ureia de Christensen
Fonte disponvel em:

Figura 18 - Meio SIM (H2S; Indol; Mobilidade)
Fonte disponvel em:
1 2 3 4 <people.rit.edu/.../PDFfiles/20081MicroLab4.pdf>
Notas: 1: no inoculado; 2: H2S - Indol + Mobilidade+;
3:H2S - Indol Mobilidade-; 4: H2S + Indol Mobilidade+.
51
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CDS_CSR_RMD_2003_6/en/. > . Acesso em: 12 dez. 2008.
54
Anexo
Meios de cultura e reagentes: para o preparo dos meios de cultura desidratados, reagentes e
solues comercializados e no discriminados a seguir, obedecer s recomendaes dos fabricantes.
Meios de Pr-enriquecimento
gua Peptonada 1% Tamponada (pH 7,2)
Peptona 10,0g
Cloreto de sdio 5,0g
Fosfato de sdio dibsico 3,5g
Fosfato de potssio monobsico 1,5g
gua destilada 1000mL
Suspender e dissolver os componentes em gua destilada, esterilizar em autoclave a 121C por
15 minutos.
pH final: 7,2 0,2 a 2C
Caldo Tetrationato
Polipeptona 5g
Sais biliares 1g
Carbonato de clcio 10g
Tiossulfato de sdio (penta-hidratado) 30g
Suspender os componentes em gua destilada e dissolver por aquecimento at a ebulio.
Distribuir alquotas de 10mL em tubos de ensaio de 16mmx160mm previamente esterilizados. No
autoclavar. Estocar por at duas semanas a 5C-10C.
pH final 8,4 0,2 a 25C.
No momento da utilizao do meio, adicionar para cada 10mL de caldo tetrationato, 0,2mL de
soluo de iodo-iodeto de potssio e 0,1mL de soluo de verde brilhante a 0,1%.
O meio no dever ser estocado aps o acrscimo das solues anteriormente descritas.
55
Caldo Rappaport-Vassiliadis
Meio Base
Triptona 5g
Cloreto de sdio 8g
Fosfato monobsico de potssio 1,6g
gua destilada 1.000mL
O meio base dever ser preparado no dia de sua utilizao.
Soluo de Cloreto de Magnsio

Cloreto de magnsio hexa-hidratado 400g
Estocar em frasco escuro, temperatura ambiente, por at um ano.
Soluo de Verde Malaquita Oxalato

Verde malaquita oxalato 0,4 g
gua destilada 1.000 mL
Estocar em frasco escuro, temperatura ambiente, por at seis meses.
Preparo e distribuio final do meio
Para o preparo do meio completo, acrescentar para cada 1.000mL do meio base: 100mL de
soluo de cloreto de magnsio e 10mL de soluo de verde malaquita oxalato. Dispensar alquotas de
10mL em tubos de 16mm x 160mm. Autoclavar a 115C por 15 minutos. Estocar o meio completo em
refrigerador e utilizar em at um ms aps o preparo.
pH final 5,5 0,2 a 25C
Meios de Triagem
Meio de Triagem de Costa e Vernin CV
A - Base semisslida
Peptona 20g
Cloreto de sdio 5g
Soluo de Azul de Timol 3mL
Indicador de Andrade 10mL
gar-gar. 5g
Adicionar todos os elementos gua e aquecer at dissolver completamente o gar. Ajustar o
pH a 7,3 ou a 7,4. Distribuir quantidades exatas do meio em bales e esterilizar a 121C por 15 minutos.
B - Base Slida
Peptona (Bacto) 1g
Triptona ou tripticase 5g
56
Tiossulfato de sdio 0,2g

Sulfato ferroso amoniacal 0,2g
Soluo de azul de timol 3mL
gar 20g
Adicionar os componentes em gua destilada e aquecer em banho-maria fervente at a completa
dissoluo. Ajustar o pH a 7,3 ou a 7,4. Distribuir quantidades exatas do meio em bales e esterilizar a
121C por 15 minutos.
Preparo e distribuio final do meio
Fundir as bases e resfriar entre 50C a 60C, aproximadamente. Adicionar, a cada um deles, na
proporo de 5mL por 100mL de meio, a soluo de ureia e acares. Distribuir, inicialmente, o gar
semisslido em volume de 2,5mL em tubos esterilizados de 13mm de dimetro com altura varivel. Deixar
solidificar, temperatura ambiente, por cerca de 30 minutos e acrescentar, em seguida, volume idntico, por
tubo, da base slida. Inclinar os tubos, de modo a deixar uma base de 2cm a 3cm de altura, aproximadamente.
Soluo de azul de timol

Azul de timol 1,6g
NaOH 0,1N 34,4mL
gua destilada 65,6mL
Indicador de Andrade
Fucsina cida 0,5g
Hidrxido de Sdio N 16mL
gua destilada 100mL
Dissolver a fucsina em gua destilada e adicionar o hidrxido.
Soluo de Ureia e acares

Ureia 20g
Lactose 30g
Sacarose 30g
gua destilada 100mL
Dissolver a mistura por aquecimento brando em banho-maria e esterilizar por filtrao.
Conservar em geladeira.
A semeadura executada com auxlio de agulha, introduzindo-a at o tero superior da

metade da camada semisslida e sob a forma de estrias, na superfcie da parte slida. Neste meio,
poder ser pesquisada a produo de indol, fixando no tampo, aps a inoculao, uma tira de papel
de filtro, embebida no reativo para pesquisa de indol ou ento impregnando o prprio algodo
(hidrfilo) na sua base interna, com esse reativo. Incubar a 37C durante 24 a 48 horas.
57
Meio de Triagem IAL (PESSOA; SILVA, 1972)
Base (Meio de Rugai)

Triptona (Difco) 10g
Extrato de carne (Difco) 2g
Cloreto de sdio (Merck) 5g
Fosfato dissdico (Synth) 2g
L-triptofano (Nuclear) 1g
Azul de bromotimol (Inlab) soluo alcolica 1,5% 2mL
gar (Difco) 11g
Dissolver todos os ingredientes, com exceo do gar e do indicador. Ajustar o pH em
7,40,2, acrescentar o gar, fundir, filtrar e adicionar o indicador. Esterilizar 121C por 15 minutos.
Lisina
Extrato de levedura (Oxoid) 3g
Glicose (Synth) 0,5g
Nitrato de potssio (Merck) 0,5g
L-lisina (Ajinomoto) 5g
gar (Difco) 4g
Prpura de bromocresol(Merck) soluo alcolica 1,6% 1,25mL
Dissolver todos os ingredientes, acertar o pH em 6,40,2, acrescentar o gar e aquecer at
completa fuso.
Vascar
Cera de carnaba (tipo flor) 10g
Vaselina lquida 90mL
Reativo de indol
p-dimetil aminobenzoaldedo 1g
cido arcrbico 2g
Dissolver o p-dimetil aminobenzoaldedo no lcool, adicionar o cido ortofosfrico e gua.
Soluo substrato
Citrato de ferro amoniacal 2g
Tiossulfato de sdio 2g
Sacarose 80g
Glicose 10g
Ureia 40g
gua destilada 85mL
58
Colocar todos os reagentes em um frasco esterilizado de 200mL, fechar e aquecer a 65C sob
agitao frequente at completa dissoluo. Deixar o frasco imerso por uma hora a essa temperatura.
Fundir 800mL de Rugai, esfriar a aproximadamente 65C e acrescentar 14mL de substrato.
Adicionar, em tubos de 12mmx120mm, quantidade de vascar (soluo 3) suficiente para formar
um anel de 1mm de espessura. Distribuir 1,5mL do meio Lisina (soluo 2) e esterilizar a 121C por 15
minutos. Deixar os tubos na posio vertical para formao do menisco vedatrio do vascar e adicionar
3mL do meio de Rugai (soluo 1) com o substrato (soluo 5). Colocar o tampo de algodo no reativo
do indol (soluo 4). Deixar inclinado de tal maneira que a base seja de aproximadamente um tero da
altura do pice.
Meio Bsico para Fermentao de Carboidratos

Peptona 10g
Extrato de carne 3g
Cloreto de sdio 5g
Ajustar pH a 7.2. Distribuir em volumes de 3mL a 5mL e esterilizar a 121C por 15 minutos. Os
carboidratos glicose, lactose, sacarose e manitol so incorporados ao meio, na concentrao final de 1,0%,
os demais carboidratos so geralmente utilizados a 0,5%.
A glicose, manitol, dulcitol, salicina, adonitol e inositol podem ser includos ao meio bsico
e esterilizados a 121C por 15 minutos, pois resistem a esse processo. No entanto, lactose, sacarose,
celobiose, arabinose, ramnose e xilose devem ser esterilizados parte, principalmente sob a forma
de solues a 10% ou a 20%, recorrendo-se, para tanto, aos processos fsicos, como a filtrao ou o
aquecimento a 121C por 10 minutos, seguido de resfriamento brusco. A presena de cido no meio,
em decorrncia do metabolismo da bactria, revelada pela viragem do indicador de Andrade para uma
colorao avermelhada.
Caldo Ureia
Extrato de levedura 0,1g
Fosfato de sdio dibsico 9,5g
Fosfato de potssio monobsico 9,1g
Ureia bacteriolgica 20g
Vermelho de fenol 0,01g
Suspender os componentes em gua destilada e homogeneizar at a total dissoluo. Esterilizar
por filtrao. Distribuir alquotas de 3mL em tubos de ensaio de 13X100mm.
pH final 6,8 0,2 a 25C.
59
Meio para Manuteno e Envio de Cepas

gar nutriente fosfatado**
*Extrato de carne 3g
*Peptona 10g
*Cloreto de Sdio (NaCl) 3g
Fosfato dibsico de sdio (12 H2O) 2g
*gar-gar 15 g
Ajustar o pH 7.2-7.4. Distribuir em tubos de hemlise, em volumes de 3mL a 4mL/tubo e
esterilizar a 121oC por 15 minutos. Deixar solidificar em posio discretamente inclinada (bisel curto).
A semeadura do meio deve ser realizada por duas a trs picadas, at a profundidade, e por estrias, na
superfcie. Substituir o tampo de algodo dos tubos por rolhas de borracha ou por silicone previamente
esterilizadas. Empregar as condies normais de tempo e de temperatura de incubao. Para manuteno
por longo perodo, as cepas repicadas devem ser mantidas ao abrigo da luz.
* A formulao citada poder ser substituda por meio comercializado (gar nutriente), desde
que mantidas as concentraes anteriormente mencionadas, efetuando-se adio somente da(s) droga(s)
no existente(s) na formulao bsica.
** Essa formulao poder ser utilizada para manuteno e envio de cepas das famlias
Vibrionaceae e Aeromonadaceae. Para o preparo do meio, devem ser adicionados 10g de cloreto de sdio
(NaCl), em substituio ao peso indicado na formulao acima.
Solues e Reagentes
Soluo de iodo-iodeto de potssio
Iodeto de potssio 5g
Iodo ressublimado 6g
gua destilada estril 20mL
Dissolver o iodeto de potssio em 5mL de gua destilada estril. Adicionar o iodo e dissolver por agitao.
Diluir para um volume final de 20mL.
Soluo de verde brilhante a 0,1%

Corante verde brilhante 0,1g
gua destilada estril 100mL
Dissolver o corante em gua esterilizada
Soluo salina a 0,85%

Cloreto de sdio 8,5g
Dissolver o cloreto de sdio em gua destilada. Autoclavar a 121C por 15 minutos. Resfriar temperatura ambiente.
60
ISBN 978-85-334-1792-2
Disque Sade
0800.61.1997
Biblioteca Virtual em Sade do Ministrio da Sade
www.saude.gov.br/bvs
Secretaria de Vigilncia em Sade do Ministrio da Sade
www.saude.gov.br/svs
Secretaria de Ministrio da
Vigilncia em Sade Sade

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dever ser a 43C.

Quadro 5 - Confirmao de Salmonella spp. em alimentos ISO 6579:2007

Quadro 6 - Avaliao de Salmonella spp. em alimentos

4. Caldo Gram negativo Caldo GN

Quadro 7 - Caractersticas dos meios de enriquecimento seletivos

CHROMagar Salmonella um meio seletivo e diferencial para o isolamento e a identificao

gar Verde gar Sulfito de

Proteose peptona Proteose peptona Proteose peptona

Indicadores Vermelho neutro Fucsina cida bismuto

Identificao Bioqumica Presuntiva (Meios de Triagem)

1. gar ferro-acar triplo (gar TSI)

gar ferro - dois acares (Kligler Iron gar KIA)

gar Lisina-Ferro LIA

Meio de Costa e Vernin CV

Meio IAL (PESSOA; SILVA, 1972)

Meios MIO Motilidade-Indol-Ornitina e Meio MILi Motilidade-Indol-Lisina

Quadro 10 - Reaes nos meios de triagem TSI e KIA*

Quadro 11 - Reaes no gar Lisina Ferro LIA

Quadro 12 - Reaes observadas no meio de Costa e Vernin CV

Quadro 13 - Interpretao do meio EPM

Caracterizao bioqumica complementar

Essas caractersticas so: fermentao de carboidratos, reao de vermelho de metila VM,

3. Pesquisa da produo de indol

4. Prova do Vermelho de Metila VM

Mecanismo bioqumico dos testes de VM e VP

Acetilmetilcarbinol Fermentao cida mista

Complexo vermelho (VP +)

8. Produo de sulfeto de hidrognio H2S

Na converso de arginina para citrulina intervm uma dehidrolase, ao invs de uma

10. Fenilalanina desaminase

Fenilalanina desaminao __ cido fenil pirvico ____________ precipitado verde (piruvato)

11. Fermentao de carboidratos

Fenilalanina desaminao cido fenil pirvico __________ precipitado verde (piruvato)