Vol. Ir1 459-475 1350 | CONSIDERACOES SOBRE METODOLOGIAS DE CONTAGEM DE ALGAS DO PERIFTTON BICcUDO, D.C.” RESUMO Este trabalho @ uma sintese dos métodos mais usualmente empregados na contagem de algas do perifiton. Inclui métedos "in situ" e@ do material removido do substrato, bem como técnicas de separagdo. sao feitas algumas consideragSes sobre as vantagens e desvantagens dos métodos, sobre fixagdo do material em fungdo da metodologia de quantificagio e sobre a determinac de limites de contagem. Finalmente, algumas sugestdes gerais sio apresentadas no sentido de, na medida do possivel, minorar certas desuniformidades e/ou nortear os estudos quantitativos dessa comunidade. ABSTRACT - SOME CONSIDERATIONS ON THE ENUMERATION METHODS FOR PERIPHYTIC ALGAE This article synthesizes the most common methods for the enumeration of periphytic algae. It includes “in situ" and xvemoval methods, as well as separation techniques. Considerations both for and against each * IBt = Sie Paulo, sP- 460 - method, on the fixation of the material in relation to the quantitative procedure adopted, and on the establishment of an enumeration limit are presented. Finally, a few general suggestions are, as far as possible, presented aiming at decreasing of certain unevennesses and/or guiding of the quantitative studies of the periphytic community. INTRODUCAG Em oposicao a metodologia de contagem de comunidades fitoplancténicas, raros so os trabalhos que fazem uma avaliagdo critica das fontes e da magnitude de erros dos matedos empregados nc estudo das comunidades de algas do perifiton, E esta situacio & particularmente agravada pela existéncia de indmeros métodos diferentes na quantificagdo desta comunidade. SLADECKOVA = (1962) 34 havia salientado a importancia, para a limnologia em geral, de trabalhos estatisticos comparatives sobre as distintas metodologias. Entretanto, muito pouco foi feito neste sentido e novos métedos continuaram a ser propostos, ainda recentemente. Esta situagdo atual a fruto da histéria relativamente recente dos estudos sobre perifiten em relagio & do fitoplancton e, principalmente, dos varios problemas inerentes A andlise de uma comunidade tio complexa @ heterogénea. Uma revisfo mais ampla sobre a metodologia empregada no estudo do perifiton foi feita por SLADECKOVA (1962). Mais recentemente, DELBECQUE (1985) fez uma avaliacio de determinados métodos e técnicas de remog#o com base no estudo do perifiton de Nuphan futea (u.} smith e Nymphaea alba L. Apesar doa trabalhos acima, informagdea importantes @ especificas sobre a contagem desta comunidade ou nio-publicadas. Este fato, juntamente com a inexist@ncia de bibliografia encontram-se dispersas em literatura- 461 - nacional no assunto, levaram A realizacéo deste trabalho. Devido A amplidao do tema, pretende-se apresentar apenas os métodos que vém sendo mais usualmente empregados no estudo das algas do perifiton, com os seus problemas, vantagens e@ desvantagens. Fogem do presente objetivo as questdes relacionadas com os procedimentos de coleta @ amostragem. OBSERVACAO DO MATERIAL gJ&é de inicio, o primeiro problema reside na ebservacio de uma comunidade que se desenvolve sobre substratos téo heterogéneos, de diferentes espessuras © Rreas, vives e@ inertes. Duas possibilidades existem, @ependendo das condicées particulares: o exame "in situ" do material, divetamente sobre o substrato, ou apés sua remocao, METODOS “IN SITU" © exame "in situ" tem a vantagem de assegurar a observaco de toda a comunidade com um minima de perdas, bem como a anflise da microdistribuicéo original das algas. Este tipo de informac&o &, muitas vezes, necessfria pois reflete a relagdo das algas com o substrato, principalmente tratando-se de substratos vivos (GODWARD, 1934; CATTANEQ, 97a). A quantificacéo diretamente sobre 0 substrato pode ser feita através de microscépio Sptico comum, microscépio de fluorescéncia e microscépio eletrénico de varredura. A eficiéncia destas técnicas vai depender do grav de desenvolvimento de perifiton, que pode impedir 4 visualizacSo das camadaa mais inferiores da comunidade, Ainda, para o exame ao microscépio comum, ha outro requisite basice: © substrato deve possuir certa- 462 - transparéncia para permitir a passagem da luz do microscépio. As condicgSes para a contagem ao microsc6pio comum podem ser conseguidas com o uso de certos tipos de substratos artificiais tais como de laminas de vidre, e mesmo de hospedeiros menores ou de partes deles. Quando a aglomeragéo des organiames e/ou de depésito orginico e inorg&nico do perifiton dificultam a visualizacéo, pode-se empregar técnicas adicionais de clareamento. Bons resultados 44 foram obtidos através da imersdo de hospedeiros como Lemma a Spiredeéta em formalina a 3% durante um ou mais dias (BOWKER 6& DENNY, 1980; AGUJARO, comunicagao pessoal); eu utilizando-se eloralnidrate para a extracéo de clorofila (REHBRON apud SLADECKOVA, 1962), ou clorox em combinagac com lugel, come corante (CARTER, 1982); ou pré-tratamento com EDTA (DELRECQUE, 1995). © métode do microseépio de fluorescéncia baseia-se na fluorescéncia primaria da clorofila a. Uma avaliacao do mesmo foi feita por JONES (1974), que observou que a combinarao de diferentes filtros e a imersao de pedras em solugio especial possibilitavam a distingao dos grupos de algas. B que o método fornece estimativas rapidas e confiaveis da densidade e da microdistribuigao de algas epiliticas. Entretanto, para tecido foliar, DELBECQUE (1985) 85 pSde distinghir a nivel especifico as algas dos maiores, de contorno caracteristice como, por exemplo, o de Coccomeds, devido & fluorescéncia das bactérias. Assim, recomenda o métcdo apenas para o estudo de determinadas espécies. 0 microscépio eletrénico de varredura tem sido mais utilizadc para o estudo da arquitetura do perifiton, devido ao seu poder de resolucio e & sua profundidade de campo.= 463 - METODOS BASEADCS NA REMOCKO Como muitas vezes os métodos “in situ” nao sao vidveis, principalmente nos substratos © densamente revestidos, muita ateng. vem sendo dada 4s técnicas de separacSo. Todavia, a remogao do perifiton continua sendo um dos maiores obst@culos para as medidas quantitativas desta comunidade. Em parte, este problema deve-se & grande variacio na textura, morfologia e topografia dos substratos; e, noutra parte, aos diferentes mecanismos e graus de fixacio exibidos pelas algas perifiticas (Ho, 15979). Com a remocéo, a8 algas mais frageis, bem como as filamentosas, coloniais e agregadas, podem ser danificadas, além de, na maioria dos procedimentos, perder-se a configuracao original do perifiton. Mas, a maior critica @ que dificilmente a separacéo @ completa, podendo levar a dades quantitativos imprecises. E por conta disto, muitas técnicas continuam sendo propostas ainda recentemente. As técnicas de separagdo mecanica consistem, basicamanta, de simples agitacio (MOSS, 1976}; jatos de Agua (HICKMAN &§ KLARER, 1973)1 varias formas de raspagem com escova, pincel, espatula de metal, entre outras (BOWKER & DENNY, 1993); © de tratamento por ultrassom (HICKMAN apud ROBINSON, 1983). Uma combinasie entre as técnicas de separa¢do mecdnica e quimica consiste na agitagZe com FAR (HO, 19797 Gons, 1982). As técnicas de separacSo quimica astio baseadas na hidrélise fcida das algas ligadas ao substrato por subst€ncias mucopolissacarideas. Enzimas como celulase, pectinase, mutanase, entre outras, e subst@ncias quelantes como o EDTA também podem agir nestas ligagdes (DELBECQUE, 1985). Uma técnica denominada "stomaching" foi proposta= 464 - yecentemente por BOWKER et alii (1986), Consiste na colocagdo da amostra dentro de uma bolea plastica, que & inserida em uma m&quina, onde & vigorosamente batida em sua superficie externa por pas de metal. Segundo os autores, nesta técnica o hospedeiro — Cladophora gtomexata (u.) Kitz. — permanece relativamente intacto e a suspensio obtida de algas 4 passivel de quantificacio. Finalmente, deve-se mencionar a técnica de remocdo pelo filme superficial, que @ totalmente distinta das demais. & a finica em que a posigdo mitua dos elementos do periffton e a impresso do substrato sfo mantidas. © principio desta técnica consiste na solidificacéo de uma gubstancta 1fquida sobre o substrato, apés o que ela & puxada, obtendo=se uma pelicula translficida juntamente com o periffton aderido. Substancias como m&scara facial {CATTANEO, 19787 CATTANEO & KALFF, 1978}; "Cyclon-lac" (DELBECQUE, 1985);3 entre outras, tém sido utilizadas. Pode-se, ainda, aplicar um pré-tratamento com EDTA para facilitar o desprendimento das alaas mais firmemente aderidas (DELBECQUE, 1985). Obviamente, pela técnica do filme superficial também ha Go inconveniente da visualizacdo de uma comunidade densamente desenvolvida., Todavia, tem a vantagem de possibilitar o estude da configuracao original do perifiton mesmo em substratos eapessos, onde h& impedimento da passagem da luz. Além disso, & muito Gtil para estudos especificos da parte da comunidade mais firmemente aderida, © que pode ser feito apés remorao por agitacdo do perifiton mais frouxamente aderide (CATTANEO, 1978). Sobre a eficiéncia das téenicas de separacio, existem dados conflitantes em literatura e raros sfo os trabalhos que fazem uma abordagem comparativa entre as diferentes técnicas. Através da agitagdo manual combinada com FAA, h& dados de 99% de remoc&o (GOUGH & WOELKERLING, 1976) e de apenas 6 a 68% (CATTANEO & KALFF, 1980) para macréfitas- 465 - aquaticas. Anda, para Cfadophena glomenata L, Kitz. foi observada remogaéo de 12 a 36% pela técnica acima e de 100% pela de “stomaching" (BOWKER et alii, 1986). Com relac&o & técnica do film superficial, CATTANEO (1978) observou a nfo-remogdo de apenas 5% das epifitas firmemente aderidas. Uma abordagem comparativa mais ampla destas técnicas fol feita por DELBECQUE (1985). © autor considerou que a do filme superficial pode ser usada em combinacda com outras, mas que dependendo da estrutura foliar do hospedeire a remocgéo néo € completa; que as enzimas nao facilitam a remocao principalmente das espécies prostradas; e que a capacidade do EDTA de remover a matriz ndo-viva do agregado de detritos do periffton & superior & das enzimas e da agitacdo com FAA, com os melhores resultados obtidos em pH baixo (pH = 4,7). Ne caso particular da remocio do perifiton de Ceadephora gtomenata L. xKitz., BOWKER et alii (1986) recomendam a t@cnica do “stomaching" como a mais r4pida e eficiente. Resultado interessante fei obtida por JONES (1974), que conseguiu remocao de 100% para uma espécie de diatemicea apilitica pelos procedimentos usuais de raspagem. Apesar da remogéo total, obteve dados quantitativos subestimados com relagaio aos da conatem "in situ" por epiflucrescéncia, devido ao tratamento posterior & remegdo que provocou guebra das fristulas. METODOS DE CONTAGEM Grande desuniformidade existe na metodologia de contagem. Diferencas basicas deven-se, principalmente, A quantificacio do material “in situ" ou removido do substrato. Mas, masmo am cada uma destas situacSes nio se= 466 - est4 dando o mesmo tratamento. Na contagem de perifiton removide, trés métodos desenvolvides para o estudo de comunidades fiteplancténicas estfo senda empregados, que sio os de McNABB (1960), onde a concentracio e a quantificagfa so feitaa na membrana-filtro de "Millipore" (BROWN 6 AUSTIN, 1971; HO, 1979); 0 de Segdwick-Rafter (GOUGH & WOELKERLING, 1976); @ o de Uterm&h1, através de microscépio invertido (CATTANEO, 19BT). A quantifica o do material “in situ", bem como a do removido pela técnica do filme superficial, tem sido feita, basicamente, ao microscépio 6Sptico comum. No primeiro caso, o hospedeiro ou parte dele pode ser colocado entre lamina e¢ laminula, juntamente com a solucdo preservativa (AGUJARO, comunicagéo pessoal} ou com 0 fixador e mais algumas gotas de glicerol a 598% (BOWKER & DENNY, 1980). Ainda, conforme o tipo de substrato, um dos lados pode ser raspado ¢ o outro examinado sob laminula (SLADECKOVA, 1962}. No segundo caso, o filme transparente embebido como perifiten @ montado em Permount, entre lamina © laminula (CATTANEO, 1978). Laminas semi-permanentes podem ser preparadas com © material “in situ", selando-se a laminula com esmalte de unha ou bélsame do Canada, © que possibilita o re-estudo taxonémico @ mesmo quantitative do material. Finalmente, microscépio de fluorescéncia tem sido mais utilizade na quantificacdo "in situ" de perifiton sobre pedras (JONES, 1974). © aumento recomendado para a contagem do material ao microscépio comum, principalmente pelos métoedes “in situ", 6 de pelo menos 1000X, Este aumento permite a visualizagéo da parte da comunidade mais firmemente aderida, que 6 dificultadsa pelo substrato ac fundo e pelos detritos orginicos e inorganicos do perifiton. O sistema de contagem do material removido ou diretamente sobre o substrato tem sido feito principalmente- 467 - x transectos ou por campos aleatérios. UBHLINGER (1964) © SANDGREN & ROBINSON (1984) yealizaram eatudes estatisticos sobre a enumeracho do fitoplancten pelo métedo de Uterméhl. Ambos recomendam, enfaticamente, a contagem pelo sistema de campos aleatérios, em especial pelo freqtente padrao de distribui¢de nao ac acaso das algas no sedimento destas camaras circulares. E mesmo para distribuicdo ao acaser UEHLINGER (1964) observou que este sistema de contagem fornece valores mais préximos da densidade real da cAmara. Especial atengdo deve ser dada a esta recomendacaa na quantificacio do perifiten, principalmente pelos métodos “in situ". £ sabido que as algas perifiticas raramente es: distribuidas ao acasc, especialmente em densidades populacicnais maiores, onde a agregacio & inevitavel (HO, 1979). © tipo de distribuicgdo das algas & também importante na determinagio ¢o némerc minimo de individuos a ger contado ou da 4rea minima do substrato a ser amostrada, para se obter estimativas confiaveis. Os autores que utilizam os métodos usuais para o fitopl@ncton adotam, na maioria, as mesmas recomendagdes para o perifiton, ou seja, contagem de 30 campos aleatérios na membrana-filtro, conforme método da presenga/auséncia de McNABB (1960); ¢ de até 100 individues da espécie mais comum, pelo m@todo de Utermdhl (LUND et alii, 1958). Entretanto, a precisio destes métodes @ funcao da distribuigdo aleatéria dos individuos na membrana ou no sedimento da cAmara, o que deve ser devidamente testado (Wer HO, 1979; BROWN & AUSTIN, 1971)- A determinac&o do limite de centagem pelos métodos “in situ" tem sido mais problematica e, com poucas excagSes, sem um estudo preliminar. Alguns baselam-se em um niimero minimo de individuos (BROWN, 1976), mas a maioria numa area minima (JONES, 1974; CATTANEO, 19787 BOWKER & DENNY, 12980).Embora mais ompiricos, existem dois métedes simples e extremamente pratices para a determinacdo da area minima © que podem ser aplicados para todos os métodos de contagem, independente da remogéo ou nae do material. oO primeiro baseia-se na menor flutuagdo da média cumulative calculada a cada campo ou de cinco em cinco campos aleatdrios (ELLIOT, 1977). © outro, recomendado por BOUDORESQUE (1971) para estudos de fitobento marinho, consiste no método grafico da rea por espécies adicionadas. A Srea minima 6 determinada assim que praticamente cesse a adicio de espécies com o aumento da &rea examinada. Segundo CAIN & CASTRO apud BOUDORESQUE, 1971), esta Grea é atingida quando um aumento de 108 de &rea corresponder a um aumento inferior a 10% de espéci adicionadas. Nas Fig. 1 e 2, os métodos sao respectivamente exemplificados com base em uma comunidade de algas ep{fitas sobre escamas de Ricciocanpos nafans {L.} Corda. Ambos os métedas podem também ser utilizados conjuntamente e 6 interessante notar que fornecem resultados semelhantes. Nos exemplos, a estabilizagdéo mais rapida ocorren nas escamas mais jovens ¢ o opesto deu-se com as mais velhasi e a partir da amostragem de um niimero préximo de campos. Finalmente, o8 @ados quantitatives podem ser expressos em termos de individuos, area ou volume celular, dependendo do propésite do trabalho. ROBINSON (1983) menciona que, nem sempre, as medidas de biovolume sio indicadoras precisas da biomassa e gue, para alga epifitas, a rea superficial celular esté melhor correlacionada com taxas de assimilacao. Decidida a unidade quantitativa, os resultados podem ser expressos em peso seco ou em area superficial do substrato. Embora o primeire possa ser mais ffeil e Precisamente determinado, seu uso & extremamente limitado e problemitico na comparagdo de densidades de populagdes perifiticas. Isto porque a relagdo entre a area superficial @ 0 peso seco é extremamente varifvel de macréfita paraFigura 1oe-e - = 469 - ACHGINTHES HUNGARICA —4te OVENS [ ceruanities wusursama ose, mepianes FB] — es ee) AGHRANTUCS MIMUTISSIMA .erc VELHAE Média cumolativa da eapicte dominante de comunidade 4@ alg! bre raeanas de Ricciacatpos Hata@ns, Firs 0 Fig. 12. excamas median ss?) fy Fige Ics escames male velhas (Seampo = 0.0085- 470 - ESCAMAS JOVENS Espthes apiconapas AMAS MEDIANAS. 35 Escanas ESPEDES. ADGONADAS af escamas veLsias eseises aoiconacas ‘0 39 a MIMERG OE CAMPOS: Figura 2 a-e - Mimero de espécies adteton iio da rea amostrada 4 4 velnas ¢Scampo = 0,0085 mm!). de uma comunddace de aleaa epffitas em fur encamaa de Ricedocaapes natans, ecamas mifa Jovens; Fig, lb, escamas modianany Fig. 1c. excomaa nat- 471 - micréfita (GOUGH & WORLKERLING, 1976). FIXACAO DO MATERIAL Atencado deve ser dada & preservagic do material em funcao do métado de contagem a ser utilizado. © perifiton removide tem sido fixade com formalina a 3-4% ou com FAA para contagens em membrana-filtro ou camara de Segdwick-Rafter, ou com lugol acético, conforme método de Uterméhl. Para contagens "in situ", tem-se empregado mais freqtentemente formalina a 3-48. Todavia, gempre que possivel, & recomendfvel examinar amostra fresca para facilitar o reconhecimento de certas espécies durante a contagem. A comunidade mais firmemente aderida & composta por uma grande variedade de algas diminutas e frageis, cujas caracteristicas taxondmicas, em certos asos até mesmo a nivel genérico, podem ser danificadas com o fixador. CONSIDERACOES FINAIS Como um m&tedo pode ser adequado em uma dada condic&o e insatisfatério em outras, e pela inexisténcia de metodologias unificadas, especial atencdo deve ser dada is condicées particulares de cada investigacdo. Apesar desta problemética, algumas sugestées gerais podem ser feitas para a quantificacao da algas perifiticas, como segue: a) sempre que possivel, analisar material vivo, principalmente os mais frageis, e proceder A sua identificacao previamente & enumeracdo da comunidade; b) estudos preliminares sic necessdrios para a escolha do métedo de contagem e, quando preciso, da técnica de remocio; ¢c) dar preferéncia aos métodos "in situ" sempre que as condigées permitirem; 4) estudos preliminares sao também necessdrios na determinac&o- 472 - do namero de réplicas ¢ da frea minima a ser quantificada do substratc, ou da sedimento concentrado pelos matodos mencionados para 9 fitoplaneton; e) enumeracdo por campos aleat6rios &@ recomendada; f) a quantificacéo em termos de individuos, Area ou volume celular & funcfo do propésito do trabalho; g) maior esforco deve ser despendido no sentido de expressar os dados quantitatives por unidade de drea-padrio do substrato; e h) na utilizacico de substratos artificiais, estudos preliminares adicionais sao necessarios na escolha do tipo de esubstrato, niimero de réplicas, tempo de exposicéo, entre outros. Finalmente, estudos estatisticos sobre a reprodutilidade dos matodos quantitatives, bem como sobre a comparabilidade entre os mesmos s&o urgentes. Destes estudos depende uma futura uniformizagao das andlises quantitativas. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS BOUDORESOUE, C.F. Méthodes d'&tude qualitative et quantitative du benthos (en particulier du phytobenthes}. Tethys, 3 (1): 79-104, L971. BOWKER, D.W. & DENNY, P, The seasonal sucession and distribution of epiphytic algae in the phyllosphere of Lema miko’ L. Arch. Hydrobiol., 90(1}: 39-55, 1980. . The spatial distribution of algae on shoots of emergent macrophytes in a Reedawamp in the littoral zone of lake Windermere, Nova Hedwigia, 37: 389-401, 1983. BOWKER, D.W.; TEUTEM, W.; FRY, J.C. A note on “stomaching” for the quantitative sampling of epiphyton. Freshwater Biol., 16: 123-25, 1986. BROWN, H.D. A Comparison of the attached algal communities- 473 - of a natural and an artificial substrate. J. 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