Autor Metabólitos Extração Subst.

cromatografia EM obs
analisados Referencia
E padrão

POELMANS, S., WASCH, K., BRABANDER, H. F., VAN DE WIELE, M., COURTHEYN,
D., VAN GINKEL, L.A. STERK, S.S. DELAHAUT, Ph., DUBOIS, M., SCHILT, R.,
NIELEN, M., VERCAMMEN, J., IMPENS, S., STEPHANY, V., HAMOIR, T., POTTIE, G.
VAN POUCKE, C., VAN PETEGHEM, C. Analytical possibilities for the detection of
stanozolol and its metabolites, Analytica Chimica Acta 473, p.39–47, 2002.
Introdução
Estanozolol é um esteroide androgênico anabólico heterocíclico originalmente
sintetizado por Cliton et al., 1959. Sua estrutura química difere de esteroides endógenos
devido à presença de um anel pirazol fundido ao sistema de anéis androstano. Como a
maioria dos esteroides anabolizantes, o estanozolol possui um comportamento pobre
quando analisado por cromatografia gasosa (CG) além de ser difícil de detectar em
urina. Isso se dá devido à sua rápida metabolização, levando a baixos níveis
concentração da substância original na urina.

OH
CH3

HN
N
Metabolização e métodos de análise
Em 1989, Massé et al. Publicou o primeiro trabalho descrevendo 11 metabólitos
do estanozolol e apontou os que seriam os melhores alvos analíticos. A amostras
passaram por uma hidrólise enzimática de a-glucuronidase / sulfatase seguido por uma
extraíção em fase sólida (SPE) seguida de uma extração líquido-líquido (L-L). As
análises feitas por Cromatografia gasosa - espectrometria de massa (GC-MS)
permitiram a detecção de metabolitos mono- e di-hidroxilados. A maior parte deles são
excretados na urina na forma conjugada e menos de 5% dos metabolitos são
encontrados na fração não conjugada. Os metabolitos mais abundantes identificados na
fração conjugada foram 16α – e 16β-hidroxiestanozolol (16-OHStan), estanozolol e 3’-
hidroxiestanozolol (3’-OHStan).
Em 1990, Mück e Henion desenvolveram um método analítico para a análise do
estanozolol e seus metabólitos em urina equina e humana por CL-EM. Essa abordagem
também foi baseada na hidrólise enzimática para liberar os metabólitos conjugados,
extração L-L subsequente análise por CL em fase reversa acoplada ao EM tandem
(triplo quadrupolo) e ionização por pressão atmosférica (API). O autor chegou a mesma
conclusão, como já descrita por Massé et al., que em urina humana continha Stan não
metabolizado além de metabolitos mono- e di-hidroxilados. Os dados mostraram que os
níveis de 3 -OHStan na urina humana eram mais baixos que os níveis do próprio Stan
e do 16-OHStan, que teve o nível mais alto.
Em 1990, Chung et al. [12] conseguiram identificar a principal forma conjugada
do estanozolol. Ele descreveu que seus metabolitos estavam presentes na forma de
glucuronídeo exclusivamente na urina humana. O autor também relatou que os
principais metabólitos de Stan analisados por GC-MS com monitoramento de íons
selecionado de seus íons característicos foram encontrados como 3 -OHStan e seu
epímero. Isso não corresponde completamente à conclusão de Mück e Henion que
encontraram Stan e 16-OHStan estavam presentes em uma concentração maior que 3
-OHStan.
Em 1996, Schänzer et al. estudaram a eliminação dos metabólitos do stanozolol
na urina de atletas. Ele concluiu que os metabólitos poderiam ser detectados mais do
que o composto original. Os metabólitos, todos conjugados, foram identificados como 3
-OHStan, 4-OHStan e 16-OHStan.
Em um estudo multi-laboratorial usando urina de bezerro, todos os cinco
laboratórios descobriram que a concentração de 16-OHStan em função do tempo foi
semelhante. Os primeiros 4 dias uma concentração estável de 16-OHStan (entre 1 e 4
g kg−1), a partir do dia 4, houve um aumento da concentração detectada até o máximo
(entre 5 e 11 g kg-1) foi encontrado entre os dias 8 e 10. Mais tarde houve uma
diminuição na concentração, mas após o dia 14, 16-OHStan ainda era observado. No
Além do 16-OHStan, também pequenas quantidades de Stan foram observados nas
primeiras horas após a injeção. O metabolito 3 -OHStan foi encontrado apenas em
concentração por alguns laboratórios. Este é o primeiro tabalho indicando que,
dependendo da técnica de separação e detecção utilizados (GC-MS ou LC-MS), podem
existir diferentes interpretações quanto à identificação de metabolitos.
CG-EM
Schänzer et al. 1996 implementaram a espectrometria de massas de alta
resolução (EMAR) na triagem e identificação de metabolitos de estanozolol. Os
metabólitos reunidos foram derivatizados com trimetilsilil para análise GC-MS. GC-MS
também foi utilizado por Ferchaud et al. [7] em 1997 no modo de impacto eletrônico (EI).
O autor usou um procedimento de derivatização do resíduo com MSTFA-TMIS-DTE (N-
metil-N- (trimetilsilil) -triluoroacetamida-trimetiliodosilano-ditiotreitol). Mudando o método
de derivatização usando heptafluorobutiril anidrido (HFBA) em vez de MSTFA – TMIS –
DTE permitiu a detecção de concentrações mais baixas 1 ng l-1) de Stan na urina de
vaca após administração oral. Com GC-MS no monitoramento de íons selecionado
(SIM) modo, Delahaut et al. [14] detectaram dois dos metabolitos, 3-OHStan e 16-
OHStan. Para ambos metabólitos os espectros continham mais de quatro íons
diagnóstico no tempo de retenção correto e nas proporções corretas. No entanto, era
óbvio que o poder de detecção do 16-OHStan foi menor que o de 3-OHStan. Houve
também uma resposta do 4-OHStan no tempo de retenção correto, mas por falta de dois
íons diagnóstico, os dados foram considerados não relevantes. A diferença de poder de
detecção entre os dois metabolitos, 3-OHStan e 16-OHStan, podem ser devidos à
derivatização. Uma possível razão para derivatização incompleta pode ser o
impedimento estérico da grupos hidroxílicos presentes nas posições 16 e 17 em 16-
OHStan [9].
Choi e Chung [15] desenvolveram em 2000, um método para melhorar a
detecção de 3-OHStan e seu 17-epímero como principais metabólitos de Stan na urina
humana por GC-MS. A extração foi baseado em isobutiloxicarbonilação extrativa
(reação isoBOC) combinada com uma extração subsequente de pentano. Essa extração
com uma reação isoBOC levou a excelentes recuperações de ambos os metabólitos. A
injeção de derivados de N-isoBOC-O-TMS do metabolitos resultaram em dois picos
cromatográficos com espectros de massa idênticos no modo de ionização por elétrons
(EI). Em 2001, Haber et al. [16] relataram uma método para automatização da
preparação da amostra e análise GC-MS para androgênicos urinários humanos
esteróides anabolizantes.

Em 1998, foi realizado um estudo multi-laboratorial para estudar a cinética de

excreção de estanozolol e seus metabolitos em bezerros. O experimento compreendeu
três bezerros machos que foram injetados por via intramuscular com dose única de Stan.
Diferentes laboratórios examinados amostras de urina com diferentes extrações e
limpezas procedimentos e avaliou diferentes técnicas analíticas como GC-MS no modo
de ionização negativa e LC-MS-MS. Como mencionado acima, o poder de detecção do
16-OHStan com GC-MS é inferior ao de 3 -OHStan.
Em LC-MS-MS não houve diferença no poder de detecção entre 3 -OHStan e
16-OHStan. Os sinais provenientes do LC-MS-MS de concentrações iguais dos padrões
de referência eram da mesma magnitude para ambos os metabólitos. No entanto, no
cromatograma, 16-OHStan e 3-OHStan co-eluíam. A partir dos espectros, pode-se
concluir que a presença de uma quantidade menor de 3-OHStan foi mascarada por uma
quantidade maior de 16-OHStan. A principal conclusão deste estudo multi-laboratorial
foi que LC-MS-MS parecia ser a melhor escolha como método de detecção do
metabolito 16-OH de Stan.
Em 2000, Van de Wiele et al. relataram a otimização da detecção de Stan e seus
principais metabolito 16-OHStan nas fezes e na urina de gado por LC-MS. O
procedimento de limpeza e extração consistiu em uma extração direta líquido-líquido
para fezes. A urina foi hidrolisada enzimaticamente antes a uma SPE e uma extração
ácida. A intenção dessa extração ácida era produzir um extrato muito mais claro. Sem
essa extração, a matriz suja causou deterioração precoce da coluna cromatográfica e
bloqueio do capilar aquecido do espectrômetro. Os autores discutiram dois métodos
diferentes de detecção com LC-MS-MS. Em um primeira abordagem, o extrato final foi
detectado sem derivatização, enquanto em uma segunda abordagem, uma etapa de
derivatização para 16-OHStan foi incluída. O método de detecção foi otimizado pela
abordagem sem derivação. A ionização por eletropulverização (ESI) parecia para obter
melhores resultados do que a ionização química por pressão atmosférica (APCI). Ao
testar diferentes dispositivos móveis ilustraram que a fase móvel contendo ácido fórmico
era duas vezes melhor que a fase móvel fase contendo ácido acético.
Sem a etapa de derivatização, os resultados MS-MS mostraram muitos íons de
diagnóstico presentes em um padrão específico de grupos (Fig. 3). O passo da segunda
abordagem foi baseado na reação de 16-OHStan com ácido fenilborônico (PBA) (que
era específico para a ligação de compostos contendo diol em solução). Foi formado um
derivado, que no modo APCI produziu um pico intenso de íons e MS – MS, um número
limitado de íons de diagnóstico (Fig. 4).
Este procedimento resultou em cromatogramas sem interferência da matriz em
contraste com o primeiro método. A vantagem do método sem derivatiFig. 3. Espectro
LC-MS2 de 16-OHStan. A razão era que nenhuma etapa extra de derivatização era
necessária. e também que Stan poderia ser determinado. O espectro de 16-OHStan foi
difícil de interpretar devido à matriz interferências. A reação de derivatização teve a
vantagem de produzir espectros com íons abundantes em taxas de íons mais estáveis.
Apenas o metabolito 16-OHStan pode ser derivatizado com ácido fenilborônico. Um
método confiável para a confirmação de Stan e seu principal metabólito 16-OHStan na
urina bovina por LC-MS-MS foi desenvolvido em 2001 por Draisci et al 18] O
procedimento de amostra consistiu em hidrólise enzimática, extração de L-L em
duplicado e purificação usando uma coluna de extração em fase sólida de amino. APCI
no modo de íon positivo foi usado para ionizar os analitos. As moléculas protonadas [M
+ H]+ de Stan (m / z 329) e 16-OHStan (m / z 345) gerados, serviram como íons
precursores para indução de colisão dissociação (CID) nas experiências MS-MS. 3 íons
de diagnóstico para cada analito foram identificados confirmação por monitoramento de
reação selecionado (SRM) LC-MS-MS
TUDELA, E., DEVENTER, K., VAN EENOO, P., Sensitive detection of 3-hydroxy-
stanozolol glucuronide by liquid chromatography-tandem mass spectrometry,
Journal of Chromatography A, 2010
Introdução
Devido à capacidade de melhorar o desempenho físico em esportes, esteroides
anabolizantes androgênicos (AAS) compõe um das classes de substâncias e métodos
proibidos pela Agência Mundial Antidopagem (WADA). AAS pode ser extensivamente
biotransformados através do metabolismo das fases I e II antes de ser excretado pela
urina. Uma das vias metabólicas comumente observada em AAS destaca-se a
glucuronidação.
O estanozolol (17β-hidroxi-17α-metil-5α-androst-2-eno [3,2-c] -pirazol) (STAN)
foi sintetizado em 1959 e ainda é um dos esteróides anabolizantes mais detectados no
controle de dopagem. A estrutura particular do estanozolol, um anel de pirazol fundido
ao esqueleto androstano, o difere da maioria dos AAS. O estanozolol é extensivamente
metabolizado (AONDE) e seus metabólitos urinários podem ser detectados por muito
mais tempo que o composto parental. Os produtos metabólicos de fase I utilizados como
alvos analíticos no controle de dopagem são 3’-hidroxiestanozolol (3-OH-STAN), 4β-
hidroxiestanozolol (4-OH-STAN), 16β-hidroxi-estanozolol (16-OH-STAN) e 4,16-di-
hidroxi-estanozolol (4,16-OH-STAN). Os metabolitos do estanozolol são excretados na
urina como conjugados de glucuronídeo, e, por esse motivo, a hidrólise enzimática
geralmente é aplicada antes da extração. Antes da introdução da cromatografia líquida
acoplada a espectrometria de massas (CL-EM), a detecção era realizada por
cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massa de cromatografia (CG-EM).
No entanto, o CL-EM é, atualmente, a principal escolha para a detecção de metabólitos
de estanozolol em urina de humanos e animais visto que o processo laborioso de
derivatização que precede a análise por CG-EM se tornou desnecessário. Além disso,
devido o anel pirazol se ioniza facilmente durante o processo de electropulverização
(ESI).

O OH OH HO
OH CH3
O
HO O
O
O OH OH
OH CH3 N
O HO
N OH
H H
N
N
H H

a b
 OH
CH3

N
N
H H
O
HO
O
OH
HO
OH O

c
Figura 1 – a) 3’-hidroxiestanozolol (3-OHSTAN) b) 16β-hidroxi-estanozolol (16-
OHSTAN) c) 4β-hidroxiestanozolol (4-OHSTAN) glucuronídeos
O metabólito 4,16STAN, detectado no modo negativo de ionização por ESI
provou ser um bom alvo analítico para a detecção a longo prazo do abuso de estanozolol
nas análises de controle de dopagem. Infelizmente, nenhum padrão comercial está
disponível para este composto e a confirmação de uma amostra suspeita pode ser feita
comparando o tempo de retenção e o espectro de massa com uma amostra de
referência (urina de excreção).
Recentemente, o metabólito 3’-hidroxi-estanozolol glucuronídeo (3STANG)
tornou-se comercialmente disponível como substância de referência. Portanto, o
objetivo deste trabalho foi investigar se o 3STANG intacto pode ser usado para confirmar
a triagem de resultados positivos em sub concentrações (ng mL-1) usando uma única
etapa de extração. Note-se que, ao longo deste trabalho, a concentração de 3STANG é
expressa como equivalentes de agliconas para permitir a comparação direta com outros
trabalhos.
Resultados e discussão
A investigação de espectros de massa de varredura completa no modo ionização
positiva e negativa mostrou vários precursores em potencial para o método SRM. O
modo de ionização negativo produziu uma quantidade de molécula desprotonada [M-H]-
(m/z 519) devido à acidez da fração glucuronídeo. No modo positivo, observou-se um
abundante íon molecular protonado [M + H]+ (m / z 521) devido a afinidade de prótons
do anel pirazol. Além disso, um aduto [M + Na]+ e [2M + H]+ foram observados no modo
positivo e [2M-H]- no modo de ionização negativa. No entanto, devido a baixas
intensidades (<10%), esses íons não foram mais investigados e apenas os protonados
e íons desprotonados foram selecionados para experimentos de varredura completa de
MS / MS.
A fragmentação do 3STANG produziu a perda da fração glucuronideo a baixas
energias de colisão. A fragmentação deste foi observada nos modos positivo e negativo,
produzindo o correspondente aglicona a m/z 345 e m/z 343, respectivamente (figura 2
a, c). Essa fragmentação também foi descrita anteriormente para outros esteróides
glicuronídeos. A otimização automática (dados não mostrados) da energia de colisão
para a perda do grupo glucuronídeo no modo positivo resultou em um valor de 26 eV.
No entanto, durante esses experimentos, observou-se que, apesar de uma intensidade
20% menor, uma energia de colisão de 40 eV aumentou o S / N em 50%. Por esse
motivo, o último valor foi utilizado durante a validação. Incremento adicional do CE, no
modo positivo, produziu um padrão de fragmentação semelhante à aglicona com um íon
abundante em m/z 97 (figura 2d). A origem deste fragmento foi descrito em outros
trabalhos. Incremento adicional da CE no modo negativo produziu íons em m / z 85, 113
e 175 que se originam da fragmentação da porção glucuronídeo (figura 2b). Esses íons
eram de baixa abundância e não foram usados em experimentos adicionais.
 Figura 2 - Espectros de íons do produto para 3STANG: no modo de ionização
negativa a 20 eV (a) e 30 eV (b) e no modo de ionização positiva a 20 eV (c) e 80 eV
(d)
Em uma segunda etapa, comparou-se o comportamento do 3STANG e 3STAN
frente a espectrometria de massa. Portanto, as soluções equimolares de ambos foram
analisadas em EM de varredura completa. Comparação dos espectros mostraram
eficiência de ionização semelhante nos modos positivo e negativo. Portanto, conclui-se
que a presença do grupo glucuronídeo não melhora as propriedades de ionização. No
entanto, a comparação das configurações otimizadas SRM mostrou que a transição,
correspondente à perda do glucuronido (521/345), é dez vezes mais abundante que o
fragmento mais abundante de 3STAN, i.e. 345/97. O ion produto 97 obtido da 3STANG
e 3STAN tiveram intensidade comparável. O íon produto 343 em modo negativo também
teve aproximadamente a mesma intensidade que o 97 sendo 10 vezes menor que o
345. Finalmente, os íons 345, 97 (modo positivo) e 343 (modo negativo) foram incluídos
no método SRM foram utilizados na validação do método. As configurações
espectrométricas de massa são exibidas na tabela 1.

Condições cromatográficas
Inicialmente, uma coluna Omnispher C18 (100 mm x 2 mm) foi selecionada
devido aos bons resultados para a análise de metabólitos de estanozolol. No entanto,
durante o desenvolvimento do método, foi observada uma interferência no tempo de
retenção do produto íon 343 em algumas urinas. Infelizmente, a origem da interferência
não pôde ser explicada. A alteração do programa de eluição cromatográfica não permitiu
a separação da linha de base da interferência do 3STANG. Quando a coluna foi
substituída por outra coluna mais curta (Sunfire C18, 50mm x 2,1 mm) a interferência
não pôde mais ser detectada.
Outro problema observado durante o desenvolvimento do método foi que o o
tempo de retenção do 3STANG deslocou aproximadamente 0,2 min à frente do
cromatograma em algumas amostras de urina em comparação com uma amostra de
referência. Essa diferença excedeu a variação tolerada (0,1 minutos) em comparação
com uma amostra de referência analisada, não cumprindo os critérios de confirmação.
Essa mudança para frente no tempo de retenção também foi observada para o
I.S. ETGd3, mas não para PROSTAN. Isso sugere que a mudança está relacionada com
a fração do ácido glucuronídeo e apoiou a escolha para ETGd3 como I.S para
cromatografia. Apesar do ETGd3 mostrar uma mudança semelhante, também o RRT-
critério (diferença máxima permitida de 1%) não foi preenchido. Esse efeito foi atribuídos
à interação com a matriz urinária extraída. Para melhorar a reprodutibilidade do tempo
de retenção, a quantidade de HOAc na solução usada para ressuspender a porção
evaporada após a extração foi aumentada de 0,1% para 5%. Dessa maneira, tanto a
amostra de referência quanto os extratos urinários apresentaram o mesmo pH. Essa
alteração gerou variações no tempo de retenção inferiores a 0,1 min em comparação
com uma amostra de referência autêntica. Também foram satisfeitos os critérios de RRT
(?).

Preparação de amostra
3STANG contém uma estrutura zwitteriônica que dificulta a recuperação
eficiente por extração líquido-líquido (LLE). Portanto, a extração em fase sólida (SPE)
era obrigatória. Devido comportamento da porção ácida glucuronídeo e o caráter básico
do grupo pirazol, ambos SPE catiônica e aniônica podem ser aplicadas. Como as
colunas de troca catiônica foram utilizados com sucesso para a extração de metabólitos
de estanozolol foi preferido esse tipo de sorvente.
Inicialmente, foi aplicada uma abordagem de extração descrita anteriormente.
No entanto, o 3STANG não pôde ser recuperado dos cartuchos. A investigação das
etapas de lavagem mostrou que a lavagem de segundos, usada para remover
interferências polares básicas (NH4OH a 5% em MeOH / H2O 20/80) eluíram o 3STANG.
Portanto, apenas uma lavagem básica com NH4OH a 5% em H20 foi feita.
Devido à ausência de um derivado isotópico do 3STANG, duas substâncias
foram selecionados para fins de controle de qualidade: o prostanozol foi usado para
controlar a SPE enquanto o ETGd3 foi usado para controlar a cromatografia (figura 1).

Discussão
A abordagem apresentada aqui apresenta melhorias significativas em
comparação com as anteriores, permitindo a confirmação do uso indevido de
estanozolol em concentrações muito baixas em humanos urina usando uma etapa de
extração sem a necessidade de hidrólise enzimática. Comparando o LOD observado, o
método se mostrou 10 vezes mais sensível que os anterior descritos.
A melhoria significativa em comparação com os outros métodos de detecção
deve-se provavelmente a um combinação de fatores. A presença de um íon produto
adicional (521/345) com uma intensidade 10 vezes maior que a 345/97 contribui para a
o aumento da sensibilidade do método. A principal dificuldade na confirmação do 3STAN
reside no fato de que sua mais intensa transição (345/97) é aproximadamente 5 vezes
mais abundante que a segunda mais intensa transição (345/121).
Embora uma transição possa ser suficiente para a identificação, se provada a
singularidade dessa transição, normalmente dois íons de diagnóstico do produto
precursor são usados para confirmar uma AAF. Além disso, a ausência de hidrólise
enzimática, a alta recuperação da extração e o efeito de matriz baixa também contribui
para a sensibilidade. Finalmente, a ausência de um tempo O consumo da etapa de
hidrólise (geralmente de 1,5 a 2,5 h) também melhora o tempo de resposta.
A aplicação do método a um estudo de administração mostrou, na amostra,
administração prévia de 2 mg de estanozolol, sem pico no tempo de retenção de
3STANG. Nas amostras pós- Administração, o 3STANG pôde ser detectado com
sucesso até 240 horas (10 dias) após a ingestão (figura 3). Isso significa um
prolongamento do tempo de detecção de quase 50% em comparação com outro para
detectar a aglicona 3STAN.
 Figura 3: Amostra de administração após 240 h: (a) amostra de administração prévia; (b) amostra
pós-administração, 240 h; (c) solução padrão de 3STANG a 3 ng mL-1

O método validado também foi aplicado a um AAF para o qual 4,16STAN foi
observado como o metabolito mais abundante durante a análise de rotina. 3STANG foi
identificado e o tempo de retenção e a razão entre as transições de íons também
cumpriram os critérios da WADA em comparação com um aumento urina a 50 pg mL-1
(Figura 4)

Figura 4: Achado analítico adverso: (a) urina negativa; (b) AAF; (c) urina com cravos a 50 pg mL-
1
Conclusão
Um método sensível para a detecção de 3'OH-estanozolol glucuronido foi
validado. Considerando os critérios de identificação da WADA, foi obtido um LOD de 50
pg mL-1. este LOD baixo pode ser atribuído à presença de uma transição abundante e
específica adicional.
A omissão da etapa de hidrólise enzimática, baixo efeito da matriz e alta
recuperação da extração também contribuem para o aumento da sensibilidade do
ensaio. O método também foi aplicado com sucesso a amostras positivas e excreção
de amostras de urina mostrando um aumento nos tempos de detecção de 50% em
comparação com a detecção da aglicona.

SCHÄNZER, W., GUDDAT, S., THOMAS, A., OPFERMANN, G., GEYER, H.,
THEVIS, M., Expanding analytical possibilities concerning the detection of
stanozolol misuse by means of high resolution/high accuracy mass spectrometric
detection of stanozolol glucuronides in human sports drug testing Drug Test.
Analysis, 2013.
Introdução
 Métodos de expansão da janela de oportunidade para detectar o uso ilícito de
esteróides anabolizantes e androgênicos (AAS) nos esportes foi objeto de intensa
pesquisa por mais de 25 anos em doping controles. Entre esses AAS, o estanozolol
(Figura 1, 1), em particular provou ser um desafio devido às suas propriedades físico-
químicas peculiares (resultante da condensação do anel A esteroidal com um pirazol),
complicando a detecção anteriormente empregada exclusivamente ensaios baseados
em cromatografia gasosa-espectrometria de massa (GC-MS).

Em 1986, as análises para determinação do estanozolol em urina foi extendida

para a utilização de seu principal metabólito referido como 3’-OH-estanozolol (Figura
1, 2) como demonstrado por Schänzer e Donike. Esse estudo deu início a
investigações mais aprofundadas acerca dos caminhos metabólicos desse esteroide
sintético. Tais trabalhos tem como principal objetivo encontrar alvos analíticos
provenientes do processo de biotransformação da substância original visando
aumentar a janela de detecção dessa substância no organismo mesmo após a
interrupção de seu uso por atletas de elite.
As características moleculares do estanozolol e seus metabólitos exigem um
processo de derivatização sofisticado e métodos GC-MS refinados. A estrutura
molecular do estanozolol provou ser extraordinariamente vantajoso em abordagens
baseadas em cromatografia líquida acoplada a espectrometria de massas por
ionização por electropulverização por spray (tandem) [LC-MS (/ MS)] -,resultando na
diminuição contínua limites de detecção (LODs) e janelas de detecção com expansão
espectros de analitos alvo, sendo a mais recente contribuição a análise do 3’-OH-
estanozolol glucuronídeo (Figura 1, 3) analisado a 25–50pg / ml em urina humana. No
presente estudo, o uso de espectrometria de massa de alta resolução / alta precisão
para a detecção de glucuronídeo de 3'-OHstanozolol é descrito e informações
complementares sobre os metabólitos de glucuronídeo conjugado a N do estanozolol e
17-epistanozolol e o uso destes em controles rotineiros de doping são fornecidos. O
metabóli n-glicuronídeo foi observado e caracterizado através das amostras de urina
de excreção. Para fins de confirmação, o N-glucuronídeo foi sintetizado quimicamente
através da reação de Koenigs-Knorr e servidos para fins de identificação desses novos
compostos-alvo. Finalmente, a utilidade do 3’-OH-estanozolol glucuronido e
glucuronidos conjugados a N de estanozolol e O 17-epistanozolol no teste de drogas
esportivas foi demonstrado com 85 resultados analíticos adversos sobre o uso
indevido de estanozolol dentro de seis meses. Além disso, o comportamento de
dissociação e a massa características espectrométricas do 16-oxo-estanozolol (Figura
1, 4) após a ionização por eletrospray ESI e ativação colisional foram estudados,
permitindo sua diferenciação dos derivados 17-hidroximetil pelos eliminação
diagnóstica de 30 Da atribuída ao grupo C2H6.
Resultados e discussão
Análise do glucuronido de 3’-OH-estanozolol
Devido à disponibilidade comercial do 3’-OH-estanozolol glucuronídeo (Figura 1,
3), o composto de referência foi utilizado para estudos preliminares por LC-MS / Estudos
de EM, para otimização do método, validação e confirmação de resultados analíticos
adversos (AAF). O tempo de retenção do estanozolol foi de 5,57 min Figura 2a) e sua
identidade comprovada pelas transições de íons de m / z 521 - 345 e 521 - 97 usando
as massas exatas respectivas com erros <5 ppm.
Identificação de metabólitos complementares de estanozolol
Para melhorar a janela de detecção do uso indevido de estanozolol nos esportes,
foi realizado um estudo de excreção no qual amostras de urina foram colhidas após a
administração oral de 5 mg de estanozolol e as amostras foram analisadas por LC-MS
/ MS de alta resolução / alta precisão capacidade nos modos MS e MS / MS. De acordo
com protocolos de teste iniciais anteriores, amostras de urina foram injetadas o sistema
LC-MS / MS sem preparação adicional da amostra, exceto pela adição do padrão interno
metiltestosterona (a 100 ng / ml).
Experimentos de varredura de íons de produtos direcionados em íons
precursores de vários metabólitos diferentes (hipotéticos) incluindo particularmente o (s)
glucuronido (s) do estanozolol e os seus 17-epímero (íon precursor [M + H] + em m / z
505,29) e hidroxilado metabólitos da fase I (íon precursor [M + H] + em m / z 521,29)
produziram uma série de sinais atribuídos aos metabólitos de estanozolol por meios de
massas precisas das moléculas protonadas intactas e os respectivos aglomerados
obtidos por ativação colisional. Uma típica amostra pós-administração (5 dias) e uma
amostra de urina em branco são mostrados na Figura 2.

Figura 2 - Cromatogramas de íons extraídos de a) uma amostra pós-administração coletada 5 dias

após a aplicação de 5 mg de estanozolol b) uma urina em branco. Os pares de íons precursores-produto m
/ z 505 - 329 e 521 - 345 foram escolhidos para monitorar os conjugados de ácido glucurônico de (epi)
estanozolol e análogos hidroxilados, respectivamente. Em todas as análises, o padrão interno
(metiltestosterona) foi registrado com o par íon precursor-produto m / z 303 - 109. De acordo com massas
precisas de íons precursores e de produtos, experimentos de hidrólise e comparação com padrões de
referência, estruturas foram atribuídos conforme indicado ao lado de cada pico.
Tudela et al., 2013 relatou a utilização do 3’-OH-estanozolol glucuronídeo,
disponível como material de referência, como um alvo analítico válido para fins de
controle de dopagem. No entanto, a caracterização dos derivados metabólicos aqui
apresentados exigiu a combinação de esforços de experimentos de hidrólise, síntese e
interpretação dos espectros de massa MS/MS.
 Os cromatogramas e espectros MS / MS em m / z 505.29 resultaram em três
sinais distintos, como mostrado na Figura 2a (em cima). O estanozolol compreende um
grupo hidroxila em C-17 e, portanto, esperava-se produzir um conjugado de ácido
glucurônico; no entanto, a origem das duas espécies adicionais com fórmulas idênticas
deveria ser esclarecida e a estrutura do composto 17-O-glucuronidado verificado.
Portanto, uma amostra de urina contendo predominantemente a substâncias eluídas
aos 5,14 e 5,53 min (3 h após a administração amostra) (Figura 4a topo) foi submetida
a hidrólise enzimática com β-glucuronidase que cliva os conjugados de esteróides do
ácido β-O-glucurônico. Após a hidrólise, a amostra de urina foi analisada novamente,
demonstrando o desaparecimento do pico 1 (5,14 min) enquanto o pico 2 (5,53 min)
permaneceu em sua abundância inicial (Figura 4a, meio).
HO OH O OH
O
OH
OH HO
HO O CH3
O
O O OH
CH3
O

N
N
N N
H H
H H

Stan-glucuronídeo 17-epistanozolol-glucuronídeo

Figura 3 – estruturas do Stan-glucuronídeo e 17-epistanozolol-glucuronídeo

Figura 3. (a) Cromatogramas de íons extraídos de uma amostra coletada 3 h

após a administração 5 mg de estanozolol, indicando a presença de estanozolol-O-
glucuronido (aos 5,14 minutos) e estanozolol-N-glucuronideo (aos 5,53 minutos). Após
a hidrólise enzimática, o primeiro pico de eluição desapareceu, apoiando a atribuição
estrutural como o 17-O-glucuronido. Os íons correspondentes do produto de ambos os
compostos são representados em (b) (superior e média, respectivamente), além do
espectro de íons produto atribuído ao 17-epistanozolol-N-glucuronídeo (inferior).
Enquanto o estanozolol-O-glucuronido (superior) foi dissociado com uma energia de
colisão de 45 eV, o estanozolol (médio) e o 17-epistanozolol-N-glucuronido (inferior)
foram dissociado a 35 eV.
 Concluiu-se, portanto, que o pico 1 correspondia à 17-O-stanozolol
glucuronideo enquanto o pico 2 era atribuído a um conjugado de ácido glucurônico não
hidrolisável portando a fração glucuronídeo em um átomo de nitrogênio do grupo
pirazol. Os espectros de massa de íons produto dos analitos são representados na
Figura 3b e não revelou diferenças significativas que poderiam permitir localizar o local
da conjugação; no entanto, o suposto estanozolol-O-glucuronido (Figura 3b, em cima)
exigiu mais energia de colisão para dissociar (CE = 45 eV) do que o correspondente
estanozolol-N-glucuronídeo (Figura 3b, meio) e 17-epistanozolol-N-glucuronídeo
(Figura 3b, fundo), que foram ativados colisionalmente somente com 35 eV. Sob
valores crescentes de CE (como mostrado nas inserções medido em CE = 65 eV),
metabolitos conjugados N e O rendeu os íons do produto de diagnóstico de
estanozolol (por exemplo, m / z 81.0452)
Para apoiar a suposição de que o N-estanozolol-glucuronido foi encontrado na
amostra pós-administração, a síntese química foi conduzidos de acordo com os
protocolos estabelecidos pela Koenigs-Knorr aproximação. O acesso
estereoquimicamente impedido às funções 17-hidroxi de Esteróides 17-alquilados
(como, por exemplo, metiltestosterona) resultam em
rendimentos modestos de 17-O-glucuronídeos desses compostos. [22,23] em
No caso do estanozolol, essa foi uma vantagem particular, pois o principal
o produto obtido correspondeu ao pico 2 (Figura 3a, parte inferior),
que também se mostrou resistente a condições de hidrólise enzimática como
aplicado à amostra de urina (dados não mostrados). Baseado em
observa-se que 17-epímeros de AAS típico (isto é, 17β-metil-17α-
hidroxi-esteróides) geralmente representam as espécies eluidoras posteriores
Sistemas LC operados sob condições convencionais de C-18 RP, pico
3 (Figura 2a, em cima) foi atribuído ao 17-epistanozolol-N-glucuronido,
cujo espectro de massa de íons do produto é mostrado na Figura 3b
(inferior). Para corroborar esse pressuposto, uma amostra de urina pós-
administração coletada após 7 dias, que continha
quase exclusivamente o pico 3, foi submetido a hidrólise química
após remoção de todo o estanozolol não conjugado e glucuronidado
metabolitos passíveis de clivagem enzimática (vide supra). Por
Como meio dessa estratégia, N-glucuronídeos foram isolados e
subsequentemente hidrolisados por ácido clorídrico aquoso. A análise
demonstrou a presença de 17-epistanozolol não conjugado
e 18-norstanozolol (o produto de degradação obtido de
tratamento ácido do estanozolol 17-epimérico), [24] os quais foram
confirmado por comparação com substâncias de referência e, portanto,
fornecendo evidências para a composição assumida do pico 3 como
 17-epistanozolol-N-glucuronido (dados não mostrados).
A atribuição de estruturas aos O-glucuronídeos observados (Figura 2)
de 16β-OH-estanozolol, 3’-OH-estanozolol, 17-epi-3’-OH-estanozolol e
4β-OH-estanozolol foi realizado por referência na literatura [13]
e material de referência disponível, bem como íons de produtos para
diagnóstico
conhecido pelos diferentes analitos de estudos anteriores.
Aqui o
íons de produto em m / z 81, 97 e 145 são particularmente característicos
para os glucuronídeos do 16β-OH estanozolol (devido à não modificação
Porção A-ring / pirazol), 3’-OH-estanozolol e 17-epi-3’-OH-estanozolol
(devido ao resíduo de pirazol hidroxilado) e 4β-OH estanozolol
(Clivagem do anel B e eliminação da água), respectivamente. Além disso,
todos esses glicuronídeos foram hidrolisados sob a influência de
β-glucuronidase, que substanciaram ainda mais a proposta
composições.
Achados recentes de metabólitos de longo prazo gerados a partir de
17-metil-17-hidroxi-esteróides, como metandienona, [26]
oxandrolona, [27] desidroclorometilestestosterona, [28] e
oximetolona, [29] alimentou a busca por metabólitos análogos em
caso de estanozolol. Uma característica comum dos metabólitos de longo
prazo acima mencionados, sob condições ESI-MS / MS, é a eliminação de
formaldeído (30 Da), [26] que também serviu de indicador no
presente estudo. No espectro de massa iônica do produto do precursor
íon [M + H] + em m / z 519, que foi atribuído a um hidroxilado
análogo glucuronidado de 17-hidroximetil, 17-metil-
18-norstanozolol, o íon do aglicônio foi observado em
m / z 343.2369 com a composição elementar determinada experimentalmente
de C21H30O2N2. Além disso, um íon de produto em m / z 313.1899
(- 30 unidades de massa, Figura 4a) estava presente. No entanto, a precisão
massas revelaram a diferença de C2H6 em vez de CH2O entre
m / z 343 e 313, demonstrando que as espécies analisadas não eram
17-hidroximetil, 17-metil-18-norstanozolol, mas 16-oxo-estanozolol
 compreendendo a mesma composição elementar corroborada por
a análise da respectiva substância de referência (figura 4b). o
sugeriu-se que uma perda peculiar de etano (30 Da) se originasse
o anel D esteróide incluindo C-18 e C-20 e a introdução de uma ligação dupla
C-13 - C-17, como mostrado esquematicamente na Figura 4c.
Aqui, a rotulagem de deutério de C-18 ou C-20 forneceria
informações adicionais e serão objeto de estudos futuros.
Estudo de eliminação análise de amostras de urina
Para estimar a utilidade dos metabolitos recentemente identificados para
prolongar e / ou melhorar a detecção de abuso de estanozolol, a
rastreabilidade do estanozolol-O-glucuronido (diamante, linha sólida),
estanozolol-N-glucuronida (círculo, linha tracejada), 17-epistanozolol-
Nglucuronida (triângulo, linha sólida), 16β-OH-estanozolol-O-glucuronida
(diamante, linha tracejada), 4β-OH-estanozolol-O-glucuronido (círculo,
linha sólida) e 3’-OH-estanozolol-O-glucuronido (linha quadrada e tracejada)
pelo método de triagem mencionado acima ("diluir e injetar") foi
avaliados em amostras de urina do estudo de administração. Na Figura 5, o
intensidades (escala logarítmica) dos sinais do analito foram plotadas
momentos da amostragem de urina, demonstrando consideravelmente mais
tempo
visibilidade do 17-epistanozolol-N-glucuronido que foi detectado
a 672 h (28 dias) após a administração
Caracterização / validação de métodos
Antes de aplicar o glucuronido de 3’-OH-estanozolol, bem como o
metabólitos complementares para controle do doping, a
adequação ao objetivo das abordagens iniciais de teste e confirmação
foram determinados. As características dos métodos resultantes e
parâmetros validados estão resumidos na Tabela 1. A especificidade foi
demonstrado para ambos os métodos por meio de 20 urina em branco
amostras (10 homens e 10 mulheres), onde não há sinais de interferência
foram observados (Figura 2a, à direita). O limite de detecção (LOD) foi
determinado por injeção de 10 amostras diferentes de urina em branco
20 pg / ml e 5 pg / ml com 3’-OH-estanozolol-O-glucuronido e
 análise subsequente com o teste inicial e confirmação
ensaio, respectivamente. Desde a avaliação da relação sinal / ruído
Não foi encontrada uma abordagem razoável devido à falta de informações
biológicas.
"Ruído", a presença do íon aglônio (m / z 345) e o
íon característico do produto derivado do anel A em m / z 97 (vide supra)
foi considerado obrigatório. A supressão de íons foi determinada por
comparando seis amostras diferentes de urina com 100 pg / ml de
3’-OH-estanozolol-O-glucuronido (testado com ambos os
método de teste e confirmação) com padrão sem matriz
soluções em concentrações correspondentes. O efeito da matriz
variou consideravelmente entre as amostras individuais e
variou de 3 a 45% (triagem) e 15 a 84% (confirmação).
Embora o método tenha se mostrado suficientemente robusto nessas
condições
padrões internos rotulados para os analitos-alvo
deve ser levado em consideração. De acordo com o Padrão Internacional para
Laboratórios, [30] intra-dia (14,8%, 9,0% e
7,4% para concentrações baixa, média e alta, respectivamente)
e inter-dia (16,1%, 9,7% e 6,8% para baixa, média e alta
concentrações, respectivamente) foram determinadas imprecisões,
demonstrando ainda mais a capacidade de identificação do metodologia
aplicada. Além disso, uma resposta linear do analito
com aumento da concentração na matriz da amostra
cobrindo a faixa de concentração de 25 a 150 pg / ml
(R2 = 0,9956). A recuperação do 3’-OH-estanozolol-O-glucuronido
foi encontrado para ser de 94%.
Amostras de controle de doping de rotina
Com as metodologias estabelecidas, um total de 659 dopagens de rotina
amostras de controle foram testadas quanto à presença de metabólitos de
estanozolol por um período de seis meses. No total, 85 analíticas adversas
achados (AAFs), apenas 13 dos quais teriam sido
observado pelo teste GC-MS / MS usado alternativamente. Exemplarmente,
os resultados de um dos 85 AAFs são ilustrados na Figura 6.
 Empregando a abordagem de rastreamento rápido por injeção direta,
estanozolol-O- (5,27 min) e N-glucuronido (5,58 min), bem como
16β-OH-estanozolol-O-glucuronido (4,93 min), 3’-OH-estanozolol-Oglucuronida
(5,58 min) e 3’-OH-17-epistanozolol-O-glucuronida
(5,88 min) (Figura 6, à esquerda), enquanto a confirmação
O método permitiu ainda a identificação de 17-epistanozolol-Nglucuronídeo
(5,93 min, Figura 6, à direita). Todos os compostos foram
monitorados com os respectivos pares de íons glucuronídeo / aglicônio usando
alta resolução / alta precisão, ou seja, m / z 505.2910-329.2585 no caso de
de estanozolol / 17-epistanozolol em m / z 521.2858-345.2537 para a
metabolitos mono-hidroxilados e glucuronidados do estanozolol.
Além disso, pelo menos um íon de produto de diagnóstico indicativo para o
a estrutura esteróide (por exemplo, m / z 81, 97 ou 145, vide supra) foi
registrada.
Todos os AAFs foram confirmados pela análise direcionada do glucuronídeo de
3’-OHstanozolol, suportados e corroborados pelo
padrões de metabolito de estanozolol-glucuronido observados na urina
amostras. A eliminação do ruído de fundo interferente foi
realizada extraindo o íon do produto de alta resolução /
espectros de massa de alta precisão usando janelas de ± 5 ppm.
Conclusão
No presente estudo, a utilidade da análise direta do ácido glucurônico
conjugados de estanozolol por meio de cromatografia líquida e
espectrometria de massa em tandem de alta resolução / alta precisão em
esportes
teste de drogas foi avaliado e demonstrado. Caracterizado e
validado por meio de 3’-OH-estanozolol comercialmente disponível
glucuronido, métodos iniciais de teste e confirmação foram
estabelecido, o que permitiu a identificação inequívoca de
abuso de estanozolol em amostras de controle de doping de rotina. Além disso,
dois novos metabólitos a longo prazo para a detecção de abuso de estanozolol
foram observados em amostras de urina do estudo de administração. Estes
analitos alvo complementares, designados como estanozolol-N-glucuronido e
17-epistanozolol-N-glucuronídeo, foram caracterizados por espectrometria de
massa, síntese química e experimentos de hidrólise, e ambos
 mostrou-se particularmente útil como compostos-alvo, permitindo a
determinação do abuso de drogas por até 28 dias após a administração
de 5 mg de estanozolol. Empregando as abordagens caracterizadas para
rotineiros de drogas esportivas, 85 achados analíticos adversos
estanozolol em apenas 659 amostras (13%) foi relatado durante um período
de 6 meses, demonstrando a enorme utilidade do sistema estabelecido
protocolo. Como a espectrometria de massa de alta resolução / alta precisão
foi considerado essencial para a identificação bem-sucedida
quantidades mais baixas de metabolitos de estanozolol na urina humana,
maior alargamento da sua implementação aos controlos antidopagem é
encorajados.
THEVIS, M., DIB, J., THOMAS, A., HÖPPNER, S., LAGOJDA, A., KUEHNE,
D., SANDER, M., OPFERMANNA, J., SCHÄNZER, W., Complementing the
characterization of in vivo generated N-glucuronic acid conjugates of stanozolol by
collision cross section computation and analysis, Drug Test. Analysis v.7, 1050–1056,
2015.

Introdução
Os esteróides anabolizantes-androgênicos (AAS) representam os classe
detectada de drogas usadas para melhorar o desempenho ilegalmente na elite esporte
[1] e seu metabolismo e eliminação tem sido um dos principais objeto de pesquisa
antidoping há mais de 25 anos. [2–7] Neste contexto, a caracterização dos metabolitos
a longo prazo, em particular recebeu um interesse particular [8–12], pois permitiram
retrospectividade ampliada na descoberta do uso indevido de AAS no passado. [13]
Além dos produtos metabólicos da fase I, os metabólitos da fase II como conjugados
de ácido glucurônico, tornaram-se alvo viável analitos em controles de doping. [14–20]
No entanto, a localização do local da conjugação por meios espectrométricos
puramente de massa foi complicada, [21,22] especialmente quando a ionização e / ou
dissociação induzida por colisão (CID) causam a eliminação imediata da porção
conjugada do núcleo esteróide. Consequentemente, informações adicionais aos
tempos de retenção e dados espectrais de massa é desejável que apóie a
caracterização completa dos metabólitos presente em matrizes biológicas, como o
controle antidoping de amostras de urina.
Aqui, a mobilidade iônica (IM) demonstrou fornecer recursos ortogonais
e complementar às abordagens analíticas de rotina existentes. [23–25]
IM permitiu a rápida separação (ms) de espécies isoméricas no
com base em suas propriedades de deriva contra um gás de deriva neutro (por
exemplo, He, N2,
ou CO2), denominada seção transversal de colisão (CCS), sob o
 influência de um campo eletrônico fraco. [26,27] Portanto, o MI fornece
informações específicas.
informações sobre conformação estrutural e, portanto, atualmente
usado em diversas áreas de pesquisa e aplicações com uma ampla gama
de compostos de baixo peso molecular até mega do tamanho de Dalton
estruturas biológicas, incluindo a detecção rápida de produtos químicos
águas residuais e ar, determinação de estruturas de peptídeos e proteínas,
análise de compostos farmacêuticos e estudos sobre petróleo bruto. [28–37]
No presente estudo, a espectrometria de mobilidade de íons de ondas viajantes
(TWIMS) com nitrogênio como gás de tração em interface com um
espectrômetro de massa em tempo de vôo em quadrupol (QqTOF) foi usado para
gerar
informações sobre o local da conjugação dos glucuronídeos de estanozolol
observado em amostras de urina pós-administração e em amostras autênticas
de controle de doping. Portanto, tempos de desvio de cinco diferentes, mas
determinados glucuronídeos AAS conhecidos estruturalmente relacionados
foram determinados,
Os CCSs correspondentes foram calculados por meio de ferramentas de
software de modelagem (ORCA e MOBCAL), empregando o conjunto de dados de
B3LYP / 6-31G, [38–42] e uma curva de calibração para glicuronídeos AAS
foi criado. Posteriormente, os tempos de deriva dos glucuronídeos de
estanozolol foram medidos e os CCSs obtidos experimentalmente foram
em comparação com estruturas plausíveis e respectivos CCSs computados,
permitindo apoiar a atribuição de posição da conjugação de estanozolol
relatada em estudos anteriores.
medições de tempo de deriva de cromatografia líquida (LC-TWIMSMS / MS) e
cálculo de CCS para cinco padrões de glucuronídeo AAS
Os cinco glicuronídeos AAS da 19-nortestosterona, testosterona,
metiltestosterona, boldenona e 3’-hidroxiestanozolol foram estudados por LC-
TWIMS-MS / MS para preparar um tempo de desvio / calibração CCS teórica para
análogos estruturais (Tabela 1). Sob o escolhido
condições baseadas em uma velocidade de onda de 500 m / s, a deriva
observada
os tempos variavam de 65 a 80 caixas (3,5 a 4,2 ms) (Figura 1). Configurações
alternativas de velocidade de onda foram testadas, mas apresentaram deriva
semelhante
desempenhos de separação de tempo (dados não mostrados). 19-
Nortestosterona
 o glucuronido produziu o menor tempo de deriva (66,05 caixas; 3,57 ms)
enquanto o glucuronídeo de 3'-hidroxi-estanozolol, portador da fração de
pirazol hidroxilado saliente, deu origem ao maior tempo de deriva (77,34
caixas; 4,18 ms) dos compostos modelo. Para os esteróides 19-
nortestosterona, testosterona, metiltestosterona e boldenona
compreendendo sistemas π-elétrons conjugados compostos por um 3-oxo-
Funcionalidade 4-eno ou 3-oxo-1,4-dieno, a maior afinidade de prótons
e, portanto, o local de protonação mais provável [50] foi atribuído ao oxigênio
da estrutura do anel A esteroidal com afinidades de prótons variando
entre 939,8 e 961,4 kJ / mol (Tabela 1). Portanto, os cálculos do CCS
foram iniciados a partir de uma estrutura específica para cada um desses
glucuronídeos. No caso do glucuronido de 3’-hidroxi-estanozolol, vários
estruturas protonadas eram concebíveis devido à presença de um
sistema aromático contendo dois átomos de nitrogênio, resultando em 12
estruturas potenciais diferentes do analito protonado. Uma minimização da energia da
estrutura pelos cálculos de DFT para todas essas espécies foi
realizada, produzindo uma estrutura particularmente favorecida com um próton
afinidade de 1074,3 kJ / mol. Usando esses dados, uma curva de calibração foi
criado com a equação de y = 44,131x + 23,397 (R2 = 0,986).
Medições por cromatografia líquida-tempo de deriva (UPLCTWIMS-MS / MS) e
cálculos de CCS para estanozolol
glucuronídeos
De acordo com relatórios de estudos anteriores, três principais ácidos
glicurônicos
conjugados de estanozolol foram detectados em uma amostra de urina pós-
administração de estanozolol (Figura 2b). [43] No íon extraído
cromatograma de m / z 505,2, os sinais em 7,36 min, 8,61 min,
9,91 min foram atribuídos ao O-glucuronídeo da droga, N-glucuronida,
e 17-epi-N-glucuronida, com base na ordem de eluição e na literatura
dados. Além disso, um sinal menor representando indiscutivelmente um
segundo
N-glucuronido foi observado no tempo de retenção de 8,86 min,
também encontrado na alíquota analisada da amostra sintetizada
estanozolol-N-glucuronídeos (Figura 2a). TWIMS medições de
os analitos produziram tempos de deriva para o O-glucuronídeo de 78,26
escaninhos
 (4,23 ms) e 72,04 caixas (3,89 ms) para o epi-N-glucuronido,
correspondente ao CCS determinado experimentalmente de 209,9 Å2 e
195,1 Å2, respectivamente, usando a curva de calibração derivada de glicose
AAS acima mencionada. O principal N-glucuronídeo encontrado no tempo de retenção
de 8,62 min apresentou um tempo de deriva consideravelmente menor
de 72,78 escaninhos (3,93 ms) e CCS menor (196,8 Å2) que o menor,
eluição posterior (8,86 min) de N-glucuronídeo, produzindo 75,63 escaninhos
(4,08 ms)
e, correspondentemente, 203,6 Å2 (Figura 3, Tabela 1).
produziu CCS calculado semelhante de 204.1 e 203.1Å2, respectivamente, o
indiscutivelmente 2'N-glucuronidado e o stanozolol conjugado com 17-O
foram encontrados com valores mais altos de 205,1 e 212,4 Å2 (Tabela 1).
Como com
o glucuronido 3'-hidroxi-estanozolol calibrador, diferentes protonados
espécies de 1'- e 2'N-glucuronídeo de estanozolol, que foram contabilizadas
usando apenas aquelas resultantes de
protonação no local com a maior afinidade de prótons. Com ambos
N-glucuronídeos, o nitrogênio sem conjugação com ácido glucurônico
provou ser favorecido. A diferença acima mencionada e experimentalmente
determinada de aproximadamente 7 Å2 entre os dois grupos N-conjugados
glucuronídeos de estanozolol foram refletidos pelos valores calculados de ca.
1 Å2 apenas, sugerindo a existência de limitações nos empregados
algoritmo de computação, que exigiu confirmação adicional da estrutura
baseada em RMN de ambos os analitos. Aqui, a glucuronidação 1'N- e 2'N foi
atribuída de forma inequívoca ao pico 1 (8,62 min)
e pico 2 (8,85 min), respectivamente, especialmente por experimentos HMBC
exibindo 3 acoplamentos J entre os átomos C e H relevantes
(Informações de suporte S1).
Além da determinação do CCS baseada nos glucuronídeos do AAS,
Os valores de CCS calculados a partir de calibrações de polialanina foram
obtidos
para os conjugados de glucuronídeo de estanozolol na urina (Tabela 1). Estes
foram encontrados para ser substancialmente mais baixos, variando de 144 a
161 Å2,
mas o deslocamento (Δ) do CCS resultante de ambas as metodologias
apresentou uma diferença bastante constante de aproximadamente 45 Å2.
Conseqüentemente,
 uma excelente correlação (R2 = 0,9997) entre as abordagens
existia, sublinhando a robustez das análises de tempo de deriva
e a importância dos CCSs gerados in silico para a estrutura
atribuições

Discussão
Foi relatado que o tempo de desvio de um analito representa um parâmetro
específico robusto e estável, específico para o analito, que contribui com informações
relevantes para métodos de separação estabelecidos, como
cromatografia líquida. [51,52] As informações estruturais são obtidas
que podem ser comparados com composições modeladas em silico
e, assim, complementa o conjunto de dados existente. No entanto, o CCS
O cálculo das biomoléculas de baixa massa molecular, em particular quando o
nitrogênio é considerado gás de tração, é comparativamente
jovem campo de pesquisa. Neste estudo, os cálculos de DFT foram conduzidos
usando ORCA com o conjunto de dados de B3LYP / 6-31G, de acordo com estudos
anteriores. [49] Este procedimento se mostrou adequado
para as moléculas investigadas e conjuntos de dados maiores em níveis mais
altos
teoria não forneceu vantagens substanciais, mas exigiu
tempos de computação significativamente mais longos. Os cálculos MOBCAL
foram conduzidos usando os valores TM Lennard-Jones otimizados para N2
como relatado por Campuzano et al. em 2012 [28]; digno de nota é, no entanto,
o fato de a instrumentação empregada utilizar uma combinação de nitrogênio (como
gás de deriva) e hélio (como gás de amortecimento do
célula de pré-mobilidade).
A boa correlação entre os CCSs calculados e os tempos de deriva medidos
experimentalmente dos cinco glucuronídeos AAS
calibres corroboraram a validade da abordagem escolhida para apoiar a
caracterização dos conjugados de ácido glucurônico de
estanozolol. Ambos os isômeros dos N-glucuronídeos urinários do estanozolol
exibiram tempos de deriva substancialmente mais curtos que os
correspondentes
O-glucuronido e, assim, ajustam-se ao padrão observado de
Valores CCS. A separação experimentalmente realizada do
No entanto, as espécies glucuronidadas foram maiores do que as
 Diferenças no CCS, sugerindo que os algoritmos empregados podem
precisam de otimização adicional antes que atribuições estruturais inequívocas
de analitos sejam ativadas. Aqui, os dados de RMN ainda eram necessários,
que identificaram inequivocamente os locais de conjugação dos
Nglucuronídeos e eventualmente confirmaram a glucuronidação do
primeira e segunda espécies eluentes em N1 e N2, respectivamente. No
entanto, foram obtidas informações de suporte sobre os compostos-alvo, o que pode
ser de considerável interesse quando possíveis
produtos metabólicos devem ser caracterizados. Ferramentas que permitem
excluir ou pré-selecionar estruturas potenciais e, assim, minimizar
ou direcionando a carga de trabalho e estratégias, por exemplo, para
sínteses químicas.
Demonstrou-se que o esforço de calibração do sistema LC-IM-MS / MS é
justificado, mas também demorado. Usando
a opção de calibração genérica à base de polialanina facilita a geração de
valores de CCS para compostos parcialmente conhecidos / desconhecidos com
tempos de deriva medidos com robustez. As descobertas aqui apresentadas,
no entanto, também indicam que padrões ou valores relativos de CCS
interpretado quando comparado com os CCSs derivados in silico como
compensações
de tamanho substancial pode ser aplicado.
Conclusão
A identificação de metabólitos de drogas representa um processo demorado
tarefa desafiadora e, ao mesmo tempo, o conhecimento sobre
o destino metabólico da terapêutica nova e estabelecida é de grande
interesse particular para laboratórios de análises clínicas, forenses e
esportivas. A capacidade de análise de seção transversal de mobilidade / colisão de
íons
e computação para contribuir com as informações desejáveis
demonstrado por meio de um autêntico controle analítico de doping
caso relativo a diferentes conjugados de ácido N-glucurônico da
esteróide anabólico-androgênico stanozolol. Explorando um tempo de deriva
robusto
análises utilizando TWIMS e calibração de instrumento adaptada ao analito
combinada com dados gerados in silico sobre afinidades de prótons
e CAC de potenciais produtos metabólicos, a atribuição estrutural do chamado
metabólito a longo prazo do estanozolol, a saber
 o glucuronido de estanozolol-1’N, como postulado em um estudo anterior, foi
corroborada com as informações complementares fornecidas neste documento.
Embora a síntese e caracterização multidisciplinar do alvo
analitos (por exemplo, por espectroscopia MS e RMN) é o padrão ouro em
estudos de metabolismo de medicamentos, rotas alternativas que requerem
quantidades da substância ou substâncias presentes, por exemplo, em
matrizes é de grande importância. Os dados mostrados neste estudo sugerem
outro instrumento poderoso e complexo na caixa de ferramentas
de químicos analíticos

WANG, Z., ZHOU, X., LIU, X., DONG, Y., ZHANG, J., A novel HPLC-MRM
strategy to discover unknown and long-term metabolites of stanozolol for
expanding analytical possibilities in doping-control, J. Chromatogr. B xxx (2016)
xxx–xxx
Introdução
Os esteróides androgênicos anabolizantes (AAS) são uma classe de
substâncias normalmente derivadas da testosterona, que é um hormônio
anabólico androgênico e proteico endógeno. Embora o AAS
foram incluídos na lista de proibidos desde 1976, eles são
ainda são as substâncias mais mal utilizadas devido aos seus efeitos benéficos
duradouros no desempenho atlético. Cerca de 60% dos
resultados analíticos adversos (AAF) são decorrentes do AAS de acordo com
as estatísticas anuais de testes da WADA [1–3]. Não é de surpreender,
estanozolol (Fig. 1) está no topo da lista AAF no AAS devido à sua
funções anabólicas proteicas notáveis. Geralmente era detectado por
protótipo e seus principais metabólitos da fase I, como 3-hidroxiestanozolol, 4-
hidroxi-estanozolol ou 16-hidroxi-estanozolol, usando
cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massa (GC-MS) ou
cromatografia líquida de alta eficiência acoplada a tandem
espectrometria de massa (HPLC – MS / MS) [4-9]. Exceto hidroxilado,
18-desmetilado, 17-epimerizado, 18-oxidado e glucuronido
metabólitos conjugados também foram relatados, mas muito poucos
eles podem ser detectados por muito tempo in vivo [10-16]. Enquanto isso, o
stanozolol é um composto sintetizado projetado a partir de
ocorrência de testosterona, e seu processo metabólico é complexo e
 individualmente diferente. Como resultado, muitos metabólitos desconhecidos e
de baixa concentração não foram descobertos [10,11]. Isto é
importante estudar o metabolismo do estanozolol em profundidade e
identificar mais metabólitos a longo prazo, com o objetivo de
expandindo e estendendo suas janelas de detecção.
O modo de monitoramento de reação múltipla (MRM) é uma das varreduras
modos de espectrometria de massa com triplo quadrupolo com altíssima
sensibilidade. O íon precursor produziu íons de produtos por colisão
dissociação induzida (CID). Ao definir o precursor específico para as transições
de íons do produto, trace quantidades de substâncias em matrizes complexas
pode ser detectado. Ao empregar essa técnica, tanto os metabólitos de baixa
concentração quanto os compostos desconhecidos previstos poderiam
ser detectado. Esta técnica tem sido amplamente utilizada no campo
de proteômica [17,18], metabolômica [19–21] e metabólica de medicamentos
perfis [22–25] nos últimos anos. Por exemplo, J. A. Lee et al.
usou a estratégia de MRM para prever e descobrir os metabólitos de
amitriptilina e comparar diferenças de espécies em seu metabolismo
microssômico hepático [22].
Na análise de controle de doping, a tecnologia MRM é usada principalmente
detectar as substâncias e metabolitos conhecidos e fornecer uma
ensaio sensível e seletivo. Neste estudo, encontramos estanozolol
e seus principais metabólitos podem produzir diagnóstico representativo
íons de produtos que estavam intimamente relacionados às suas estruturas
Modo MRM. 3-hidroxi-estanozolol, por exemplo, poderia produzir um
fragmento iônico característico de m / z 97, composto por 3'-
grupo funcional hidroxil substituído. Assim, empregando o conhecido
íons de fragmentos característicos como íons do produto e íons precursores
especulativos para metabólitos desconhecidos e de baixa concentração
com base nas possíveis reações metabólicas das fases I e II
em humanos, é capaz de descobrir mais metabólitos de AAS, como
estanozolol na urina humana.
Além disso, MS / MS direcionados de alta resolução (RH direcionado
MS / MS), o modo de varredura da espectrometria de massa em tempo
quadrupolo de vôo (Q-TOF) [26] foi usado para coletar dados HR / MS de alta
qualidade em HR
 dos compostos alvo e, em seguida, o metabolito descobertos pela técnica
HPLCMRM foram identificados com precisão
Resultados e discussão
3.1 Otimização da preparação da amostra e análise
condições
Devido à diferença de polaridade nas fases I e II
metabolitos, três alíquotas da amostra de urina foram preparadas por diferentes
abordagens. Os metabólitos da fase I foram pré-tratados com
extração líquido-líquido devido à sua baixa polaridade, utilizando éter metiltert-
butílico (MTBE). O MTBE não apresentava apenas baixa toxicidade e
volátil forte, mas também mantido na camada superior após a extração. O
extrator foi muito conveniente para ser transferido e
enriquecido durante a preparação da amostra.
A maioria dos metabólitos da fase II eram solúveis em água; portanto, eles
foram coletados e purificados com extração em fase sólida.
Como exceção, produtos metilados foram gerados na fase II
metabolismo, mas geralmente eram dissolvidos na fase orgânica e
pré-tratados como metabólitos da fase I devido à sua baixa polaridade.
Até onde sabemos, um certo número de metabólitos pode ser
produzido em formas não conjugadas e conjugadas. Eles eram
hidrolisado pela glucuronidase e extraído com MTBE em nossa
estude.
Muitos metabólitos de estanozolol eram isômeros com menor diferença
estrutural, sendo necessário otimizar a cromatografia
condições de separação para isolar cada metabolito das grandezas extensão.
Um programa de eluição gradiente mais lento e fase móvel mais baixa
taxa de fluxo foi empregada para alcançar uma separação ideal.
O método deve ser validado em termos de repetibilidade e
robustez dos tempos de retenção para cada metabolito individual. É essencial
distinguir cada substância por sua especificidade
tempo de retenção, especialmente para os metabólitos com menor
discrepância estrutural. Em nosso estudo, o RSD do tempo de retenção para cada
metabolito era inferior a 1% e cumpria os requisitos em
Documento técnico da WADA [1]. Além disso, o método HPLCMRM
desenvolvido foi validado usando padrões comerciais disponíveis
incluindo estanozolol, 3’-hidroxi-estanozolol, 4-hidroxi-estanozolol
 e 16-hidroxi-estanozolol. Os resultados foram mostrados na Tabela 1. O
O limite de detecção desses compostos estava entre 10 e 100 pg / mL.
3.2 Fragmentação característica do estanozolol e seus principais
metabolitos
A base dessa estratégia de HPLC-MRM para a caracterização do perfil
metabólico foi que o estanozolol e seus metabólitos compartilhavam o mesmo
esqueleto e poderia produzir fragmento correlato estrutural semelhante
íons. O estanozolol e seus principais metabólitos foram analisados primeiro
usando
modo de verificação de íons do produto. Como conseqüência, 3’-hidroxi-
estanozolol
produziu um íon de fragmento característico em m / z 97, que era um
indicação de que o grupo hidroxila substituído por 3 'é sua característica
estrutural. Da mesma forma, o 4-hidroxi-estanozolol gerou uma
fragmento iônico característico em m / z 145, estanozolol e 16-
hidroxiestanozolol em m / z 81, uma vez que não há substituição no anel A e no anel
N. Estes
íons de fragmentos observados foram descritos em um estudo anterior
[15] A fragmentação característica do estanozolol foi demonstrada em
Figura 1.
Em resumo, os metabólitos do estanozolol podem ser classificados em
duas categorias em termos de produtos das fases I e II. Cada
A categoria foi composta por três grupos diferentes, com diferentes
características estruturais. Além disso, pode-se observar que o
íons do produto de estanozolol e seus principais metabólitos eram abundantes
e estável enquanto a energia de colisão foi fixada em 50 eV.

3.3 Estratégia HPLC-MRM para a descoberta e identificação de

metabolitos de estanozolol
O MRM é um dos modos de varredura no espectrômetro de massa com triplo
quadrupolo. O íon precursor do analito foi escaneado no Q1 e
produziu íons de produtos fragmentados por CID no segundo trimestre. Em
seguida, o fragmento de íon característico foi digitalizado no terceiro trimestre. Esse
mecanismo de verificação
pode atingir uma sensibilidade extremamente alta. Portanto, vários íons de
transição metabólica previstos podem ser monitorados simultaneamente
 no Q1 e Q3 [24] e pode ser bem usado para descobrir traços
quantidade de metabólitos em matriz biológica complexa.
O fluxo de trabalho da estratégia para descoberta e identificação de
metabólitos de estanozolol foi exibido na Fig. 2. Primeiro,
O estanozolol e seus principais metabólitos foram analisados usando o modo
de varredura iônica do produto para encontrar os íons de fragmentos
energias de colisão ideais. Então possível fase I e fase II
reações metabólicas foram hipotetizadas de acordo com a estrutura
estanozolol e seus principais metabólitos, e os íons precursores de
metabolitos foram estabelecidos com base na diferença de m / z no
metabolismo
produtos de reação.
Em segundo lugar, as amostras de urina em branco e o estudo de
administração
As amostras de urina foram pré-tratadas usando três métodos diferentes de
preparação de amostras, dependendo principalmente das polaridades da fase I e
metabolitos da fase II. As amostras foram então analisadas por MRM
utilizando o precursor das transições de íons do produto descritas
acima e energia de colisão a 50 eV. Os metabolitos do estanozolol
foram reconhecidos pela comparação dos cromatogramas MRM de amostras
em branco
e amostras de urina positivas. Um composto apareceu no positivo
a amostra de urina, mas não mostrada na urina em branco, foi assumida como
o metabolito do estanozolol. Para eliminar quaisquer desvios,
duas alíquotas de urina em branco foram coletadas de cada voluntário
tempo diferente antes da aplicação do medicamento. Urina pós-administração
amostras coletadas 2, 5 e 10 dias após a ingestão do medicamento foram
selecionadas
para análise. Foram descobertos 27 metabólitos da fase I e 21 da fase II
(Tabela 2). Os cromatogramas MRM desses metabólitos foram
demonstrado na figura 3.
Em terceiro lugar, as estruturas desses metabólitos detectados foram
especuladas por uma investigação cuidadosa de seus EM / MS de alta resolução
espectros. Em comparação com os espectros de massa para fase
desconhecida
Metabolitos I com os de "compostos de referência" (estanozolol
 e seus principais metabólitos), o diferencial nos íons de diagnóstico
poderia ser identificada e a possível estrutura do metabolito
foi capaz de prever. Por exemplo, o tempo de retenção de M7 foi
21,10 min e sua massa exata era m / z 343.2376, o que forneceu
a composição elementar de C21H30N2O2 (molécula protonada de
massa = m / z 343,2380, erro = 1,18 ppm). Também possuía o íon fragmento
dominante caracterizado em m / z 97.0391 (C4H5N2O, massa = m / z
97,0396, erro = 5,61 ppm), que ilustrava que era hidroxilação a 3 -C.
Comparado com 3-hidroxi-estanozolol (C21H32N2O2),
dois átomos de hidrogênio foram eliminados. Foi proposto que
M7 foi metabolito de desidrogenação de 3-hidroxi-estanozolol.
De acordo com seus espectros de MS / MS direcionados, como mostrado na
Fig. 4,
o íon fragmento em m / z 121.1010 (C9H13, massa = m / z 121.1012,
erro = 1,47 ppm) de M7 correspondiam à desidrogenação em C-15 e C-16. Os
metabólitos conjugados da fase II foram confirmados por
perda dos compostos detectados. Por exemplo, M31 eram os metabólitos
conjugados da fase II. Seu tempo de retenção foi de 15,31 min e
sua massa exata era m / z 521,2850, o que fornecia o elemento
composição de C27H40N2O8 (massa da molécula protonada = m / z
521,2857, erro = 1,43 ppm). De acordo com seus espectros de MS / MS
direcionados, conforme revelado na Fig. 4, ele possuía o íon de fragmento dominante
em m / z
345,2530 (C21H33N2O2, massa = m / z 345,2537, erro = 1,90 ppm),
que era o íon protonado do hidroxi-estanozolol (C21H32N2O2),
e o fragmento iônico característico dominante em m / z 145.0756
(C9H9N2, massa = m / z 145,0760, erro = 2,95 ppm) que indicava
tinha hidroxilação em C-4. Sua perda neutra do íon precursor em
m / z 521 era 176 (C6H8O6), o que foi proposto como sendo o
conjugados de ácido glucurônico de 4-hidroxi-estanozolol. Seu conjugado
o local da reação era incerto.
Quarto, a via metabólica foi prevista e explicada
de acordo com as estruturas dos metabolitos de stanozolol recentemente
detectados. Ao comparar as diferenças de componentes e concentrações para os
metabólitos gerais (fase I e fase II) após
enzimólise sobre os metabólitos da fase I, foi possível
 especular as correlações transformacionais entre a fase I
e metabolitos da fase II. Com base nas considerações acima, o
perfis metabólicos do estanozolol foram caracterizados e os metabólitos a
longo prazo foram determinados como marcadores alvo
Teste de drogas.
Em resumo, o estanozolol desconhecido e de baixa concentração
metabólitos na urina humana foram descobertos e identificados de forma
abrangente, empregando o modo de varredura por HPLC-MRM
modo de varredura HR HR / MS direcionada. Como conseqüência, vários
metabólitos de longo prazo foram descobertos para análise de controle de doping. d
escoberta de metabólitos desconhecidos e de longo prazo para expansão
janela analítica para uso indevido de estanozolol
Utilizando as estratégias descritas acima, amostras de urina coletadas
foram analisados antes e até 25 dias após a administração de três voluntários
saudáveis. Quarenta e oito metabolitos do estanozolol foram
identificados, incluindo 27 metabólitos da fase I e 21 da fase II,
quais 13 metabolitos da fase I e 14 metabolitos da fase II têm
não foi relatado até agora. Identificação estrutural de todos esses
metabolitos foi listado nas informações de suporte. A fase
Os metabólitos I foram obtidos por reações como monohidroxilação,
dihidroxilação, trihidroxilação, desidrogenação,
epimerização, desmetilação, metileno em cetona, desidratação de álcool,
carboxilação de estanozolol. Reacções metabólicas de fase II
foram compostos de conjugação sulfato, conjugação glucuronida
e metilação.
Usando transições teóricas de MRM para descobrir metabólitos,
traria dois riscos: um era um novo metabólito designado com base
na fragmentação na fonte de outro, enquanto esse risco pode ser
diminuiu verificando o tempo de retenção relacionado à polaridade. Por
exemplo, composto A que teve o mesmo tempo de retenção (13,19 min)
e espectros de MS / MS de HR direcionados com M12 (mono-hidroxilados)
metabolito do 4-OH-estanozolol) era suspeito de desidrogenado
metabolito de 4-OH-estanozolol. Devido à polaridade diferente, a retenção
tempo de metabolito desidrogenado deve ser maior que o do
4-OH-estanozolol (15,62 min) e seu metabólito monohidroxilado na coluna C18.
Portanto, pode-se inferir que o composto A não era
 o metabolito desidrogenado do 4-OH-estanozolol. Além disso,
íon precursor do composto A (m / z 343) mostrou 18 Da menos
do que o de M12 (m / z 361). Portanto, o composto A deve ser o
resultado da geração na fonte de um [M + H-H2O] + a partir de M12. O outro
risco foi um novo metabólito atribuído pela contribuição isotópica de
outro metabolito. Esse risco pode ser superado comparando-se a distribuição
isotópica teórica de íons precursores e dados experimentais
de um novo metabolito. Por exemplo, o composto B mostrou o mesmo
tempo de retenção (15,14 min) e espectros de MS / MS de HR direcionados
com
16-OH-estanozolol e seu íon precursor (m / z 347) foram 2 Da mais
que 16-OH-estanozolol. Mas sua distribuição isotópica experimental
íon precursor não era consistente com o isotópico teórico
distribuição calculada por sua fórmula. Portanto, pode-se inferir que
O composto B é uma contribuição isotópica de 16-OH-estanozolol, mas
não é um metabolito real. Acima de tudo, 56 metabólitos suspeitos foram
descoberto inicialmente por transições teóricas de MRM e 48 delas
foram finalmente identificados com uma precisão de 85,7%.
Embora os padrões da maioria dos metabólitos detectados não estivessem
disponíveis, pode-se inferir que os limites de detecção deles estavam próximos
nível de pg / mL de acordo com a LOD dos compostos comerciais disponíveis
(consulte a Tabela 1).
Acima de tudo, a técnica de HPLC-MRM tem uma grande vantagem em
descobrir concentrações desconhecidas e baixas de metabólitos. Embora seja
uma espécie de técnica de varredura por espectrometria de massa de baixa
resolução e
Para obter alguns resultados positivos falsos, foi utilizada a técnica de
varredura HR MS / MS de espectrometria de massa de alta resolução para
identificar os metabólitos como uma poderosa técnica complementar.
As curvas de nível-tempo do estanozolol e seus 48 metabólitos em
amostras de urina de três voluntários foram mostradas na Fig. 5. Nove
metabólitos a longo prazo foram determinados e puderam ser detectados
mais de 15 dias em amostras de urina pós-administração de medicamentos
(Tabela 2).
Os componentes dos metabolitos descobertos na urina de três
voluntários eram idênticos e os tempos de detecção para a maioria dos
 metabolitos foram semelhantes. Havia 5 metabólitos (M5, M16, M24,
M40 e M44) com desvio significativo no tempo de detecção devido a
diferenças individuais. Os tempos de detecção de metabolitos conhecidos
aproximaram-se dos resultados apresentados na literatura [12]. Além do que,
além do mais,
A via metabólica do estanozolol foi construída pela estrutura
correlação entre os metabólitos da fase I e da fase II (Fig. 6).
4. Conclusão
Neste estudo, uma nova estratégia de HPLC-MRM foi bem desenvolvida
caracterizar de forma abrangente o perfil metabólico do estanozolol
e descubra seu desconhecido, baixa concentração e longo prazo
metabolitos para fins de controle de doping. Quarenta e oito stanozolol
metabolitos foram detectados no total e 27 de 48 não foram
relatado anteriormente. Nove metabolitos podem ser identificados por mais de
15 dias após a administração do medicamento. Essa estratégia poderia
efetivamente
expanda a janela analítica e estenda o tempo de detecção de
stanozolol aos 23 dias após a administração do medicamento. Esta
investigação
poderia fornecer um meio valioso de controle de doping para outras
substâncias proibidas