SRIES EM BIOTECNOLOGIA

volume I

Tecnologia de Bioprocessos
 P 436 t
Pereira Jr., Nei. (editor-autor)
Tecnologia de bioprocessos / Nei Pereira Jr., Elba
Pinto da Silva Bon, Maria Antonieta Ferrara. Rio de
Janeiro: Escola de Qumica/UFRJ, 2008.
62 p.: il. (Sries em Biotecnologia, v. 1)

ISBN 978-85-903967-2-7
Inclui bibliografia.

1. Bioprocessos. 2. Tecnologia. 3. Bioprodutos.

I. Bon, Elba Pinto da Silva. II. Ferrara, Maria
Antonieta.
III. Ttulo. IV. Srie.
CDD 600

Biblioteca Nacional

2
 BREVE NOTA BIBLIOGRFICA SOBRE OS AUTORES

Nei Pereira Jr Professor Titular do Departamento de Engenharia Bioqumica da Escola de

Qumica da Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ). Possui os ttulos de Engenheiro
Qumico (EQ-UFRJ, 1977); MSc em Tecnologia de Processos Bioqumicos (EQ-UFRJ, 1982) e
PhD em Biotecnologia (The University of Manchester, UK, 1991). Desde 1991, vem liderando
projetos de Pesquisa & Desenvolvimento & Inovao nos Laboratrios de Desenvolvimento de
Bioprocessos da UFRJ, onde j orientou 65 teses (43 MSc e 22 DSc). Coordena as seguintes
linhas de pesquisa: Biotecnologia de Lignocelulsicos; Processos com Microrganismos
Recombinantes; Biotecnologia Ambiental; Floculao/Imobilizao de Clulas e Enzimas;
Tecnologia da Produo de Antibiticos; Produo de Alimentos Funcionais; Gesto
Tecnolgica e Tratamento/Minimizao de Resduos e Efluentes Industriais. Atualmente,
orienta 05 estudantes de mestrado e 08 de doutorado. J publicou mais de 200 trabalhos
(artigos em peridicos indexados e trabalhos em eventos cientficos) e 07 patentes, uma
delas relacionada produo de bioetanol de bagao de cana-de-acar via hidrlise
enzimtica de celulose, trabalho realizado para a PETROBRAS que resultou na patente de
nmero 1000 da empresa. Tambm desenvolve trabalhos cooperativos com instituies de
ensino e pesquisa nacionais e internacionais, bem como com empresas. bolsista do CNPq
(Produtividade em Pesquisa) e da FAPERJ (Cientista do nosso Estado) em reconhecimento as
suas contribuies ao desenvolvimento da cincia e tecnologia nacionais, assim como na
formao de recursos humanos altamente capacitados. Ele foi recentemente agraciado com
os seguintes prmios: PETROBRAS Inventor 2005, 2006 e 2007; Tese Ouro (2006),
concedido pela Escola de Qumica por ter atingido a orientao de 50 teses em seu Programa
de Ps-graduao e o prmio nacional da Associao Brasileira da Indstria Qumica
(ABIQUIM) - Pesquisador de Destaque 2006.

Elba Pinto da Silva Bon Professora Associada do Departamento de Bioqumica do

Instituto de Qumica da Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ). graduada em
Cincias Biolgicas (UERJ, 1970), com Mestrado em Bioqumica (UFRJ, 1974) e em
Engenharia Bioqumica (UMIST-UK, 1987), Doutorado em Engenharia Bioqumica (UMIST-UK,
1991) e Ps-Doutorado no Departamento de Biologia do Massachusetts Institute of
Technology (MIT, Cambridge, USA, 1995). a coordenadora do Laboratrio de Tecnologia
Enzimtica do IQ/UFRJ, onde atua nas reas de Microbiologia Aplicada, Biocatlise e
Regulao do Metabolismo por Nitrognio, com nfase a produo e uso de enzimas
industriais e especiais e regulao da expresso gnica. J orientou 27 teses (15 MSc e 12
DSc) e atualmente, orienta 03 estudantes de mestrado e 02 de doutorado. Coordena
projetos de pesquisa desenvolvidos em colaborao com o Instituto Nacional de Tecnologia -
MCT e a Fundao Oswaldo Cruz - MS. J coordenou ou coordena projetos de pesquisa com
colaborao internacional com Portugal, Alemanha e Sucia. coordenadora cientfica e
coordenadora setorial da rea de Produo de Celulases do Projeto Bioetanol. Atua tambm
na rea de polticas de Cincia e Tecnologia tendo estruturado e organizao muitas edies
do evento ENZITEC. Participa das atividades do Frum de Biotecnologia do Governo Federal,
como contratada pelo CGEE na rea de Enzimas Industriais e Especiais.

Maria Antonieta Ferrara Pesquisadora do Instituto de Tecnologia em Frmacos de Far-

Manguinhos / Fundao Oswaldo Cruz. Possui graduao em Qumica (IQ/UFRJ, 1974),
Mestrado (EQ/UFRJ, 1988) e Doutorado (EQ/UFRJ, 2004) em Tecnologia de Processos
Qumicos e Bioqumicos. Tem experincia nas reas de Microbiologia, com nfase em
Bioprocessos e de Tecnologia Enzimtica, atuando principalmente nos seguintes temas:
produo de enzimas, produo de metablitos microbianos bioativos, produo de protenas
heterlogas por Pichia pastoris, bioconverso, enzimas teraputicas, fungos endofticos e
pr-tratamento e hidrlise enzimtica de biomassa vegetal.

3
APRESENTAO

A Biotecnologia Moderna oferece inovadoras possibilidades para a

produo de substncias qumicas e processos mais limpos. Em seu cerne est o
princpio de se trabalhar em harmonia com o mundo natural. A Biotecnologia tem
solues para atender humanidade em suas mais diferentes necessidades
(alimentos, energia, medicamentos), bem como suplantar tecnologias que
poluem a biosfera ou que contribuam para a depleo de fontes finitas. No
entanto, a indstria, a comunidade cientfica e o governo necessitam trabalhar
em conjunto para que o Brasil possa lanar mo plenamente do potencial da
Biotecnologia, a fim de alcanar sua sustentabilidade industrial/econmica/
ambiental e permitir que o pas siga a sua vocao natural para essa rea.
neste contexto, que lanamos a primeira verso das Sries em
Biotecnologia com a inteno de disponibilizar material instrucional a
estudantes que tencionem atuar profissionalmente nesta importante rea.
Esta primeira edio apresenta conceitos e fundamentos necessrios
para uma melhor compreenso das diferentes etapas que compem a
Tecnologia de Bioprocessos, com o objetivo de fornecer aos estudantes uma
viso global e integrada desta temtica, imprescindvel quando se pretende
transformar conhecimento em realidade produtiva. No entanto, de carter
introdutrio e cunho aplicado, no tem a pretenso de ser uma apresentao
exaustiva sobre o assunto. Na realidade, so notas de aulas que temos a
inteno de transformar em sries didticas, de forma a colocar o estudante em
contato com os problemas e desafios da Biotecnologia, quer seja na rea
acadmica ou no setor industrial. Esperamos que o contedo desta edio
proporcione aos leitores uma viso abrangente da rea para conhecimento e
reflexes.
Estamos convictos da importncia da Biotecnologia para o Brasil, pois ela
concilia o desenvolvimento tecnolgico com a preservao ambiental. Somos
conscientes de que o meio ambiente brasileiro representa um ativo de valor
incalculvel e contribui decisivamente para a representatividade brasileira no
cenrio internacional. Para isto registramos nosso firme propsito e compromisso
de contribuir efetivamente na formao de massa crtica capacitada para atuar
nesta importante rea, permitindo a insero desses profissionais em um
mercado cada vez mais competitivo e regulador em termos de produtos e
processos.
Os Autores
4
 NDICE

Tpico Pgina
1. A Biotecnologia Microbiana: Conceitos e Aplicaes 7
Biotecnologia de Bactrias 10
Biotecnologia de Leveduras e Fungos Filamentosos 12
Tecnologia do DNA Recombinante 14
2. Bioprocessos 18
3. Agente Biolgico: Caractersticas 21
4. Nutrio dos Microrganismos 23
Fontes de Energia 23
Fontes de Carbono 23
Fontes de Nitrognio 24
Fontes de Minerais 24
Fatores de crescimento 25
5. Matrias-Primas Glicdicas 25
6. Meio de Cultivo 27
Otimizao do meio de cultivo 29
Formulao de meio de cultivo com base na composio 31
centesimal de microrganismos
7. Esterilizao de Meios e Equipamentos 33
8. Biorreator 35
9. Modos de Operao de Bioprocessos 41
Quanto conduo 41
Quanto ao desenvolvimento do agente microbiano 45
Quanto ao suprimento de oxignio 47
10. Processos de Separao e Purificao de Produto 50
11. Extrapolao de Escala 50
12. Tratamento Biolgico de Resduos e Efluentes 53
13. Consideraes Gerais 57
14. Referncias Bibliogrficas Recomendadas 58

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 TECNOLOGIA DE BIOPROCESSOS

Nei Pereira Jr.1; Elba Pinto da Silva Bon2& Maria Antonieta Ferrara3
1
Laboratrios de Desenvolvimento de Bioprocessos
Escola de Qumica - CT/UFRJ nei@eq.ufrj.br
2
Laboratrio de Tecnologia Enzimtica
Instituto de Qumica CCMN/UFRJ
3
Instituto de Tecnologia em Frmacos
Farmanguinhos/FIOCRUZ

1. A Biotecnologia Microbiana: Conceitos e Aplicaes

Os vrios conceitos da Biotecnologia se referem ao uso de clulas ou

sistemas bioqumicos em processos de produo de bens ou de prestao de
servios (Tabela 1). Neste contexto, a Biotecnologia tem papel destacado, sob o
ponto de vista histrico e tecnolgico, visto que os primeiros processos industriais
basearam-se na ao de microrganismos e a grande maioria daqueles
consagrados utiliza microrganismos nativos ou modificados geneticamente.
A Biotecnologia apresenta carter inter e multidisciplinar, necessitando aqueles
que militam nesta rea de conhecimentos fundamentais em Bioqumica, Gentica,
Microbiologia Aplicada e Engenharia Bioqumica, a fim de se ter uma maior
compreenso sobre a atividade do biocatalisador e buscar suas melhores
condies de desempenho em biorreator (otimizao). Outras ferramentas como
a Modelagem e a Simulao, bem como o Controle e a Instrumentao so
peas-chaves na otimizao de Bioprocessos.
Trata-se de uma rea muito extensa, conforme exemplificado a seguir, para
processos, produtos e servios: diferentes microrganismos so utilizados para a
produo de substncias de interesse comercial, como: antibiticos, cidos
orgnicos, solventes, enzimas e biocombustveis por processos fermentativos. O
produto pode ser ainda o prprio microrganismo, como a produo de levedura
de panificao e inoculantes agrcolas, ou as clulas microbianas podem ser
utilizadas em processos de biotransformao, como por exemplo, para a
produo de esterides, aromas e fragrncias. Alm da produo de bens de
consumo, os microrganismos so tambm utilizados em processos de tratamento
de resduos e efluentes urbanos e industriais, na recuperao de metais, tais
como cobre, chumbo e urnio, ou em processos de biorremediao de solos
contaminados. Os principais produtos da Biotecnologia podem ser agrupados de
acordo com o seu uso, em produtos da indstria farmacutica (antibiticos,
hormnios, vacinas, vitaminas e protenas teraputicas humanas), da indstria de
alimentos (aminocidos, flavorizantes, polissacardeos e gomas xantana) e da
indstria qumica (etanol, acetona, butanol, glicerol, cido lctico, cido ctrico,
polisteres, inseticidas microbianos). Como as enzimas microbianas so utilizadas
em diferentes segmentos industriais, no conveniente classific-las de acordo
com a sua aplicao. Em decorrncia das vrias aplicaes de seus produtos, a
Biotecnologia insere-se em uma gama de segmentos industriais (Figura 1).
6
 Tabela1: Definies de Biotecnologia.

DEFINIO REFERNCIA
Conjunto de processos microbianos e outros
processos bioqumicos desenvolvidos em escala Stenesh (1989)
industrial
Uso de organismos vivos para produzir produtos Glazer & Nikaido (1995)
benficos para a espcie humana
Integrao de cincias naturais e de cincias da
engenharia visando aplicao de organismos, Smith-Doerr et al. (1997)
clulas, derivados celulares e anlogos moleculares
para produtos e servios
toda tecnologia de processo ou produto que
lance mo, em pelo menos uma de suas etapas, da
ao de microrganismos, clulas animais ou
vegetais, ou de substncias produzidas por estes Rehn & Reed (1993)
agentes biolgicos, sendo caracterizada por sua
multidisciplinaridade

Conjunto de tecnologias habilitadoras (enabling

technologies), que possuem em comum o uso de
clulas ou molculas biolgicas para aplicaes na Marx (1989)
produo de bens e servios, em reas como sade
humana & animal, agricultura, energia e meio
ambiente

agropecurio

qumico txtil

veterinrio BIOTECNOLOGIA ambiental

alimentcio energtico

mdico-farmacutico

Figura 1: Insero da Biotecnologia em diferentes setores produtivos.

7
Todos os microrganismos produzem uma variedade muito grande de enzimas
intracelulares em pequenas quantidades, para a catlise das suas reaes
metablicas. As enzimas, tambm denominadas de biocatalisadores, so
catalisadores proticos com caractersticas particulares pela sua alta eficincia em
condies fisiolgicas e alta especificidade, sendo inclusive capazes de catalisar
reaes estereoespecficas. Este potencial cataltico utilizado industrialmente
no s nos clssicos processos fermentativos, mas tambm em processos de
biotransformaes microbianas para a catlise de reaes qumicas de difcil
ocorrncia e de grande importncia na indstria farmacutica. Um exemplo tpico
refere-se produo de esterides utilizando-se Rhizopus nigricans. O fungo ,
inicialmente, cultivado em biorreatores em condies otimizadas para se atingir
altas concentraes celulares. Finda a fase de crescimento celular, o substrato a
ser transformado, a progesterona, adicionado ao biorreator e, aps um perodo
de incubao determinado, o produto da biotransformao, a 11-
hidroprogesterona, extrado com solvente orgnico. Este composto pode ser
subseqentemente transformado, por via qumica, para a produo industrial de
um outro esteride, a cortisona (Madigan et al., 2000 e Atlas, 1997).
Enquanto nas biotransformaes os sistemas enzimticos de interesse no so
extrados das clulas, a catlise enzimtica industrial usa enzimas microbianas
excretadas ou extradas de microrganismos e com diferentes graus de
purificao. As enzimas microbianas excretadas so produzidas em maiores
quantidades do que as intracelulares e tm a funo principal de degradar
macromolculas presentes no meio ambiente, como a celulose, o amido, a lignina
e protenas, para que seus componentes possam ser absorvidos como nutrientes
pelos microrganismos.
As enzimas so utilizadas em muitos segmentos industriais, como o de alimentos
e bebidas, de detergentes, txtil, couro, celulose e papel, qumica fina,
medicamentos e cosmticos e, ainda, em metodologia analtica e em biologia
molecular. Amilases, glicose oxidase, pectinases, invertase, renina, naraginase,
lipases, proteases, celulases e peroxidases so os biocatalisadores mais utilizados
(Atlas, 1997 e Bon & Pereira Jr., 1999). Enzimas so tambm empregadas como
medicamento, como por exemplo, a asparaginase utilizada no tratamento de
leucemia. O mercado mundial de biocatalisadores, atualmente avaliado, em US$
1,5 bilhes tem previses de crescimento continuado em resposta s demandas
por processos industriais com menor impacto ambiental e menor consumo
energtico e tambm por produtos de melhor qualidade (Godfrey, 2003).
O desenvolvimento da Biotecnologia tem importncia mpar para o Brasil, devido
ao seu baixo impacto ambiental, sendo possvel conciliar o desenvolvimento
industrial com a preservao de ecossistemas. Sabemos que o Brasil apresenta
uma das maiores biodiversidades do planeta e que seu territrio possui recursos
hdricos correspondentes a 12% da gua doce do planeta, incluindo o Aqfero
Guarani, que o maior do mundo. So esses os recursos naturais mais
importantes para a humanidade a partir deste sculo, representando um ativo de
valor incalculvel. Essas riquezas, patrimnio da sociedade brasileira, devem ser
preservadas da poluio ambiental provocada por prticas inadequadas de
diferentes setores industriais e agro-industriais.
O equilbrio natural dos ecossistemas, to antigo quanto a vida na Terra, pode ser
considerado como uma importante rea da Biotecnologia Microbiana. Os
microrganismos habitam praticamente todos os ambientes terrestres, sendo
8
transportados por correntes de ar para a atmosfera e de continente para
continente. Esses seres microscpios tambm habitam todos os ambientes
marinhos, das superfcies aquticas ao fundo dos oceanos. Por causa desta
caracterstica de crescimento nos mais variados ambientes, os microrganismos,
atravs de suas vias metablicas intracelulares e de molculas bioativas
excretadas para o meio externo, atuam na manuteno do ciclo biolgico de
elementos qumicos, no controle populacional, na descontaminao de ambientes
aquticos e terrestres e na disponibilizao de nutrientes para diferentes formas
de vida. Estas tarefas gigantescas, inestimveis e insubstituveis no so
facilmente perceptveis, correndo o risco de no serem adequadamente
protegidas. Embora a ao antropognica venha interferindo de forma negativa
no modus operandi dos ecossistemas e, portanto, no seu equilbrio, as
populaes microbianas que habitam o nosso planeta continuam alicerando a
manuteno da vida na Terra.
O fantstico potencial metablico envolvido na sntese e degradao das mais
variadas estruturas qumicas por bactrias, fungos, algas e protozorios est
distribudo em microrganismos com caractersticas fisiolgicas muitas vezes
peculiares. As bactrias, por exemplo, so encontradas nos mais diferentes
climas e microambientes do planeta, alguns considerados inspitos. Bactrias
haloflicas vivem em ambientes aquticos com alto teor salino, como o Mar Morto,
as termoflicas, em fontes termais, em temperaturas entre 800C e 1000C e as
baroflicas se adaptaram s enormes presses das profundezas do mar.
Adicionalmente, algumas bactrias so parasitas de tecidos animais e vegetais e
algumas vivem em consrcio com outros microrganismos, plantas e animais.

Biotecnologia de Bactrias
Embora as bactrias sejam mais conhecidas como microrganismos
patognicos, a grande maioria inofensiva e inclusive benfica a outros seres
vivos. Como exemplo, a tarefa fundamental da fixao do nitrognio atmosfrico
molecular levada a efeito por bactrias dos gneros Rhizobium, Bradyrhizobium
e Frankia, que vivem em associaes simbiticas com plantas leguminosas, como
o feijo e a soja. Estas bactrias, que so encontradas no solo, infectam
naturalmente plantas hospedeiras formando ndulos nas razes onde proliferam.
Este mecanismo natural de infeco tem sido utilizado, h quase cem anos, para
aumentar a fertilidade do solo atravs da sua inoculao com bactrias fixadoras
de nitrognio produzidas industrialmente por processos fermentativos (Glazer &
Nikaido, 1995).
So tambm de grande importncia biotecnolgica cepas selvagens ou
modificadas geneticamente de bactrias dos gneros Corynebacterium, Bacillus e
Microbacterium pela capacidade de excretar produtos do seu metabolismo
primrio, como aminocidos. A constatao de que Corynebacterium glutamicum
era capaz de produzir grandes quantidades de cido glutmico, quando crescida
em glicose, reportada em 1957, resultou na seleo e desenvolvimento de
bactrias para a produo de acido L-glutmico, L-arginina, L-isoleucina, L-
histidina, L-leucina, L-lisina, L-ornitina, L-fenilalanina, L-prolina, L-treonina, L-
triptofano e L-tirosina, alm de vitaminas e nucleotdeos. Fermentaes com
concentraes de L-tirosina e L-fenilalanina em torno de 25g/L esto descritas na
literatura (Piepersberg, 1993). A produo anual de aminocidos utilizados na
indstria de alimentos estimada em 530 toneladas (Madigan et al., 2000).
9
Ainda entre as bactrias, encontramos os estreptomicetos, que tambm
apresentam o genoma organizado em um nico cromossomo circular. Os
estreptomicetos, que so aerbios, vivem no solo e multiplicam-se formando
filamentos ramificados, tm grande importncia biotecnolgica por produzirem
compostos com diferentes atividades biolgicas. Assim, esses microrganismos
sintetizam molculas que atuam como antibiticos, antitumorais,
imunomoduladores, antiinflamatrios, vasoconstritores e vasodilatadores, alm
de terem aplicao no tratamento da diabete e como herbicidas. Algumas foram
ainda identificadas como inibidores enzimticos. Estes compostos, que
apresentam baixa massa molecular, so excretados em condies de
metabolismo secundrio, isto , aps a fase de crescimento celular, j tendo sido
identificados mais de 10.000 substncias diferentes (Piepersberg, 1993). Os
antibiticos, substncias que mesmo em baixas concentraes inibem o
crescimento de microrganismos patognicos, so os representantes mais
conhecidos deste grupo. Considerando o seu mercado, avaliado em 8 bilhes de
dlares (Glazer & Nikaido, 1995), os antibiticos so os produtos mais
importantes da biotecnologia microbiana, excetuando-se bebidas alcolicas e
queijos.
O primeiro depoimento oficial sobre a ao do antibitico penicilina foi feito por
Alexander Fleming em 1928, quando relatou a eficincia do filtrado de uma
cultura do fungo Penicillium notatum como um teraputico local em uma infeco
provocada por Staphylococcus. O grande sucesso dos antibiticos no tratamento
de infeces bacterianas em comparao aos quimioterpicos, que comearam a
ser disponibilizados na mesma poca, deveu-se sua eficincia em comparao
apresentada por drogas como as sulfas. Assim, enquanto concentraes
inibitrias mnimas (CIMs) de sulfonamidas nos pacientes esto na faixa de 10 a
100 g/mL, o antibitico penicilina mata bactrias sensveis como Streptococcus
pneumoniae com CMIs em torno de 0,01 g/mL (Glazer & Nikaido, 1995).
Os antibiticos podem ser classificados quanto ao espectro de atividade,
antifngicos, antibacterianos, antivirais, antiprotozorios e antitumorais; quanto
a seu mecanismo de ao, interferindo na sntese da parede celular, na sntese
de cidos nuclicos, na sntese de protenas e nas funes da membrana
citoplasmtica; e quanto sua estrutura qumica, lactonas macrocclicos,
quinonas e relacionados, derivados de aminocidos e peptdicos, entre outras
estruturas.
A grande maioria dos antibiticos com importncia comercial produzida por
fungos ou bactrias. Dentre os bacterianos, a maior variedade em estruturas e o
maior nmero de antibiticos so encontrados na classe Actinomycetales,
especialmente no gnero Streptomyces. Uma relao de alguns antibiticos
produzidos por Streptomyces est apresentada na tabela 2.
Segundo o Index ABIQUIF 2002, publicado pela Associao Brasileira da Indstria
Farmoqumica, so produzidos no Brasil apenas nove antibiticos, a saber:
Ampicilina, Anfotericina B, Cefalexina, Cefalotina, Ceftadizina, Eritromicina,
Nistatina, Oxacilina e Penicilina G, de um elenco de trinta e nove considerados
essenciais segundo a edio de 2002 da Relao Nacional de Medicamentos
Essenciais publicada pelo Ministrio da Sade. Entre os antibiticos produzidos no
Brasil, trs (Cefalexina, Cefalotina e Ceftazidna) so produzidos pela empresa
multinacional Eli Lilly do Brasil Ltda e seis (Ampicilina, Anfotericina B,
Eritromicina, Nistatina, Oxaciclina e Penicilina G), por outra multinacional, o
10
Grupo Prodotti. Esta relao no inclui a paromomicina, fundamental para o
tratamento de doenas negligenciadas de grande ocorrncia no Brasil, como a
leishmaniose e a tuberculose. O Brasil no produz e nem importa paromomicina,
no estando esta droga disponvel no mercado nacional. Considerando o acima
exposto, o abastecimento de antibiticos para uso humano no Brasil depende
integralmente de companhias farmacuticas internacionais. Em relao
produo de antibiticos para uso animal, o pas encontra-se em posio mais
confortvel, pois existem empresas brasileiras, como a Valle, ativas no setor.

Tabela 2: Antibiticos produzidos por microrganismos do gnero Streptomyces

Antibitico Microrganismo
Aminosidina Streptomyces rimosus
Cicloheximida Streptomyces griseus
Cicloserina Streptomyces orchidaceus
Cloranfenicol Streptomyces venezuelae
Eritromicina Streptomyces erithreus
Espectinomicina Streptomyces spectabilis
Estreptomicina Streptomyces griseus
Kanamicina Streptomyces kanamyceticus
Lincomicina Streptomyces lincolnnensis
Neomicina Streptomyces fradiae
Nistatina Streptomyces noursei
Ribostamicina Streptomyces ribosidificus
Tetraciclina Streptomyces rimosus

Fonte: Madigan et al. (2000) e Vandamme (1984)

Biotecnologia de Leveduras e Fungos Filamentosos

Historicamente, o potencial metablico dos microrganismos inseriu-se
naturalmente em aspectos fundamentais da vida humana. Assim, fungos
unicelulares, as leveduras, apresentam peculiaridades metablicas que
permitiram o seu uso de forma emprica na produo do po e do vinho,
alimentos simblicos na histria da humanidade. Os antigos egpcios, no preparo
do seu po, mantinham a massa, uma simples mistura de farinha e gua,
aquecida at a formao de bolhas, indicativo, hoje sabemos, da liberao de CO2
em conseqncia da sua fermentao (Panek, 1993). Assim, a contaminao
natural, no apenas da massa do po, mas tambm de uvas e gros de cevada,
com a levedura Saccharomyces cerevisiae e a sua subseqente fermentao
originaram o vinho e a cerveja que at os dias de hoje fazem parte dos nossos
hbitos alimentares. As fermentaes industriais com leveduras contribuem
atualmente de forma significativa para a economia de vrios pases. So
produzidas por ano centenas de toneladas de leveduras utilizadas para a
produo de po, vinho, cerveja, bebidas destiladas, cidra, saqu e licores. Um
outro importante produto industrial derivado de S. cerevisiae, cujas clulas so
ricas em protenas, cidos nuclicos, vitaminas e sais minerais e apresentam
nveis negligenciveis de triglicerdeos, o extrato de levedura que tem
11
importantes aplicaes na indstria alimentcia e na de fermentaes industriais,
servindo como componente do meio de fermentao.
Outras leveduras dos gneros Torulopsis e Candida, sendo capazes de crescer em
melao ou em licor sulftico, subprodutos da fabricao de acar e da indstria
de papel, respectivamente, so utilizadas para o tratamento destes resduos
industriais. A biomassa microbiana formada pode ser, subseqentemente,
utilizada como fonte de protena para alimentao animal.
Considerando ainda o potencial biotecnolgico das leveduras, microrganismos dos
gneros Saccharomyces, Kluyveromyces e Candida so capazes de fermentar
diferentes acares a etanol. de particular importncia para o Brasil a produo
de lcool combustvel por fermentao da sacarose do caldo da cana-de-acar
por S. cerevisiae, tendo em vista ser o pas, juntamente com os Estados Unidos,
os maiores produtores mundiais de etanol combustvel. Adicionalmente, o etanol
est sendo cada vez mais valorizado internacionalmente como combustvel
lquido, em comparao gasolina, derivada do petrleo. Sendo produzido a
partir de recursos renovveis, no contribui para o efeito estufa e suas
conseqncias, como as grandes modificaes climticas que esto afetando
negativamente a Terra. Para a produo deste biocombustvel, podem ser
utilizadas matrias primas sacarneas (aucaradas), amilceas e lignocelulsicas,
cujas caractersticas esto descritas a seguir. Vale ressaltar, entretanto, que
bactrias como Zymomonas mobilis podem ser tambm utilizadas em processos
fermentativos de produo de etanol.
A diversidade microbiana dos fungos muito grande, estimando-se um nmero
de espcies entre 100.000 e 250.000. Os fungos destacam-se pela sua
capacidade de atacar tecidos vegetais atravs da secreo de enzimas que
degradam biopolmeros tais como polissacardeos, lignina e protenas. familiar a
todos ns a colonizao de troncos de rvores em decomposio por diferentes
espcies de fungos. Este grupo de microrganismos, semelhana dos
estreptomicetos, tambm produz, em condies de metabolismo secundrio, uma
variedade de molculas orgnicas de pequena massa molecular com diferentes
atividades biolgicas, como a antibitica.
A comercializao de produtos teraputicos microbianos iniciou-se h mais de 50
anos com a penicilina. O uso de manipulaes genticas, basicamente tcnicas de
mutao associadas otimizao do processo fermentativo, incluindo o
desenvolvimento de meios, permitiram a melhoria do processo de produo do
antibitico, cuja concentrao passou de 0,06 para 26 g/L (Buckland & Lilly,
1993).
Inicialmente empregados apenas como agentes antibacterianos, os produtos do
metabolismo secundrio de fungos apresentam hoje em dia uma gama bastante
diversificada de aplicaes, incluindo inclusive o uso como imunossupressores em
terapias sofisticadas para pacientes transplantados (Pearce, 1997), conforme
mostrado na Tabela 3. Este avano relaciona-se, em parte, ao atual
entendimento da etiologia bioqumica e gentica de muitas doenas, o que tornou
possvel buscar substncias com ao direcionada para alvos especficos no
metabolismo celular. Dentre os antibiticos fngicos, apenas dez so produzidos
comercialmente e somente penicilinas, cefalosporinas, griseofulvinas e os cidos
clavulnico e fusdico so clinicamente importantes.

12
 Tabela 3: Medicamentos produzidos com metablitos fngicos
e microrganismos produtores.

PRODUTOS FNGICOS BIOATIVOS

APLICAO PRODUTO FUNGO
Analgsico Paxisterol Penicillium sp.
Crisospermina Apiocrea chrysosperma
Cefalosporina Cephalosporium
Antibacteriano Penicilina Penicillium, Aspergillus
Sorrentanona Penicillium chrysogenun
Equinocandina Aspergillus nidulans
cido zaragzico Mycelia sterilia, Leptodontidium
elatius, Sporomiella intermedia
Antifngico Esqualestatinas Phoma sp.
Griseofulvina Penicillium griseofurvum
Controlador da sntese de Compactina Penicilium brevicompactum
Colesterol
Mevilonina Penicillium citrinum
Dihidromevilonina Aspergillus terreus
Antitumoral Taxol Pestalotiopsis microspora
Calfostina C Cladosporium cladosporioides
KS 501, KS 502 Sporothrix sp
Antiviral Isocromofilonas Penicillium multicolor
Estimulador da contrao Alcalides Ergo Claviceps purprea
uterina
Imunomodulador FR-901235 Paecilomyces carneus

Imunossupressor Ciclosporina A Tolypocladium inflatum

Trichoderma polysporum
Tratamento de problemas Estachibocinas Stachybotrys sp.
cardiovasculares RES 1214-1/2 Pestalotiopsis sp.
Profiltico em odontologia Mutastena Aspergillus terreus
Tratamento de diabetes Salfredinas Crucibilum sp.
Fonte: Pearce (1997)

Tecnologia do DNA Recombinante

A Biotecnologia pode ser dividida em dois perodos principais: o primeiro
anterior ao uso de da tecnologia do DNA recombinante e o segundo aps a sua
implantao em 1982, a partir dos experimentos realizados em 1973 por Herbert
Boyer, Stanley Cohen e seus colaboradores. Enquanto at esta data as bactrias
podiam produzir apenas substncias codificadas no seu prprio genoma, a partir
da clulas de bactria modificadas geneticamente por tcnicas de Biologia
Molecular passaram a produzir substncias codificadas por genes animais e
vegetais. Assim, a aprovao para uso clnico de insulina humana produzida pela
bactria Escherichia coli, h mais de vinte e cinco anos, definiu a engenharia
gentica como um instrumento poderoso para a modificao de microrganismos,
de forma a transform-los em unidades de produo de compostos de interesse.
O efeito da tecnologia do DNA recombinante pode ser mais facilmente visualizado
13
comparando-se o perfil dos principais produtos comercializados antes e aps
1982. At essa data, o mercado mundial de produtos dependentes de
Biotecnologia concentrava-se em bebidas alcolicas, queijos, antibiticos, etanol
combustvel, xaropes com alto contedo de frutose, aminocidos, levedura de
panificao, esterides, vitaminas, cido ctrico, enzimas, vacinas e gomas
polissacardicas. Assim, de um mercado total de cerca de 78 bilhes de dlares,
80% relacionavam-se indstria de alimentos (Glazer & Nikaido, 1995). Embora
esta predominncia seja uma realidade at os dias de hoje, muitos processos de
produo passaram a usar microrganismos modificados por tcnicas da Biologia
Molecular com ganhos em rendimento e/ou produtividade.
O perfil dos produtos da Biotecnologia Microbiana tambm sofreu uma
modificao marcante aps 1982 devido ao aparecimento no mercado de uma
sucesso de protenas e peptdeos teraputicos, como o hormnio do crescimento
humano, interferons, fatores de coagulao, eritropoietina e soro albumina, entre
outros, produzidos por processos fermentativos. Como a obteno e purificao
destas protenas e peptdeos, em quantidades relevantes, a partir de tecidos
humanos ou animais era muito difcil, os genes humanos que codificam para
estes compostos foram clonados em E. coli e estes agentes teraputicos
passaram a ser produzidos em grandes quantidades. A produo destas
protenas teraputicas, por processo fermentativo, depende inteiramente da
tecnologia do DNA recombinante.
Embora os processos pioneiros de produo de protenas heterlogas tenham
utilizado E. coli, o posterior desenvolvimento de tcnicas de Biologia Molecular
para leveduras, baseadas em parte nos protocolos utilizados para bactrias,
permitiu a sua insero nestes processos de produo. So considerados marcos
da Biologia Molecular de leveduras os trabalhos de Hinnen, Hicks e Fink,
Transformation of yeast e de Beggs Transformation of yeast by a replicating
hybrid plasmid, ambos publicados em 1978. A partir da, as leveduras
Saccharomyces cerevisiae e Pichia pastoris, consideradas como GRAS (Generally
Regarded as Safe) pelo Food and Drug Administration dos EUA, tm sido
empregadas na produo de protenas heterlogas, competindo atualmente com
as bactrias pela liderana nesta rea.
As vantagens apresentadas pelas leveduras relacionam-se com a sua capacidade
de realizar modificaes ps-traducionais, como glicosilaes, que no apenas
contribuem para que as protenas heterlogas adquiram a conformao correta,
como tambm para a sua estabilidade, prolongando a meia vida enquanto agente
teraputico. Alm disso, diferentemente das bactrias, que precisam ser
rompidas para a obteno da protena de interesse, as clulas de levedura so
capazes de secretar as protenas recombinantes, facilitando as etapas
subseqentes de purificao. Assim, a partir da comercializao em 1986 pela
companhia Merck, da vacina para uso humano Recombivax contra hepatite B,
vrias outras protenas teraputicas heterlogas produzidas por S. cerevisiae,
como a insulina, produzida pela Novo-Nordisk, passaram a ser comercializadas.
O uso da tecnologia do DNA recombinante em leveduras para a produo de
protenas teraputicas uma rea em franca expanso, sendo atualmente
estudado tambm em Kluveromyces lactis, Schizosaccharomyces pombe,
Schwanniomyces occidentalis e Yarrowia lipolytica. Neste contexto, tm se
destacado as leveduras metilotrficas facultativas Candida boidinii, Hansenula
polymorpha, Pichia methanolica e principalmente Pichia pastoris (Walker, 1998).
14
Como a P. pastoris pode ser facilmente manipulada para produzir protenas
intracelulares ou excretadas em altos nveis, mais de 400 protenas, da
endostatina humana protena da seda de aranhas, foram expressas nesta
levedura, que tambm capaz de processar a protena heterloga de forma
semelhante de eucariotos superiores, realizando reaes de glicosilao,
protelise e formao de pontes de enxofre.
Os altos nveis de produo de protenas heterlogas devem-se utilizao do
promotor do gene da lcool oxidase I (AOX1), eficiente e especificamente
regulado, para ativar a expresso do gene de interesse. O promotor do gene
AOX1 fortemente reprimido em clulas crescendo em glicose ou na maioria das
outras fontes de carbono, mas aumenta a expresso do gene de interesse em
torno de 1.000 vezes quando as clulas so transferidas para metanol.
Adicionalmente, como P. pastoris uma levedura que preferencialmente respira
em lugar de fermentar, no produz etanol e cido actico, cuja toxicidade no
meio de cultivo impede fermentaes com altas densidades celulares, desejveis
para aumentar a concentrao da protena de interesse. Fermentaes com Pichia
podem resultar em concentraes de protena heterloga que variam de 15 mg/L,
no caso da antitrombina III humana, at 5 g/L para o caso da gelatina sinttica,
passando, por exemplo, por valores de 1,5 g/L para a insulina humana
(Cereghino et al., 2002).
Embora a maioria das enzimas industriais seja extracelular e produzida por
fungos e bactrias, a tecnologia do DNA recombinante vem recebendo uma
ateno crescente para a produo de biocatalisadores, tendo especial
importncia a expresso heterloga em leveduras metilotrficas dos gneros
Pichia, Candida e Hansenula.
Muitos genes que codificam para a sntese de enzimas humanas (glutamato
descarboxilase e h-lipase), vegetais (glicolato oxidase de espinafre e malato
desidrogenase de melo) e microbianas (dipeptil-peptidase, glicose-oxidase e
fitase de Aspergillus, glicoamilase de Rhizopus, 1,2-manosiltransferase,
adenilato quinase, invertase e catalase de Saccharomyces), j foram expressas
nestas leveduras, indicando a possibilidade de uma acentuada diversificao do
uso industrial de biocatalisadores.
Abrindo ainda mais o leque de possibilidades do uso de enzimas, existem
biocatalisadores produzidas por microrganismos extremoflicos do grupo Archea,
que so naturalmente estveis em condies extremas de temperatura, pH e
salinidade. Devido sua atividade nestas condies, o potencial industrial das
extremozimas muito grande. A Taq polimerase de Thermus aquaticus e Puf
polimerase de Pyrococcus furiosus apresentam atividade 950C e 1000C,
respectivamente, sendo utilizadas nos procedimentos de PCR (polymerase chain
reaction) (Atlas, 1997; Gellissen, 2000 e Stetter, 1999).
A Tabela 4 fornece outros exemplos de substncias produzidas por espcies
microbianas naturalmente ocorrentes e recombinantes, agentes dos processos de
biotransformao.

15
 Tabela 4: Espcies microbianas usadas na manufatura de produtos comerciais.

Produtos qumicos industriais

Saccharomyces cerevisiae etanol (de sacarose e glicose)
Kluyveromyces fragilis etanol (de lactose)
Clostridium acetobulylicum acetona e butanol
Aspergillus niger cido ctrico
Amino cidos e nucleotdeos flavorizantes
Corynebacterium glutamicum L-lisina
Corynebacterium glutamicum cido 5 inosnico e cido 5 guanilnico
Vitaminas
Ashbya gossypii riboflavina
Eremothecium ashbyii riboflavina
Pseudomonas denitrificans vitamina B12
Propionibacterium shermanii vitamina B12
Enzimas
Aspergillus oryzae amilases
Aspergillus niger glucoamilase
Trichoderma reesii celulases
Saccharomyces cerevisiae invertase
Kluyveromyces fragilis lactase
Candida lipolytica lipase
Asperillus niger pectinases e proteases
Bacillus sp. proteases
Polissacardeos
Leuconostoc mesenteroides dextrana
Xantomonas campestris goma xantana
Vacinas
Corynebacterium diphtheriae difiteria
Saccharomyces cerevisiae hepatite B
recombinante
Produtos farmacuticos
Penicillium chrysogenum penicilinas
Cephalosporium acremonium cefalosporinas
Streptomyces sp. anfotericina B; kanamicinas; neomicinas,
estreptomicinas, tetraciclinas; cido
clavulnico etc.
Bacillus brevis gramicidina S
Bacillus licheniformis bacitracina
Bacillus polymyxa polimixina B
Rhizopus nigricans transformao de esterides
Arthrobacter simplex transformao de esterides
Escherichia coli recombinante insulina; hormnios de crescimento,
interferons
Saccharomyces cerevisiae insulina
recombinante

16
2. Bioprocessos

Os processos levados a cabo por agentes biolgicos so denominados de

Bioprocessos e definidos como um conjunto de operaes que efetuam o
tratamento da matria-prima/resduo, o preparo dos meios, a esterilizao
(quando o processo demandar) e a transformao do substrato em produto(s)
por rota bioqumica, seguida de processos de separao e purificao de
produto(s).
So consideradas expresses sinonmias: processos fermentativos com
microrganismos naturalmente ocorrentes ou recombinantes, processos
biotecnolgicos, processos com clulas animais ou vegetais, processos
enzimticos ou os tratamentos biolgicos de resduos e efluentes.
A distino entre Bioprocessos e Processos Qumicos est calcada na natureza
dos catalisadores utilizados em suas reaes. Os Bioprocessos so conduzidos
mediante ao de agentes biolgicos, sendo, portanto, as transformaes
catalisadas enzimaticamente. A Tabela 5 mostra as principais caractersticas de
Bioprocessos e as compara com as dos Processos Qumicos.
Bioprocessos conduzidos por microrganismos, tradicionalmente conhecidos como
processos fermentativos, so importantes fontes de produtos biolgicos usados
nas indstrias farmacutica, qumica e alimentcia. Na ltima dcada observou-se
um aumento expressivo na quantidade de bioprodutos comerciais, especialmente
metablitos secundrios e protenas teraputicas produzidas com tecnologia de
DNA recombinante. Verificaram-se, ainda, significativas mudanas na
configurao de biorreatores, visando melhoria de seu desempenho e assegurar
operaes com maior segurana.
Tabela 5: Bioprocessos versus Processos Qumicos.

Bioprocessos Processos Qumicos

Decorrentes de atividade biolgica Decorrentes de reaes qumicas

Catalisadores de alta especificidade Catalisadores no especficos
Condies brandas de T, P e pH Condies drsticas de T, P e pH
Maiores volumes Menores volumes
Podem requerer esterilidade No requerem esterilidade

Em que pesem as complexidades e particularidades dos Bioprocessos, podemos

dividi-los em trs estgios (Figura 2). A etapa que antecede a transformao
denominada de montante (upstream), seguida da etapa de transformao
propriamente dita e, finalmente, a etapa de jusante (downstream). H autores
que incluem a transformao na etapa de montante. No entanto, por
envolverem diferentes procedimentos, somos pela diviso de um Bioprocesso em
trs etapas e no em duas.

17
 Tratamento da matria-prima
Preparo de meio; Esterilizao
upstream process

BIORREATOR

Fenmenos
qumicos
Meio de cultivo
Fenmenos
fsicos Agente biolgico:
clulas microbianas,
animais, vegetais ou
enzimas
Fenmenos
biolgicos

CONDIES AMBIENTAIS TIMAS

Separao de clulas
Separao/purificao de produto
downstream process

Figura 2: Etapas fundamentais de um tpico Bioprocesso.

A Figura 3 apresenta um esquema geral de um Bioprocesso tpico, ressaltando

que a forma de conduo do bioprocesso, a configurao do biorreator, assim
como a definio das etapas de recuperao do produto tambm se constituem
em aspectos importantes para se garantir sucesso na operao destes processos.
Estas etapas sero descritas posteriormente com maiores detalhes.
Atualmente, nfase dada ao desenvolvimento de Bioprocessos que no sejam
apenas cost/effective, mas que tambm atendam s exigncias crescentes de
confiabilidade e reprodutibilidade, o que vem aumentando a necessidade de
melhoria no monitoramento e controle de tais processos.
Algumas transformaes microbianas, analogamente s reaes qumicas,
atingem rendimentos prximos ao mximo estequiomtrico (produtos do
metabolismo primrio), embora apresentando taxas globais de produo baixas.
Outras, como as do metabolismo secundrio, resultam em baixos valores de
rendimento e produtividade, havendo um enorme campo para avanos em ambos
os casos. Os progressos sero alcanados atravs de uma maior compreenso
sobre a fisiologia celular e da interao da clula com o ambiente qumico e fsico
no biorreator. esta combinao, este binmio: clula (ou enzima)/meio
ambiente (ou condies reacionais), que define o xito de um Bioprocesso.
18
 TRATAMENTO DA
MATRIA PRIMA

PREPARO DO EFLUENTE/ TRATAMENTO/

MEIO RESDUO APROVEITAMENTO

ESTERILIZAO
BIORREATOR
DE
PRODUO
BIORREATOR
DE MEIO
PROPAGAO ISENTO DE
SEPARAO CLULAS
DE CLULAS

INOCULAO
FILTRAO PURIFICAO
DO AR DA
BIOMASSA BIOMOLCULA
BANCO DE EXTRACELULAR
CLULAS
AERAO
ROMPIMENTO
CELULAR
BIOMOLCULA BIOMOLCULA
COM ALTO GRAU COM ALTO GRAU
DE PUREZA PURIFICAO DA DE PUREZA
BIOMOLCULA
INTRACELULAR

EFLUENTE/ TRATAMENTO / EFLUENTE/

RESDUO APROVEITAMENTO RESDUO

Figura 3: Esquema simplificado de um tpico Bioprocesso.

Mais recentemente, o escopo da tecnologia de processos fermentativos ampliou-

se para incluir o cultivo de clulas animais. O cultivo destes agentes biolgicos
pode ser adaptado a uma cultura em suspenso e, portanto, uma abordagem
similar aplicada ao desenvolvimento/melhoramento de processos fermentativos
tradicionais pode ser adotada ao cultivo de clulas animais. Ressalta-se, no
entanto, que o fato das clulas animais serem maiores e mais frgeis do que
clulas microbianas e mais exigentes impem que tais processos devam ser
desenvolvidos e conduzidos com grande conhecimento sobre a fisiologia e
morfologia destes agentes biolgicos, bem como sobre as caractersticas
hidrodinmicas do meio, condies de aerao no biorreator e suas relaes com
a atividade e viabilidade celular.
19
A seguir abordar-se-o os principais aspectos de um bioprocesso, descrevendo
caractersticas do agente biolgico, matrias-primas, preparo do(s) meio(s),
biorreator(es) e separao e purificao de produto(s).

3. Agente Biolgico: Caractersticas

O agente biolgico deve ser selecionado, quando se tenciona transferir o

bioprocesso para a escala industrial, em funo das seguintes propriedades:
elevada atividade, ou seja, ser capaz de converter rapidamente o substrato em
produto com altos rendimentos, conduzindo a altos valores de produtividade;
estabilidade sob condies ambientais extremas (elevada presso osmtica do
meio, elevada temperatura, elevada fora inica), devendo, ainda, ser tolerante e
resistente a substncias txicas, que podem ser geradas no processo de
tratamento da matria-prima ou encontradas em resduos e efluentes. Tcnicas
da Biologia Molecular aplicada1 e da Engenharia Metablica2 vm sendo utilizadas
para se maximizar essas propriedades desejveis em um agente biolgico.
importante ressaltar, que estas tcnicas devem ser empregadas, quando
necessrias, para maximizar o potencial produtor dos agentes biolgicos
responsveis pelas transformaes. A histria da produo de penicilina um
clssico exemplo do impacto de manipulaes genticas associadas ao
desenvolvimento de meios para melhoria do processo. A combinao de tcnicas
de mutao com otimizao do processo fermentativo, resultou em um aumento
no rendimento em penicilina da ordem de trs vezes em magnitude (de 0,06 a 26
g/L). Portanto, conhecer as caractersticas/propriedades desses biocatalisadores
(bem como melhor-las) levar a inmeras vantagens no desenvolvimento de
Bioprocessos industriais.
Quando Bioprocessos so realizados por clulas vivas, uma vez definido o
produto ou a atividade de interesse, a prxima etapa deve envolver uma
pesquisa na literatura para identificar agentes biolgicos portadores da
caracterstica desejada ou com potencial de possu-la, seguida da aquisio de
linhagens arquivadas em colees de cultura e/ou pelo seu isolamento de
amostras naturais, seguido de procedimentos de seleo e melhoramento de
linhagens produtoras.
No cultivo de clulas microbianas, animais e vegetais em laboratrio
necessrio, para se conhecer suas caractersticas/propriedades, determinar seu
crescimento, bem como monitorar suas converses. Uma variedade de nutrientes
utilizada para os fins acima referidos, incluindo-se fonte de carbono, nitrognio,
enxofre, fsforo, oxignio, vitaminas e sais minerais.
Esses agentes biolgicos, particularmente microrganismos utilizados em
processos industriais, devem ser adequadamente preservados e conservados

1
Biologia Molecular aplicada: Ramo da Biologia que estuda a origem, transformao e interao dos
genes e seus produtos de expresso no indivduo, populao ou espcie, possibilitando o controle a
nvel gentico, a construo de agentes biolgicos timos e combinaes timas clula-biorreator.
2
Engenharia Metablica: combinao de mtodos analticos e mtodos matemticos para quantificar
fluxos in vivo com o auxlio de tcnicas da Biologia molecular, objetivando programar modificaes
genticas dirigidas a fim de melhorar propriedades celulares.

20
como cultura pura. Atravs de diferentes tcnicas possvel manter todas as
caractersticas da populao microbiana de interesse e, dessa forma, sempre que
uma nova produo iniciada a qualidade do produto tambm mantida. Assim,
a manuteno e a preservao de microrganismos so etapas de extrema
importncia para assegurar a sua viabilidade e atividade, bem como prevenir
mudanas genticas que podem levar reduo ou perda das propriedades
fenotpicas desejadas. Tcnicas de manuteno e preservao de microrganismos
incluem: repiques peridicos, conservao em parafina, em glicerol, liofilizao,
criopreservao etc. Estas tcnicas esto amplamente descritas na literatura (ver
referncias bibliogrficas recomendadas).
Aps procedimento de inoculao, a clula desenvolve seu metabolismo, a fim de
produzir energia para suportar suas reaes biossintticas e de manuteno
energtica. As molculas-combustveis (carbohidratos, lipdios, protenas)
utilizadas pela clula contm elevado nvel de energia qumica, devido ao seu alto
grau de ordem estrutural, apresentando, relativamente, baixa entropia. Durante
o catabolismo, essas substncias so degradadas a molculas menores, como
dixido de carbono, gua, lcoois etc. Como resultado dessa transformao, a
molcula-combustvel sofre uma perda do seu contedo de energia livre (forma
de energia capaz de realizar trabalho a temperatura e presso constantes). A
energia livre liberada durante as reaes do catabolismo, e por isso chamadas de
exoergnicas, conservada na forma de energia qumica nas ligaes covalentes
de certos compostos, como o ATP.
Os processos biossintticos (anabolismo), transporte ativo atravs da membrana
e mobilidade celular envolvem reaes endoergnicas (carentes de energia). As
clulas tm suas necessidades atendidas atravs da energia produzida durante o
catabolismo (Figura 4).

Nutrientes
Produtos

Energia
Crescimento
Energia
ANABOLISMO Movimento,
(Biossntese) Transporte,
CATABOLISMO etc.

Componentes(Degradao)
Celulares

Fonte de
Energia
Figura 4: Esquema simplificado do metabolismo celular.
Muitas clulas vivas necessitam de oxignio para manuteno de seu
metabolismo. Em Bioprocessos conduzidos com microrganismos aerbios, o
oxignio suprido ao biorreator, via de regra, com bolhas de ar, atravs de um
compressor, como ser visto mais adiante. J em Bioprocessos anaerbicos, os
microrganismos obtm o oxignio metablico atravs de substncias que contm
21
oxignio ligado molecularmente. Nos primeiros, o adequado suprimento de
oxignio para atender a demanda da clula imperativo, assim como a
manuteno de condies anaerbicas estritas no segundo caso. Se essas
exigncias no forem atendidas o processo encontra-se com seu potencial
limitado, podendo haver desvios no metabolismo celular ou mesmo sua
interrupo, com a conseqente perda da viabilidade celular.
Dentro da concepo de processo integrado, a associao de determinadas
caractersticas do agente biolgico (clulas ou enzimas), bem como das
particularidades do sistema reacional, com os processos de downstream tem sido
tambm uma tendncia no desenvolvimento e melhoria da operacionalidade de
Bioprocessos. Assim, se o agente biolgico do processo for um microrganismo
portador de propriedades agregativas (floculao), poder-se-o suprimir
equipamentos onerosos de separao de clulas, e utilizar novas configuraes
de biorreatores mais compactos e menos intensivos em energia, tornando o
processo, conseqentemente, mais econmico. Associaes de sistemas
reacionais com separao simultnea de produto(s) podem, tambm, ser
desenvolvidas (imobilizao de enzimas em suportes de colunas cromatogrficas,
sistemas de fermentao acoplados a mdulos de membrana e outros
destilao a vcuo), com os conseqentes benefcios tcnicos e econmicos para
a operao e a viabilidade dos Bioprocessos.

4. Nutrio dos Microrganismos

As necessidades nutricionais dos microrganismos so diversas, uma vez
que estes apresentam diferenas inerentes na sua capacidade de sintetizar os
constituintes celulares a partir de nutrientes simples. A demanda por gua, fontes
de energia, carbono, nitrognio e elementos minerais, assim como o
acesso/utilizao de oxignio, entretanto, comum a todos os microrganismos.

4.1. Fontes de Energia:

De acordo com a forma pela qual os microrganismos assimilam energia,
eles podem ser classificados em:
Fototrficos: possuem pigmentos fotossintticos que permitem a utilizao da
luz como fonte de energia. Ex.: algas e bactrias fotossintetisantes.
Quimiolitotrficos: obtm energia a partir da oxidao de um substrato
inorgnico, geralmente especfico para o microrganismo em particular, como
hidrognio, enxfre, amnia, nitritos e sais ferrosos. Ex.: bactrias dos gneros
Thiobacillus, Nitrosomonas, Nitrobacter, Hydrogenomonas e Desulphovibrio.
Quimiorganotrficos: obtm energia a partir do catabolismo de substratos
orgnicos, acares em particular. A este grupo pertence a grande maioria dos
microrganismos utilizados industrialmente (Madigan et al., 2000).
4.2. Fontes de Carbono:
Uma clula tpica contm cerca de 50% de sua massa seca em carbono.
Este elemento necessrio para a biossntese de diversos constituintes celulares,
como carboidratos, protenas, lipdeos, cidos nuclicos etc. A forma de sua
utilizao est intimamente relacionada quela que cada microrganismo em
particular emprega para seu suprimento de energia. Organismos

22
quimiorganotrficos satisfazem a maior parte de suas necessidades de carbono
pela incorporao de metablitos obtidos pela degradao de substratos
orgnicos, os quais tambm fornecem energia. Os autotrficos, por outro lado,
so capazes de induzir a fotlise da gua, que permite a fixao de dixido de
carbono e sua utilizao como nica fonte de carbono.
Desta forma, o potencial para utilizar fontes de carbono para o metabolismo varia
enormemente entre os microrganismos. Desde os chamados compostos C1 (CO,
CO2, formaldedo, metanol, metilamina), at macromolculas complexas
(glicognio, amido, protenas, celulose, cidos nuclicos), praticamente todos os
compostos orgnicos da natureza podem ser utilizados como fonte de carbono
e/ou energia por microrganismos, desde que estes possuam os sistemas
enzimticos e de transporte adequados a cada fonte. Compostos orgnicos que
contm carbono e nitrognio, tais como aminocidos e protenas, podem servir
tanto como fonte de carbono, como de nitrognio.
As macromolculas so inicialmente convertidas extracelularmente a subunidades
menores, oligmeros ou monmeros, por enzimas despolimerizantes. Caminhos
metablicos perifricos so, ento, utilizados para transformar estes compostos
em metablitos capazes de ser catabolizados por vias metablicas centrais. Os di
e oligossacardeos de baixas massas moleculares (sacarose, maltose e outros),
assim como oligopeptdeos e oligonucleotdeos podem ser hidrolisados
extracelularmente ou primeiramente transportados para o interior da clula e
ento hidrolisados (Krmer & Sprenger, 1993).
Os carboidratos so as principais fontes de carbono e energia para os
microrganismos, sendo a glicose a mais fcil e amplamente utilizada, seguida por
frutose, manose e galactose (Gadd, 1988).

4.3. Fontes de Nitrognio:

O nitrognio um constituinte essencial s clulas, uma vez que
necessrio formao de aminocidos e cidos nuclicos. Seu teor na clula pode
atingir at 15% em massa seca.
Os microrganismos apresentam grande diversidade na assimilao de fontes de
nitrognio. Muitos so autotrficos para nitrognio, sendo capazes de utilizar
nitrato, amnio e, algumas vezes, nitrognio gasoso como nica fonte de
nitrognio. Outros, entretanto, necessitam do suprimento deste elemento sob a
forma de aminocidos ou de bases purnicas e pirimidnicas. Os microrganismos
que requerem aminocidos podem ser nutricionalmente deficientes por
incapacidade de sintetizar ou o grupamento amino ou certos aminocidos
especficos. As necessidades do primeiro grupo podem ser supridas pelo
fornecimento de qualquer aminocido como fonte de nitrognio. Os ltimos,
entretanto, requerem a proviso dos aminocidos especficos (Rhodes & Fletcher,
1963; Madigan et al., 2000).

4.4. Fontes de Minerais:

Os microrganismos necessitam, para suas funes estruturais e
fisiolgicas, de hidrognio, oxignio, fsforo, enxfre, potssio, clcio, magnsio,
sdio, ferro e, em alguns casos, cloro. Em adio, requerem elementos-traos, os
quais desempenham importante papel como constituintes de enzimas e co-
enzimas. Estes ltimos incluem mangans, cobre, zinco, molibdnio, cromo,

23
nquel, cobalto e boro e so, em geral, necessrios em quantidades relativamente
baixas (Rhodes & Fletcher, 1963; Madigan et al., 2000).
Por sua vez, a gua essencial para a ao enzimtica, dissoluo de materiais
orgnicos e inorgnicos e como reagente em muitos processos metablicos.
Seu teor nas clulas situa-se na faixa de 70-90%.
Os nutrientes inorgnicos podem agir de quatro formas no interior da clula:
entrar no metabolismo levando sntese de compostos necessrios ao
funcionamento da clula; estimular o metabolismo como co-fator para reaes
enzimticas; inibir o metabolismo e, finalmente, contribuir para as propriedades
osmticas (Jennings, 1988).

4.5. Fatores de Crescimento:

Muitos microrganismos so incapazes de sintetizar certos aminocidos,
substncias orgnicas simples e complexas ou vitaminas, os quais so
constituintes ou precursores de enzimas e coenzimas. Essas substncias devem
ser supridas ao meio de cultura sempre que necessrio (Rhodes & Fletcher, 1963;
Madigan et al., 2000).

5. Matrias-Primas Glicdicas
A viabilidade tcnica, os balanos mssicos e energticos e a
economicidade so aspectos relevantes que devem ser considerados na escolha
da matria-prima. Em geral, esta deve apresentar as seguintes caractersticas:
composio adequada ao crescimento do agente biolgico e formao do
produto de interesse;
baixo custo de obteno, beneficiamento, transporte e estocagem;
elevada disponibilidade e facilidade de padronizao dos componentes;
no contribuir para dificultar os processos de separao do produto.
Uma grande variedade de matrias-primas, geralmente provenientes da agro-
indstria, utilizada como fonte(s) de substrato/carbono/energia e outros
nutrientes. De uma forma geral, as matrias-primas para Bioprocessos podem
ser agrupadas em funo da estrutura e complexidade molecular dos substratos3.
Em algumas, os substratos encontram-se na forma polimrica, e sua hidrlise
prvia ser necessria, caso o agente biolgico no seja capaz de sintetizar
enzimas que catalisam a despolimerizao desses substratos. Assim, estas
matrias-primas podem conter:
substratos solveis que podem ser facilmente extrados e convertidos
prontamente a produto(s), como por exemplo: sacarose, glicose, frutose e
lactose, de cana de acar, beterraba, melao, soro de leite etc;
polissacardeos insolveis, que precisam de tratamento moderado para
solubilizao e hidrlise, antes da converso a produto(s) como por exemplo:
amido de milho, mandioca, trigo, cevada, batata etc;
polissacardeos insolveis altamente resistentes, que necessitam de pr-
tratamento fsico, seguido de hidrlise qumica ou enzimtica para produzir

3
Substrato o reagente primrio do qual o produto obtido.
24
 substratos na forma monomrica, que sero convertidos a produto(s), como
por exemplo: celulose e hemicelulose de matrias-primas lignocelulsicas.

A figura 5 apresenta a classificao das matrias-primas em funo de seus

respectivos substratos.

AUCARADAS AMILCEAS LIGNOCELULSICAS

LACTOSE SACAROSE AMIDO CELULOSE HEMICELULOSE

GALACTOSE XILOSE
GLICOSE MANOSE
FRUTOSE
GALACTOSE

ARABINOSE

Figura 5: Principais matrias-primas glicdicas e seus substratos correspondentes.

Em determinados Bioprocessos, como a produo de enzimas por fermentao no

estado slido, pode-se prescindir de pr-tratamentos, intensivos em energia e,
consequentemente, onerosos, j que muitos microrganismos tm a habilidade de
atacar o complexo contendo o(s) polissacardeo(s) e outras macromolculas na
sua forma ntegra, como fazem na natureza.
Obviamente que, quando se avalia a utilizao dessas matrias-primas, existem
aspectos particulares que devem ser levados em considerao, por estarem
relacionados viabilidade tcnica, a balanos mssicos e energticos e
economicidade do Bioprocesso em desenvolvimento, como mencionado
anteriomente. H que se ressaltar, que a matria-prima um dos componentes
mais relevantes nos custos de produo, havendo casos em que pode representar
at 75% dos custos totais, sendo esta uma das razes pelo crescente interesse
no aproveitamento de resduos agro-industriais e florestais como matrias-primas
para uma grande variedade de bioconverses (Pereira Jr., 1991).
O perfil das matrias-primas tradicionalmente utilizadas nos processos
microbianos convencionais no sofreu significativas modificaes nos ltimos
cinqenta anos. A tecnologia do DNA recombinante, entretanto, vem
gradativamente aumentando a importncia de fontes de carbono pouco utilizadas
anteriormente. Como exemplo, a crescente utilizao das leveduras metilotrficas
Pichia pastoris e Hansenula polymorpha, para a produo de enzimas
recombinantes preconiza o seu crescimento inicial em fontes de carbono menos

25
repressoras como o glicerol e a induo do gene de interesse com metanol
(Cereghino & Cregg, 2000; Gelissen, 2000).

6. Meios de Cultivo
Os meios de propagao e produo devem conter os nutrientes (fonte
de carbono/energia/substrato, fonte de nitrognio, co-fatores4, precursores5 e
elementos traos) em concentraes tais que resultem em atividade mxima do
agente biolgico, no sendo as condies timas para o crescimento celular,
necessariamente, as mesmas para o processo produtivo.
A escolha dos nutrientes adequados gerao do produto de interesse est
relacionada atividade metablica desenvolvida pelo agente biolgico. Nesse
ponto destaca-se, ento, a importncia das informaes obtidas sobre as
exigncias nutricionais da populao microbiana envolvida no processo. Buscam-
se, ento, as fontes adequadas que possuam os componentes necessrios ao
bom desempenho da clula. Assim, h que se fortificar a matria-prima com
componentes que faltam, retirar aqueles que inibem, de modo a permitir uma
rpida e eficiente converso do substrato em produto com o rendimento
desejado.
evidente que quanto maior o atendimento s exigncias nutricionais, mais apta
estar o clula viva a responder aos estmulos externos. Conseqentemente,
mais eficiente ser a converso do produto de interesse e maior a produtividade.
Satisfazer as exigncias nutricionais das clulas ou compor adequadamente o
meio de cultivo em laboratrio, cujas dimenses dos biorreatores so pequenas,
pode ser fcil, empregando-se nutrientes puros e caros. No entanto, para compor
o meio industrial do Bioprocesso, alguns nutrientes devero ser selecionados de
acordo com suas caractersticas no s nutricionais, mas tambm econmicas,
no podendo ser esquecidas as particularidades inerentes ao agente da
transformao, quanto ao que ser aproveitado para suas reaes metablicas ou
a algum efeito de inibio sobre essas reaes ou mesmo sobre a sntese do
produto final.
A escolha da fonte de carbono muito importante devido ao fato de a sntese de
diversas biomolculas estar sujeita represso catablica6. A glicose, por
exemplo, apesar de ser, em geral, excelente fonte para o crescimento celular,
tem sido reportada como repressora para a sntese de diversas substncias, em
particular na produo de enzimas e antibiticos (Lambert & Meers, 1983).

4
Cofatores: so componentes essenciais, orgnicos ou inorgnicos, necessrios em pequenas
quantidades para a atividade mxima dos sistemas enzimticos. Ex: metais, vitaminas e substncias
qumicas complexas.
5
Precursor: um reagente especfico, cuja adio ao meio resulta na incorporao de um
determinado grupo estrutural molcula do produto. No obtenvel pela reao de fermentao,
tendo que ser fornecido pr-formado. Ex: cido fenil-actico (produo de penicilina) e on cobalto
na produo de cianocobalamina (vitamina B12).
6
Represso catablica: sistema coordenado que determina preferncia por glicose, inibindo a
expresso de perons que codificam enzimas de rotas metablicas alternativas. A represso
catablica resulta da reduo nos nveis de cAMP na clula pela presena de glicose, ocasionando na
inatividade de CAP (catabolic activator protein).

26
Da mesma forma, a fonte de nitrognio deve ser escolhida com bastante critrio.
conhecido que fontes de nitrognio chamadas de preferenciais, ricas ou de fcil
metabolismo, como o on amnio, a glutamina, a asparagina e a mistura de
aminocidos e peptdeos presentes na peptona e outros concentrados proticos
comerciais, so repressoras da produo de diversas enzimas. Ao contrrio,
prolina e uria, ornitina e alantoina, entre outros, denominadas fontes no
preferenciais, pobres ou de assimilao mais lenta, so fontes de nitrognio no
repressoras e, portanto, o seu uso em geral favorece a produo de biomolculas
sensveis represso por nitrognio (Adrio, 2003; Walker, 1998; Magasanik &
Kaiser, 2002).
Entre as fontes de nitrognio inorgnicas, o sulfato de amnio o sal mais
utilizado devido ao seu baixo custo, sendo tambm empregado o nitrato de sdio.
Adicionalmente, existe uma grande disponibilidade de fontes de nitrognio
orgnico de grande aplicao em Bioprocessos industriais, como a uria. As
principais fontes de nitrognio complexas empregadas so: extrato de levedura
(rico em vitaminas do complexo B e aminocidos); licor da macerao do milho
(subproduto da industrializao do milho, fonte bem balanceada em carbono,
nitrognio, enxofre e sais minerais, contendo ainda vitaminas, como riboflavina,
niacina, cido pantotnico, biotina e piridoxina); farinha de soja (resduo da
indstria de produo de leo de soja, rico em nitrognio, o qual , entretanto,
mais complexo e de mais difcil assimilao do que o nitrognio do licor da
macerao do milho) (European Comission, 2002).
O valor do pH do meio de cultura parmetro de fundamental importncia e
tambm deve ser otimizado, de forma a proporcionar um bom crescimento
celular e elevados rendimentos em produto. H que se ressaltar que quando o
agente biolgico for enzimas, ou mesmo quando estas biomolculas so os
produtos do Bioprocesso, a atividade e a estabilidade enzimticas so fortemente
dependentes da fora inica do meio, temperatura, pH e da relao entre a
concentrao de substrato e de enzima. Estas variveis bsicas influenciam o
desempenho cataltico das enzimas por afetarem suas conformaes, estejam
elas livres ou imobilizadas. Estudos devem ser conduzidos previamente a fim de
se eleger as condies timas para a catlise enzimtica.
Os meios de cultivo podem ser complexos ou quimicamente definidos. Os meios
complexos so formulados com base em subprodutos industriais e extratos
naturais, tais como: melao, milhocina, extrato de levedura e outros. Sua
composio complexa e varivel e contm vrias fontes de cada elemento.
Estes meios podem requerer suplementao com compostos que proporcionem
quantidades adicionais de alguns elementos, tais como: N, Mg e P. Os meios
complexos so extensamente utilizados em Microbiologia bsica (taxionomia,
fiosiologia e gentica), Microbiologia de guas e de alimentos e em Fermentaes
industriais. Exemplos de componentes de meios complexos encontram-se na
Tabela 6.
Os meios quimicamente definidos so formulados com compostos puros, tais
como: glicose, sulfato de amnio, fosfato mono ou di cido de potssio etc. Sua
composio qumica conhecida e reproduzvel, contendo fontes de cada
elemento e dos nutrientes essenciais requeridos. Estes meios so usados
preferencialmente em pesquisa e desenvolvimento de Bioprocessos. Uma classe
especial de meio quimicamente definido o meio mnimo, que se pode definir
como aquele formado por uma fonte nica de cada elemento ou componente.
27
Os meios complexos so adequados em nvel industrial por serem mais baratos e
porque, em certos casos, se obtm melhores rendimentos e produtividades
volumtricas. Isto se deve a uma variedade de molculas orgnicas, em sua
constituio, que evitam que a clula necessite sintetiz-las a partir de glicose e
compostos inorgnicos. Por outro lado, os meios quimicamente definidos
permitem um melhor controle das condies ambientais para o crescimento e
para a produo, sendo fcil excluir substncias txicas ou inibidoras e incluir
precursores e/ou indutores nos nveis adequados. Por esta razo, certas
fermentaes que requerem um controle estrito das condies ambientais,
resultam mais produtivas quando se utilizam meios quimicamente definidos. A
Tabela 7 mostra, a ttulo de exemplo, a composio de um meio quimicamente
definido para o cultivo de clulas de Saccharomyces cerevisiae.

Tabela 6: Exemplos de componentes de meios complexos industriais.

Componente Origem
Melao Indstria aucareira
Milhocina Subproduto do processamento de milho
Licor sulftico Efluente da indstria de polpa e papel
Soro/permeado de soro de leite Subproduto do processamento de queijo
Vinhoto Subproduto da produo de etanol
Farinha de soja e pescado Industrializao da soja e pescado
Extrato de levedura Indstria de levedura de panificao

Tabela 7: Meio quimicamente definido para o cultivo de clulas de S. cerevisiae.

Componente Concentrao (g/L)

Glicose 18,0
(NH4)2SO4 3,2
MgSO4.7H2O 0,39
KH2PO4 0,68
NaCl 0,008
FeSO4.7H2O 0,002
CuSO4.5H2O 0,001
ZnSO4.7H2O 0,003
CaCl2 0,028
CoCl2.6 H2O 0,0002

6.1. Otimizao do meio de cultivo

A otimizao da composio do meio de cultivo para obter-se mximo

rendimento em produto no uma tarefa fcil. Tradicionalmente, abordagens
empricas tm sido adotadas, nas quais os efeitos de componentes individuais do
meio sobre o rendimento em biomassa e produto so investigados em frascos
cnicos agitados. As fontes de carbono so examinadas primeiramente e,
posteriormente, as fontes de nitrognio, at que todas as combinaes dos
componentes do meio sejam estudadas, atingindo-se um meio de composio
otimizada. Normalmente, compostos repressores so descartados e aqueles que
estimulam ou induzem a sntese de enzimas so mantidos. Ressalta-se que este
28
procedimento envolve um grande nmero de experimentos e demanda um tempo
muito grande para se chegar a composio otimizada do meio, sendo os
constituintes investigados individualmente e, via de regra, negligenciados os
efeitos interativos entre os mesmos. Um procedimento alternativo pode ser
utilizado na otimizao de meios em Bioprocessos, baseado em mtodos
estatsticos que permitem otimizar as concentraes dos componentes
fundamentais do meio, levando-se em considerao o grau de inter-relao entre
eles (Demain & Solomon, 1986). Aps seleo dos principais componentes do
meio que afetam o rendimento em produto e a produtividade, procede-se a
combinao dos mesmos de acordo com uma metodologia estatstica
(Planejamento Fatorial), que permite o planejamento dos experimentos. Desta
forma, os efeitos de vrios componentes podem ser determinados
simultaneamente, com um nmero relativamente pequeno de experimentos.
O Planejamento Fatorial de experimentos baseia-se no estudo de dois parmetros
do processo. So eles os fatores e os nveis. Fatores so as variveis do
processo, como por exemplo, a temperatura de crescimento de um
microrganismo ou a concentrao de determinado nutriente em um meio de
cultivo. J os nveis so as diferentes condies pesquisadas, geralmente so
utilizados nveis superiores, inferiores e centrais.
Para um melhor entendimento, imaginemos um Planejamento experimental
envolvendo a temperatura de crescimento de determinado microrganismo e a
concentrao de um nutriente em seu meio de cultivo. Podemos estabelecer para
cada fator estudado (temperatura e concentrao) 3 nveis de estudo (Tabela 8):

Tabela 8: Definio de Fatores e Nveis para o Planejamento Experimental.

Nvel
Fator Superior Central Inferior
Temperatura de cultivo 37C 35C 33C
Concentrao de nutriente 5% 3% 1%

A representao de um planejamento fatorial nk, sendo n o nmero de nveis e

k o nmero de fatores. Utilizando os dados da tabela anterior, temos que n = 3 e
k = 2, ento o planejamento fatorial em questo ter um total de 32
experimentos, ou seja, 9 condies experimentais diferentes. Estas condies
experimentais so representadas por uma matriz de planejamento (Tabela 9),
onde cada nvel possui sua representao numrica: o superior representado
pelo valor +1, o central pelo valor 0 e o inferior pelo valor 1.

Veja que todas as condies possveis esto descritas na Tabela 9. Os

experimentos so ento realizados, tendo sido definida previamente a varivel de
resposta, geralmente, no caso de otimizao de Bioprocesso, a concentrao do
produto ou o fator de rendimento ou, ainda, a produtividade volumtrica ou
especfica. Aps a obteno dos resultados de cada um dos experimentos
relacionados, a anlise estatstica destes dados pode ser realizada utilizando um
software apropriado, que fornecer valores crticos dos fatores, bem como a
sua significncia e grau de interao.

29
 Tabela 9: Matriz de Planejamento Experimental.

Temperatura de Concentrao de
Experimento crescimento nutrientes
1 +1 (37C) +1 (5%)
2 +1 (37C) 0 (3%)
3 +1 (37C) -1 (1%)
4 0 (35C) +1 (5%)
5 (C) 0 (35C) 0 (3%)
6 0 (35C) -1 (1%)
7 -1 (33C) +1 (5%)
8 -1 (33C) 0 (3%)
9 -1 (33C) -1 (1%)

Observe que nesta matriz um importante fator foi ignorado: o tempo de cultivo
do microrganismo. Caso utilizssemos tambm este fator, teramos uma nova
matriz com 33 experimentos, compreendendo 27 condies experimentais
diferentes.
importante comentar que rplicas so muito importantes para o Planejamento
experimental, pois permitem que analisemos o erro intrnseco ao Bioprocesso,
chamado de erro experimental. O tipo de rplica mais importante a do ponto
central de experimentos, marcado com (C) na Tabela 9. Anlises estatsticas
demonstram que a utilizao de um nmero superior a 5 rplicas para o ponto
central dispensa duplicatas dos outros pontos experimentais.

6.2. Formulao de meio de cultivo com base na composio

centesimal de microrganismos
Conhecendo-se a composio elementar da clula (Tabela 8), pode-se
determinar a sua frmula mnima e estimar estequiometricamente suas
necessidades nutricionais. Esta composio dependente do meio em que o
microrganismo foi cultivado.
Para que o processo de reproduo celular seja possvel, os requerimentos em
matria, energia e informao devero ser atendidos, respeitando-se os
princpios de conservao de massa e energia, de forma a possibilitar a
construo de uma nova clula igual a anterior (Figura 6).

matria
CLULA

energia CLULA

produto

informao

Figura 6: Requerimentos para o crescimento/multiplicao celular.

30
A informao para a construo de uma nova clula est contida no material
gentico do microrganismo e transmitida de gerao a gerao. A matria deve
ser fornecida atravs de componentes do meio de cultivo e a energia obtida do
catabolismo da fonte de carbono e energia, de reaes de oxidao ou de
radiao solar no caso de microrganismos fotossintticos.
As clulas so representadas com base em sua composio elementar.
Composies tpicas de bactrias, leveduras e fungos filamentosos esto
apresentadas na tabela a seguir. Os elementos quantitativamente mais
importantes so: carbono, hidrognio, oxignio e nitrognio (90-92% do total da
massa celular), o que justifica a aproximao feita na equao estequiomtrica,
descrita a seguir. De grande importncia encontra-se um segundo grupo de
elementos, compostos por: Mg, P, S, Ca, Na e K, que devem ser fornecidos como
compostos aptos metabolizao pela clula. A fonte de carbono e energia pode
ser um carboidrato ou outro composto orgnico, ou mesmo CO2, carbonato ou
bicarbonato no caso de clulas quimioautotrficas e fotossintticas. A fonte de
nitrognio pode ser amnio, aminocidos, protenas, uria, nitrato ou nitrognio
molecular, sendo as duas primeiras as mais comuns. O restante dos elementos
suprido atravs de sais inorgnicos. Devido a deficincias genticas, certas
linhagens requerem fatores de crescimento, tais como vitaminas, aminocidos e
nucleotdeos, como mencionado anteriormente.

Tabela 10: Composio centesimal de clulas microbianas.

Fonte: Bailey & Ollis (1986).

ELEMENTOS BACTRIA LEVEDURA BOLORES

Carbono 46-52 46-52 45-55
Hidrognio 8-12 8-12 8-12
Oxignio 18-24 18-24 18-24
Nitrognio 10-14 5-9 3-7
Magnsio 0,1-0,5 0,1-0,5 0,1-0,3
Fsforo 2,0-3,0 0,8-2,5 0,4-4,5
Enxofre 0,1-1,0 0,01-0,25 0,1-0,5
Clcio 0,01-1,0 0,1-0,3 0,1-1,4
Potssio 1,0-4,5 1,0-4,0 0,2-2,5
Ferro 0,02-0,2 0,01-0,5 0,1-0,2
Outros <0,01 <0,01 <0,01
COMPOSTOS
Protenas 50-60 35-45 25-40
Carboidratos 6-15 30-45 40-55
Lipdios 5-10 5-10 5-10
c. Nuclicos 15-25 5-15 2-10
Cinzas 4-10 4-10 4-10

possvel representar o crescimento microbiano mediante uma equao qumica

que seja regida pelos princpios da estequiometria e da cintica. Note que as
estruturas moleculares do substrato, fonte de nitrognio e do produto so
conhecidas e sabendo-se que, de uma forma geral, em aerobiose 50-60% do
carbono contido no substrato incorporam-se plasticidade celular e em

31
anaerobiose apenas 10-20%, pode-se estimar a concentrao dos nutrientes que
iro compor o meio de cultivo.

CHlOm + NH3 + O2 CHaObNc + CHpOqNr + H2 O + CO2

SUBSTRATO FONTE DE CLULAS PRODUTO

NITROGNIO ou (CHO)

7. Esterilizao de Meios e Equipamentos

H Bioprocessos bastante exigentes quanto esterilidade dos meios de

cultivo, havendo, tambm, grande rigor assptico no s no transporte do meio
esterilizado ao biorreator, bem como no prprio sistema reacional. Pode-se citar
como exemplos de processos que demandam esterilizao: a produo de
antibiticos, vacinas, vitaminas e enzimas. Por outro lado, outros requerem
apenas uma esterilizao incipiente (pasteurizao), tendo em vista que o prprio
produto age como uma barreira contaminao, devido ao seu carter txico
aos microrganismos contaminantes. A bioproduo de combustveis, solventes e
cidos orgnicos insere-se neste ltimo caso. H, tambm, Bioprocessos em que
se prescinde totalmente de assepsia, como o caso dos biotratamentos, nos
quais a microbiota nativa ou exgena, atuando de forma consorciada,
extremamente desejvel para se reduzir da carga orgnica poluidora.
O processo de esterilizao geralmente levado a cabo por agentes fsicos. Os
mais empregados so o calor (seco e mido), a filtrao atravs de membranas
microporosas e as radiaes (especialmente a ultra violeta). O calor seco
empregado na esterilizao de instrumental e vidraria e o calor mido, presso
atmosfrica ou saturado sob presso, aplicado esterilizao de equipamentos
e, principalmente, de meios de cultivo. Esta ltima, a forma mais usual, pode ser
realizada em conjunto ou separadamente do biorreator e, ainda, em batelada ou
continuamente.
Na prtica industrial verifica-se o emprego da esterilizao de meios de cultivo
em batelada e em conjunto com o biorreator, fazendo-se passar vapor saturado
sob presso atravs de serpentinas ou jaquetas (aquecimento indireto), ou pela
injeo de vapor saturado diretamente no meio contaminado (aquecimento
direto). Neste ltimo caso, h que se levar em considerao a diluio do meio de
cultivo causada pela condensao do vapor ao entrar em contato com o meio
contaminado.
Na esterilizao em batelada, o tempo total de esterilizao relativamente
grande, podendo dar origem a decomposio de nutrientes termo-sensveis,
como as vitaminas, ou provocar reaes indesejveis entre os constituintes do
meio, como por exemplo, reaes entre amino-cidos e acares (reao de
Maillard) ou de caramelizao (decomposio dos acares). Neste sentido, esta
modalidade de esterilizao vem sendo substituda, sempre que possvel, pela
esterilizao contnua, na qual se preserva mais a integridade dos constituintes
do meio, j que o aquecimento e o resfriamento so praticamente instantneos,
32
no havendo variao de temperatura na seo de espera, que retm o meio de
cultivo a ser esterilizado em temperaturas elevadas, por curto tempo de
exposio (Figura 8). Obviamente, a esterilizao contnua essencial para
sistemas contnuos de fermentao.

Aquecimento com Aquecimento Aquecimento com Resfriamento

vapor direto eltrico vapor indireto indireto

Figura 7: Tipos de transferncia de calor na esterilizao de meios e

equipamentos.

Figura 8: Esterilizao em Batelada ( esquerda) versus Contnua ( direita).

Ti: temperatura inicial; Tf: temperatura de fermentao; Tm: temperatura mnima letal; Te:
temperatura de esterilizao; : tempo de esterilizao; I: seo de aquecimento; II: seo de
esterilizao propriamente dita; III: seo de resfriamento.

O meio preparado e esterilizado deve, ento, sofrer a ao dos agentes

biolgicos, seja pela inoculao de uma suspenso suficientemente concentrada
de clulas ativadas e propagadas ou recicladas ao processo, seja pela adio de
unidades de atividades enzimticas suficientes para catalisar a transformao do
substrato em produto, com altas converses e taxas de produo.

33
8. Biorreator

A mistura reacional, constituda de meio (de cultivo ou para converso

enzimtica) e agente biolgico, ser ento processada em biorreatores7, onde
devero ser mantidas as condies timas para o agente biolgico expressar o
mximo de sua atividade cataltica, seja atravs do metabolismo da clula ou de
simples reao enzimtica. Quando se tratar de um processo puramente
enzimtico, o meio reacional adicionado de unidades de atividade enzimtica e
a catlise realizada tambm em biorreatores para mximo de converso e
produtividade.
No biorreator, vrios fenmenos qumicos, fsicos e, naturalmente, biolgicos
ocorrem. Por essa razo, o desenvolvimento de Bioprocessos constitui-se em
uma das mais complexas e fascinantes reas de atuao da Engenharia
Bioqumica. Por exemplo, no projeto de um biorreator, devem ser levados em
considerao os seguintes aspectos: a cintica do Bioprocesso, o clculo das
tubulaes e equipamentos necessrios para manuteno de esterilidade, as
caractersticas hidrodinmicas do meio reacional, a transferncia de massa de
nutrientes na clula, a transferncia de massa de oxignio da fase gasosa para o
seio do lquido e, posteriormente, para as clulas (em processos aerados), a
transferncia de massa de produtos e subprodutos das vizinhanas das clulas
para o seio do meio de cultivo, a transferncia de calor metablico e o controle
da fisiologia microbiana.
Pode-se encontrar uma grande variedade de configuraes de biorreatores.
Dentre elas, os biorreatores agitados mecanicamente (STB-stirred tank
bioreactor) so, sem dvida, os mais estudados e utilizados industrialmente
(Figura 9). Embora no necessariamente ideais, os tanques agitados apresentam
versatilidade e fornecem bons resultados para uma grande gama de
Bioprocessos. Isto particularmente importante para as companhias
farmacuticas, pois diferentes substncias podem ser produzidas no mesmo
biorreator durante o seu tempo de vida. Adicionalmente, os investimentos em
capital para a construo destes equipamentos so normalmente recuperados na
comercializao do primeiro produto.
Apesar de sua flexibilidade, pois podem ser empregados para uma grande gama
de bioconverses, os biorreatores do tipo STB apresentam certas desvantagens,
como por exemplo: demandam grande aporte de energia para a agitao
mecnica, tendem a afetar a morfologia celular, so de difcil escalonamento e
tm de ser cuidadosamente projetados para produzir adequada mistura e
aerao.
Nos biorreatores agitados pneumaticamente (Figura 10), a potncia
necessria para se atingir o grau de mistura desejvel no sistema reacional, a fim
de se produzirem altas taxas de transferncia de massa e calor, suprida pela
energia cintica do lquido, atravs de sua circulao pelo movimento das bolhas
gasosas, isto , pneumaticamente. Este tipo de biorreator, conhecido na
literatura inglesa como airlifit (com circulao interna ou externa) ou coluna de
bolhas (bubble column), aplicado a sistemas biolgicos suscetveis s foras
cisalhantes, to intensas em biorreatores agitados mecanicamente. Alm da sua
elevada relao altura:dimetro (6:1 H/DT 20:1), quando comparado com os

7
Biorreator: tanque/recipiente no qual clulas ou enzimas realizam uma reao biolgica.
34
biorreatores do tipo STB (at 4:1), os biorreatores agitados pneumaticamente
possibilitam a operao contnua de bioprocessos com altas densidades celulares
(clulas imobilizadas ou floculantes), resultando em altos valores de
produtividade volumtrica. H registros na literatura de processos que tiveram
seus tempos de converso de substrato em produto reduzidos de dias para horas,
pelo emprego deste tipo de biorreator. As altas relaes H/DT so necessrias a
fim de se alcanarem elevadas retenes das bolhas gasosas no seio do lquido e
de gerar altas presses hidrostticas na regio prxima distribuio do ar (na
base do biorreator), que induziro o movimento do lquido.

Figura 9: Biorreator agitado mecanicamente.

O biorreator airlift difere da coluna de bolhas pela presena de um dispositivo,
colocado interna ou externamente, denominado draft tube. As funes deste
dispositivo incluem: o aumento do grau de mistura, imprimindo,
fundamentalmente, escoamento axial, a reduo da coalescncia das bolhas e a
equalizao das foras cisalhantes ao longo do biorreator. Tanto o biorreator
airlift quanto o de coluna de bolhas so comumente utilizados em culturas de
microrganismos sensveis ao cisalhamento decorrente da movimentao do
lquido.

Figura 10: Biorreatores com escoamento pneumtico.

35
Biorreatores a membrana (hollow-fiber e flat-sheet) vm, tambm, sendo
utilizados com sucesso, em determinados Bioprocessos. Sua principal vantagem
est na possibilidade de confinar clulas ou enzimas dentro do biorreator,
separando-as da corrente de sada do sistema quando se opera continuamente, e
tornando esta etapa desnecessria durante o processo de downstream. Embora,
esta vantagem possa ser tambm conseguida com outras tcnicas de
imobilizao, o confinamento de clulas em biorreatores a membrana
microporosa , talvez, a maneira mais incua de imobilizao de clulas e
enzimas, pois no so utilizados agentes qumicos nem condies drsticas de
aprisionamento. O uso de biorreatores de membrana particularmente atraente
em sistemas bifsicos, pois muitas dificuldades associadas com emulsificao e
separao de fases podem ser evitadas.

Biorreatores com clulas/enzimas imobilizadas: Nas ltimas duas dcadas

houve grandes e rpidos desenvolvimentos no uso de enzimas e clulas para
propsitos industriais, analticos e mdicos. A fim de tornar seu uso mais
conveniente, estes agentes biolgicos tm sido imobilizados, assemelhando-se
aos catalisadores de fase slida da qumica convencional. Clulas (vivas ou
mortas) e enzimas podem ser imobilizadas por vrios mtodos. Em princpio,
estes mtodos so classificados em duas categorias: imobilizao ativa ou
passiva. A imobilizao ativa requer o uso de agentes qumicos, que ativaro a
superfcie do suporte ou possibilitaro a criao de uma matriz porosa, na qual o
agente biolgico fique aprisionado, enquanto que a imobilizao passiva ocorre
quando filmes biolgicos aderem naturalmente na superfcie ou no interior de um
suporte inerte ou, ainda, quando flocos de clulas so formados. A Figura 11
ilustra os mtodos de imobilizao de agentes biolgicos.

Mtodos de Imobilizao

Imobilizao ativa Imobilizao passiva

Ligao cruzada Ligao covalente Adsoro Colonizao

Envolvimento Floculao

Figura 11: Mtodos de imobilizao de agentes biolgicos.

No mtodo do envolvimento h o confinamento fsico do material biolgico em

uma matriz polimrica formadora de gel. O mtodo apresenta como vantagens, a
baixa toxidez e a alta capacidade de reteno de clulas. Os materiais mais
utilizados so os polmeros naturais como: agar; K-carragenina; alginato e

36
pectina ou polmero sinttico como a poliacrilamida. Neste ltimo caso h
necessidade de agente funcional para formao de ligaes cruzadas, o que pode
conferir certa toxicidade s clulas.
Na tcnica da ligao covalente, os suportes so especialmente funcionalizados
para conter um grupamento qumico que ser responsvel pela imobilizao do
material biolgico ao suporte. Dentre os materiais suportes, as esferas de vidro
(dimetro variando de 100 a 500 m) tratadas com -aminopropil-trietoxisilano
so bastante empregadas. Posteriormente, o grupamento amina resultante reage
com glutaraldedo (agente bifuncional), de forma a se produzir uma estrutura
especial que possui um grupamento carbonila (-HC=O) altamente reativo. A
interao da clula/enzima com o suporte se d pela ligao da carbonila do
suporte funcionalizado com os grupamentos aminas das enzimas ou das protenas
da parede celular. Sua limitao est associada a potencial toxicidade do sistema,
conferida pela presena do glutaraldedo (Pradella, 2001).

A adsoro um mtodo no qual o material biolgico adere a suportes que no

foram funcionalizados. As foras de interao envolvem: interaes eletrostticas
entre cargas opostas das estruturas proticas e da superfcie do suporte; ligaes
inicas entre grupos aminos e carboxlicos e ligaes covalentes parciais entre
grupos aminos da parede celular e grupo hidroxila da superfcie do suporte. Sua
limitao refere-se influncia acentuada das condies ambientais na
capacidade de reteno das clulas (concentrao inica; pH e fluxo do material
lquido) ao suporte (Ansejo & Merchuk, 1995).

A floculao um fenmeno no qual clulas isoladas, suspensas em um lquido,

agregam-se para formar flocos (auto-imobilizao), resultando em rpida
sedimentao ou flotao. Os fatores envolvidos na formao de flocos so de
natureza gentica, ambiental, fisiolgica e estrutural. As foras de interao
associadas floculao envolvem: ligao protena-carboidrato (leveduras) e
formao de polissacardeos (biofilmes) em clulas bacterianas (Pereira Jr. &
BuLock, 1993 e 1994).
Vrias vantagens associadas imobilizao de clulas/enzimas podem ser
apontadas:
Possibilidade de aplicao em reaes enzimticas de mltiplas etapas;
Rendimentos e produtividades elevados;
Estabilidade operacional geralmente alta;
Operaes de extrao e/ou purificao de enzimas so desnecessrias;
Altas densidades celulares podem ser empregadas;
Densidades celulares e atividades enzimticas podem ser mantidas por
longos perodos de operao;
Produtos podem ser facilmente separados da biopartcula cataltica;
Menor suscetibilidade a contaminaes microbianas.
Por outro lado as seguintes desvantagens potenciais so apresentadas:
Reaes indesejveis podem ocorrer pela presena de vrias enzimas
cataliticamente ativas;
Desprendimento de clulas e enzimas do suporte;
Problemas ligados transferncia de massa intra-particular.

Os tipos de biorreatores para clulas/enzimas imobilizadas mais

37
comumente utilizados em so: CSTB, leito fixo e leito fluidizado, sendo os dois
ltimos mais indicados por minimizarem a exposio da biopartcula (agente
biolgico imobilizado) a elevados graus de cisalhamento e colises (Figura 12).
Para se aplicar esta tcnica em processos industriais, estudos devem ser
realizados para elucidar algumas caractersticas dos sistemas imobilizados,
principalmente no tocante fisiologia celular ou conformao da enzima
imobilizada e aos problemas de transferncia de massa intra-particular e no
prprio biorreator. No entanto, esses sistemas vm sendo utilizados
industrialmente, em pases avanados, com sucesso na produo de etanol
(combustvel e champanhe), acrilamida, alanina e dos cidos orgnicos:
asprtico, mlico e fumrico.

(A) (B)

Figura 12: Biorreatores com clulas/enzimas imobilizadas. (A) leito fixo;

(B) leito fluidizado.

Configuraes de biorreatores tm sido tambm propostas para o cultivo de

clulas animais (livres ou imobilizadas/ancoradas). Estes sistemas requerem
cuidadosa anlise para a seleo/projeto de biorreatores, tendo em vista a
ausncia de parede celular nestas clulas, o que as torna muito mais suscetveis
a foras cisalhantes do que outros organismos e, por conseguinte, rompem-se
com mais facilidade. Este problema agravado pelo tamanho relativamente
grande dessas clulas e pela falta de mobilidade individual. Clulas animais
ancoradas em microcarreadores no sofrem movimentos de rotao nem
translao, consequentemente, no podem reduzir (amortizar) o impacto das
foras decorrentes de sua exposio s foras mecnicas transferidas ao fluido. O
cultivo de clulas animais em biorreator tem sido considerado um dos grandes
desafios da Biotecnologia moderna (Ansejo & MerchuK, 1995).
Da mesma forma, o cultivo de clulas vegetais em biorreator tambm um dos
assuntos em voga na Biotecnologia moderna. O interesse comercial nestes
cultivos est relacionado com a produo de metablitos secundrios de alto
valor agregado, com aplicao na agricultura (inseticidas) e, em especial, nas
reas farmacutica e mdica, como por exemplo: analgsicos, anestsicos e
outros frmacos utilizados no combate a desordens circulatrias e cardacas,
malria, leucemia e etc. A opo pelo cultivo em biorreator deve-se a maior
38
facilidade no controle da fisiologia dessas clulas, o que permite maximizar
rendimentos e produtividades. Os avanos da Biologia Molecular, Engenharia
Metablica e da Engenharia Bioqumica indicam que o sucesso comercial de tais
bioprocessos no est distante de realizao. Este um outro campo para
grandes desenvolvimentos, assim como o desenvolvimento de foto-biorreatores
(Ansejo & MerchuK, 1995).
Qualquer que seja a configurao escolhida, para processos conduzidos com rigor
estril, a construo do biorreator deve atender aos seguintes requerimentos:

passvel de ser esterilizado quando culturas puras so empregadas;

deve ser de simples geometria e construo;
deve conter um nmero mnimo de flanges e soldas;
no deve conter zonas mortas;
material deve possuir rugosidade superficial mnima;
suportar carregamento (espessura de chapa compatvel com o volume a ser
processado);
deve ter capacidade de suportar altas presses, particularmente em
bioprocessos nos quais esterilizao requerida;
deve apresentar timas condies de mistura (baixo e uniforme
cisalhamento) e permitir uniforme suspenso de slidos;
deve possuir condies de fluxo claramente definidas, com alimentao de
substrato compatvel com as taxas de metabolizao;
deve possibilitar adequado transporte de massa, particularmente em relao
transferncia de oxignio, em processos aerados;
adequada instrumentao para o monitoramento e controle (on line ou off
line) das variveis de processo;
deve prever o controle de espuma;
flexibilidade, podendo ser empregado em outros bioprocessos;
estabilidade a longo termo;
compatibilidade com as etapas de montante (upstream) e jusante
(downstream);
Fcil escalonamento.

Um dos grandes problemas existentes na operao de biorreatores decorre da

dificuldade de medies de variveis de processo a serem controladas. No caso
de variveis fsicas, como temperatura, vazo, velocidade de agitao e taxa de
aerao, ou fsico-qumicas, como pH, potencial redox, presso parcial de
oxignio e a composio dos gases de sada, estas so usualmente empregadas
como avaliaes diretas, podendo ser medidas on line, atravs da utilizao de
sistemas de controle e outros equipamentos comerciais. Por outro lado, o
controle de variveis qumicas ou bioqumicas de difcil realizao e pesquisas
vm sendo conduzidas no sentido de desenvolver instrumentos sensveis para o
monitoramento destas variveis, capazes de relacionar variaes de espcies
qumicas com sinais eltricos ou espectrofotomtricos, utilizando como elemento
sensor um agente biolgico (biossensores).
Biorreatores so peas-chaves no desenvolvimento de Bioprocessos. No se
pode discutir o desenvolvimento/otimizao de bioprocessos sem prestar ateno
especial nas caractersticas e fenomenologias que ocorrem nestes equipamentos.

39
9. Modos de Operao de Bioprocessos

9.1. Quanto conduo

A forma mais utilizada de conduo de Bioprocessos a batelada

simples, na qual ao meio de cultivo adicionada uma suspenso celular e o
processo transcorrido, sem adies de meio novo, nem retiradas de meio
reacional durante o seu curso. A batelada simples caracterizada pela alterao
nas condies ambientais a todo instante do Bioprocesso (as concentraes de
nutrientes so reduzidas e de clulas, produtos e sub-produtos aumentadas). O
principal problema desta forma de operar Bioprocessos decorrente de
fenmenos de inibio pelo substrato, produto e outros metablitos. Por exemplo,
elevadas concentraes de substrato so inibitrias ao agente biolgico. Este
efeito est relacionado, em clulas vivas, a fenmenos osmticos que resultam
em plasmlise celular. As possveis razes para o fenmeno so: represso na
sntese de enzimas, desidratao dos sistemas enzimticos, devido perda de
gua da clula e/ou inibio do transporte de nutrientes para o seu interior. ,
tambm, fato bem conhecido que a clula viva polui seu ambiente com produtos
do seu metabolismo at cessar o crescimento e, eventualmente, perder sua
viabilidade, fenmeno este conhecido como inibio pelo produto. Ressalta-se
que esses fenmenos so dependentes da linhagem e das condies de cultivo.
Para se contornar esses problemas de inibio/represso, outras formas de
conduo podem ser utilizadas, como a batelada alimentada e suas variantes,
que possibilitam a manuteno da concentrao desses inibidores/repressores em
nveis sub-inibitrios/sub-repressores, com implicaes diretas no desempenho
da clula. A tcnica de batelada alimentada definida como um modo de
operao na qual um ou mais nutrientes necessrios ao crescimento celular so
adicionados ao biorreator, intermitentemente ou continuamente, sem que ocorra
retirada de material durante a operao. A flexibilidade de operao oferecida por
esta forma de conduo adequada a Bioprocessos em que o crescimento celular
e/ou formao de produtos so significativamente sensveis concentrao do
substrato limitante. Tcnicas de fermentao em batelada alimentada so
adotadas produo de vrias enzimas e antibiticos, uma vez que a formao
destas biomolculas muitas vezes sujeita represso pelo substrato.
A conduo contnua outra modalidade de se operar biorreatores. Como o
prprio nome sugere tanto a alimentao de meio nutriente, quanto a retirada de
produto (meio fermentado) so realizadas de forma contnua. Sua principal
vantagem, quando comparada com outras formas de conduo, est ligada
possibilidade de se operar o sistema por extensos perodos de tempo, resultando
em aumento de produtividade. Adicionalmente, o agente biolgico converte
substrato em condies estacionrias, que podem ser determinadas previamente
para o seu melhor desempenho, em contraste com a batelada simples, na qual o
agente biolgico est submetido, a todo o momento, a condies ambientais
diferentes. Os processos contnuos podem ser conduzidos com um nico
biorreator (com e sem reciclo de clulas) e com biorreatores em srie. As
seguintes vantagens da conduo contnua podem ser apontadas: inexistncia de
tempos improdutivos, levando o biorreator a permanecer muito mais tempo em
servio; as operaes que antecedem e sucedem o processo podem ser
realizadas continuamente; possibilidade de instrumentao e controle

40
automtico, levando a menores gastos com mo de obra; maior uniformidade do
produto; e as condies ambientais so constantes, o que possibilita o estudo das
vrias influncias sobre o agente do bioprocesso. No entanto, riscos de
contaminao e problemas ligados degenerescncia do agente (mutao e
variao) so citados como desvantagens da conduo contnua.
Ressalta-se que esta forma de conduo do processo particularmente adequada
para a escolha das fontes de carbono e nitrognio e tambm de outros
nutrientes. Sumariamente, se uma cultura contnua em estado permanente
submetida a pulsos contendo componentes individuais e se a concentrao
celular ou do produto de interesse mostrar um aumento transiente, ento aquele
componente particular limitante para o crescimento ou para a produo e sua
concentrao no meio dever ser aumentada para maximizar os rendimentos.
Indutores e repressores podem ser identificados a partir do aumento ou da
diminuio transiente do rendimento, em funo da adio de tais molculas.
Portanto, os componentes-chaves de um meio podem ser rapidamente
identificados sem a necessidade de um grande nmero de experimentos em
frascos agitados, como mencionado anteriormente.
A eleio da forma de conduo ser funo da cintica do Bioprocesso, tendo-se
que avaliar o momento em que a sntese do produto se inicia. Desta forma, em
que pesem as complexidades dos bioprocessos, estes podem apresentar a sntese
do produto de forma associada, semi-associada e no associada ao crescimento
microbiano. Pelo estudo cintico, pode-se orientar no projeto do processo que
melhor convm ao bioprocesso. Assim que, os produtos que se formam
associadamente ao crescimento podem ter ser processos conduzidos
continuamente. J no caso de produtos que tm a sua sntese de forma no
associada ao crescimento, a distino de duas fases orienta no sentido de
realizar-se a produo do agente separadamente, tendo at um meio de
composio diferente ao de produo. O processo dever, portanto, ser operado
em duas fases e, desta forma, passvel de ser conduzido continuamente.
Concluses anlogas anterior, aplicam-se aos processos que apresentam
cintica mista (semi-associada).
A seguir, esto ilustradas as diferentes formas de conduo de bioprocessos para
uma melhor compreenso dos possveis arranjos produtivos (Figuras 13 a 20).
Obviamente, que a escolha de um desses arranjos est ligada, como mencionado
anteriormente, cintica do processo, mas tambm aos aspectos tcnicos e
econmicos do bioprocesso em desenvolvimento. Por exemplo, a reutilizao de
clulas traz benefcios econmicos, no que concerne a utilizao mais efetiva do
substrato para a sntese do produto propriamente dita, minimizando o consumo
deste reagente primrio para a plasticidade celular. Da mesma forma, o reciclo
de clulas na conduo contnua permite que se trabalhe com os biorreatores
com altas densidades celulares, resultando em aumentos na produtividade
volumtrica e especfica do bioprocesso. Estas estratgias so particularmente
interessantes no caso do produto ser uma substncia de baixo valor agregado.
Por outro lado, substncias de alto valor agregado (como antibiticos, vitaminas
e protenas teraputicas) que, via de regra, apresentam cinticas de produo
mais lentas, devem ter seus processos de produo atendendo aos mais altos
padres de qualidade. Neste sentido, alto rigor estril requerido e a adoo da
reutilizao de clulas no se mostra como uma alternativa interessante para a
conduo desses bioprocessos, pelos riscos inerentes de contaminao.
41
 B1
Inculo
recentemente
preparado
Meio fermentado encaminhado
Seo de separao de clulas e
B2 recuperao de produto

Inculo
recentemente
preparado
Meio fermentado encaminhado
Seo de separao de clulas e
recuperao de produto

......
Figura 13: Batelada com um inculo para cada biorreator .

B1 Seo de
Meio fermentado
Inculo recuperao
sem clulas
recentemente de produto
Separao
preparado
de clulas
Suspenso concentrada
de clulas
Tratamento
das clulas
seguido de
B2 inoculao
Meio fermentado
Seo de
recuperao
sem clulas de produto
Separao
de clulas
Suspenso concentrada
de clulas

......
Figura 14: Batelada com recuperao do inculo.
.

Inculo recentemente
preparado

B1i B1f B2i B2f B3i B3f

MN MT

Figura 15: Batelada seqencial ou repetida.

BNi: incio da batelada: BNf: final da batelada. MN: meio novo; MT: meio transformado.
42
 Com alimentao
Estendida
intermintente

F=cte
F=F(f linear)
F=F(f exponencial)

Vf

Vi
Figura 16: Batelada alimentada com diferentes formas de alimentao.
Vi: volume inicial; Vf: volume final.

F (L/h) F (L/h)
So S1
Xo=0 X1
Po=0 P1

Figura 17: Processo Contnuo com um nico biorreator.

F: vazo de alimentao e de meio transformado; S: concentrao de substrato; X: concentrao de
clulas; P: concentrao de produto (o ndice o refere-se condio inicial e o ndice 1 s
concentraes na corrente que sai do biorreator).

F (L/h) F (L/h)
So S1
Xo=0 X2
Po=0 F+F (L/h) P1
S1; X1; P1

F
CfX1

Figura 18: Processo Contnuo com um nico biorreator e com reciclo de clulas.
F: vazo de alimentao e de meio transformado; S: concentrao de substrato; X: concentrao de
clulas e P: concentrao de produto (o ndice o refere-se condio inicial; o ndice 1 s
concentraes na corrente que sai do biorreator e o ndice 2 s concentraes que saem do
separador). : razo de reciclo e Cf: fator de concentrao de clulas. Note que no separador as
concentraes de substrato e produto so as mesmas que saem do biorreator, admitindo-se que no
haja transformao na seo de separao de clulas.
43
 F0 (L/h)
Fn=F0
S0
X0=0
P0=0
S1 S2 S3 Sn
X1 X2 X3 Xn
P1 P2 P3
...... Pn

Figura 19: Processo Contnuo com biorreatores em srie

sem alimentao adicional.
Os ndices de S; X e P referem-se aos valores correspondentes ordem do biorreator da srie.

F02 F03 F0n

S02 S03 S0n

F01 (L/h) F01+ F02 F01+F02+...+ F0n-2+F0n-1 Fn

S01
X0=0
P0=0
S1 S2 S3 Sn
X1 X2 X3 Xn
P1 P2 P3
...... Pn

Figura 20: Processo Contnuo com biorreatores em srie

com alimentao adicional.
Os ndices de F0; S; X e P referem-se aos valores correspondentes ordem do biorreator da srie.

9.2. Quanto ao desenvolvimento do agente microbiano

Bioprocessos podem ainda ser operados em superfcie, em profundidade

(submerso) e por fermentao no estado slido. Os processos em superfcie
so aqueles em que a biomassa (massa de clulas) situa-se na superfcie do meio
lquido, em contato direto com o ar atmosfrico, que fornece o oxignio
necessrio populao celular. O meio de cultivo colocado em recipientes
rasos, de modo a oferecer grande rea ao desenvolvimento do agente. A
diminuio da concentrao de nutrientes nas camadas superficiais faz com que
cheguem superfcie, por difuso, os nutrientes existentes nas camadas mais
profundas. Tambm, por difuso, o(s) produto(s) do metabolismo se dispersa(m)
no meio em fermentao. Pelo exposto, a difuso e a relao entre a rea
oferecida e o volume de meio desempenham papel importante no estudo de
bioprocessos operados em superfcie. Este tipo de Bioprocesso limita-se, via de
regra, aos fungos filamentosos, que tendem formar pelcula micelial na superfcie
do meio. No entanto, registra-se a produo clssica de vinagre pelo processo
Orleanense, que realizada por determinadas espcies de bactrias aerbicas do
44
gnero Acetobacter. Pelo fato de as taxas de transferncia de massa de
nutrientes serem reduzidas, os tempos de fermentao so consideravelmente
longos. Adicionalmente, os processos em superfcie so de difcil operacionalidade
e considerados anti-econmicos, pois resultam em alto custo de produo devido
custosa manipulao com esterilizao (incluindo ambiente), enchimento,
esvaziamento e limpeza das vrias bandejas necessrias produo em larga
escala.
Os processos submersos so aqueles em que a clula produtora se desenvolve
no seio do meio de cultivo, geralmente agitado e, no caso de fermentaes
aerbicas, o oxignio necessrio populao em desenvolvimento suprido,
atravs de um compressor, por borbulhamento de ar no lquido. Comparados com
os processos em superfcie, os processos submersos oferecem uma srie de
vantagens, como por exemplo: podem-se manipular, com maior facilidade,
maiores volumes de meio, facilitando a sua operacionalidade; a massa de clulas
responsveis pela transformao fica totalmente submersa no meio nutriente
uniforme, que pode ser ajustado para fornecer as condies ideais de
crescimento e produo. Absoro de nutrientes e excreo de metablitos so
realizadas com maior eficincia, levando a menores tempos de processo e,
consequentemente, ganhando-se em produtividade. Atualmente, a maioria das
fermentaes industriais importantes realizada por processo submerso. Pode-se
citar que uma determinante na reduo no preo de muitos produtos,
anteriormente obtidos por processos em superfcie, foi a possibilidade de adapt-
los aos processos submersos. O exemplo clssico , novamente, a produo de
penicilina que teve seu processo de produo modificado nos idos de 40. O
desenvolvimento da tecnologia de fermentao submersa para a produo de
antibiticos foi logo adotado pela indstria de enzimas e, hoje, a maioria delas
produzida por este processo.
A fermentao no estado slido definida como um processo no qual o
crescimento microbiano e a formao de produto ocorrem na superfcie de
substratos slidos e na ausncia de gua livre, diferentemente da fermentao
submersa e em superfcie, em que, via de regra, o(s) substrato(s) e outros
nutrientes encontram-se na sua forma solvel. Substratos tradicionalmente
utilizados constituem-se em produtos agrcolas como o arroz, o trigo, o paino, a
cevada, o milho e a soja, alm de substratos no convencionais como os resduos
agro-industriais e florestais, destacando-se: o bagao de cana-de-acar, o
sabugo de milho, o farelo de trigo e a palha de arroz. Estes resduos tm
despertado grande interesse da comunidade cientfica e industrial, pela
possibilidade de seu uso como matrias-primas para bioconverses, o que
corroborado pelo nmero crescente de publicaes neste tema. O grande
interesse decorre do fato dessas matrias-primas no possurem custos de
produo associados diretamente, sendo uma forma de se agregar valor a
resduos que se formam em abundncia nos setores agrcolas e agro-industriais.
Adicionalmente, d-se soluo para o acmulo dessas biomassas residuais, que
representam um srio problema ambiental para as indstrias. Em resumo, a
operao da fermentao no estado slido pode ser realizada sem agitao
mecnica, com agitao ocasional ou contnua, ou em colunas recheadas com
circulao de lquido (Raghavarao et al., 2003).
A fermentao em estado slido apresenta as seguintes vantagens:
Simplicidade dos meios de cultivo. O substrato slido pode requerer somente
45
 adio de gua, embora outros nutrientes possam ser adicionados;
Ausncia de requerimentos de mquinas e equipamentos sofisticados;
Os biorreatores podem ter dimenses menores pelo fato do substrato devido
ao baixo contedo em gua do sistema;
Demanda reduzida de energia;
Baixo grau de umidade, reduzindo os problemas de contaminao;
As condies de crescimento do microrganismo agente do bioprocesso so
similares s encontradas em seu ambiente natural;
Os produtos, principalmente enzimas, so obtidos em maiores concentraes
do que em fermentaes submersas;
Ausncia de formao de espuma;
Material fermentado pode ser extrado imediatamente pela adio direta de
solventes, ou por filtrao.
Porm, existem alguns fatores limitantes nas fermentaes no estado slido, tais
como: menor disponibilidade e acessibilidade ao(s) substrato(s); s podem ser
operadas em batelada; problemas de transferncia de massa (oxignio e
nutrientes), calor e momento; dificuldades no aumento de escala e,
principalmente, no monitoramento e no controle das variveis fsico-qumicas,
tais como: pH, temperatura, oxignio e grau de mistura.

9.3. Quanto ao suprimento de oxignio

O fornecimento de oxignio est intrinsecamente ligado ao metabolimo
da clula ou ainda ao direcionamento que se impe a este, de modo a se obter o
produto desejado. Sendo assim, os Bioprocessos podem ser desenvolvidos com e
sem aerao. Os processos aerados so aqueles que se passam com absoro de
oxignio livre, podendo ser realizados com aerao natural ou forada. Na
primeira modalidade o oxignio necessrio ao cultivo provm do ar ambiente.
Grande parte dos processos em superfcie e em fermentao no estado slido,
descritos anteriormente, so aerados de forma natural.
Nas clulas de metabolismo aerbio, o oxignio especialmente utilizado como
aceptor final de eltrons, participando, ao trmino da cadeia respiratria, na
reoxidao de co-enzimas, resultando na produo de ATP, que a principal
fonte de energia nas clulas. Por outro lado, como ser visto mais adiante, o
oxignio pouco solvel em gua, sendo o valor da sua concentrao de
saturao da ordem de alguns miligramas por litro. Em virtude disto, torna-se
impossvel fornecer de uma s vez todo o oxignio necessrio a uma cultura em
desenvolvimento, devendo o mesmo ser continuamente suprido ao biorrreator,
independentemente da forma de operao do Bioprocesso.
Em Bioprocessos com aerao forada, o ar atmosfrico esterilizado
normalmente borbulhado no seio do meio, onde se dissolve parte do oxignio que
utilizado pelo agente da transformao. A Figura 21 ilustra o percurso do
oxignio da fase gasosa at o interior da clula, na qual se podem observar as
diferentes resistncias opostas a sua transferncia at a absoro pela clula. O
grande campo de aplicao da aerao forada situa-se nos processos
submersos, que por permitir uma mais rpida solubilizao do oxignio no meio,
torna-o mais facilmente utilizvel. Algumas vezes emprega-se oxignio puro ou
misturado ao ar, o que resulta em melhorias na transferncia de massa da fase
gasosa para a lquida, com a conseqente melhoria no desempenho do
Bioprocesso.
46
Figura 21: Transferncia de oxignio da fase gasosa at a biopartcula cataltica.

O fornecimento de oxignio a uma cultura em desenvolvimento, muitas vezes se

constitui no gargalo da tecnologia de produo. comum, que determinadas
fermentaes aeradas, estejam limitadas em suas possibilidades de melhorar
rendimento e produtividade, no por razes inerentes capacidade das clulas,
mas sim por problemas no projeto e operao de biorreatores, em relao
necessidade de satisfazer, principalmente, as altas demandas de transferncia de
massa, mas tambm de momento e de calor.
Para se determinar a taxa tima de transferncia de massa ou taxa de absoro
de oxignio da fase gasosa para a lquida, deve-se atentar para dois aspectos: o
suprimento e a demanda de oxignio. Evidentemente, que em um meio em
fermentao, a taxa com que o oxignio se dissolve dada pela diferena entre o
que se fornece e o que efetivamente utilizado pelas clulas. O suprimento est
relacionado s variveis de ordem fsica, tais como: vazo de ar, velocidade de
agitao, grau de mistura, temperatura, geometria do biorreator etc, sendo
estudado pelas teorias clssicas de transferncia de massa gs-lquido. J a
demanda est ligada fisiologia da clula e diz respeito quantidade de
oxignio dissolvido necessria ao cultivo sendo, portanto, proporcional massa
de clulas. Define-se, assim, como demanda a quantidade de oxignio necessria
por unidade de tempo e por unidade de volume de meio de cultivo ou em
fermentao. Matematicamente, o balano de oxignio para um biorreator em
operao pode ser expresso pela seguinte equao (Bailey & Ollis, 1986):

= K L a (CS CL ) qO2 X
dCL
dt
47
onde:
dCL/dt: taxa de transferncia de O2 ou taxa de absoro de O2, moles de O2 /m3.h
KL: coeficiente global de transferncia de massa de O2 na fase lquida, m/h
a: rea especfica da superfcie de interface, m-1
CS : concentrao de saturao de O2 dissolvido, moles/m3
CL: concentrao de O2 dissolvido no seio do meio em fermentao, moles/m3
qO2: demanda especfica de oxignio, moles de O2/g clulas.h
X: concentrao de clulas no meio em fermentao, g/m3

Se a demanda supera as possibilidades de suprimento, o crescimento se realiza

com limitao de oxignio, no entanto, muitas vezes a produo de determinada
substncia de interesse comercial se d em condies de restrio de oxignio.
Na prtica, o ideal e o econmico seria igualar o suprimento demanda, mas isto
se torna difcil e no recomendvel devido baixa solubilidade do oxignio em
meios lquidos. As temperaturas para a produo de biomolculas por
fermentao esto na faixa de 30oC e nesta, a solubilidade do oxignio em gua
pura cerca de, apenas, 7 mg/L, diminuindo notoriamente com o aumento da
temperatura. Em um meio de cultivo lquido a solubilidade do oxignio torna-se
ainda menor devido presena de solutos (clulas e sais). Por conseguinte, o
potencial de transferncia encontra-se limitado pelo baixo valor de Cs.
Adicionalmente, a alta resistncia dissoluo do oxignio, nestas condies,
resulta em um baixo valor para a capacidade de oxigenao do biorreator (KLa).
O sistema de fornecimento de ar dever incluir necessariamente tubulaes,
vlvulas, medidores e reguladores de presso, rotmetros, pr-filtros e filtros de
ar para a remoo de todas as partculas maiores que 0,22 m.
Pesquisas na rea de desenvolvimento de Bioprocessos anaerbicos tm sido
tambm intensificadas nos ltimos 20 anos. Os microrganismos agentes desses
processos, alm de sua importncia clnica, apresentam considervel importncia
ecolgica, como tambm grande interesse industrial. O cultivo desses agentes
biolgicos, anaerbios estritos, requer tcnicas que efetivamente removam o
oxignio (ar) do meio lquido e da fase gasosa em contato com fase lquida. Os
biorreatores industriais utilizados nesses cultivos devem possuir alta relao
altura:dimetro, e o borbulhamento de gases inertes, como nitrognio, muitas
vezes requerido para assegurar condies plenas de anaerobiose. Os dois
clssicos exemplos de processos anaerbicos so: a fermentao acetona-
butanlica e a metanognica. Analogamente produo de metano, a
fermentao acetona-butanlica realizada em duas fases: a acetognica, na
qual h a produo de cidos orgnicos e hidrognio e a solventognica,
processo que converte cidos orgnicos a solventes (acetona, butanol e etanol).
Nestas fermentaes a agitao fsica difcil ou onerosa e o transporte de
nutrientes essenciais pode estar limitado pela difuso, o que ocasiona reduo
nas taxas de metabolizao.
A taxa de reao em biorreatores diretamente proporcional concentrao de
biomassa. Em bioprocessos anaerbicos, o rendimento em biomassa baixo e a
quantidade de clulas que pode ser produzida a partir do(s) substrato(s)
limitada. A economicidade desses processos e as taxas de biorreao podem ser
aumentadas pela reteno da biomassa no sistema reacional, empregando
tcnicas de imobilizao (passiva ou ativa) ou mesmo pela adoo de
48
configuraes de biorreatores que permitam a reteno da biomassa, como os
biorreatores a membrana, ou com dispositivos internos de reteno de biomassa
(biorreator UASB - Upward-Flow Anaerobic Sludge Blanket Reactor).

10. Processos de Separao e Purificao do Produto

Outra parte integrante de um bioprocesso e que tambm define o seu

xito a seo de recuperao de produto (downstream processing). Nesta fase,
informaes de aspectos citolgicos e fisiolgicos do microrganismo sero de
grande valia. A fisiologia microbiana indicar no apenas a gerao como
tambm a localizao do produto. Se o mesmo for secretado, as etapas de
recuperao seguem um roteiro diferente da recuperao do produto intracelular,
como esquematizado na Figura 3. No segundo caso ser necessrio romper
estruturas celulares cuja composio ser importante na escolha das tcnicas
adequadas para a liberao do produto.

O projeto dos equipamentos que iro compor esta seo ser funo da
localizao do produto (intracelular ou extracelular), do seu tamanho molecular,
concentrao, solubilidade, polaridade, volatilidade e de outras propriedades
fsico-qumicas do meio de fermentao, como viscosidade, densidade, impurezas
e partculas indesejveis. A opo pela(s) operao(es) de separao ser
influenciada pelo tamanho do prprio bioprocesso e do valor do produto. Os
arranjos devero ser em srie a fim de se atingir o grau de pureza requerida (ex.
extratos enzimticos brutos ou enzima purificada) e a forma final exigida para um
dado produto (produto cristalizado, liofilizado, lquido concentrado, prensado). A
seqncia de operaes, atravs da qual o meio contendo a biomolcula a ser
separada deve passar para a obteno de um produto de alta pureza, constitui-se
basicamente de quatro etapas (Abraho Neto, 2001).
1. Remoo de material insolvel (particulado). Operaes comuns: filtrao,
centrifugao, decantao ou sedimentao.
2. Isolamento primrio. Durante esta etapa a concentrao de produto aumenta
consideravelmente e substncias com diferentes polaridades so separadas
do produto. Operaes tpicas: extrao por solvente, precipitao e
ultrafiltrao.
3. Purificao. Destina-se remoo de impurezas como tambm concentrao
de produto. Exemplos so: a precipitao fracionada e muitos tipos de
cromatografia lquida de alto desempenho.
4. Isolamento final do produto: Esta ltima etapa deve fornecer o produto
desejado em uma forma adequada para formulao final ou comercializao
direta. As operaes aqui incluem: centrifugao e subseqente secagem de
um produto cristalizado (liofilizado ou seco por spray drying).

11. Extrapolao de Escala

A extrapolao de escala um problema comum a vrios ramos da

Engenharia Qumica. No caso de Bioprocessos conduzidos com clulas
(microbianas ou no), entretanto, o assunto tem tratamento especial. Alm de se
utilizar de conceitos estabelecidos no tratamento de outros processos da indstria
qumica, deve-se levar em considerao, a caracterstica especial de um
49
bioprocesso para a produo de substncias de interesse comercial: a presena
de um ser vivo. A extrapolao de escala envolve dois aspectos: a ampliao de
escala (scale up) e a reduo de escala (scale down) (Figura 22). Na ampliao
de escala, utiliza-se dados obtidos na otimizao do processo em escala piloto ou
de laboratrio para estabelecimento das variveis de operao na escala
industrial. A reduo de escala diz respeito reproduo em equipamento piloto
das condies ambientais que possam ser obtidas na planta industrial, a fim de
permitir a obteno de resultados aplicveis melhoria do processo j instalado
na fase maior.

Scale up

ESCALA ESCALA ESCALA

LABORATORIAL LABORATORIAL INDUSTRIAL

Scale down

Figura 22: Ampliao e reduo de escala em Bioprocessos.

A extrapolao de escala se constituiu em um dos grandes desafios da

Engenharia Bioqumica. Muitas vezes ao se ampliar a escala de produo, obtm-
se resultados diferentes e insatisfatrios queles obtidos em escalas reduzidas
(laboratorial e piloto). Isto se deve seguramente ao fato das condies
ambientais no terem sido mantidas constantes, afetando, consequentemente, o
comportamento das clulas do agente biolgico em questo.
A escala industrial depende do tipo de substncia que se esteja produzindo.
Obviamente que o tamanho da escala ser uma funo de fatores econmicos
ligados, principalmente, demanda do produto pelo mercado consumidor, bem
como o seu valor agregado. Via de regra, quanto menor o valor agregado do
produto, maior a escala de produo, a fim de se garantir o xito econmico
(rentabilidade) da empresa em relao ao capital nela investido. Em escala de
produo industrial, podemos encontrar biorreatores de algumas centenas at
alguns milhes de litros (Tabela 9). No entanto, em todos os casos, os
Bioprocessos desenvolvidos em escala laboratorial ou de bancada, requerero,
em maior ou menor grau, uma etapa de escalonamento.

Na ampliao de escala, utiliza-se dados obtidos na otimizao do processo em

escala piloto, ou de laboratrio, para estabelecimento das variveis de operao
na escala industrial. A regra bsica na ampliao de escala em Bioprocessos
procurar manter, nas diferentes escalas, as condies ambientais timas.
Estaremos, assim, fornecendo as condies necessrias para se ter a
reprodutibilidade da atividade fisiolgica do microrganismo (o agente da
transformao qumica do substrato em produto).

50
 Tabela 9: Escala de produo de Bioprocessos.

Bioprocesso Tamanho do Biorreator

(m3)
lcool; Antibiticos; Amino-cidos e Leveduras 50 a 500
Cerveja 2.000
Tratamento de Efluentes 20.000
Novas Biomolculas (m.os recombinantes, algumas centenas de litros
clulas animais ou vegetais) (mx)

H vrios critrios para ampliao de escala, baseados na similaridade necessria

para se conseguir as mesmas respostas obtidas em escalas reduzidas. A
aplicao adequada de cada um deles, ou a sua combinao com outro(s)
depende de uma srie de fatores, caractersticos para cada Bioprocesso. Os
critrios de similaridade usualmente utilizados no trato deste problema so os
seguintes:

similaridade geomtrica: relao constante entre as dimenses lineares

correspondentes nas duas escalas;
similaridade cinemtica: manuteno da velocidade do fluido em pontos
equivalentes nas duas escalas;
similaridade dinmica: manuteno das foras aplicadas nas duas escalas;
similaridade trmica: manuteno da temperatura em pontos equivalentes
nas duas escalas;
similaridade qumica: manuteno da composio qumica do meio em
pontos equivalentes nas duas escalas.

A primeira mudana de escala que um bioprocesso experimenta quando se

passa da etapa de investigao em frascos agitados a uma que envolve
biorreatores pequenos de laboratrio. As condies estabelecidas em frascos
agitados so, em geral, de difcil reproduo em escalas maiores. A etapa
seguinte no escalonamento de um bioprocesso ocorre quando se trata de
reproduzir as condies ambientais entre um biorreator de laboratrio e um de
nvel piloto ou industrial. Neste caso, mesmo que se mantenha a similaridade
geomtrica entre os biorreatores envolvidos, no possvel manter constantes
todas as variveis fsico-qumicas que determinam o micro-ambiente da biomassa
presente no biorreator. Ao ampliar-se a escala, h parmetros que modificam
necessariamente. Os mais evidentes so a relao rea/volume e a presso
hidrosttica.
Se considerarmos um biorreator com geometria tipicamente cilndrica, claro que
a rea (que determina, por exemplo, a transferncia de calor e o nvel de aerao
superficial) aumenta ao quadrado com a escala, enquanto o volume uma
funo cbica da escala. Isto faz com que a relao rea/volume se modifique
pelo simples fato de se aumentar o tamanho do biorreator, o que implica numa
transferncia de oxignio superficial mais importante nos biorreatores de
laboratrio, sendo praticamente desprezvel em biorreatores de grande escala
(Geraats, 1994).

51
Outro aspecto que se altera necessariamente com a escala a presso
hidrosttica. Em biorreatores industriais, a presso no fundo do tanque pode
assumir vrias atmosferas, enquanto que em biorreatores de laboratrio ou
piloto, a diferena de presso entre a superfcie e o fundo do tanque mnima.
Isto afeta significativamente a solubilidade do oxignio e mesmo de gases do
metabolismo celular, como o CO2.
Outra razo para a dificuldade que se impe em relao dificuldade de
manuteno das condies ambientais com o aumento de escala, deve-se a
problemas ligados homogeneidade do sistema. Os biorreatores pequenos, em
geral, podem ser considerados bem misturados, sendo as condies operacionais
medidas com sensores, e representativas do que ocorre em todo o equipamento,
no sendo o caso de biorreatores industriais, incluindo aqueles de menor
tamanho que operam fluidos viscosos e no Newtonianos.
Os aspectos de natureza fsica das condies ambientais (transferncia de massa
e calor, caractersticas do escoamento, grau de mistura, cisalhamento etc)
dependem do tamanho do biorreator, podendo ser grande as variaes quando a
geometria da escala ampliada for diferente daquela menor, onde foi otimizado o
Bioprocesso. Por outro lado, ao se aplicar a similaridade geomtrica plena,
verifica-se que a relao entre a rea superficial (proporcional ao quadrado do
dimetro) e o volume (proporcional ao cubo do dimetro) de um biorreator
decresce acentuadamente com o aumento da escala. Isto tem implicaes diretas
na transferncia de calor para esterilizao do equipamento e meio, bem como
para o controle da temperatura de fermentao.
Um outro exemplo que impede que a similaridade geomtrica plena seja adotada
em biorreatores de mistura completa est ligado velocidade perifrica, definida
como vp=DN (onde: D=dimetro do impelidor e N=velocidade de agitao). Ao
se ampliar a escala, mantendo-se a velocidade de agitao constante, ter-se-o
diferentes valores para este parmetro, refletindo diretamente sobre a reologia
do sistema. Adicionalmente, cultivos com microrganismos filamentosos ou
suscetveis a foras cisalhantes podero ter sua morfologia alterada, resultando
em diferentes respostas metablicas ou perda de sua viabilidade.
A recomendao que se identifique a varivel-chave do processo, isto , a mais
sensvel ao escalonamento. Os critrios mais usados so parmetros fsicos
relacionados com as variveis de operao. Avaliando os critrios mais
comumente empregados na extrapolao de escala de fermentadores, Belmar
(1984) destaca como mais importantes: o coeficiente volumtrico de
transferncia de oxignio (KLa), a potncia por unidade de volume (Pg/V) e a
velocidade perifrica (ND). Desta forma, o sistema projetado, mantendo este
critrio de ampliao de escala, enquanto que os outros parmetros, menos
importantes, variaro.

12. Tratamento Biolgico de Resduos/Efluentes

Com o processo de industrializao e o desenvolvimento de tecnologias e
produtos cada vez mais avanados, no s o progresso e o bem-estar foram
gerados. Problemas ligados poluio ambiental foram se acentuando e
trouxeram como conseqncia a necessidade da conscientizao quanto
importncia da restrio de lanamentos indiscriminados de resduos nos solos,
52
rios, lagos, oceanos e na atmosfera. Em todos esses ambientes habitam
microrganismos. Por causa desta caracterstica de crescimento nos mais variados
ambientes, os microrganismos desempenham funo-chave na reciclagem dos
elementos na natureza.
A tecnologia de tratamento de efluentes difere ligeiramente da tecnologia de
obteno de bioprodutos industriais. Para o tratamento de efluentes, prescinde-
se, naturalmente, dos cuidados asspticos ou da manuteno de culturas puras,
como ressaltado anteriormente. A natureza nos ensina que uma populao mista
que estabelece uma interao positiva entre diferentes grupos ou espcies
microbianas capaz de transformar compostos de elevado grau de
complexidade. Os compostos intermedirios resultantes so, ento,
transformados em outros at que substncias no txicas sejam geradas, numa
cadeia de eventos em que todos os microrganismos desempenham um papel
metablico de vital importncia para que a descontaminao/destoxificao do
ambiente se estabelea.
O tratamento de efluentes pode ser dividido basicamente em trs etapas:
tratamento primrio, que visa remoo dos contaminantes mais facilmente
separveis (partculas com tamanho superior a 100 m). Operaes tpicas:
gradeamento; desarenamento e desengorduramento.
Retiradas as partculas sedimentveis, partculas suspensas menores e material
solvel so removidos no tratamento secundrio. Estes materiais, em sua
grande maioria, so orgnicos, sendo comum o tratamento biolgico nestes
casos. Devido enorme habilidade em degradar um amplo espectro de
substncias orgnicas, bactrias, actinomicetos, leveduras, fungos filamentosos e
protozorios tm sido cada vez mais empregados como agentes de
transformao dos mais diferentes compostos, apresentando-se como
alternativas poderosas aos mtodos convencionais baseados na simples
disposio e na energia trmica. A extenso desta degradao varia entre o que
se denomina de biotransformao e mineralizao. A primeira se constitui na
degradao parcial de um composto e na formao de uma ou mais substncias,
que podem ou no ser menos txicas que o composto de origem. J a
mineralizao a transformao total de uma substncia orgnica em outras
inorgnicas, tais como dixido de carbono e gua.
A degradao da matria orgnica, contida em efluentes industriais, realizada
biologicamente por uma grande variedade de microrganismos, que agem muitas
vezes de forma sinrgica. Esses microrganismos so usados para converter
matria orgnica coloidal e carboncea dissolvida em biomassa. Atualmente,
diferentes compostos txicos tm sido degradados por ao microbiana, dentre
eles hidrocarbonetos derivados de petrleo, herbicidas e pesticidas contendo
organoclorados, organofosfatados, polmeros etc (Davis & Cornwell, 1991).
Pelo fato de a biomassa possuir densidade ligeiramente superior a da gua, sua
sedimentao possvel, permitindo a sua separao do material lquido tratado.
Esta importante caracterstica utilizada como base de uma srie de concepes
de processo para o tratamento biolgico de resduos e efluentes sanitrios ou
industriais. importante notar que a biomassa residual tambm matria
orgnica, devendo-se buscar alternativas/solues para sua destinao (reciclo
no prprio biotratamento, digesto anaerbica, incinerao, disposio em
aterros sanitrios etc).

53
Dentre os processos biolgicos tradicionais destacam-se: os Lodos ativados
(processo contnuo e aerado, com reciclo da microbiota floculante); a Digesto
anaerbica, que alm de reduzir a carga orgnica produz metano; a Nitrificao,
processo que possibilita a oxidao de amnia a nitrito e, posteriormente, a
nitrato, produzindo um efluente final com baixa demanda bioqumica de oxignio.
Outros tipos de processo incluem: lagoas aeradas, biodiscos, filtros percoladores,
reatores seqenciais descontnuos. Ressalta-se que muitas vezes faz-se
necessria a combinao de processos biolgicos para efetiva degradao do
material orgnico e inorgnico. A figura, a seguir, ilustra uma concepo tpica de
um processo de tratamento biolgico de efluentes.

Figura 15: Representao esquemtica de um processo de tratamento de

efluentes. Fonte: Davis & Cornwell (1991).
O sistema de tratamento biolgico por meio de lodos ativados muito eficiente e
largamente utilizado no tratamento de resduos e efluentes domsticos e
industriais. Para que o sistema funcione deve haver transformao bioqumica da
matria orgnica solvel e insolvel (coloidal), assim como da matria inorgnica
(N e P), sendo o ambiente bioqumico determinante na diversidade da
comunidade microbiana para a efetiva degradao do resduo/efluente a ser
tratado.
Quanto configurao do biorreator, a biomassa pode estar em suspenso ou
aderida em suportes. Em relao ao oxignio, os processos aerbios suportam
uma cadeia alimentar completa, desde bactrias at rotferos; os anxicos so
mais limitados em variedades de organismos e os anaerbios so
predominantemente bacterianos.
O tratamento tercirio direcionado a remoo de todos ou alguns
contaminantes remanescentes. Esta etapa muitas vezes necessria para
enquadrar o efluente final s condies de qualidade exigidas para o lanamento
e disposio final no ambiente, seja qual for o corpo receptor. Os processos
usados nesta etapa incluem tipicamente a filtrao, ultra-filtrao e adsoro.
54
Processos mais sofisticados empregam ainda a eletrodilise e a osmose reversa.

Aps o tratamento biolgico, a filtrao uma operao muitas vezes

compulsria, para o posterior descarte do efluente tratado e clarificado. Trata-se
de um mtodo mecnico de separao, que visa remoo de slidos suspensos
ou de flocos resultantes das operaes de floculao/coagulao. Um dos
princpios mais importantes da filtrao que os slidos recolhidos acabam por se
constituir auxiliares da filtrao, na medida em que se depositam na superfcie
filtrante. A remoo do material particulado depende muito do tamanho das
partculas em questo, sendo, para as partculas de maiores dimenses, de fcil
aplicao. No entanto, para partculas de dimenses relativamente reduzidas, a
operao de filtrao pode tornar-se extremamente dispendiosa. A filtrao
tambm comum na desidratao de lamas resultantes dos diferentes
tratamentos.
Para a separao de contaminantes remanescentes de menores dimenses e
dissolvidos na frao aquosa, a tcnica de ultra-filtrao vem cada vez mais
sendo aplicada no setor industrial, principalmente por possibilitar o reuso da
gua. Trata-se de um mtodo que permite a separao de dois ou mais lquidos
diferentes por meio da classificao dos tamanhos de molculas existentes em
uma mistura. O equipamento de ultra-filtrao consiste em uma (ou vrias)
membranas adequadas ao que se deseja separar, onde o fluxo lquido
impulsionado por intermdio de uma bomba. O volume filtrado direcionado para
o recipiente de coleta e o fluxo reprocessado vrias vezes at que se
elimine(m) todo(s) o(s) composto(s) indesejado(s). Na prtica, uma bomba
recircula continuamente o efluente contido em um tanque de armazenamento
fazendo com que este passe pela superfcie da membrana e retorne para o
tanque. Cada passagem pela membrana resulta em um efluente mais
concentrado, com molculas maiores, enquanto a gua e outras molculas
menores so extradas do efluente. Desta forma, a gua (corrente aquosa com
mnima concentrao de contaminantes) pode ser efetivamente separada. Neste
processo chamamos a gua que conseguimos extrair do sistema de volume
permeado e o restante de volume concentrado. Esta gua recuperada pode ser
simplesmente descartada ou reutilizada em outras reas da indstria.
Outra tcnica aplicada ao tratamento tercirio a adsoro, que geralmente
usada na remoo de compostos orgnicos refratrios (recalcitrantes) presentes
em muitos efluentes industriais e cuja remoo se torna difcil ou impossvel por
processos de tratamentos biolgicos convencionais. tambm comum utilizar-se
a adsoro para tratamento de efluentes com metais pesados, sendo um
processo bastante eficiente na sua remoo. O adsorvente mais comum em
processos de tratamento de efluentes o carvo ativado, que pode ter origem
em diversos materiais. Destes, os mais comuns so o carvo betuminoso e
linhito. O carvo ativado pode tambm ser produzido pela transformao, por
torrefao, de materiais orgnicos em carvo granular. Os diferentes tipos de
carvo ativado tm propriedades especficas dependendo do material de origem e
do processo de ativao. A capacidade de adsoro traduz a eficincia do carvo
na remoo de determinados contaminantes, como por exemplo, metais, cor,
fenis, etc das guas residuais. Dependendo das caractersticas do efluente um
tipo de carvo pode ter um desempenho superior ao outro, desde que a sua
capacidade seja maior nas concentraes de equilbrio do efluente.

55
Qualquer que seja a soluo adotada para o lanamento dos efluentes oriundos
do processo produtivo ou na limpeza das instalaes, fundamental que a
indstria disponha de sistema para o tratamento ou o condicionamento desses
materiais residuais.

13. Consideraes gerais

Para que Bioprocessos possam despertar o interesse tecnolgico e

comercial, seja na criao de um processo novo ou na otimizao de um j
existente, essencial entender os fatores tecnolgicos que afetam
significativamente a sua competitividade. Tais processos tm seu desempenho
avaliado atravs dos seguintes parmetros, que ditaro sua viabilidade.
Coeficientes de converso em relao ao substrato consumido e matria-
prima;
Taxas cinticas de consumo de substrato e de formao de produto;
Estabilidade do biocatalisador ou da cultura;
Produtividade;
Concentrao de produto do meio reacional.
De uma maneia geral, o programa de desenvolvimento de um Bioprocesso
envolve as seguintes etapas: seleo e melhoramento de linhagens produtoras,
otimizao de meio de cultura em frascos agitados, experimentos em
biorreatores de laboratrio, avaliao em escala piloto e, posteriormente, estudos
de ampliao de escala.
Bioprocessos devem ser periodicamente reavaliados e incorporados de inovaes
tecnolgicas, a fim de se aumentar seu desempenho e lucratividade. A absoro
de inovaes tecnolgicas, somente conseguidas atravs de Pesquisa &
Desenvolvimento & Inovao, produz grande impacto no desenvolvimento e
otimizao de Bioprocessos. Assim, por exemplo, podemos lanar mo de
tcnicas da Biologia Molecular para dotar um microrganismo de uma determinada
propriedade de interesse, ou mesmo potencializ-la, quando o agente microbiano
a exibe com baixa expresso. Muito conhecimento novo gerado, tambm, na
rea de Engenharia Metablica, atravs da manipulao do metabolismo,
decorrente de fenmenos de induo, represso e at inativao de determinadas
enzimas, levando formao preferencial de um dado produto, por exemplo.
As tcnicas de imobilizao celular, que possibilitam a supresso de
equipamentos onerosos para separao de clulas; os biorreatores no
convencionais, menos intensivos em energia e mais eficientes e produtivos; o
desenvolvimento de biossensores, integrados ao controle de bioprocessos; o
aproveitamento de resduos como matria-prima para bioconverses; bem como
o reciclo de efluentes no prprio processo, minimizando a sua gerao, so
outros exemplos de inovaes e estratgias tecnolgicas para se garantir o bom
xito de Bioprocessos.
Os rpidos avanos em tecnologia de DNA recombinante e fuso celular
continuam a abrir novas frentes para a produo de biomolculas, de protenas
heterlogas em diferentes sistemas de expresso, que incluem bactrias,
leveduras, fungos filamentosos, clulas animais e vegetais. Estas tecnologias tm
sido aplicadas com sucesso na produo de protenas de alto valor agregado para
diagnoses, vacinas e substncias teraputicas, que vem atingindo vendas em
56
bilhes de dlares, com previso de crescimento exponencial, e o Brasil
apresenta todos os requisitos para se lanar, plenamente, no desenvolvimento da
Biotecnologia, basta existir vontade poltica e mudana de cultura do setor
industrial brasileiro.

14. Referncias Bibliogrficas Recomendadas

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Agradecimentos as seguintes instituies e empresas pelo apoio

financeiro:

59
 Os Laboratrios de Desenvolvimento de Bioprocessos
(LADEBIO) da Escola de Qumica da
Universidade Federal do Rio de Janeiro

Os temas de pesquisa desenvolvidos no LADEBIO advogam uma mudana de

paradigma das atividades econmicas, em particular dos processos de produo industrial,
integrando os princpios e estratgias de qualidade total com os requisitos de qualidade
ambiental.

As linhas de pesquisa coordenadas pelo Professor Nei, ao longo de 30 anos de experincia,

so caractersticas da sua rea de especializao e esto ligadas ao Desenvolvimento de
Bioprocessos, envolvendo, em sua grande maioria, trabalhos de natureza terico-
experimental, com aplicao prtica. So temas de estudo: o desenvolvimento de processos
visando produo de biocombustveis, enzimas, poliis, antibiticos, bioinseticidas,
biossurfactantes, cidos orgnicos, aromas e fragrncias, bem como o desenvolvimento de
processos biolgicos para o tratamento de resduos e efluentes industriais.

Como ferramentas para o desenvolvimento de bioprocessos nos projetos do LADEBIO, as

seguintes estratgias so comumente adotadas: seleo e melhoramento de linhagens
(naturalmente ocorrentes ou recombinantes), construo de biocatalisadores timos;
otimizao de meios; modos de operao e cintica de bioprocessos; imobilizao de clulas
e enzimas; caracterizao e aplicao de bioprodutos, como tambm a avaliao do
desempenho de biorreatores.

Devido caracterstica tecnolgica das pesquisas do LADEBIO, em todos os trabalhos

estabelecem-se compromissos com o desenvolvimento de bioprocessos que possam ser
transformados em realidade industrial. Alm disso, estudos envolvendo a gesto tecnolgica
so realizados a fim de se ter uma viso mais ampla e identificar tendncias e desafios dos
diferentes segmentos ligados Biotecnologia, como por exemplo: estudos de Prospeco
Tecnolgica para a produo de combustveis e outras substncias qumicas com base nas
matrias-primas renovveis (Biorrefinaria), Transgenia, Biodiversidade, Meio Ambiente e
Patente. Devido natureza muldisciplinar da rea Biotecnolgica, um grande nmero de
trabalhos desenvolvido em parceria com outros grupos de pesquisa da prpria UFRJ e de
outras instituies de ensino e pesquisa externas, e tambm com empresas.

O conjunto de nossas atividades tem gerado resultados que hoje alimentam consrcios de
pesquisa entre nossos laboratrios e Universidades e Centros de pesquisa nacionais e
internacionais, tendo sido os Laboratrios de Bioprocessos da EQ/UFRJ credenciados pelo
Programa Ibero-Americano de Cincia e Tecnologia para o Desenvolvimento (IBEROEKA-
CYTED/Espanha). Tem propiciado, tambm, interaes entre a Universidade e a Indstria,
como o caso de projetos que vem desenvolvidos em parcerias com a PETROBRAS,
ARACRUZ CELULOSE, BIONASA e OXITENO. Estas parcerias tm se constitudo em um
excelente exerccio, no s para a busca de solues para as empresas, mas tambm para a
gerao de conhecimento e formao de recursos humanos altamente capacitados para o
desenvolvimento tecnolgico em nosso pas.

Contato:
Prof. Nei Pereira Jr.
Escola de Qumica CT/UFRJ
Departamento de Engenharia Bioqumica
LADEBIO sala E 121
Cidade Universitria - Ilha do Fundo - Rio de Janeiro RJ
Cep: 21949-900
Tels: 0XX.21.2562 7644/7645/7646
Fax: 0XX.21.2562 7616
e-mail: nei@eq.ufrj.br

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 LINHAS DE PESQUISA

Biotecnologia de Materiais
Lignocelulsicos

Processos com Biotecnologia

Microrganismos Ambiental
Recombinantes

Gesto Desenvolvimento Biotransformao

Biotecnolgica de Bioprocessos

Agregao de Clulas:
Tecnologia da Fenomenologia e
Produo de Aplicao
Antibiticos
Novas Bebidas
Fermentadas e Alimentos
Funcionais de Frutos da
Biodiversidade Amaznica

INFRA-ESTRUTURA LABORATORIAL

LADEBIO
Laboratrios de Desenvolvimento de Bioprocessos

Central
Analtica
Center
SINFOBIO LAPROENZ
Sistema de Informao Laboratrio de Produo
de Biomassas Enzimtica

LABENGBIO LABSBIM
Laboratrio de Engenharia Laboratrio de Sistemas
Bioqumica Biolgicos Imobilizados

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