HPLC - Cromatografia líquida de alta eficiência

Química Analítica / JCM

HPLC
 High Performance (pressure) Liquid Chromatography
☺ nas colunas de enchimemto o fluxo é baixo mesmo para granulometrias elevadas (150-200 µm)
 < granulometria < HEPT - exige pressões muito elevadas
☺ mistura de nucleosidos - 1967 - 60 min / 10-20 psig
1969 - 24 min / 400 psig
1 psig = 108 kPa
1970 - 1,25 min / 5000 psig
 Condições actuais:
☺ colunas de 5 a 25 cm com enchimento de 3 a 10 µm
☺ 5000 - 10 000 psig / 40 000 - 100 000 pratos / m

HPLC - tipo de cromatoografia que emprega uma fase móvel líquida e uma fase estacionária finamente dividida e que,
para ter um fluxo razoável, opera a pressões elevadas

Constituíntes

Sistema de Aquisição e
Bombas Injector Coluna Detector
solventes trat. de dados
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Enviar até 11.04.07 para: marques@uma.pt

Validação

Num laboratório de cromatografia com dois analistas foram realizados vários

testes para verificar se o método em uso para a determinação por GC de etanol
em hiclato de doxiciclina (valor teórico: 4,5%) poderia ser considerado válido.
Foram obtidos os seguintes resultados:
 tempos de retenção relativos: metanol: 0,3 / acetona : 0,6 / etanol 1,0
☺ Metanol e acetona são possíveis impurezas
 solução amostra: 12345 / 12450 / 11950 / 12456 / 12100
 Soluções de etanol a: 20%: 3120 / 40%: 4980 / 60%: 7305 / 80%: 9850 / 100%: 12300 /
 120%: 14650
 solução amostra (repetição): 12245 / 12650 / 12405 / 12158 / 12250
 solução amostra (outro dia /analista): 11900 / 13070 / 12347 / 11250 / 12440
☺ Nota: as percentagens indicadas dizem respeito ao valor teórico: 4,5%.

O método é selectivo?

Qual o valor obtido?

Que conclusões poderá tirar quanto à validade do método e à destreza dos
analistas envolvidos na determinação?

Que sugeria para melhorar a confiança no resultado?
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 Resolução

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Desconhecendo a resolução dificilmente se pode dizer se um método é selectivo

Se 4,5 % é a percentagem teórica, corresponde à solução a 100%!!
 Por isso se indicam soluções acima e abaixo deste valor
 Não se pode confundir o significado dos 4,5% e da % das soluções padrão

A maioria dos alunos retirou a solução a 20% que neste caso não seria preciso
 A área foi mudada de 3500 para 3120

Claramente um dos analistas tem falta de formação

 Nota: os resultados de ambos os analistas são exactos mas um deles pouco preciso
 A repetibilidade pode ser boa mas não a reproductibilidade
 A solução não é colocar o bom analista a fazer sempre o método mas dar formação ao outro
analista

Resultado
 Quando se indica que o valor teórico é de 4,5 % significa que se admite que o erro esteja no 5!
☺ Não tem valor indicar um resultado com 3 algarismos significativos
☺ Seria diferente se o valor teórico fosse de 4,50 %
 HPLC

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Sistema de solventes
 desgaseificação / vácuo - hélio (sparging)
 Bombas
☺ bombas de duplo pistão
☺ válvulas proporcionais
☺ câmara de mistura
 eluição isocrática - composição da FM é constante
 eluição de gradiente - composição da FM varia ao longo
do cromatograma
☺ Bombas isocráticas
☺ Bombas binárias
☺ Bombas quaternárias
 Bombas

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Bombas
 pressão elevada (> 6000 psig) - riscos de fugas
 saída contínua (sem pulsação) / pistão
 fluxos de 0,1 a 10 ml/min
 reproductibilidade de fluxo de 0,5% !!
 Injector

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Injector
 o uso de septum é limitado a cerca de 1500 psig
 injecção em loop de volume fixo ( 5 - 500 µl)
☺ típico 20 µl
 Autoinjector
☺ Capacidade de preparação de amostras
 HPLC - colunas

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colunas
colunasde
deaço
açocom
com1010aa30
30cmcmde
decomprimento
comprimentoee44aa10 10mm
mmdedediâmetro
diâmetrointerno
interno
enchimento de 5 a 10 µm / 5000 - 6 000 psig / 40 000 - 60 000 pratos /
enchimento de 5 a 10 µm / 5000 - 6 000 psig / 40 000 - 60 000 pratos / m m

Micro: 3 a 7,5 cm de comprimento / DI = 1 a 4,6 mm / <10 000 psig / 3 ou 5 µm / até 100 000 pratos / m
Vantagens: velocidade elevada e baixo consumo de solventes

Enchimento
 sílica (aglomeração de partículas altamente regulares
☺ eventualm. cobertas por filme orgânico
 alumina / polímeros porosos / resinas permutadoras de iões

3.0 and 4.6mm Standard Super-Link System™

HPLC Columns
 HPLC - enchimentos

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A cromatografia de partição representa a maioria das aplicações

 líquido-líquido: fase estacionária é um solvente adsorvido no suporte (apenas usado
ocasionalmente)
 fase ligada: fase estacionária orgânica está ligada à superfície do suporte por ligações
covalentes (> estabilidade - > uso)

Enchimentos de fase ligada
/ / CH3 / / CH3
- Si -- OH + Cl - Si -- R --Si -- O -- Si -- R ; R = octil (C(8) / octadecil (C18)
\ \ CH3 \ \ CH3

 outros grupos funcionais: aminas alifáticas / éteres / nitrilos / hidroc. aromáticos

 maior estabilidade / apresenta alguma limitação na capacidade de amostra

Cromatografia de fase normal
 fase estacionária polar / fase móvel não polar - o soluto menos polar elui primeiro
☺ água; trietilenoglicol; CN / hexano, éter isopropílico

Cromatografia em fase reversa (+ de 75 % das aplicações)
 fase estacionária não polar / fase móvel polar / soluto mais polar elue primeiro
☺ C8; C18 / soluções aquosas de metanol, acetonitrilo, THF; soluções tamponadas
 Pré-colunas + forno

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Pré-colunas
 aumento da vida das colunas
☺ mesma (similar) composição da fase estacionária / maior granulometria
☺ remoção de partículas e contaminantes dos solventes
☺ saturação da fase móvel com a fase estacionária

Forno de colunas
 TA - 150 C (temperatura ambiente - ou ligeiramente acima - na maioria das
aplicações)
☺ Maior a temperatura menores os tempos de retenção
☺ Maiores temperaturas causam maior degradação da coluna
 para a quantificação a termostatização é essencial (± 0,1 C)
☺ A identificação é essencialmente feita com base nos tempos de retenção
 HPLC

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Detectores HPLC

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 Espectro electromagnético

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A espectroscopia - estudo da interacção da radiação electromagnética com a matéria

Espectro - representação bidimensional da força da interacção vs. energia

raios raios gama raios x UV VIS IV micro ondas ondas rádio

Espectro
cósmicos electromagnético
transições e- internos excitação vibração rotação molecular
nucleares electrónica molecular spin electrónico RMN

λ, cm

Espectroscopia / espectrometria - informação geral / informação

quantitativa
 a espectroscopia está na base do grande desenvolvimento da ciência actual,
desde a química à astronomia
 Fenómenos associados à absorção da luz

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R - Relaxação vibracional

A - Absorção

F - Fluorescência (mesmo spin)

P - Fosforescência (spins dif.)

IC - Conversão Interna (mesmo spin)

ISC - conversão intersistema (spins
dif.)

P aparece sempre a maiores

comprimentos de onda (< E) que F
 Ambos os fenómenos são raros devido
aos tempos de vida muito curtos
 HPLC - detectores

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Os detectores de absorção (UV + Vis) são

usados na maioria das aplicações
 células analíticas
 detector de foto-diodos (diode array)

Sensitivity (toluene) 5x 10-8 g/ml

Sensitivity 1 x 10-7g/ml
Linear Dynamic Range 5x 10-8 to 5 x 10-4 g/ml Linear Dynamic Range 5 x 10-7 to 5 x 10-4 g/ml
Response Index 0.98 - 1.02 Response Index 0.97 - 1.03
UV – comprimento de onda 360nm

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 DAD

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Comparação de espectros UV

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Fluorescência vs. UV

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 HPLC

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Critérios de escolha
 uma boa separação representa sempre um balanço entre as forças intramoleculares que se
estabelecem entre amostra e fases estacionária e móvel
 usar uma fase estacionária com polaridade semelhante à amostra e uma fase móvel de
polaridade muito diferente
☺ o contrário é possível mas menos eficaz (tr geralmente muito curtos)
☺ polaridades idênticas (amostra e fase estacionária) pode levar a tr muito longos
 alterar a polaridade do solvente (mistura) de forma a melhorar a separação

Aspectos experimentais
 temperatura estável para trr reproductíveis
 desgaseificação dos solventes
 2-3 réplicas e soluções padrão
☺ limite de detecção - menor concentração detectável (3x acima do ruído de fundo)
☺ limite de quantificação - menor concentração determinada sem ambiguidade (10x vezes o ruído de
fundo)
☺ Tailing - arrastamento do pico (coeficientes de partilha não lineares)

Cs Cs Cs

Cm Cm Cm
 Trabalho

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Descreva de forma breve o funcionamento de um detector ELSD

 Entregar por mail até 11 de Maio
 Tratamento de amostras

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Amostras puras
 apenas necessitam do solvente apropriado (solubilização seguida de filtração)
☺ o solvente deverá ser semelhante ou mais fraco que o usado na fase móvel
☺ usar THF ou metanol em fase reversa (água) pode provocar perdas de resolução
☺ a escolha do solvente pode ser condicionada pelo detector utilizado

Amostras compostas
 a presença de impurezas não dissolvidas exige, no mínimo, uma filtração
 extração da matriz (excipientes)
☺ necessidade de determinar a % de recuperação
 uso de solventes diferentes do usado na injecção exige reconstituição da amostra
☺ extração / concentração / reconstituição
 pré-colunas / separação de componentes de diferentes polaridades (Sep-Pak)

Amostras biológicas
 caracterizadas por concentrações muito baixas
 precipitação das proteínas (acetonitrilo + centrifugação) / concentração / reconstituição
 SPE

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 LLE

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 Derivatização

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Aminoácidos
☺ Reagente:6-aminoquinolyl-N-hydrozysuccinimidyl
carbamate
 Liberta: N-hydroxysuccinimide (NHS)
☺ Reacção completa num minuto
☺ Derivados estáveis (+ de 1 semana)
☺ Fluorescem a 395 nm

AccQTag column 3.9 x 150mm (waters)

Fluorescence detection with 250 nm excitation, 395 nm
emission
UV detection at 248 nm

A 140mM NaAC, 6.9mM Triethylamine, EDTA (1ml of a

1mg/ml solution per liter) pH to 5.8 w / 5 - 10%
phosphoric acid solution
B Acetonitrile
C Water
Cromatografia preparativa

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 Aquisição e tratamento de dados

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Automação
 o uso de computadores veio aumentar a capacidade de utilização dos aparelhos
 preparação da amostra / injecção / controlo / aquisição / tratamento de dados
☺ sistemas de optimização de separações cromatográficas

Aquisição de dados
 20 - 200 Hz ( > 8 pontos por pico)
☺ para definir um pico são precisos pelo menos
3 pontos a “subir” e 3 a “descer”
 armazenagem (identificação)

Tratamento de dados
 acumulação / “smoothing” / integração / derivatização
 determinação de tempos (tr) e intensidades (áreas / alturas)
☺ integração - definição do princípio e fim do pico
☺ picos mal definidos (falta de resolução e “tailing”)
 correção da linha de base
 tratamento à posteriori
☺ utilizando novos parâmetros (“threshold” / integração)
 não melhora a separação!!