/ ~\ CartaMolecular © Centro de Genomas Compartilhando Informagao - N°2 METODOLOGIA PCR REAL TIME Metodologla que esta gradativamente substituindo a técnica convencional de PCR. Neste informativo pretendemos explicar as principais caracteristicas e vantagens na utlizagao deste método de ampliicagao de acidos nucléicos 0 QUE E? Reagao em Cadela pela Polimerase (PCR) em Tempo Re Esta metodologia combina amplificagao e detecgao simultaneamente, isto 6, a fluorescéncia emitida 6 mensurada fem tempo real & medida que os produtos sao originados no decorrer da reacdo. Neste caso, 0 monitoramento do ‘ensaio ocorre durante todo o processo de produgao de amplicons & acadaciclo da POR, Durante toda a reagao, uma curva é gerada de acordo com a concentragao do produto sintetizado e em funcao do ndimerode ciclos. QUAL A DIFERENGA? Conforme explicado no item acima, a principal diferenga entre a reagao em tempo real e a técnica tradicional é a capacidade de monitoramento constante realizado pela PCR em tempo real. Esta caracteristica permite fa detecgo antecipada de possiveis problemas ocorridos durante a amplificagao, possibilitando assim, que medidas corretivas sejam tomadas mais rapidamente. ‘A PCR em tempo real € metodologia avangada e moderna, apresentando também outras caracteristicas que contribuem com seu melhor desempenho. QUAIS AS VANTAGENS? © PCR em Tempo Real é considerado um método mais sensivel, especifico e reprodutivel para a detecgao e ‘quantificagao de DNA e RNA. Sao mais sensiveis porque seu formato é otimizado para obtengao de sua eficiéncia maxima, e mals especificos pela necessidade, na maioria dos formatos, do anelamento especifico de pelo menos trés_oligonucleotideos: dois iniciadores e uma sonda. Além disto, sua reprodutibilidade se deve ao fato dos dados de quantificagaio serem coletados na fase exponencial inicial da PCR, na qual a variabilidade é menor que nas leituras dos ciclos finals. Outra vantagem reside no fato de que a deteccao e ou quantificagao por PCR em Tempo Real elimina os processamentos pés amplificagao , reduzindo a manipulacao com etapas desnecessarias, Além disto, do inicio a0 fim, 0s tubos de reagao nao sao abertos para processamentos adicionais, reduzindo o risco de que aerosséis de produtos amplificados possam “contaminar” futuras reacdes. Em comparagao ao PCR convencional, ‘© PCR em Tempo Real oferece uma faixa dindmica de deteceao muito mais ampla. A faixa dinamica de um ensaio determina que se possa detectar ou quantificar quantidades minimas de moléculas, bem como quantidades extremamente altas de moléculas presentes em uma amostra biologica. ‘A matoria dos métodos convencionais tem que optar entre detectar uma quantidade pequena de moléculas ou estender sua deteccao a quantidades muito elevadas de moléculas, Uma importante possibilidade oferecida por este método é a realizagao com maior facilidade de ‘t€enicas conhecidas como “multiplex’ ‘As *multiplex’permitem a amplificagao de diferentes sequéncias alvos dentro de uma Gnica amostra através da detecgao de sinais de fluorescéncia fem canais dticos distintos. Pode-se, por exemplo, em um mesmo tubo de reagao se propiciar a reagao concomitante de varios patégenos infecciosos ou varios marcadores genéticos. (© CENTRO DE GENOMAS EM TEMPO REAL Desde que o Centro de Genomas tomou conhecimento desta inovagao na area da Biologia Molecular vem trabalhando para implementar esta metodologia em um maior némero possivel de exames. Atualmente, realizamos a Técnica de PCR em Tempo Real para: “HCV Quantitative -HCV Qualitative - HBV Quantitative -HBV Qualitative HIV. Quantitativo -Chlamydia CMV Quantitative -NAT Teste “multiplex” para adetecgao simultaneade HIVe HCV Reconhecendo que a exceléncia alia- se semprea tecnologias inovadoras, O Centro de Genomas continua trabalhando para que esta metodologia seja aplicada a outros exames © se prepara para o langamento de outras inovagées, )( >) CartaMolecular A IMPORTANCIA DE UMA COLETA EFICAZ EM PAPEL DE FILTRO Autilizagao do papel de filtro no exame de Investigacao de Vinculo Genético, mais conhecido como Teste de Paternidade ou Exame de DNA, facilita a coleta, o transporte e armazenamento da amostra, pois o papel de filtro utilizado para este procedimento permite uma armazenagem por tempo indeterminado & temperatura ambiente. Ressaltamos que a extragaio do DNA extremamente eficiente, Porém, vale reiterar que algumas medidas devem ser atentamente observadas @ seguidas, a fim de que nao ocorra a degradacao do material genético. Dentre os principais problemas encontrados e responsdveis pelas solicitagdes de novas, coletas, destacam-se o enwvio de papel de filtro encharcado, seja pela quantidade exagerada de sangue coletado ou por sua secagem ineficiente. Para que seja possivel a extragao do DNA, o sangue coletado deve transpassar o papel de filtro, aparecendo no verso de mesmo, Apenas algumas gotas sao necessarias para que o material seja extraido e a secagem deve ser perfetta, por no minimo 15, minutos. Estas medidas simples garantem a qualidade do material e evitam os transtornos acarretados pelas solicitagdes de novas coletas. Outro fator importante que pode atrasar a liberagao do laudo 6 0 nao preenchimento dos dados dos periciandos endo envio da documentagao necesséria. Para liberagdio do resultado mandatério que juntamente a amostra sejam enviadas c6pias dos documentos de identificagdio detodos os envolvides no proceso. Ccoletacorreta, ‘colt era Quaisquer dtividas sobre estes procedimentos, entrem em contato com nosso Departamento de Atendimento ao Cliente 115581 9593 ramal:233 eD4/ cps Devido a baixa estabilidade das amostras utilizadas para a realizagao do exame de CD4/ CD8, as amostras nao serdo recebidas as sextas-feiras e em vésperas de feriados. Contamos com a colaboragao dos laboratérios apoiados e assim cevitaremos repetigaes e novas coletas. NOVOS EXAMES Encontra-se disponivel o exame para a quantificagao do CMV. Considera-se atualmente que a quantificagao do DNA do CMV PCR em tempo real possa ser mais sensivel e especifico do que os testes convencionais mais antigos, como antigenemia (Alice etal, 2006; Hernando etal, 2006), Abaixo se encontram as informagoes necessarias para coleta.e envio do material: Material: sangue total (EDTA) ou plasma, Volume de amostra: Smlsangue total Imi plasma Armazenamento: sanguc total refrigerado/ plasma congelado Estabilidade: Sangue total até 24horas apés a coleta refrigerado/ plasma congelado. Metodologia: PCR om tempo real. Prazo de entrega: 4S horas apés.orecebimento, \ee \dinamica de detec¢ao: 10° a 10" cépias/mi este wsasce