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Rio de Janeiro
2010
Local do Estgio: Laboratrio de Hidrobiologia
Endereo: Avenida Prof. Rodolpho Rocco 211, CENTRO DE CINCIAS DA SADE - CSS -
BLOCO A - Laboratrio de Hidrobiologia - Ilha do Fundo - Cidade Universitria - Rio de
Janeiro RJ
Matrcula: 523481
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Sumrio
I. Introduo
O projeto BGMONITORA vem sendo realizado h muitos anos e, assim como o projeto
HABITAT, tem como objetivo o levantamento da quantidade de nutrientes (ortofosfato, nitrito,
oxignio dissolvido, silicato) depositados sobre a Baa como tambm a quantificao de bactrias
autotrficas e heterotrficas presentes no local. Podemos dividir os ramos do laboratrio de
Hidrobiologia em dois: o laboratrio responsvel pela parte de anlises microbiolgicas (UCEA) e
o laboratrio responsvel pela parte de anlises fsicas e qumicas. O segundo atingia em sua maior
parte a qumica (mais voltado aos alunos de qumica industrial e meio ambiente), por isso todo o
estgio foi realizado no primeiro laboratrio (mais voltado aos alunos de biotecnologia) destinado
parte biolgica.
A ecologia microbiana pertence a uma linha que tem se desenvolvido bastante com a
aplicao de tecnologias modernas voltadas pra outras reas, entre elas, a citometria de fluxo que
foi originalmente desenvolvida para estudo de clulas de sangue e cncer, tratando-se de uma
tcnica que atua atravs de anlises mltiplas em clulas individuais.
Em relao tica, necessria uma fonte de luz focalizada no exato ponto da cubeta onde
as clulas passam enfileiradas, conforme mostra a figura 1.a. Os lasers so as melhores opes por
emitirem luz monocromtica e unidirecional. Entre outras, os aparelhos coletam basicamente a
desvio frontal (Foward scatter ou FSC), correspondente ao tamanho da clula, a lateral (side
scatter ou SSC), correspondente a complexidade ou granulosidade da clula, e algumas cores
(verde, laranja e vermelho). Dependendo da partcula ou clula com que se trabalha e do objetivo a
que se destina, os parmetros FSC e SSC podem ser suficientes para caracterizar um determinado
tipo celular. Quando partculas fluorescentes ou marcadas com corantes fluorescentes (anticorpos
conjugados fluorforos ou intercalantes de cido nuclico) so iluminadas, elas absorvem luz e
emitem fluorescncia (figura 1. b). As florescncias ou emisses das clulas podem ser
selecionadas por filtros especficos que deixam passar apenas alguns comprimentos de onda,
tornando o processo ainda mais seletivo. recebendo excitaes e emitindo fluorescncia, quando
marcado com algum anticorpo conjugado a um fluorforo ou molcula intercalante de cido
nuclico.
Por ltimo, no que se refere eletrnica, os sinais analgicos gerados so percebidos por
fotodetectoras e transformados em digitais. Para isso so utilizados recursos computacionais que
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realizam essa tarefa em alta velocidade, sendo necessrio, tambm, um grande banco de dados
para que os mesmo, gerados em enorme quantidade, possam ser armazenados.
Figura 1: (a) Detalhe da formao do fluxo laminar. (b) Esquema da iluminao da amostra por um laser, e o
espalhamento frontal, lateral e as diferentes fluorescncias. Figuras modificadas de Purdue.
II. Objetivo
limpeza de vidrarias, lavagem de material com cido, preparo de reagentes foram predominantes
nesta fase inicial.
Todos os dados a respeito das anlises eram salvos num sistema interno (PCServ) feito para
o laboratrio onde continha todos os dados sobre as anlises e os resultados obtidos. Antes de
transferir os resultados para esse sistema, os mesmos eram processados numa planilha prpria para
o clculo da abundncia bacteriana. Esta planilha era impressa e submetida aprovao do tcnico
responsvel para que, em seguida, fosse inserida no sistema.
Para garantir a descontaminao completa dos materiais lavados no ultra-som, estes eram
lavados com soluo de cido clordrico (J.T.Baker) 1:1 (v /v) antes de utiliz-los nas anlises de
rotina. Aps a lavagem as vidrarias e materiais so enxaguadas trs vezes com gua ultra pura
(destilada e filtrada em sistema Millipore).
Antes de ser utilizado todo material voltado anlise de bactrias devidamente embalado
com papel pardo e encaminhado para a autoclave, onde permanece por 15 minutos.
Antes de qualquer utilizao da gua ultra pura para anlise de bactrias, a mesma era
submetida 15 minutos na autoclave para esterilizao.
Em primeiro lugar prepara-se a soluo tampo fosfato onde 27,6g de fosfato de sdio
monobsico (Merck) e 35,6g de fosfato de sdio dibsico (J.T.Baker) so dissolvidos e
avolumados, com gua ultra pura, 1L.
Uma vez preparado o tampo fosfato, utiliza-se 100 mL do mesmo e 15,2 g de cloreto de
sdio (Qhemis) para o preparo de 2 L de tampo fosfato salino. Esse procedimento repetido
mais nove vezes para completar um volume final de 20 L.
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Dilui-se (1:20) a soluo estoque de formaldedo 40% em gua dor mar filtrada em filtro de
seringa com membrana de Ester de celulose com poro de 0,22 m (Millipore).
Dilui-se (1:10) o reagente tween 80 (Synth) em gua ultra pura, aquecendo em banho maria
e constante agitao.
Dissolve-se 0,2661g de pirofosfato de sdio (Synth) e avoluma-se 100 mL com gua ultra
pura.
III. 3. Anlises
Figura 2: (a) Organizao das amostras em caixas para galo de nitrognio lquido. (b) Gales de nitrognio
lquido para armazenamento das amostras.
Durante o preparo para a anlise so feitas trs rplicas de cada amostra pesando-se, em
tubos de centrifuga de 15 mL, 0,5g de sedimento, conforme mostra a figura 4. Em seguida,
adiciona-se 3 mL formaldedo 2 % (m/v) diludo em gua do mar filtrada e incuba-se 4C
durante 30 minutos. Passados os 30 minutos a amostra congelada -20C por aproximadamente
24 horas.
Figura 5: Citmetro de fluxo com os sistemas de injeo de fluido carreador e descarte de esgoto.
IV. Discusso
Aps a coleta necessrio que a preservao da amostra seja feita o mais rpido possvel a
fim de se evitar perdas. Nessa etapa, utilizam-se fixadores a base de aldedos (formaldedo), uma
vez que estes formam ligaes cruzadas inter e intramoleculares com protenas e,
consequentemente, fortalecem os componentes da clula.
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Para determinadas amostras torna-se necessria a realizao de diluies com PBS filtrado
em membrana de 0,22 m pouco antes da anlise. Neste caso, a diluio justifica-se pelo aumento
da probabilidade de se computar mais de um evento ou clula por vez, o que pode ocasionar um
erro na contabilidade.
A sonicao, numa viso geral, um processo que utiliza energia das ondas sonoras
auxiliando no processo de agitao das partculas contidas num recipiente, podendo ser usada para
acelerar a dissoluo de determinadas substncias, provimento de energia necessria para uma
determinada reao qumica, degradao de meteriais orgnicos entre outros. Nesse caso,
utilizando uma potncia adequada, a sonicao atua como uma etapa fsica para desagregao das
bactrias da matriz do sedimento. Esta etapa necessria para que no ocorra somente a
quantificao das bactrias em suspenso, levando a um erro nos resultados. vlido ressaltar que
a utilizao de uma potncia abaixo da ideal pode levar a uma ineficincia na separao das
bactrias das partculas do sedimento, assim como, uma potncia muito elevada pode ocasionar
lise celular.
que detectada pela fotodetectora. Como nas amostras utilizadas, gua e sedimento marinho, se
encontram tanto bactrias autotrficas quanto heterotrficas, ambas so marcadas com Syto 13,
porm, emitem nveis de florescncia diferentes devido maior ou menor quantidade de cido
nuclico. Essa diferena na emisso de fluorescncia juntamente com o tamanho da clula vai
gerar pontos em diferentes reas do grfico caracterizando as bactrias como autotrficas ou
heterotrficas.
Figura 7: Citogramas tipo Dot Plot de Fluorescncia verde (FL1) contra a fluorescncia vermelha (FL4). (a)
Amostra de gua. (b) Amostra de sedimento.
Na anlise por citometria de fluxo, os cidos nuclicos das bactrias fluorescem em verde,
devido ao Syto 13, e a clorofila, no caso das bactrias, autotrficas, em vermelho. Utilizando esses
parmetros mais o espalhamento lateral podem se analisar as diferentes populaes de bactrias
com facilidade. Os resultados da anlise so nuvens de pontos em grficos escolhidos pelo
operador. Usualmente, utiliza-se um grfico do espalhamento lateral (SSC) contra a fluorescncia
verde, conforme mostra a figura 8.c, e tambm, um grfico da fluorescncia verde (FL1) conta
fluorescncia vermelha (FL4) como ilustrado na figura 8.b. Alm da contagem total de clulas,
uma informao importante que pode ser obtida a separao de clulas por contedo aparente
de cidos nuclicos. Segundo as caractersticas de espalhamento lateral (SSC), da fluorescncia
(Syto 13 ligado aos cidos nuclicos) e auto-fluorescncia da clorofila (quando retiramos
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autotrficos da contagem), as bactria podem ser classificadas como sendo de alto contedo de
cidos nuclicos (HNA) e de baixo contedo de cidos nuclicos (LNA).
Figura 8: Citogramas tpicos com os diferentes painis e informaes obtidas da FCM, ilustrando em verde bactrias HNA, em azul bactrias
LNA, em amarelo as microesferas de ltex de 1,5 m. (a) Espalhamento lateral (SSC) contra a fluorescncia verde (FL1). (b) Fluorescncia verde
(FL1) contra a fluorescncia vermelha (FL4). (c) Histograma da fluorescncia verde (FL1). Fonte: Andrade & Paranhos, 2007.
Por outro lado, com a utilizao dessa tcnica, no possvel avaliar a forma das clulas
analisadas, sendo as mesmas, nesse contexto, apenas pontos de luz. Outra desvantagem o alto
custo do equipamento que acaba sendo um impedimento para o avano dessa tcnica nas cincias
ambientais.
V. Consideraes Finais
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Esse estudo, de total relevncia nos dias atuais, foi fundamental no aprendizado e
amadurecimento pessoal no cotidiano do laboratrio alm de ser um alerta para a preservao
ambiental.
No futuro, pretendo atuar como tcnica na rea militar assim como concluir a faculdade de
biologia no IFRJ.
VI. Agradecimentos
Em primeiro lugar, gostaria de agradecer a minha famlia que sempre me apoiou nos
estudos assim como em outros momentos da minha vida.
Por ltimo, agradeo aos meus amigos do IFRJ que sempre me deram fora e incentivo
para concluir o curso.
2. Andrade, L.; Gonzalez, A.M.; Araujo, F.V.; Paranhos, R. Flow cytometry assessment of
bacterioplankton in tropical marine environments. J. Microbiol. Meth., 55: 841-850, 2004.
3. Del Giorgio, P.A.; Bird, D.F.; Prairie, Y.T.; Planas, D. Flow cytometric determination of
bacterial abundance in lake plankton with the green nucleic acid stain syto 13. Limnol Oceanogr,
41(4), 783-789, 1996.
4. Kolm, H.E.; Giamberardino Filho, R.E.; Korman, M.C. Spatial distribution and temporal
variability of heterotrophic bacteria in the sediments of Paranagu and Antonina Bays, Paran,
Brazil. Rev. Microbiol., 28, 230-238, 1997.