Organizagao do Genoma @ Expressao Génica Um fenstipo de uma planta é 0 resultado de trés fatores principais: 0 seu gendtipo (todos os genes, ou alelos, que determinam as caracteristicas da planta), 0 padrao de modificacdes epigenéticas de seu DNA e 0 ambiente em que vive. No Capitulo 1, foram revisados a estrutura fundamental e a funcdo do DNA, seu empacotamento dentro de cromossomos e as duas fases principais da expressao génica: transcrigdo e traducao. Neste capitulo, sera discutido como a composigdo do genoma, além de seus genes, influencia a fisiologia e a evolucao do organismo. Primeiro, seréo exa- minados a organizacao do genoma nuclear e os elementos extragene que contém. Em seguida, volta-se para os genomas citoplasmaticos que estao contidos dentro das mitocéndrias e dos plastideos. Também sera discutido sobre a maquinaria ce- lular necessaria para transcrever e traduzir os genes em proteinas funcionais e sera visto como a expressdo génica é regulada tanto transcricional como pds-transcricio- nalmente. Finalmente, serdo introduzidas algumas das ferramentas utilizadas para estudar a funcao génica, concluindo com uma discussdo sobre o uso da engenharia genética na pesquisa e na agricultura. Organizacdo do genoma nuclear Como discutido no Capitulo 1, 0 genoma nuclear contém a maioria dos genes necessarios para as funcées fisiologicas da planta. O primeiro genoma de uma espécie vegetal a ser completamente sequenciado foi o de uma pequena angios- perma dicotiledénea chamada Arabidopsis thaliana (arabidopse-do-tale ou erva- -estrelada), em 2000. ;16 Lincoln Taiz & Eduardo Zeiger ) genoma de A. thaliana é composto por cerea de 187 mb ndes de pares de bases (157 Mpb), que sao distribuidos cinco cromossomos, Bm comparagio, 0 Yeno co ere rr 4 1 do lirio (Fritillaria assyriaca), a espéete vegetal com o naior genoma conhecido, contém 88,000 Mpb, Dentro de seu genoma nuclear, A, th WO ye nes codificadores de protefnas ¢ quase 5,000 penes que slo. pseudogenes (genes no funcionais) ou partes det je DNA moveis, « serem diseutidos mal Além dosse adiante, neste capitulo) genes, em A, thaliana que produzem RNAs RNAs), Muitos dese envolvidos na regulag neRNAs werdo deserl rdiante, neste eaprtuto, > conhecidos mai: nao codificade RNA: ca. Tanto os transposon: de proteina so, provavelmente yeni juanto 0» tos em mais detalhes, mai Ogenoma vegetal, no entanto, consiste em muito mal do que genes. Nesta segio, sera examinada a comp regides do genoma correspondem a fungdes especttica O genoma nuclear é compactado na cromatina de DNA formando estru © genoma nuclear ¢ composto por moléeula que sio enroladas em torno de histona tura conta’ Capitulo 1). DNA e histona: nao DNA, na (ver Figura 1.10). Dois tipos de cromatina podem ser em forma de chamadas nucle on (ver , juntamente ¢ teinas que se lig 10 referidos como cromath distinguidos: eucromatina e heterocromatina, 1 sido com base na te, esses dois tipos foram distin ua aparéncia em microscopia dptica, quando corados com A heterocromatina ¢ ente corantes especificos eral bem mais compactada ¢ eseura do ortanto, parece mai que a eucromatina, menos condensada, A maioria dos ge nes que so ativamente transeritos em uma planta esté localizada dentro das ‘mo, enquanto muitos genes localizados em regides heterocromaticas no silo transcritos to inatl 108 genes ¢ vos ou silenciados, Comparada com a eucromatina, a heterocromatina ¢ rela nes. AS tivamente pobre em gi regide meros, diversos knobs (saliéncias), ¢ as regides imediatamente adjacentes 00) telomeros, ou extremidades dos cro. mossomos, conhecidas como regides subteloméricas (Gill et al, 2008) As estruturas k FIGURA 2.1 wellolar eromaticas ge ralmente sio formadas por sequen de DNA altan tigdes em série (tandem repeats): ble te repetitivas ou repe- de motivos de nucleotideo epee de 150 a 180 pb, que se repe vezes. Uma segunda classe de repeti+ ma drea verde largo, gdes & a das repetigées dispersas, Um thos, mal tipo de repetigdo dispersa é conhecida em azul sho regio Marcadore podem ser usadc ie eromossomos de uma diferente linhagem de mitho (5 linhas co aqui, de A188 aicadones CFO bs preparacbes c nos da regiao mediana dos cromossomo aramente visiveis No topo d heter como wequéncia simples repel ida (SSR, Simple Sequence Repeats) ou microssatélites, Essas repetic6es so compos- tas pe to curtas quanto dois nucleotideos, «que se repetem centenas ou mesmo milhares de vezes, Ou repetigdes dispersas encontrado zenes saltadores” ou transpo cs (Heslop-Harrison e Schmidt, 2007) ina 6 0 de Centromeros, telomeros e organizadores nucleolares contém sequéncias repetitivas Os mais proeminentes marcadores estruturais nos cromos- omos 0 08 centrOmeros, os telOmeros € os organizadores nucleolares, Essas regides contém sequéncias repetitivas de DNA que podem ser visiveis por fluorescéncia em hibridi zagao in situ (FISH in situ hybridization, Kato et al,, 2005), uma técnica que utiliza sondas moleculares com fluorescéncia mareaday de DNA ‘a ser identificada (Figura 2.1), Centrémeros so constrigoes normal nente fragmentos que se ligam especificamente a uma sequéncia os eromossomos, onde cromatides-irmas aderem-se umas as outras e onde as fibras do fuso ligam-se durante a divi- Jo celular, A ligagdo das fibras ao centromero é mediada pelo cinetocoro, um complexo de proteinas que circunda 6 centromero (ver Capitulo 1). Centromeros consistem em regides de DNA al transponiveis (Jian mente repetitivas e elementos inativos s et al,, 2003; Ma et al., 2007). Teléme- ros silo sequéncias localizadas nas extremidades de cada cromossomo, Os telémeros agem como “quepes” (caps) nas extremidades do cromossomo e impedem a perda de DNA durante a sua replicagao, As moléculas de RNA que compoem os ribossomos (FRNA) silo transcritos a partir de regides organizadoras nucleo! res (NORs, nucleolar organizer regions). Como 0s cromoss6micos, incluindo centromeros, teldmeros e organiza para identificar cromossomos individuais. Cada linha 1 873). As sequencias de DNA (sondas), complement2- foram marcadas com corantes fluorescentes © «Os centromeros podem ser vistos como pontos os organizadores nucleolares como ‘omo 6, ¢ 05 telomeras como ténues pontos verme “romossomos 2-4. As areas maiores destacadas fomaticas especificas (a partir de Kato etal, 2004),ribossomos S40 compostos principalmente de tRNA, ¢, jé {que muitos ribossomos sio necessirios para a traducio, ayo é surpresa que as NORs contenham centenas de c6- pias repetidas de cada gene de rRNA. Dependendo da EEpécie vegetal, um ou varios organizadores nucleolares Estao presentes no genoma (o milho tem um no cromosso- tno6; ver Figura 2.1). Devido a sua natureza repetitiva e a0 feu alto contetido GC, as NORs podem ser vistas por meio de um microsc6pio Sptico (apés coloragao) e, portanto, po- idem servir como marcadores especificos de cromossomos. Eases marcadores podem ser usados para mapear tragos fenotipicos especificos para regides cromossémicas. Ape- sar de sua natureza repetitiva, o rDNA (DNA que codifica TRNA) € ativamente transcrito. O rDNA do organizador ‘nucleolar, junto com proteinas que transcrevem 0 DNA processam o transcrito primario do rRNA para montagem fem ribossomos, formam uma estrutura nuclear proemi- nente chamada nucléolo (ver Figura 1.4). Transposons sao sequéncias méveis dentro do genoma Um tipo dominante de DNA repetitivo dentro das regides heterocromaticas do genoma ¢ o transposon. Transpo- sons, ou elementos transponiveis, sdo também conhe- cidos como “genes saltadores” porque alguns deles tém ‘a capacidade de inserir uma c6pia de si mesmos em um. novo local dentro do genoma. Existem duas grandes classes de transposons: os re- troelementos ou retrotransposons (Classe 1) ¢ 0s trans posons de DNA (Classe 2). Essas duas classes sao distin- guidas por seu modo de replicagao e de insercdo em um novo local (Figura 2.2). Os retrotransposons fazem uma cépia de RNA de si mesmos, que é reversamente transcrita em DNA, antes de ser inserida em outras partes do ge~ noma (ver Figura 2.2A). Como normalmente nao deixam sua localizacao original, mas geram cépias adicionais de si ‘mesmos, retrotransposons ativos tendem a se multiplicar dentro do genoma (Eickbush e Malik, 2002). Transposons de DNA, 20 contrario, movem-se de uma posigao para outra, usando um mecanismo de “corta-e-cola”, catalisa- do por uma enzima que é codificada dentro da sequéncia do transposon. Esta enzima, transposase, corta e emenda (Gplicing) o transposon, inserindo-o em outras partes do genoma, em muitos casos mantendo constante o némero total de copias do transposon (ver Figura 2.2B). ‘A transposicao em um gene pode resultar em muta~ es, Se um transposon acopla-se dentro de uma regido Codificadora, o gene pode ser inativado. A insergao de um transposon proximo a um gene também pode alterar 0 Pa~ rao de expresso génica. Por exemplo,o transposon pode perturbar os elementos reguladores normais do gene, im- edindo a transcrigao ou, j4 que muitas vezes carregam transposons promotores, aumentar a sua transcriga0. A capacidade mutagénica dos transposons pode de- sempenhar um papel importante na evolucdo do genoma do hospedeiro. De uma perspectiva evolutiva, um baixo nivel de mutagénese poderia ser vantajoso para uma espé- (A) Retrotransposons (elemento transponivel da classe 1) Nova cépia do DNA do genoma _Retrotransposon retrotransposon | eng { @Gm= (8) Transposons de ONA (elemento transponivel da classe 2) Insergao DNA do genoma Transposon Excisa0 Transposon excisado (Ona) ‘Nova localizaca0_ do transposon FIGURA 2.2 As duas classes principais de transposons diferem no seu modo de transposicao. (A) Os retrotransposons movem-se por meio de um RNA intermediario, (8) Transposons de DNA movem-se Uusando um mecanismo de corte-e-cola (cut-and-paste) cie, uma vez que poderia criar a variagao original necessi- ria para permitir que se adapte a um ambiente em mudan- ga Se a taxa de transposicao é alta, entretanto, resultando em individuos com muitas mutagdes, ao menos algumas dessas mutagdes provavelmente sero deletérias e pode- rao diminuir a aptidao (fitness) geral da espécie. Plantas e outros organismos parecem ser capazes de regular a atividade de transposons por meio da metilacio do DNA ehistonas. Como seré visto mais adiante neste ¢a- pitulo, esses mesmos processos s40 usados para reprimir a transcricao em regides heterocromaticas do genoma, ‘medida que mais sequéncias de DNA gendmico tornaram- “se disponiveis, os cientistas tém observado um grande niimero de transposons altamente metilados em regides heterocrométicas. E a metilagao dos transposons que cau- sa a formagao da heterocromatina em um determinado lo- cal? Ou 0s transposons tornam-se metilados porque esto presentes em regides heterocromaticas? Estudos em mutantes, que sao incapazes de manter a metilagéo do genoma, tém mostrado que uma lenta perdaSetor revertido FIGURA 2.3 A perda de metilacdo pode levar a mutagdes, cas0 0 msposons n3o metiladados tornem-se ativos. Uma mutacio cha- ode diminuicao na metilacao do DNA (dm!) ocasiona hipomet- iacao (metilacao diminuida) de transposons endogencs, A metacee She que surgiu em um mutante dm’, é o resultado da insersie Ge um transposon no gene DWARFS (DWF), que é necessi oe varsintese do hormnio de crescimento brassinosterace Or) 2 Ose ransposon-induzido clam (8 esquerds) a0/ada 08 SPC sek vagem, em Arabidopsis. (6) © mutante cam so (esquerde) e com aera) um setor que foi revertioo para o Fen6tipo 62 selvagem, sraross que 6 transposon, “satou para fora” do gene DWEé (a partir de Miura et al., 2001). dde metilacio a0 longo de geraches pode ae transposons se aentes ¢ aumentar a frequencia de mutacdes transpo- ceionais (Miura etal, 2001) (Figure 2 3). Essa atividade de transposon pode diminuir consideravelmente a aptidao da prole. Portanto, a metilacéo ¢ formacado de heterocroma- Fina parecem desempenhar PaPels importantes na estabili dade do genoma. todo o m copias multiplas de poliploides conté? genoma Nivel de ploidia — ge uma célula- € ou! igenoma inteiro te da estrutura Treagoes tanto para a fisiOlo” i muitos organisms, enoma diploide (2N) vais de replicasae o ntimero de c6pias do tro aspecto importan ‘a evolucao. El iantas, todo 0 BF gia qua mais rodadas adicion especialmente pode sofrer uma ou ™ ciado a mutagai aaa tagdo ou doenca Sehr) Tam um ever MoE PE evento de duplicaga oe nea cceaame eee eo Duas formas a liploidia e aloy Eee rs Cane a Hs oe ‘Autopoliploides contin ma completos de uma eee ‘lopoliplaldes coniém mtiploa genomes camel one de sofrem replicagao do caida needa fost Pate tomas pa E10 Faro est genoma em sua ide de uma espécie € pécie podem formar neiose Nes war a Far0s 1, Uma célula espermitica haploi ‘uma oosfera haploice de outra es lum diploide hibrido interespecttico. Am fas plantas geralmente falta, mas pode Je fgametas duplicados, o que pode Produ’ alopol ploide, Além disso, se células bridas acidentalimente tire a divisdo celular, fomnam-se ‘alopoliploides (Figura 2.58). Esse tipo de topoliploidizas® Pe (Faure Jem um zigoto Mbrido ou ais wo s nice ne Janta hibrida aasgs vegetativos ou reprodutivas 0a 1a ansfase |. 7 apostos. A Se reslta e de cores plantas. Durante ee movert-se para POS Mp anatase I. A mes mm metade do numet® metas homGlogos ace engo disjuncd0") 3 etas ov SUES FiGURA 2.4 Meiose em Flos homdlogos separa” Tromatides separam-se durante era ceils fihas, cad ave uate torent. 50 um pat de TO mente deixar de se Separar durante 2 anstase Ealolas-fihas resU! sd aneuploides 4 especies ve paredes celular Condensam-se ev S interfase, por um Pe"FIGURA 2.14 Rotas de RNAi nas plantas. (A) MicroRNAs (miRNAs) sao parte de muitas rotas genéticas durante o desenvolvimento da planta. (B) RNAs de interferéncia curtos (siRNAs) sao requeridos para serao analisados, primeiramente, os eventos que levam a acumula¢gao de dsRNA na célula. A seguir, serao discuti- dos os componentes moleculares e eventos a jusante do processo de RNAi. MicroRNAS REGULAM, POS-TRANSCRICIONALMENTE, MUITOS GENES DE DESENVOLVIMENTO Os microRNAs (miRNAs) estado envolvidos em muitos processos de de- senvolvimento, como a formagao de folhas e flores, a divi- sao celular e a orientacao (polaridade) de 6rgaos vegetais (Kidner e Martienssen, 2005). Todos os miRNAs surgem da transcrigaéo mediada por RNA-polimerase II de um manter heterocromatina e para silenciar genes nao utilizados. A ro’ de siRNA, envolvendo RdRP2, esta ilustrada aqui. (C) As células ve getais podem montar uma resposta de RNAi a infeccdo por virus locus especifico, 0 qual codifica um miRNA transcrito primario (um pri-miRNA), 0 qual pode variar em com- primento (de centenas a milhares de nucleotideos). Esse transcrito primario recebe um quepe na extremidade 5’, € poliadenilado na extremidade 3° e forma uma linha de dupla-fita, cujos bragos de bases pareadas confinam uma volta de fita simples. Em seguida, os pri-miRNAs sao pro- cessados em pré-miRNAs, geralmente com 70a 80 nucleo- tideos em animais, mas que podem ter até varias centenas de nucleotideos de comprimento nas plantas. Nas plan- tas, dentro do nticleo, os pri-miRNAs sao convertidos em miRNAs pelas proteinas DICER-LIKE 1 (DCL1) e HYPO-