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Apostila Pratica Farm-Odonto PDF
Apostila Pratica Farm-Odonto PDF
INSTITUTO BIOMDICO
DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA E PARASITOLOGIA
DISCIPLINA DE BACTERIOLOGIA
APOSTILA
DE
AULAS PRTICAS
- DISCIPLINA -
BACTERIOLOGIA
ASSUNTO 4: Diluio 14
Contagem de UFC viveis
Obteno de Cultura pura
ANEXO I 45
Tcnicas de Colorao 45
Colorao de Gram 45
Colorao de Zihel-Neelsen (BAAR) 48
Tcnica Para Evidenciao de Espiroquetas 50
Mtodo de Albert-Laybourn 53
APRESENTAO
INTRODUO:
flambar a boca dos frascos e tubos antes e depois das inoculaes (4).
BACTRIAS NO AMBIENTE
Fundamentao Terica
A presena de bactrias uma constante nos mais variados ambientes. Freqentemente
tais bactrias no esto associadas a nenhum prejuzo. A microbiota intestinal
desempenha importante papel na defesa do organismo contra certas infeces; existem
1
estudos que sugerem que a microbiota normal estimula o desenvolvimento das defesas
imunolgicas. Ao mesmo tempo que desenvolve atividades benficas a microbiota pode
ser responsvel por uma srie de doenas oportunistas que podem ser relacionadas, por
exemplo, ao uso constante de drogas imunossupressoras, antibiticos e internaes em
UTI.
Muitas infeces causadas por bactrias so adquiridas por contato direto ou veiculadas
por alimentos. Ao contrrio do que se pensava antigamente, a disseminao de bactrias
patogncias pelo ar e poeira no ocorre com grande freqncia, pois de um modo geral,
no sobrevivem por longos perodos no ambiente externo. Entretanto, estas vias de
transmisso podem ser de grande importncia em determinadas situaes. No caso de
bactrias esporuladas a transmisso area mais importante. No ambiente hospitalar
deve ser feito o controle microbiano frequentemente para evitar contaminaes. Os
alimentos so uma importante via de transmisso de doenas bacterianas como a
shigelose, salmonellose, clera e vrias outras. O farmacutico deve estar atento
sempre.
OBJETIVOS:
MATERIAL:
- Vidrarias.
- Outros materiais de uso em um laboratrio de Microbiologia.
- gua peptonada.
- Placas de Petri com Agar simples.
- Pipetas e tubos de ensaio estreis.
- Papel, barbante, algodo cardado, gaze.
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d. Abrir as placas de Agar simples (1 por grupo), fora da rea de segurana, deixando
cada uma por 5, 10, 15 e 20, fechando quando atingido o tempo respectivo. Incubar a
37o C por 48 horas e analisar o crescimento obtido.
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ASSUNTO 2:
- Meios de Cultura
- Tcnicas de Semeadura
INTRODUO:
MEIOS DE CULTURA
Para uma melhor compreenso das diversas finalidades e usos dos meios de cultura,
apresentamos a seguir uma breve classificao dos mesmos:
A) Quanto composio:
A.1) Naturais so aqueles de origem vegetal (um pedao de batata, po, frutas)
ou animal (gema de ovo).
A.2) Artificiais so aqueles constitudos de substncias qumicas podendo ser
definidos ou indefinidos (complexos).
Definidos: sabido toda a sua composio.
Indefinidos ou Complexos: desconhecido por si. Sabe-se apenas
aproximadamente. Os meios utilizados na rotina so complexos.
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Seletivo contm substncias seletivas que inibem o crescimento de certas
bactrias e permitem o crescimento de outras. So meios slidos e tm como
objetivo isolar culturas puras.
Indicadores meios que permitem a diferenciao visual do crescimento
bacteriano facilitando a sua identificao. Freqentemente os meios seletivos so
tambm indicadorese todos os meios utilizados na confirmao bioqumica dos
isolamentos so indicadores. A indicao mais freqente a alterao de cor do
meio por mudana no pH do mesmo, podendo ainda ser a produo de gs,
precipitao de componentes do meio por atividade proteoltica e lipoltica, etc...
Estoque so meios normalmente semi-slidos com a finalidade de preservar
uma cultura bacteriana pura para posteriores utilizaes no laboratrio.
A. Meio Inclinado
Em estria sinuosa: semear com ala de platina, em ziguezague, partindo da base para a
extremidade da superfcie inclinada do meio
Este tipo de semeadura permite a obteno de melhor massa de microorganismos.
Em estria reta: semear com agulha de platina, em estria reta, partindo da base para a
extremidade da superfcie inclinada do meio, ou em profundidade e superfcie.
Este tipo de semeadura utilizada em provas bioqumicas para identificao bacteriana.
C. Em Placa de Petri:
C.1. Em superfcie:
Estrias mltiplas ou esgotamento: fazer o inoculo em um ponto da superfcie
do meio, flambar a ala, deixar esfriar e da semear em ziguezague em toda a superfcie
do meio.
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Este tipo de semeadura empregado para o isolamento bacteriano, obteno de
u.f.c. isoladas. Denomina-se tcnica se esgotamento.
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Procedimento para inocular em caldo simples:
Difuso: com ala de platina ou pipeta, introduzir o inoculo ( 0,1 mL) na massa
do meio. Este tipo de semeadura empregada para obteno do crescimento
bacteriano. um repique normal.
OBJETIVOS:
MATERIAL:
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ASSUNTO 3:
- Esterilizao e Desinfeco
- Ao dos Agentes Fsicos e Qumicos sobre as Bactrias
INTRODUO:
Fundamentao Terica
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Calor mido: na presena de gua (ou vapor dgua)
- < 100o C: pasteurizao (mtodo desinfetante). Muito utilizado para alimentos e
bebidas. A pasteurizao rpida do leite emprega uma temperatura em torno de 72o C
por 15 a 20 segundos, seguida de resfriamento rpido. A pasteurizao consegue
eliminar cerca de 99,5% de microrganismos, aqueles esporulados so termoresistentes,
conseguindo resistir a esse tratamento.
Alimentos pasteurizados leite, sucos industriais.
- = 100o C: a fervura (mtodo desinfetante). O alimento submetido a uma
temperatura igual a 100o C por at 15 minutos. Eficiente contra as formas vegetativas
bacterianas mas no destri completamente as formas esporuladas.
- > 100o C: a autoclavao (mtodo esterilizante). Os materiais e alimentos so
submetidos a uma temperatura em torno de 121o C por 15-30 minutos, um tempo e
temperatura bem inferiores queles empregados em calor seco. Isso possvel pelo
emprego de alta presso interna (1 ATM) na autoclave. A autoclave similar a uma
panela de presso.
Filtrao
Clarificantes: so os filtros domsticos, retm as impurezas grosseiras, so
desinfetantes.
Esterilizantes: possuem poros iguais ou menores a 1mm podendo reter inclusive
alguns vrus.
Outros:
Presso Osmtica (Salga); Dessecao (prod. Alimentcios em p, liofilizao);
uso de baixas temperaturas (refrigerao, congelamento)
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OBS: Dos cresis o mais importante a creolina, utilizada para pisos e sanitrios. O
hexaclorofeno muito usado na antissepsia cirrgica.
cido hipocloroso instvel, espontaneamente forma mais HCl e oxignio nascente, isso
que matar os microorganismos.
lcalis:
Hidrxido de Sdio (NaOH)= presente nos sabes conferindo a estes a sua relativa ao
anti-sptica.
Outros: KOH, Ca(OH)2
Corantes Bsicos: mais eficientes contra Gram positivos. Ex.: Cristal Violeta,
Azul de Metileno.
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Oxidantes e Redutores
- Oxidantes: oxidam componentes celulares levando morte das clulas. Ex.:
Oznio (O3), gua oxigenada (H2O2), permanganato de potssio, perxido de zinco.
Usados como anti-spticos.
- Redutores: reduzem compostos celulares levando morte das clulas.
Aldedos e derivados:
Formaldedo/ formalina: muito irritante / So usados para desinfectar paredes e
pisos.
Glutaraldedo: mais ativo e menos txico que o formaldedo; esporocida aps 6
horas de contato)
xido de Etileno (gs): um agente alquilante inativando protenas e cido
nuclico. Usado em um recipiente fechado que recebe todo material a ser utilizado
(contm algumas ampolas de xido de etileno lquido), temperatura de 52o C, este
lquido torna-se gasoso, assim, seus vapores so esterilizantes. Usado para esterilizao
de materiais de borracha ou plstico.
A clula microbiana est em equilbrio, oxidantes e redutores rompem esse equilbrio,
matando a clula.
OBJETIVOS:
MATERIAL:
EXECUO:
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c) Um terceiro aluno faz a antissepsia de seu polegar com gaze embebida no 1
antissptico por 1 minuto, seca o dedo com gaze estril e faz depois a impresso no
terceiro quadrante;
d) Um quarto aluno faz a antissepsia de seu polegar com gaze embebida no 2
antissptico por 1 minuto, seca o dedo com gaze estril e faz depois a impresso no
quarto quadrante.
- Incubar a placa a 37 C por 24 horas e analisar o crescimento.
1. DEDO 2. DEDO
+ SABO
3. DEDO + 4. DEDO +
ANTIS. 1 ANTIS. 2
t5
t10
t20
E B
A B
C D
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Importncia da Aula de Controle Microbiano
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ASSUNTO 4:
- Diluio
- Contagem de u.f.c.viveis
- Obteno de Cultura Pura
OBJETIVOS:
1. Metodologia de Diluies
2. Plaqueamento para contagem de u.f.c. viveis
3. Contagem de u.f.c. viveis
4. Obteno de cultura pura
MATERIAL:
a. Diluio
A partir da cultura bacteriana, inocular 1mL em 9mL de salina, homogeneizar, retirar
1mL e transferir para outro tubo com 9mL de salina... Obtendo assim, as diluies 1/10,
1/100, 1/1000...
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ASSUNTO 5:
- Colorao Simples
- Morfologia
INTRODUO:
Torna-se necessrio fixar e corar as bactrias para o estudo exato da sua morfologia e
citologia. Com efeito, a pequenez dos detalhes estruturais, a falta de contraste natural
destes detalhes e o movimento das bactrias aliado sua grande refringncia, tornam
impossvel o estudo morfolgico exato destes organismos nos simples exames a fresco.
A fixao a coagulao do protoplasma bacteriano e a sua colagem s lminas,
com o mnimo de deformao, quer dizer, imobilizao dos microrganismos e das
estruturas celulares. So agentes fixadores o calor, atuando em escala moderada, os
vapores de cido smico, o formol, o ter, os sais de mercrio, etc.
Os corantes so substncias dotadas de cor prpria e que uma vez dissolvidas
comunicam essa cor s estruturas com as quais so postas em contacto.
Os corantes usados em Bacteriologia so produtos artificiais ou sintticos.
Os corantes sintticos, so compostos orgnicos de estrutura complexa em que
um ou mais anis benznicos se encontram ligados a um grupo auxcromo e outro
cromforo.
a. A funo do grupo cromforo conferir ao composto a cor.
b. A funo do grupo auxcromo permitir a dissociao inica do corante,
tornando-o apto a formar sais e a reagir quimicamente com os tecidos, clulas e
estruturas celulares.
Os corantes da Bacteriologia so sais e podem ser classificados em corantes
cidos e bsicos.
Os corantes bsicos so corantes de eleio da Bacteriologia uma vez que as
bactrias, possuem carga eltrica negativa. Deste modo, a afinidade eletroqumica torna
possvel a fixao do radical corado sobre as estruturas celulares das bactrias, o que
no sucede com os corantes cidos cujo radical corado eletronegativo.
Os mordentes so substncias que reforam a ao dos corantes, so
principalmente usados como mordentes em Bacteriologia, o cido tnico, o cido
crmico, o cido fnico, o iodo (Soluto de Lugol), o calor, os alcalis; estas substncias
aumentam a energia de fixao das cores sobre as estruturas celulares.
OBJETIVOS:
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4.Colorao simples - a colorao de microrganismo com uma nica soluo de
corante3. Ex: azul de metileno ou fucsina.
5. Observar formas e arranjos bacterianos atravs de preparaes fixadas e coradas.
MATERIAL:
b) Esfregao
- Tirar do frasco uma lmina esterilizada e enxugar bem
- Flambar, rapidamente, nos dois lados da lmina
- Flambar a ala de platina ao rubro e deix-la esfriar prximo chama
- Tomar o tubo de cultura (em caldo) com a mo esquerda e com os dedos mdio e
anular da mo direita remover o tampo de algodo da boca do tubo
-Flambar a boca do tubo de cultura
- A ala de platina, segura entre o polegar e o indicador da mo direita, ser introduzida
no interior do tubo at tocar no meio de cultura
- Flambar novamente a boca do tubo
- Fechar o tubo com o tampo de algodo e coloc-lo na estante
- Tomar a lmina com a mo esquerda e depositar no centro da mesma uma gotcula
(uma alada``) da suspenso bacteriana
- Com movimentos de rotao da ala de platina, o material deve ser bem espalhado a
fim de se obter um esfregao de forma oval, bem fino e uniforme
- Deixar secar ao ar e marcar com lpis dermatogrfico do lado oposto onde se situa a
preparao
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Em se tratando de material de cultura em meio slido, deve ser observado o seguinte:
- Depositar uma pequena gota de gua destilada ou soluo fisiolgica estril no centro
da lmina
- Tocar a colnia com uma agulha de platina esterilizada e suspender a mesma na
gotcula d`gua, de forma a obter um esfregao fino e uniforme
c) Fixao do material
A fixao evita que o material se desprenda no decurso das manipulaes posteriores.
Pode ser feita por:
# Agentes Fsicos (calor) consiste em passar a lmina, com a face onde se acha o
esfregao para cima, na chama do bico de Bunsen 2 a 3 vezes rapidamente
# Agentes Qumicos utiliza-se uma substncia qumica como lcool metlico, lcool
etlico, lcool-acetona, ter-acetona, formol etc., deixando-se em contato com os
esfregaos dessecados durante alguns minutos (2 a 10 minutos).
O fixador pode ser posto sobre o esfregao convenientemente protegido contra a
evaporao rpida, ou ento o preparado ser mergulhado no fixador contido em
recipientes apropriados.
Procedimento para preparao do esfregao e fixao.2
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3. Colorao Simples , Mtodo fixado e corado
a. Preparo do esfregao
b. Fixao
c. Colorao
Cobrir o esfregao com a soluo de azul de metileno ou fucsina diluda durante 5
minutos . Lavar, secar com papel de filtro e observar com objetiva de imerso.
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ASSUNTO 6:
- Colorao de Gram
INTRODUO:
Fundamentao Terica
A colorao pelo mtodo de Gram chamada de colorao diferencial porque
so utilizados dois corantes e as bactrias ficam coradas em tonalidades diferentes. Isso
possvel devido composio da parede celular das mesmas.
Essas bactrias podem ser aerbias, anaerbias facultativas e anaerbias.
Possuem a forma de cocos, bacilos ou vbrios (bacilos encurvados). Muitas so
patognicas e outras, membros da microbiota normal do corpo humano.
A maioria dos cocos Gram-positiva com exceo dos gneros Neisseria e
Veillonella que so os nicos Gram-negativos; entre os bacilos Gram-positivos incluem-
se aqueles pertencentes aos gneros Corynebacterium, Listeria, Bacillus, Lactobacillus
e Clostridium; os demais bacilos so Gram-negativos (a maioria); os vbrios so Gram-
negativos.
A investigao das caractersticas morfolgicas e de colorao (morfo-tintoriais)
das bactrias etapa inicial de grande importncia no isolamento e identificao de
bactrias de material clnico bem como de alimentos. No entanto, a identificao
completa de uma bactria sempre necessitar de dados fisiolgicos ou genticos da
mesma.
O mecanismo da colorao de Gram se refere composio da parede celular,
sendo que as G+ possuem uma espessa camada de peptideoglicano e cido teicico, e as
G-, uma fina camada de peptideoglicano, sobre a qual se encontra uma camada
composta por lipoprotenas, fosfolipdeos, protenas e lipopolissacardeos. Durante o
processo de colorao, o tratamento com lcool (ou cool-acetona) extrai os lipdeos,
da resultando uma porosidade ou permeabilidade aumentada da parede celular das G-.
Assim, o complexo cristal violeta-iodo (CV-I) pode ser retirado e as G- so descoradas.
A parede celular das bactrias G+, em virtude de sua composio diferente, torna-se
desidratada durante o tratamento com lcool, a porosidade diminui, a permeabilidade
reduzida e o complexo CV-I no pode ser extrado.
Outra explicao baseia-se tambm em diferenas de permeabilidade entre os
dois grupos de bactrias. Nas bactrias G+, o complexo CV-I retido na parede aps o
tratamento pelo lcool, o que causa, provavelmente, uma diminuio do dimetro dos
poros da camada de glicopeptdeo ou peptideoglicano da parede celular. Os poros da
parede das bactrias G- permanecem suficientemente grandes, mesmo depois do
tratamento pelo lcool, possibilitando a extrao do complexo CV-I.
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Segundo Trabulsi, na etapa diferencial com lcool, as bactrias G- devido
pequena espessura da camada basal e s descontinuidades existentes nesta camada, em
pontos de aderncia entre a membrana externa e a membrana celular, tm o complexo
corado extrado pelo lcool que deixa as clulas descoradas.
OBJETIVOS:
MATERIAL:
- Lminas.
- Culturas em meios lquido e slido.
- Ala e agulha de platina.
- Cristal violeta.
- Lugol.
- lcool etlico.
- Fucsina de Ziehl.
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Procedimento para colorao de Gram5.
Notas:
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5. Se houver um questionamento acerca da Gram-positividade ou Gram-negatividade da
cultura, uma colorao de Gram paralela aconselhvel. Para isto, deve-se usar culturas
bacterianas conhecidas como G+ (Staphylococcus aureus) e G- (Escherichia coli) como
controle.
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ASSUNTO 7:
- Cocos Gram-positivos
INTRODUO:
I. Staphylococcus
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Provas bioqumicas
- Prova da Catalase:
A prova da catalase se destina a verificao da presena da enzima catalase. A
prova pode ser efetuada com o crescimento bacteriano obtido em qualquer meio de
cultura, exceto meios com sangue pois este possui catalase, levando a resultados falso-
positivos.
A catalase uma enzima que decompe o perxido de hidrognio com formao
de gua e oxignio molecular. A verificao da produo dessa enzima por determinada
bactria pode ser feita adicionando-se perxido de hidrognio (H2O2 a 30%) a cultura
em meio slido ou lquido, e verificando-se desprendimento de bolhas gasosas (O2). Na
ausncia de catalase, no h decomposio do perxido.
Uma leitura da prova de catalase pode ser feita de maneira cuidadosa a partir de
um crescimento em agar-sangue da seguinte maneira: adiciona-se primeiramente uma
gota de perxido em uma rea do meio desprovida de crescimento e em seguida sobre
uma colnia a ser testada. Considera-se positivo apenas se o borbulhamento foi mais
rpido e intenso sobre a colnia.
- Fermentao do Manitol:
O manitol um acar que alguns microorganismos so capazes de utilizar como
fonte de energia atravs da fermentao. A prova se baseia na alterao do pH do meio,
graas a produo de cidos durante o processo de fermentao. Essa mudana de pH
pode ser observada pela viragem de cor do meio devido a presena do indicador de pH
Vermelho de Fenol. A prova pode ser realizada em meios de cultura lquidos ou slidos.
Aps a semeadura, o meio deve ser incubado a 37C por 18 24 horas.
Interpretao:
positivo: amarelo
negativo: no h alterao da cor
- Prova da coagulase:
A coagulase estafiloccica se apresenta em duas formas: coagulase ligada e
coagulase livre.
A coagulase ligada, presente na parede da clula bacteriana, converte o
fibrinognio em fibrina diretamente, sem o envolvimento dos fatores de coagulao, e
pode ser detectado em teste direto em lmina, utilizando-se da suspenso de
Staphylococcus acrescida de 2 gotas de plasma citratado, fazendo movimentos
circulares e observando-se a formao de cogulo no tempo de 1-2 minutos. Pode-se
tornar mais sensvel o teste em tubo, por este detectar tanto a coagulase livre quanto a
ligada, sendo a prova de escolha.
A coagulase livre produzida e liberada pelo microorganismo, reagindo com o
fator de coagulao do plasma, CRF, formando uma substncia semelhante, mas no
idntica, trombina, que converte fibrinognio em fibrina. Para o teste, utiliza-se
plasma citratado humano ou de coelho, estril, diludo em soluo salina na proporo
de 1:5. a reao ocorre volume a volume a 37C.
Estudos recentes demonstraram que a produo da enzima coagulase se intensifica
quando o microorganismo crescido e meio contendo alta concentrao de NaCl. Desta
forma, aconselha-se a utilizao de colnias para a prova, crescidas em Agar Manita
(Agar Manitol Salgado) contendo NaCl e Vermelho de Fenol. Este procedimento
aumentaria a sensibilidade do teste.
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A prova consiste da semeadura de uma alada do microorganismo em estudo em
tubo contendo o plasma diludo e incubao a 37C. A menor coagulao considerada
positiva. Devem ser feitas leituras peridicas a cada 1-2 horas, por at 24 horas, pois
algumas espcies produzem fibrinognio, que dissolve o cogulo formado.
Aconselha-se tambm utilizar sempre um teste positivo com uma amostra de S.
aureus.
- Prova da DNAse:
Alguns microorganismos so capazes de utilizar o DNA presente no meio como
fonte de energia, atravs da produo da enzima DNAse.
No meio com DNA deve ser feita uma estria simples (reta) ou um spot (ponto de
semadura) central com o microorganismo em estudo. Incubar a 37C por 24 horas e
adicionar ao meio HCl 1N e aguardar a turvao do meio.
Lembrando que o DNA material protico e que o HCl, como cido, tem poder
desnaturante sobre as protenas, a turvao do meio apenas a precipitao do DNA
desnaturado. Se a bactria produzir DNAse, todo o DNA ao seu redor ter sido
degradado, ento ao adicionar o HCL no haver turvao nesta rea. Portanto, se
houver um halo claro ao redor do crescimento bacteriano, o resultado positivo.
- Sensibilidade a Novobiocina:
Semear o microorganismo suspeito em placa de Agar simples ou Mueller Hinton
com swab, para obteno de crescimento confluente, e adicionar o disco de novobiocina
(5mg/ml). Incubar a 37C por 24 horas. As bactrias resistentes no apresentaro halo de
inibio, enquanto as sensveis sim.
II. Streptococcus
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gnero separado e possuem caractersticas peculiares. Apresentam-se em forma de
cadeia ou em pares, e so Gram positivos.
Para o isolamento pode-se recorrer previamente ao uso de meios seletivos ou
de enriquecimento. O meio de seletivo especfico para estreptococos mais usado o
caldo Hitchens-Pike, seletivo por apresentar azida sdica e cristal violeta. Um meio
alternativo para enriquecimento o caldo tioglicolato de sdio, adequado para o
crescimento de bactrias, inclusive aquelas microaerfilas e anaerbias. O meio clssico
de isolamento de estreptococos o agar sangue aonde pode-se observar o perfil
hemoltico dos mesmos.
Os Streptococcus foram descritos em 1874 por Billroth, causando exsudato
purulento em leses de erisiplela e em feridas infectadas. Em seguida, foram isolados do
sangue de pacientes em estado febril, e da garganta de crianas com escarlatina.
Em 1903, Schottmuller props que os estreptococos fossem classificados
conforme a capacidade de lisar hemcias in vitro. Em 1919, Brown chamou de a, b e
g as lises observadas nas hemcias em placas de Agar sangue.
Os estreptococos a hemolticos apresentam zonas de hemlise parciais, com
hemcias integras na parte mais interna (junto colnia) e hemlise maior na parte mais
externa. Frequentemente aparece uma colorao esverdeada na rea de hemlise
(devido a alterao da hemoglobina pelo sistema oxi-redutor da clula bacteriana), que
originou a qualificao estreptococos do grupo esverdecente ou Streptococcus
viridans. O Streptococcus pneumoniae apresentam hemlise a e colnia puntiforme
com aprofundamento no pice da colnia (parecendo um pequeno vulco)
Os estreptococos b hemolticos produzem uma zona de hemlise total,, no se
observando hemcias ntegras (microscpio ptico com objetiva de 10x). O
Streptococcus pyogenes apresenta dois tipos de hemolisinas: O e S a hemolisina O
destruda pela ao do oxignio atmosfrico, e, portanto, s demonstrada em colnias
crescidas em profundidade no Agar Sangue. A hemolisina S estvel ao oxignio do ar
e produz hemlise mesmo nas colnias crescidas na superfcie do meio de cultura.
Como cerca de 15% dos Streptococcus apresentam hemolisina O, se torna necessria a
semeadura do microorganismo pela tcnica do pour-plate.
Os estreptococos g so anemolticos, ou seja, no produzem hemlise
nomeio. Muitas das espcies saprfitas so deste grupo.
As colnias de estreptococos isoladas em agar sangue so puntiformes (< 1mm
de dimetro), transparentes luz transmitida e peroladas luz refletida. Os
estreptococos so negativos na prova de catalase o que os diferencia dos estafilococos.
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Na identificao de estreptococos alm do perfil hemoltico, a determinao
do Grupo Lancefield (carboidrato antignico de parede) importante. No entanto, em
funo do custo desta investigao outras provas auxiliares so realizadas para a
identificao das principais espcies. O esquema abaixo apresenta estas provas:
Provas bioqumicas
- Prova da optoquina:
Colocar um disco de optoquina na superfcie do Agar Sangue (pode-se incluir no
antibiograma). Havendo impedimento do crescimento das colnias ao redor do disco de
optoquina (2 cm de dimetro), trata-se de teste positivo.
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- Bile solubilidade:
A prova realizada conforme esquema que se segue:
a 1,0 ml de cultura em calo, adicionar uma gota de vermelho de fenol;
acertar o pH em aproximadamente 7,5 com NaOH 0,1N (cor rsea);
adicionar aproximadamente 4 gotas de desoxicolato de sdio ou blis;
incubar juntamente com o tubo sem blis a 37C por 3 horas.
* clareamento: positivo
* inalterado: negativo
- Bacitracina:
Utilizar discos impregnados com bacitracina (0,04 U) colocados na superfcie do
meio de cultura semeado com o microorganismo em estudo (pode-se incluir no
antibiograma) e incubar a 37C por 24 horas em microaerofilia.
- Crescimento a 56C:
Para evitar dvidas entre estreptococos e enterococos (Streptococcus faecalis),
submeter a cultura a um aquecimento a 56C por 30 minutos. Somente os enterococos
resistem a este tratamento.
OBJETIVOS:
MATERIAL:
- cultura de Staphylococcus aureus e Staphylococcus epidermidis
1a aula: swabs estreis, tubo com soluo salina, Agar Chapman, Meio de
Tioglicolato (ou de Hitchens-Pike).
2a aula: Agar sangue, Caldo simples ou BHI, Agar inclinado, Agar DNAse,
dessecador com vela.
3a aula: reativo para catalase (H2O2), reativo para DNAse (HCl 1N), reativo
para coagulase (plasma sangneo), tubo controle positivo, lminas e
conjunto de colorao de Gram.
1 DIA:
28
b. inocular swab de nasofaringe em Agar Chapman pela tcnica de esgotamento.
c. Incubar a 37C por 24 horas.
2 DIA:
3 DIA:
Importncia da Aula:
de suma importncia para o profissional farmacutico o conhecimento dos
cocos Gram positivos, pois eles so responsveis por diversas infeces humanas.
Staphylococcus aureus (o + importante representante) causa abcessos,
endocardites e osteomielites, intoxicao alimentar e sndrome do choque txico. S.
epidermidis pode causar endocardites e S. saprophyticus causa infeces do trato
urinrio.
Os estreptococos produzem uma grande variedade de infeces como faringite e
infeces celulares septicemia (Streptococcus agalactiae causa infeco urinria em
gestantes). Tb podem causar desordens imunolgicas como febre reumtica e
glomerulonefrite aguda (causada por Streptococcus pyogenes).
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ASSUNTO 8:
- Colimetria.
INTRODUO
A gua elemento fundamental para a sobrevivncia humana. Sua grande
utilizao no abastecimento pblico, na recreao, na industria, no uso domestico atesta
essa importncia vital.
As guas para abastecimento podem ser poludas por servir de reservatrio para
espcies microbianas patognicas e permitir a sobrevivncia das mesmas, e
reconhecida desde os primrdios da civilizao. Vrias doenas podem ser veiculadas
pela gua, tais como clera, febre tifide, disenterias, leptospirose, tuberculose, hepatite,
poliomielite, doenas parasitrias e fngicas. Essas doenas so resultantes da ingesto
de gua e alimentos contaminados ou do emprego de gua poluda pela irrigao, pesca,
lazer, piscicultura, cultura de marisco.
Em cidades onde existe um sistema eficiente de esgotamento sanitrio, o esgoto
domstico um dos principais responsveis pela poluio das guas, estimulando o
crescimento de microrganismo. A assimilao destes contaminantes orgnicos
biodegradveis realizada com o concurso de bactrias presentes, por meio de um
processo, que consome o oxignio dissolvido na gua dos rios ou reservatrios. Quando
a carga de matria orgnica biodegradvel presente na gua, e o OD (Oxignio
Dissolvido), que mede a concentrao de oxignio disperso na gua (Soares, 1999).
Alm dos esgotos domsticos, os efluentes industriais e o escoamento superficial
urbano contribuem grandemente na poluio dos corpos dgua. Os efluentes industriais
contem grandes nmeros ou metais pesados. O escoamento superficial urbano contm
todos os poluentes que se depositam na superfcie do solo na ausncia de chuvas, como
lixo e matria orgnica. Estes acumulados no solo, valas e bueiros so arrastos quando
da estao chuvosa para os cursos dgua superficiais, constituindo-se numa outra fonte
de poluio (Soares, 1999).
Os microrganismos dotados de potencial patognico chegam s extenses
hdricas procedentes das excrees intestinais do homem e de outros animais. Embora j
existam mtodos desenvolvidos para a deteco de vrios organismos patognicos de
veiculao hdrica, os mesmos no so aplicveis na rotina devido ao alto custo e
necessidade de pessoal especializado (CETESB, 1993).
Uma alternativa para a avaliao da qualidade sanitria da gua a pesquisa de
organismo no patognicos constituintes da microbiota normal das fezes de animais de
sangue quente, que quando encontrados indicam a ocorrncia de contaminao fecal,
evidenciando o risco da presena de patgenos. Fezes humanas contm de 20-30 % de
resduos alimentares no digeridos, sendo o restante constitudo de gua e bactrias. NO
indivduo saudvel essas bactrias constituem os habitantes normais do intestinos onde
a Escherichia coli a representante caracterstica. O nmero desses microrganismos
pode atingir XXXXclulas/g de fezes. Assim a presena da Escherichia coli em
alimentos e gua indicativo de contaminao fecal e possibilidade de presena de
patgenos entricos.
Microrganismos indicadores de poluio de gua so utilizados para monitorar,
classificar e restringir o uso das guas. Um indicador ideal deveria preencher os
seguintes critrios: 1. Ser aplicvel a todo tipo de gua; 2. Estar presente
simultaneamente com os microrganismos patognicos, com um tempo de sobrevivncia
igual quele patgeno entrico mais resistente; 3. No se reproduzir em guas
contaminadas, para no resultar em valores aumentados ( HAGLER E MENDONA-
HAGLER, 1998 ).
30
No se conhece nenhum microrganismo ou grupo de microrganismo que atenda
a todos esses requisitos, mas h vrios que se aproximam das exigncias referidas e que
so muito teis.
As bactrias empregadas como indicadores de poluio fecal em guas so: os
coliformes totais, coliformes fecais, estreptococos fecais e o Clostridium perfringens.
Contagens de Salmonella e de bactrias do gnero Bifidobactrias tm sido propostas. O
Indicador microbiolgico mais empregado o grupo dos coliformes. Este e outros
indicadores de poluio orientam a margem de segurana sanitria de gua potvel, da
gua utilizada para fins recreativos e dos cultivos de organismos marinhos comestveis.
A Organizao Mundial de Sade (OMS) recomenda para guas recreacionais
um mximo de 100 coliformes fecais por 100ml de gua.
COLETA DE AMOSTRAS
Quando a amostra for coletada, deve ser deixado um espao livre na garrafa
(cerca de 2,5 cm) para facilitar a homogeneizao antes da inoculao. As garrafas
devem ser mantidas vedadas at o momento da coleta da amostra e devem ser tomados
todos os cuidados de assepsia no momento da coleta, de forma a evitar contaminaes
secundrias.
*PONTO DE COLETA
1. gua da torneira
a. Abrir a torneira e deixar correr por 5 minutos, para eliminar as impurezas e a gua na
acumulada nas tubulaes.
b. Com algodo embebido em lcool, passar na abertura e internamente e em seguida
flambar.
c. Abrir a torneira novamente por mais 1 a 2 minutos.
d. Abrir o frasco esterilizado e coletar a gua. Introduzir gua no frasco at cerca de
trs quartos do seu volume.
e. Tampar o frasco e transportar imediatamente ao laboratrio.
2. Poos e Cisternas
a. Preparao do frasco amarrar o frasco e uma pedra como contrapeso com um
barbante para facilitar a descida no poo.
b. Descer o frasco dentro do poo sem permitir que o mesmo toque nos lados.
c. Submergir o frasco completamente na gua.
31
d. Uma vez que o frasco estiver cheio, recolher e derramar parte da gua para criar um
espao de ar e colocar a tampa no frasco imediatamente.
a. Coleta da amostra de gua de rios e lagoas nestes casos deve-se mergulhar o frasco
at uma profundidade de 20cm, com abertura voltada em direo contrria a corrente, a
fim de evitar a contaminao da gua com as mos.
b. Coleta da gua do mar a coleta deve ser feita na regio onde as pessoas costumam
banhar-se, que corresponde profundidade aproximadamente de 1,0 m, que a regio
das praias mais utilizada para a recreao de contato primrio, na mar baixa e 24 horas
sem chuvas.
O ideal a anlise iniciar-se at 1 hora aps a coleta. Caso isto seja impossvel, a
amostra deve ser transportada sob refrigerao. A amostra deve ser mantida entre 4 a 10
graus Celsius no prazo mximo de at 30 horas aps a coleta.
Amostras presumivelmente poludas tm de ser inoculadas no mximo aps 6
horas da coleta.
Entre o recebimento da amostra e o inicio da inoculao, a mesma deve ser mantida em
geladeira (cerca de 5 graus Celsius).
32
Tabelas de NMP/100 ml de amostra:
33
3 1 1 75
3 1 2 120
3 2 0 93
3 2 1 150
3 2 2 210
3 3 0 240
3 3 1 460
3 3 2 1100
3 3 3 2400
Teste Presuntivo
Inocular, aps a escolha da tabela, dem tubos contendo caldo lauril sulfato triptose
ou caldo de lacose em concentraes dupla ou simples. Os tubos devem conter tubinhos
de Durham.
Ocriscimento com formao de gs significa teste presuntivo positivo para
coliformes totais. Os tubos que no apresentarem formao de gs com 24 horas de
incubao devem ser incubados at 48 horas.
Os tubos positivos com 24 horas devem ser imdiatamente inoculados nos meios de
confirmao para se evitar que um crescimento muito abundante provoque o
abaixamento do pH, o que pode provocar resultados falsamente negativos.
Teste de Confirmao
Coliformes Totais
A partir dos tubos dom formao de gs, semear por alada (dimetro=3 mm) em
tubos contendo caldo de blis para igual nmero de tubos contendo caldo EC. Incubar os
tubos a 35 0,5 por 48 3 horas.
A formao de qualquer quantidade de gs constitui teste positivo para coliformes
totais.
Coliforems Fecais
Dos tubos positivos do teste presuntivo, transferir com uma ala de platina uma
pequena poro do meio para igual nmero de tubos contendo caldo EC. Incubar os
tubos a 44,5 0,2 C por 24 horas.
A presena de gs no interior dos tubinhos de Durhan considerada reao
positiva, indicando contaminao de origem fecal.
A ausncia de gs mesmo com evidncia de crescimento indica a presena de
coliformes de outra fonte que no seja de intestinos de animais de sangue quente.
34
Teste complemento
A partir dos tubos positivos de caldo blis verde brilhante, semear por estrias em
placa contendo endo agar ou azul de metileno agar (agar EMB). Incubar a 35 0,5C
por 24 2 horas.
De cada placa, escolher uma ou mais colnias tpicas e bem isoladas; transferir
cada colnia para tubos contendo caldo de lactose ou caldo lauril triptose e para um
tubo inclinado de agar nutriente. Incubar a 35 0,5C por 24 horas, prosseguindo a
incubao at 48 3 horas caso no tenha ocorrido formao de gs aps a primeira
incubao.
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B. TCNICA DE FILTRAO EM MEMBRANA
Vantagens:
- Os resultados so obtidos aps 22-24 horas.
- Podem ser analizados volumes maiores e mais representativos das amostras.
- Os resultados em membrana tm maior grau de preciso, em relao tcnica
dos tubos mtiplos, proporcionado tambm maior reprodutibilidade.
- Um maior nmero de amostras pode ser processado com um mnimo de
espao e equipamentos.
Limitaes:
- As amostras com alta densidade de bactrias no coliformes, porm capazes de
se desenvolverer sobre o meio de cultura, pois os coliformes podero ser impedidos de
se desenvolverem ou seno a densidade de coliformes podero ser impedidos de se
desenvolverem ou seno a densidade de coliformes pode ser menor do que a obtida pela
tcnica do NMP.
- guas com alta turbidez devido as alfgas ou substncias em suspenso, pois
estas podem formar uma pelcula na superfcie da membrana e interferir no
desenvolvimento de colnias caracterstica de coliformes.
Tcnica
36
ASSUNTO 9:
- Provas Bioqumicas para a Identificao de Bacilos Gram-negativos
OBJETIVO
1. Plaqueamento Seletivo
Etapa de isolamento bacteriano a partir de espcies clnico, utilizando meios
seletivo-indicadores como o Agar EMB. Neste meio as bactrias Gram positivas so
inibidas pela presena de eosina e azul de metileno. As bactrias Gram negativas
fermentadoras de lactose ( LAC + ) apresentam-se como colnias rosa-avermelhadas
com ou sem centro negro, enquanto as no-fermentadoras ( LAC - ) formam colnias
transparentes.
2. Triagem
Conjunto de provas bioqumicas realizadas simultaneamente em 1 ou 2 meios,
permitindo uma diferenciao inicial dos isolamentos e direcionamento da
contaminao bioqumica. Quando realizada em meio TSI, podemos observar:
- Fermentao de glicose e produo de gs
- Fermentao de lactose e/ou sacarose
- Produo de H2S
Bactrias que utilizam apenas glicose provocam acidificao (de colorao
amarela) apenas na base, permanecendo o pice alcalino (de cor avermelhada).
Bactrias fermentadoras de lactose e/ou sacarose acidificam todo o meio. A formao
de gs evidenciada pelo rompimento ou descolamento do meio. A produo de H2S se
manifesta pelo escurecimento do meio.
37
Triagem Meio TSI7
3. Confirmao Bioqumica
Conjunto de provas necessrias para a identificao bioqumica das colnias
suspeitas. Algumas dessas provas esto descritas abaixo:
Fermentao de Carboidratos7
38
Meio: Clark & Lubs (meio glicosado e tamponado).
Inoculao: idem ao item a. Aps inoculao (48 h), adicionar os reativos:
VP I (Barrit I): alfa-naftol (0,6 mL)
VP II ( Barrit II): KOH 40% (0,2 mL)
Leitura (aps 10 15 minutos):
*observar o aparecimento de anel vermelhos na superfcie do tubo
(resultado positivo)
*sem alterao: resultado negativo
39
meio: Agar semi-slido (SIM).
Inoculao: utilizar agulha bacteriolgica, fazendo uma picada central at da
profundidade do tubo.
Leitura: crescimento fora do local da picada = + (mvel)
crescimento somente ao redor da picada = - (imvel)
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ASSUNTO 10:
- Teste de Sensibilidade a Antimicrobianos (TSA)
Mtodo de Kirby-Bauer
OBJETIVOS:
MATERIAL:
1. Inculo:
Cultura pura, em fase log, padronizado, diluda at obteno de turvao semelhante ao
tubo n 0,5 da escala de McFarlnd (1,0x108)
2. Meio
Mueller-Hinton, recente, em camada de 4 5 mm, pH = 7,2 7,4, com umidade
adequada. Em alguns casos pode ser enriquecido com 5% de sangue, etc.
3. Semeadura
Inocular a cultura a ser testada na superfcie do agar, com o auxlio de um swab, para
um crescimento confluente (1).
4. Antimicrobianos
Com o auxlio de uma pina flambada, aplicar os discos com antimicrobianos sobre o
meio recm-semeado de modo eqidistante (3).
Identificar a placa e incubar a 37C por 18 24 horas em posio invertida.
Ocorrer difuso das substncias e suas concentraes diminuem gradativamente a
medida que se afastam do disco.
A eficincia de uma droga demonstrada pelo aparecimento de um halo de inibio do
crescimento do microorganismo.
5. Leitura
Com o auxlio de uma rgua graduada, medir o dimetro dos halos de inibio,
incluindo o dimetro do disco (4).
42
Figura: Teste de sensibilidade a antimicrobianos2.
6. Interpretao
Interpretar a sensibilidade aos antimicrobianos de acordo com o dimetro do halo de
inibio encontrado em tabelas padronizadas que contm os valores em mm, para as
drogas disponveis comercialmente.
7. Controle
Usar como controles os seguintes microorganismos, de acordo com as drogas utilizadas:
- Staphylococcus aureus ATCC 25923
- Escherichia coli ATCC 25922
- Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853
43
Cefalotina 14 15 17 18
Polimixina 8 09 11 12
Sulfazotrim 10 11 15 16
Notas:
3. Lembrar que um halo de inibio maior que outro no indica propriamente uma
maior atividade do antibacteriano sobre o microorganismo em teste. Outros fatores,
como carga antibitica, difusibilidade, etc., intervm na formao dos halos. Portanto,
deve ser utilizada a tabela na interpretao dos resultados.
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ANEXO I
TCNICAS DE COLORAO
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Ao lavarmos as clulas com a soluo de lcool-acetona, lcool-ter ou ainda lcool
puro, as bactrias G- so descoradas, enquanto que as G+ retm o complexo
iodopararosanilina, devido a sua parede celular funcionar como uma barreira a eluio
do complexo corante pelo lcool.
OBJETIVOS
Tcnica:
A. Preparao do esfregao:
Lmina nova ou estocada em lcool.
Flambar no bico de Bunsen.
Deixar esfriar.
46
Cultivo em meio slido
Colocar uma gota de gua destilada estril, soluo salina ou meio lquido
estril no centro da lmina;
Tocar, assepticamente, com agulha estril uma colnia.
Homogeneizar o material colhido no lquido da lmina, espalhando a
suspenso;
Secar, fixar e esfriar como citado acima.
B. Colorao Simples:
D. Interpretao de resultados:
Solues reagentes:
1. Cristal violeta:
- Cristal violeta 1,0g
- lcool a 95 10mL
- gua 100mL
47
2. Lugol:
- Iodo 1,0g
- Iodeto de potssio 10mL
- gua 300mL
3. Fucsina:
- Fucsina bsica 0,3g
- Fenol 5,0g
- lcool a 95 10mL
- gua 100mL
Dever ser diluda 1:10 para ser utilizada no mtodo de Gram. Existem vrias
modificaes introduzidas no mtodo visando melhora-lo, uma das utilizadas a de
Kopeloff-Beermann. Com adio de bicarbonato de sdio soluo de cristal violeta e a
substituio da soluo de fucsina por safranina. As principais vantagens deste mtodo
modificado: no iro sofrer interferncia de pH (como a acidez do pus) e, preservar as
bactrias G+ que se descoram facilmente (Gram lbeis).
48
se obteve xito para o seu cultivo em laboratrio, sendo considerado parasita
intracelular obrigatrio.
OBJETIVOS:
Tcnica:
49
b. Tcnica de colorao idntica a descrita anteriormente, com exceo do
cido clordrico (1%)
c. Observar ao microscpio o agrupamento tpico.
Material necessrio:
1. Azul de metileno
Azul de metileno 1g
lcool etlico 95 GL 100 ml
gua q.s.p. 1000 ml
2. Sol. lcool-cido
Obs: deixar o cido escorrer lentamente pelas paredes do recipiente contendo lcool,
agitar suavemente.
Atualmente, quase todos os casos de sfilis so adquiridos por contato sexual com leses
infecciosas. Meios incomuns de transmisso incluem o contato pessoal no sexual, com
fmites contaminados, transfuses sanguneas ou a infeco em tero. Uma grande
proporo das infeces extra genitais ocorre nas proximidades da boca, como resultado
da disseminao dos microorganismos pela cavidade oral durante o beijo. At o
momento, no h nenhum agente imunizante ativo como profilaxia para a infeco
siflica.
50
hospedeiros animais, domsticos e selvagens e nos seres humanos uma ocorrncia
acidental.
Para as leptospiroses e infeces por Borrelia esses mtodos no devem ser feitos,
atravs do mtodo em campo escuro, para as leptospiroses e, no sangue, durante um
episdio febril, para as espiroquetas do gnero Borrelia.
OBJETIVO:
51
Ao restante, adicionar gota a gota soluo concentrada de amnia ata que o
precipitado castanho que se forma dissolva-se totalmente
Adicionar gota a gota a soluo de nitrato que foi retirada at que aparea uma
fraca turvao persistente.
MATERIAL:
a. Microscpio ptico(M.O.)
b. M.O. + condensador
c. Lminas
d. Reagentes Fontana-Tribondeau
e. SWAB
f. lcool
g. leo de cedro
h. Soluo salina
i. Culturas em meios lquidos e slidos
j. Exsudato positivo
Reagentes de Fontana-Tribondeau:
1. Lquido de Ruge
- cido actico 1,0 mL
- Formalina 2,0 mL
- gua 100 mL
2. Mordente
- fenol 1,0 g
- cido tnico 5,0 g
52
- gua 100 ml
TCNICA:
1. Preparao do esfregao
Solues reagentes:
1. Soluo de Albert-Laybourn
- azul de toluidina 0,15g
- verde malaquita 0,20g
- cido actico glacial 1,00ml
- lcool 95% 2,00ml
- gua destilada 100ml
53
Referncias Bibliogrficas:
6. http://www.mc.maricopa.edu/~johnson/labtools/Dbiochem/emb.html, acessado em
22/11/2007.
7. http://biology.fullerton.edu/biol302/302labf99/biochem.html, acessado em
22/11/2007.
54